ĐẶC điểm lâm SÀNG, cận lâm SÀNG và ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PCR đa mồi TRONG CHẨN đoán VIÊM PHỔI CỘNG ĐỒNG ở TRẺ EM

Nhờ khuếch đại rồi mới phát hiện nên kỹ thuậtnày có độ nhạy rất cao, giới hạn thấp nhất có thể phát hiện được là một phân tử.Chính vì vậy, real - time PCR đa mồi là một công cụ rất hữu d

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN CHUYÊN KHOA CẤP II

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS.TS Nguyễn Thị Yến

2 TS Đoàn Mai Thanh

HÀ NỘI - 2019

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ VIÊM PHỔI MẮC PHẢI TẠI CỘNG ĐỒNG 3

1.1.1 Khái niệm 3

1.1.2 Sinh bệnh học của viêm phổi 3

1.1.3 Căn nguyên gây viêm phổi trẻ em 5

1.1.4 Chẩn đoán 6

1.2 TỔNG QUAN VỀ POLYMERASE CHAIN REACTION 8

1.2.1 Khái quát về PCR 8

1.2.2 Real-time PCR là gì? 9

1.2.3 PCR đa mồi 10

1.2.4 Nguyên tắc của PCR 10

1.2.5 Kỹ thuật tiến hành 11

1.3 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI 13

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 15

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn 15

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 16

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 17

2.1.4 Thời gian nghiên cứu 17

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 17

2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 17

2.2.3 Nội dung nghiên cứu 17

2.2.4 Kỹ thuật thu thập thông tin 25

2.5 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU 27

Chương 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28

3.1 CÁC THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 28

3.2 ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG, CẬN LÂM SÀNG CAP 29

3.2.1 Phân bố bệnh nhân theo lý do vào viện 29

3.2.2 Phân bố bệnh nhân theo triệu chứng cơ năng khi nhập viện 29

3.2.3 Phân bố bệnh nhân theo triệu chứng thực thể tại phổi khi nhập viện .30 3.2.4 Phân bố bệnh nhân theo triệu chứng ngoài phổi khi nhập viện 30

3.2.5 Đặc điểm X quang phổi 30

3.2.6 Đặc điểm huyết học 31

3.2.7 Đặc điểm về các yếu tố thời gian theo nhóm tuổi 31

3.2.8 Kết quả xét nghiệm mPCR 32

3.2.9 Kết quả nuôi cấy dịch tỵ hầu 32

Chương 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN 33

DỰ KIẾN KẾT LUẬN 34

DỰ KIẾN KHUYẾN NGHỊ 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO

Bảng 3.1: Phân bố tuổi bệnh nhân trong nghiên cứu 28

Bảng 3.2: Phân bố bệnh nhân theo lý do vào viện 29

Bảng 3.3 Phân bố bệnh nhân theo triệu chứng cơ năng khi nhập viện 29

Bảng 3.4 Đặc điểm về các triệu chứng thực thể tại phổi theo nhóm nghiên cứu 30

Bảng 3.5 Đặc điểm các triệu chứng ngoài phổi theo nhóm nghiên cứu 30

Bảng 3.6: Đặc điểm X quang phổi 30

Bảng 3.7 Đặc điểm biến đổi huyết học theo nhóm nghiên cứu 31

Bảng 3.8 Đặc điểm về các yếu tố thời gian theo nhóm tuổi 31

Bảng 3.9: Kết quả xét nghiệm mPCR 32

Bảng 3.10: Tải lượng vi khuẩn phế cầu qua xét nghiệm mPCR 32

Bảng 3.11: Kết quả nuôi cấy dịch tỵ hầu 32

Bảng 3.12: So sánh kết quả xét nghiệm mPCR và nuổi cấy dịch tỵ hầu 32

DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Phân bố giới bệnh nhi trong nghiên cứu 28

ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm phổi mắc phải tại cộng đồng (CAP) là một bệnh phổ biến ở trẻ

em, đặc biệt là ở các nước đang phát triển Trên toàn thế giới, CAP là nguyênnhân hàng đầu gây tử vong ở trẻ dưới 5 tuổi Các yếu tố làm tăng tỷ lệ mắc

và mức độ nghiêm trọng của bệnh bao gồm sinh non, suy dinh dưỡng, tìnhtrạng kinh tế xã hội thấp, tiếp xúc với khói thuốc lá và chăm sóc y tế [1] Theothống kê của WHO (năm 2000) trung bình mỗi trẻ mắc 0,28 đợt/trẻ/năm Cácnước đang phát triển có tỷ lệ trẻ dưới 5 tuổi mắc CAP cao gấp 5 lần các nướcphát triển, Việt Nam đứng hàng thứ 9 trong số những nước có mắc CAP caonhất thế giới [2] Ước tính tử vong do viêm phổi ở trẻ dưới 5 tuổi trên thế giới

là 0,26 trẻ/1000 trẻ sơ sinh sống Như vậy hàng năm có khoảng 1,8 triệu trẻ tửvong do viêm phổi (không kể viêm phổi sơ sinh) [3]

Tại Na Uy, một nghiên cứu tiến hành từ năm 2002 – 2005 thấy, cứ 1000 trẻdưới 5 tuổi thì có 32,8% trẻ mắc CAP, tỉ lệ này ở trẻ dưới 2 tuổi là 42,1% TạiAnh, tỉ lệ trẻ dưới 5 tuổi mắc CAP trên 1000 trẻ là 33,8%, tỉ lệ phải nhập viện là28,7% [5] Tại Việt Nam, theo số liệu báo cáo năm 2004 của WHO và UNICEF,mỗi năm có khoảng 4500 trẻ dưới 5 tuổi tử vong do viêm phổi, chiếm 12% [4]

Nguyên nhân gây CAP có rất nhiều như vi khuẩn, virus, ký sinh trùng,nấm…Tại các nước đang phát triển, vi khuẩn là căn nguyên gây bệnh phổbiến nhất [2] Nguyên nhân cụ thể phụ thuộc rất nhiều vào độ tuổi của trẻ.Nhiễm virus và Streptococcus pneumoniae là phổ biến nhất ở trẻ em tuổi mẫugiáo, trong khi Mycoplasma pneumoniae thường gặp ở trẻ lớn [1] Tần suấttrẻ bị CAP do phế cầu gặp các biến chứng như hoại tử, tràn dịch màng phổi /tràn dịch màng phổi phức tạp và áp xe phổi dường như đang gia tăng [5]

Việc chẩn đoán xác định viêm phổi do phế cầu chủ yếu vẫn dựa vào triệuchứng lâm sàng và xét nghiệm đờm, trong đó nuôi cấy là xét nghiệm đặc hiệunhất để xác định tác nhân gây bệnh Tuy nhiên việc nuôi cấy dịch đường hô hấp

để phân lập vi khuẩn thường mất nhiều thời gian và phụ thuộc rất nhiều vào kỹthuật lấy mẫu, bảo quản, vận chuyển và thời gian lưu giữ bệnh phẩm Kỹ thuậtReal-time PCR đa mồi là kỹ thuật nhân bản DNA trong ống nghiệm dựa vào các

chu kỳ nhiệt Nhờ các chu kỳ nhiệt này mà đoạn DNA đích được nhân bản theocấp số nhân để sau 30 đến 40 chu kỳ, đoạn DNA đích được nhân bản thành hàng

tỷ bản sao dễ dàng được phát hiện Nhờ khuếch đại rồi mới phát hiện nên kỹ thuậtnày có độ nhạy rất cao, giới hạn thấp nhất có thể phát hiện được là một phân tử.Chính vì vậy, real - time PCR đa mồi là một công cụ rất hữu dụng trong phát hiệntác nhân vi sinh vật gây bệnh Trong kỹ thuật nuôi cấy, người ta phân lập vi khuẩnrồi khuếch đại bộ gen từ đó phát hiện vi sinh vật gây bệnh, xét nghiệm real - timePCR đa mồi phát hiện tác nhân gây bệnh không khác gì nuôi cấy nhưng khôngphải nuôi cấy bộ gen mà chỉ là một đoạn gen đặc hiệu của vi sinh vật gây bệnh(không phải trong môi trường phân lập và nuôi cấy phức tạp mà chỉ đơn giảntrong một ống chứa dung dịch phản ứng – PCR mix) thành hàng tỷ bản sao rồisau đó định danh các bản sao này xem có đúng của vi sinh vật muốn tìm khôngdựa vào kích thước và/hay trình tự các nucleotide trên các bản sao này Do đó độđặc hiệu của real – time PCR đa mồi cũng không khác gì nuôi cấy

Kỹ thuật real – time PCR đa mồi còn có ưu điểm vượt trội so với xétnghiệm vi sinh là kết quả có sớm trong vòng 5 giờ kể từ khi bắt đầu làm xétnghiệm trong khi xét nghiệm vi sinh cần từ 48 đến 72 giờ, hơn nữa nó còn có thểchẩn đoán vi khuẩn gây bệnh mà phương pháp nuôi cấy dịch tỵ hầu cho kết quả

âm tính do bệnh nhân đã sử dụng kháng sinh trước đó, đồng thời real – time PCR

đa mồi còn có thể phát hiện cùng lúc nhiều loại tác nhân gây bệnh Vậy, phươngpháp Real – time PCR đa mồi có thực sự hữu ích trong việc tìm căn nguyên gâyviêm phổi cộng đồng ? Xuất phát từ vấn đề này, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và giá trị của kỹ thuật real –

time PCR đa mồi trong chẩn đoán viêm phổi mắc phải tại cộng đồng ở bệnh nhi từ 2 tháng đến 5 tuổi tại bệnh viện Nhi trung ương” nhằm hai mục tiêu:

1 Mô tả đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng viêm phổi mắc phải tại cộng

đồng ở trẻ em.

2 Xác định ngưỡng phát hiện phế cầu thích hợp để ứng dụng trong chẩn

đoán viêm phổi cộng đồng bằng kỹ thuật real – time PCR đa mồi

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ VIÊM PHỔI MẮC PHẢI TẠI CỘNG ĐỒNG 1.1.1 Khái niệm

Viêm phổi là tình trạng tổn thương viêm trong nhu mô phổi bao gồmviêm phế nang, túi phế nang, tổ chức liên kết kẽ và viêm tiểu phế quản tận cùng[6] Viêm phổi có thể lan toả cả hai bên phổi hoặc tập trung ở một thuỳ phổi

Viêm phổi được chia làm 4 loại: viêm phổi mắc phải tại cộng đồng(community-acquired pneumonia, CAP), viêm phổi mắc phải tại bệnh viện(hospital-acquired pneumonia, HAP), viêm phổi liên quan đến thở máy(ventilator acquired pneumonia, VAP), viêm phổi liên quan đến chăm sóc y

tế (health care-acquired pneumonia, HCAP)

Viêm phổi cộng đồng được định nghĩa là viêm phổi mắc phải khi bệnhnhân đang sống ngoài bệnh viện hoặc là không sử dụng các phương tiện chămsóc dài ngày.Theo hướng dẫn của bộ y tế viêm phổi cộng đồng là viêm phổi ởngoài cộng đồng hoặc 48 giờ đầu tiên nằm [7]

1.1.2 Sinh bệnh học của viêm phổi

1.1.2.1 Các đường vào phổi của vi sinh vật

Đường hô hấp :

Do hít phải ở môi trường không khí: từ các hạt nước bọt (chứa vi sinh vật)của người mang mầm bệnh hắt hơi, ho ra hoặc từ hạt bụi có chứa vi khuẩn củađộng vật (nhiễm Chlamydia psittaci), từ hạt nước chứa Legionella [8]

Do hít phải vi khuẩn từ ổ nhiễm của đường hô hấp trên: viêm nhiễmvùng tai mũi họng, viêm răng lợi, viêm xoang…

Đường máu: vi sinh vật theo đường máu từ ổ nhiễm trùng ban đầu tới phổi

Đường cận phổi

1.1.2.2 Cơ chế bảo vệ của bộ máy hô hấp

- Cơ chế cơ học:

 Lông chuyển : giúp làm sạch đường thở thường xuyên [9] Chấtnhầy : ngưng kết hạt bụi , vi sinh vật và ngăn cản sự tiếp xúc vớicác chất kích thích được hít vào niêm mạc đường thở [99]

- Cơ chế bảo vệ tế bào và dịch thể

 Các globulin miễn dịch : IgA, IgG, IGM

 Lactoferrin : ức chế sự phát triển của vi khuẩn

 Lysozyme: chống lại xâm nhập của nấm, vi khuẩn

 Surfactan: bất hoạt vi khuẩn, tăng cường khả năng làm việc củabạch cầu

1.1.2.3 Bệnh sinh

Ở trẻ em viêm phổi do vi khuẩn thường thứ phát sau nhiễm virus đường

hô hấp nhiễm virus làm rối loạn các cơ chế phòng vệ của đường hô hấp docác cơ chế :

- Làm biến đổi bản chất các chất tiết bình thường của đường hô hấp

- Ngăn cản sự thực bào

- Biến đổi khuẩn giới đường hô hấp

- Làm tổn thương tạm thời hệ biểu mô có lông chuyển ở niêm mạc khí đạo.Viêm phổi thùy: 24h đầu là giai đoạn sung huyết, đặc trưng bởi sự sunghuyết các mạch máu và phù nề phế nang, có sự hiện diện của vi khuẩn vàbạch cầu đa nhân trung tính Hai, ba ngày sau là giai đoạn gan hóa đỏ, đặctrưng bởi sự xuất hiện nhiều hồng cầu, bạch cầu đa nhân trung tính, tế bàobiểu mô bong ra và sợi fibrin bên trong phế nang Hai, ba ngày sau nữa là giaiđoạn gan hóa xám bởi vì có chất tiết mủ fibrin, hồng cầu bị phân hủy vàhemosiderin Giai đoạn cuối cùng là sự phục hồi cấu trúc phổi Quá trình xuấttiết fibrin có thể xảy ra ở màng phổi tạo ra tiếng cọ màng phổi và có thể dẫnđến dày dính màng phổi.

Phế quản phế viêm: Là tổn thương đặc phổi từng đám, ảnh hưởng đếnmột hoặc nhiều thùy Chất xuất tiết có thể chứa bạch cầu đa nhân trungtính ở trong phế nang và những tiểu phế quản, phế quản gần đó

Viêm phổi kẽ: Là tổn thương viêm từng đám hoặc lan tỏa ảnh hưởngđến tổ chức kẽ, đặc trưng bởi sự thâm nhiễm lympho, đại thực bào và tươngbào Phế nang không chứa chất xuất tiết nhưng có thể có những mànghyaline giàu protein lót bên trong lòng phế nang Bội nhiễm có thể gây

ra kiểu hỗn hợp viêm bên trong phế nang và tổ chức kẽ

Viêm phổi dạng kê: Là tổn thương kín đáo nhưng nhiều do sự lan tỏa của vikhuẩn trong phổi qua đường máu do lao kê, histoplasmosis, coccidioidomycosisbiểu hiện bởi tổn thương hạt hoại tử casein từng ổ Nhiễm herpes virus,cytomegalvirus hoặc virus varicella-zoster gây tổn thương xuất huyết hoại

tử cấp nặng ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch [11]

1.1.3 Căn nguyên gây viêm phổi trẻ em

Viêm phổi trẻ em có thể do vi khuẩn, virus hoặc vi sinh vật khác TheoWHO, các nguyên nhân hay gặp nhất là: Streptococcus pneumonia, Haemophilus

influenza và Respiratory Synticyal virus Ở trẻ lớn, thường gặp vi khuẩn khôngđiển hình, đại diện là Mycoplasma pneumonia.

S.pneumoniae (phế cầu) nguyên nhân vi khuẩn hàng đầu gây viêmphổi cộng đồng ở trẻ em dưới 5 tuổi, là cầu khuẩn gram dương có vỏ Phế cầu

có hơn 90 type huyết thanh Hiện nay thế giới đã có vaccine đa giá tiêmphòng phế cầu

Haemophilus influenza (HI) là trực khuẩn gram âm có vỏ hoặc không

vỏ Chủng gây bệnh thường có vỏ được phân thành 6 type từ a đến f HI type

b là nguyên nhân chính gây viêm màng não và viêm phổi trẻ em Tại ViệtNam, từ năm 2009, vaccine phòng HI type b đã được đưa vào chương trìnhtiêm chủng mở rộng trên toàn quốc

Mycoplasma pneumonia là vi khuẩn nội bào không có vỏ, nguyên nhânhàng đầu gây viêm phổi không điển hình, có thể tới 50% trong các nguyênnhân ở trẻ trên 5 tuổi Vi khuẩn này kháng tự nhiên với các kháng sinh có cơchế phá vách như: Betalactam, Amynoside,…Chúng bị tiêu diệt bởi cáckháng sinh nhóm Macrolid, Tetracyclin, Quinolone

Ngoài ra còn các vi khuẩn khác cũng là nguyên nhân gây viêm phổi trẻ

em như: tụ cầu, liên cầu, trực khuẩn ho gà, M cataralis, C pneumonia,…Nguyên nhân viêm phổi do vi khuẩn thường gặp theo lứa tuổi:

Trẻ sơ sinh: liên cầu B, trực khuẩn gram âm đường ruột, Listerriamonocytogent, Chlamydia trachomatis

Trẻ 2 tháng đến 5 tuổi: phế cầu, HI, M pneumonia, tụ cầu,…

Trẻ > 5 tuổi: M.pneumonia, phế cầu, tụ cầu,…[12]

1.1.4 Chẩn đoán

Chẩn đoán viêm phổi và mức độ nặng (viêm phổi, viêm phổi nặng) ởtrẻ em chủ yếu dựa vào lâm sàng

1.1.4.1 Viêm phổi

Trẻ ho, sốt kèm theo ít nhất một trong các dấu hiệu sau:

- Thở nhanh: Dấu hiệu thường gặp và là dấu hiệu sớm của viêm phổi ởtrẻ em Theo TCYTTG ngưỡng thở nhanh của trẻ em được quy định như sau: + Đối với trẻ < 2 tháng tuổi: ≥ 60 lần/phút là thở nhanh

+ Đối với trẻ 2 - 12 tháng tuổi: ≥ 50 lần/phút là thở nhanh

+ Trẻ từ 1 - 5 tuổi: ≥ 40 lần/phút là thở nhanh

Cần lưu ý: Đếm nhịp thở khi trẻ nằm yên hoặc lúc ngủ, phải đếm trọn 1phút Đối với trẻ < 2 tháng tuổi phải đếm 2 lần vì trẻ nhỏ thở không đều, nếu

cả 2 lần đếm mà nhịp thở đều ≥ 60 lần/phút thì mới có giá trị

- Rút lõm lồng ngực: phần dưới lồng ngực lõm vào ở thì hít vào

Ở trẻ < 2 tháng tuổi nếu chỉ rút lõm nhẹ thì chưa có giá trị vì lồng ngực ởtrẻ nhỏ lứa tuổi này còn mềm, khi thở bình thường cũng có thể bị rút lõm nhẹ

Vì vậy ở lứa tuổi này khi rút lõm lồng ngực mạnh (lõm sâu và dễ nhìn thấy)mới có giá trị chẩn đoán

- Khám phổi thấy có bất thường: giảm thông khí, có tiếng bất thường( ran ẩm, ran phế quản, ran nổ,…) [12]

1.1.4.2 Viêm phổi nặng

Chẩn đoán viêm phổi nặng khi trẻ có dấu hiệu của viêm phổi kèm theo

ít nhất một trong các dấu hiệu sau: [12]

- Dấu hiệu toàn thân nặng:

+ Bỏ bú hoặc không uống được

+ Rối loạn tri giác: lơ mơ hoặc hôn mê

+ Co giật

- Dấu hiệu suy hô hấp nặng (thở rên, rút lõm lồng ngực rất nặng)

- Tím tái hoặc SpO2 < 90%

- Trẻ < 2 tháng tuổi

1.1.4.3 Cận lâm sàng

 X-quang phổi

Chụp X-quang phổi là phương pháp để xác định các tổn thương phổitrong đó có viêm phổi Tuy nhiên không phải các trường hợp viêm phổi đượcchẩn đoán trên lâm sàng nào cũng có dấu hiệu tổn thương trên phim X-quangphổi tương ứng và ngược lại Vì vậy không nhất thiết các trường hợp viêmphổi cộng đồng nào cũng cần chụp Xquang phổi mà chỉ chụp X-quang phổikhi cần thiết (trường hợp viêm phổi nặng cần điều trị tại bệnh viện)

Hình ảnh viêm phổi điển hình trên phim x – quang là đám mờ ở nhu môphổi ranh giới không rõ một bên hoặc 2 bên phổi Viêm phổi do vi khuẩn, đặcbiệt do phế cầu tổn thương phổi có hình mờ hệ thống bên trong có các nhánhchứa khí Tổn thương viêm phổi do virus hoặc vi khuẩn không điển hìnhthường đa dạng, hay gặp tổn thương khoảng kẽ, có thể gặp tràn dịch màngphổi, áp xe phổi, xẹp phổi,…[12]

 Xét nghiệm công thức máu và CRP

Bạch cầu máu ngoại vi, đặc biệt là tỷ lệ đa nhân trung tính và CRP máuthường tăng cao khi viêm phổi do vi khuẩn, bình thường nếu do virus hoặc vikhuẩn không điển hình [12]

 Các xét nghiệm cận lâm sàng khác (nếu có điều kiện)

Cấy máu, cấy dịch tỵ hầu, đờm, dịch màng phổi, dịch khí - phế quảnqua ống nội khí quản, qua nội soi phế quản để tìm vi khuẩn gây bệnh, làmkháng sinh đồ; xét nghiệm PCR tìm nguyên nhân virus, vi khuẩn, nguyênnhân gây viêm phổi không điển hình như M pneumoniae, Chlamydia [13]

1.2 TỔNG QUAN VỀ POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

1.2.1 Khái quát về PCR

PCR là thử nghiệm nhân bản một đoạn DNA trong ống nghiệm dựa vàocác chu kỳ nhiệt Thử nghiệm được thực hiện trong một ống nghiệm nhỏ chứa

dung dịch phản ứng (gọi là PCR mix) có thể tích vào khoảng từ 10l đến 50lvới các thành phần chủ yếu là:(1) enzyme polymerase chịu nhiệt, thườngđược gọi là Taq polymerase, có hoạt tính tối đa ở 72oC và bền được với nhiệtđộ; (2) 4 loại desoxyribonucleotide (dNTP) là Adenine, Thymine, Guanine,

và Cytosine (dATP, dTTP, dGTP, và dCTP); (3) DNA chứa các đoạn DNAđích sẽ được nhân bản trong ống phản ứng; (4) các đoạn mồi (primer) xuôi vàngược là các đoạn oligonucleotide có chiều dài khoảng 20 – 30 nucleotide cótrình tự bổ sung một cách đặc hiệu với trình tự của 2 đầu đoạn DNA sẽ đượcnhân bản; (5) ion Mg++ trong muối MgCl2 ở nồng độ thích hợp, (6) dung dịchđệm Tris-KCl để làm dung môi thích hợp cho phản ứng Khi ống nghiệmphản ứng này được cho vào buồng ủ chu kỳ nhiệt của máy luân nhiệt (thermalcycler), mà chúng ta thường gọi là máy PCR, chương trình nhiệt độ trong máy

sẽ làm cho nhiệt độ trong buồng ủ nhiệt của máy thay đổi theo chu kỳ, nhờvậy mà phản ứng nhân bản DNA sẽ xảy ra.[14]

1.2.2 Real-time PCR là gì?

Trong kỹ thuật PCR, sau khi hoàn tất khuếch đại đoạn DNA đích,người làm thí nghiệm phải tiếp tục làm một số bước thí nghiệm để đọc kếtquả xác định có sản phẩm khuếch đại mong muốn trong ống phản ứng haykhông, và giai đoạn này gọi là giai đoạn thí nghiệm sau PCR Trong giai đoạnnày, người làm thí nghiệm có thể thực hiện điện di sản phẩm PCR trên gelagarose để xem có vạch sản phẩm khuếch đại đúng kích thước mong muốnhay không, cũng có thể thực hiện thí nghiệm lai với các đoạn dò đặc hiệu(trên màng, trên giếng hay phiến nhựa ) để xem sản phẩm khuếch đại cótrình tự mong muốn hay không Kỹ thuật PCR mà cần phải có giai đoạn thínghiệm để đọc và phân tích sau khi hoàn tất phản ứng khuếch đại, ngày hômnay được gọi là PCR cổ điển (classical PCR)

Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích hiểnthị được ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, chính vì vậy nên được gọi

là real-time; và do đặc điểm này nên với real-time PCR người làm thí nghiệmkhông cần thiết phải làm tiếp các thí nghiệm để đọc và phân tích kết quả đểxác định có sản phẩm khuếch đại đích hay không vì kết quả cuối cùng củaphản ứng khuếch đại cũng được hiển thị ngay sau khi hoàn tất phản ứngkhuếch đại Như vậy, nên có thể nói real-time PCR là kỹ thuật nhân bản DNAđích trong ống nghiệm thành hàng tỷ bản sao dựa vào các chu kỳ nhiệt và kếtquả khuếch đại trong ống phản ứng được hiển thị cùng lúc với phản ứngkhuếch đại xảy ra để người làm thí nghiệm có thể thấy được.[14]

1.2.3 PCR đa mồi (multiplex PCR)

Là PCR sử dụng nhiều cặp mồi đặc hiệu cho các đoạn DNA đích đặchiệu từ nhiều sinh vật muốn được phát hiện đồng thời Để thiết kế đượcMultiplex PCR thì quan trọng nhất là phải làm sao thiết kế được các mồi cócùng nhiệt độ bắt cặp (Ta) lên DNA đích, đồng thời các mồi này cũng khôngđược bắt cặp với nhau, và quan trọng nhất là độ nhạy phát hiện từng tác nhânđích không bị giảm mà vẫn tương đương như độ nhạy của PCR đơn mồi Tuynhiên rất khó để đạt được các điều kiện như vậy, nhất là khi muốn phát hiệntrên 2 tác nhân vi sinh trực tiếp trong bệnh phẩm Do vậy, PCR đa mồi phát

hiện trên 2 tác nhân vi sinh chỉ có thể áp dụng để phát hiện nhiều tác nhân vi

sinh cùng một lúc trong các môi trường nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn vìlượng DNA của vi khuẩn đích nếu có mặt sẽ hiện diện khá nhiều trong cácmôi trường tăng sinh này [14]

1.2.4 Nguyên tắc của PCR

Về mặt nguyên tắc, một chu kỳ nhiệt độ sẽ bao gồm 3 giai đoạn nhiệt

độ (1) Đầu tiên nhiệt độ sẽ được đưa lên 94oC, ở nhiệt độ này các liên kếthydro của mạch đôi DNA sẽ bị mất đi, nhờ vậy DNA đích bị biến tính thành

các mạch đơn; giai đoạn nhiệt độ này được gọi là giai đoạn biến tính (2) Kế

đó nhiệt độ sẽ được hạ đến 55oC-65oC là nhiệt độ thích hợp để các đoạn mồitìm đến bắt cặp bổ sung vào hai đầu của đoạn DNA đích, giai đoạn nhiệt độ

này được gọi là giai đoạn bắt cặp (3) Cuối cùng, nhiệt độ được đưa lên 72oC

là nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính của enzyme Taq polymerase để kéo các

dNTP lại đầu 3’ của đoạn mồi đang bắt cặp trên đầu 5’ của sợi DNA đích đểbắt nguồn cho sự tổng hợp nên mạch bổ sung Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt,một DNA đích đã được nhân bản thành hai bản sao; và nếu chu kỳ này đượclặp đi lặp lại liên tục 30 đến 40 lần thì từ một DNA đích đã nhân bản đượcthành 230 đến 240 bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao [14]

1.2.5 Kỹ thuật tiến hành

Sử dụng bệnh phẩm dịch tỵ hầu hoặc nội khí quản, lấy vào ống vôtrùng falcon 15ml

Bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm

Bệnh phẩm được chuyển tới khoa xét nghiệm sớm nhất trong giờ hànhchính, hoặc bảo quản trong tủ 4ºC tại khoa lâm sàng trong khi chờ chuyển tớikhoa xét nghiệm Thời gian chờ không quá 48 giờ

Quy trình tách chiết mẫu bệnh phẩm

Tiền xử lý mẫu bệnh phẩm

- Quá trình xử lý mẫu phải được thực hiện trong tủ an toàn sinh họctránh hiện tượng lây nhiễm chéo và đảm bảo sự an toàn cho môi trường cũngnhư cán bộ xử lý mẫu

- Các mẫu được cấp mã, đánh số và được lưu vào ống ly tâm vô trùng1,5 ml

Tách chiết bệnh phẩm bằng hệ thống tách chiết tự động

Chuẩn bị phản ứng Realtime PCR

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm

3 bước sau:

Bước 1: biến tính tách đôi sợi DNA

Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảycủa phân tử ( 94 - 95ºC) trong vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNAmạch kép tách thành 2 mạch đơn Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạchkhuôn cho sự tổng hợp 2 mạch bổ sung mới

Bước 2: bắt cặp

Trong bước này nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của cácPrimer (Tm), cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn Trong thựcnghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 55 – 65ºC Tùy thuộc vào Tmcủa các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây

Bước 3: kéo dài

Nhiệt độ tặng lên 72ºC giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất.Dưới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lượt được gắn vàoprimer theo nguyên tắc bổ sung vào mạch khuôn Thời gian của giai đoạn nàytùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giâyđến vài phút Sự khuếch đại này có thể được tính như sau:

Tổng lượng DNA khuếch đại = m * 2n

m: là số bản sao của chuỗi mã hóan: là số chu kỳ

Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân bản thành 2bản sao, và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 đến 40 lần thì từ mộtDNA đích đã nhân bản thành 230 đến 240 bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao.

Đọc hiểu kết quả

Chất phát

huỳnh quang

Phân tích Biểu đồ 1(tác nhân) Biểu đồ 2 (tác nhân)

FAM Streptococcus pneumoniae

(SP) Legionella pneumophila (LP)HEX Haemophilus influenzae

(HI)

Bordetella parapertussis

(BPP)Cal Red 610 Mycoplasma pneumoniae

(MP) Bordetella pertussis (BP)Quasar 670 IC (Internal Control) Chlamydophila

pneumoniae(CP)

- Các kết quả là dương tính nếu giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct)=<42

- Các kết quả là âm tính nếu giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct)>42

1.3 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI

Nghiên cứu trong nước:

Năm 2000, tác giả Đỗ Thị Thanh Xuân trong “ Nghiên cứu đặc điểmlâm sàng và điều trị viêm phổi do vi khuẩn kháng kháng sinh ở trẻ em ” đãnghiên cứu trên 558 bệnh nhi viêm phổi tại bệnh viện Bạch Mai , kết quả S.pneumoniae và H influenzae vẫn là những vi khuẩn chủ yếu gây bệnh với tỷ

lệ 26,7% và 11,6% M.catarrhalis, S.aureus và các vi khuẩn Gram âm khácchiếm tỷ lệ ít hơn [15]

Năm 2017, tác giả Phạm Hùng Vân nghiên cứu : “ Tác nhân vi sinh vậtgây viêm phổi cộng đồng phải nhập viện” , multiplex real-time PCR cho tỷ lệphát hiện được vi sinh vaatjgaay bệnh là 69% cao hơn một cách có ý nghĩa sovới phương pháp nuôi cấy là 45% trong đó S pneumoniae và H influenzae là

có tỷ lệ cao nhất (41.3% và 22.2%), kế đến đó là K pneumoniae (11.4%), A.baumannii (10.7%), E coli (6.6%) và P aeruginosa (6.3%), ngoài ra còn cócác tác nhân khác được phát hiện với tỷ lệ thấp hơn [16]

Năm 2019, tác giả Đào Thị Mỹ Hà nghiên cứu “ Viêm phổi cộng đồng

và viêm phổi liên quan đến chăm sóc y tế do các tác nhân vi sinh vật phát hiệnbằng real – time PCR đờm” cho thấy : Tỉ lệ phát hiện các tác nhân bằng phươngpháp cấy đàm định lượng là 28.8%, bằng phương pháp Real-time PCR đàm là57.5% Ở nhóm có điều trị kháng sinh tuyến trước, tỷ lệ phát hiện tác nhân gâybệnh của Real-time PCR đàm gấp 2 lần cấy đàm (53.8% với 25.6%)(p<0.05) Real-Time PCR đàm phát hiện được các tác nhân S.pneumonia(16.4%), Haemophilus influenza (9.6%), Moraxella catarrhalis (1.4%) trong khicấy đàm không phát hiện được [17]

Nghiên cứu trên thế giới.

Năm 2015, tác giả Mathew JL đã nghiên cứu trên 2345 trẻ bị CAP ở

Ấn Độ cho thấy trong nuối cấy dịch tỵ hầu vi khuẩn Streptococcus pneumoniachiếm 79,1%, tiếp đến là Haemophilus influenza chiếm 9,6%.[18]

Ở Trung Quốc, một nghiên cứu của tác giả NING GJ và cộng sự về cănnguyên gây viêm phổi cộng đồng ở trẻ em dưới 5 tuổi đã chỉ ra căn nguyênhay gặp nhất là Klebsiella pneumoniae (5.4%), Streptococcus pneumoniae(5.2%), Escherichia coli (5.2%), Staphylococcus aureus (3.9%), Haemophilusinfluenza (3.6%) and Haemophilus parainfluenzae (3.3%).[19]

Tại Malaysia, nghiên cứu của tác giả Mustafa ML năm 2011 về cănnguyên vi sinh vật gây viêm phổi cộng đồng ở người lớn thấy khả năng pháthiện được vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm là 39,1% với các phương pháp xétnghiệm thông thường và tăng lên 65,2% với xét nghiệm real – time PCR.[20]

Theo tác giả Shelly Bolotin, khi nghiên cứu về mối tương quan giữa chu kỳngưỡng ( Ct: cycle threshold: là chu kỳ nhiệt mà ở thời điểm đó thiết bị realtimePCR ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng bắt đầu vượtquá cường độ huỳnh quang nền) và mức độ bệnh ho gà đã cho thấy giá trị Ct < 36được báo cáo là dương tính, Ct >=36 và Ct <40 là không xác định [21]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Gồm tất cả trẻ từ 2 tháng đến 5 tuổi được chẩn đoán viêm phổi mắc phảitại cộng đồng vào điều trị tại khoa Quốc tế từ tháng 6 năm 2019 đến tháng 12năm 2019

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn

- Trẻ từ 02 tháng đến 5 tuổi được chẩn đoán viêm phổi cộng đồng

Theo WHO viêm phổi cộng đồng là viêm phổi ngoài cộng đồng hoặc trong vòng 48h đầu sau nhập viện, tiêu chuẩn chẩn đoán viêm phổi chủ yếu dựa vào lâm sàng, bao gồm :

+ Nhịp thở nhanh: là dấu hiệu chính (bắt buộc đếm nhịp thở trong 1 phút

và đánh giá theo tuổi)

Chẩn đoán mức độ nặng của VP:

- Viêm phổi không nặng: ho hoặc khó thở kèm theo thở nhanh theo

tuổi, nhưng không có dấu hiệu của VP nặng và rất nặng

- Viêm phổi nặng: ho hoặc khó thở kèm theo ít nhất một triệu chứng

sau: rút lõm lồng ngực, phập phồng cánh mũi hoặc thở rên ở trẻ dưới 2 thángtuổi, nhưng không có dấu hiệu nguy hiểm toàn thân

- Viêm phổi rất nặng: triệu chứng chính là ho hoặc khó thở, kèm theo

ít nhất một trong các dấu hiệu sau:

+ Tím tái trung tâm hoặc SpO2 < 90%

+ Không uống được hoặc bỏ bú hoặc nôn ra tất cả mọi thứ

+ Trẻ co giật

+ Li bì khó đánh thức hoặc hôn mê

+ Suy dinh dưỡng nặng

Cận lâm sàng:

X - quang phổi: Tại các cơ sở có máy đây là bằng chứng khách quanchuẩn đoán viêm phổi Tuy nhiên, trong 2 – 3 ngày đầu của bệnh X quangphổi có thể bình thường Hình ảnh viêm phổi điển hình là đám mờ ở nhu môphổi danh giới không rõ một hoặc hai bên phổi

Xét nghiệm công thức máu và CRP: Bạch cầu máu ngoại vi (đặc biệt là

tỷ lệ đa nhân trung tính) và CRP máu thường tăng cao khi viêm phổi do vikhuẩn, bình thường nếu do virus hoặc vi khuẩn không điển hình

- Bệnh nhân đồng ý và ký Bản thoả thuận tham gia nghiên cứu

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

- Loại trừ những bệnh nhân được chẩn đoán là viêm phổi bệnh viện,viêm phổi liên quan đến chăm sóc y tế

- Những bệnh nhân đủ tiêu chuẩn tham gia nghiên cứu nhưng gia đìnhkhông đồng ý tham gia