Thực hành nuôi cấy mô thực vật pdf

BÀI I PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 1 - NGUYÊN TẮC 1.1 - Nguyên tắc pha chế môi trường Môi trường nuôi cấy mô thực vật khác với các loại môi trường nuôi cấy vi

MỤC LỤC

Bài 1 Phương pháp pha chế môi trường nuôi cấy mô thực vật 2

Bài 2 Phương pháp khử trùng mô thực vật 7

Bài 3 Khử trùng nuôi cấy chồi ngủ cúc và hạt cam 11

Bài 4 Vi nhân giống dứa bằng nuôi cấy chồi ngủ 16

Bài 5 Phương pháp nuôi cấy tạo mô sẹo ở thực vật 19

Bài 6 Kỹ thuật tạo áo bao hạt giống nhân tạo 24

Bài 7 Phương pháp tách và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 28

Bài 8 Phương pháp vi ghép ở thực vật 33

Bài 9 Phương pháp thuần hoá cây ra vườn ươm 37

Bài 10 Kỹ thuật thủy canh cây trồng 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

BÀI I

PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG

NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

1 - NGUYÊN TẮC

1.1 - Nguyên tắc pha chế môi trường

Môi trường nuôi cấy mô thực vật khác với các loại môi trường nuôi cấy vi sinh là

có thành phần rất phức tạp, sự hiện diện của rất nhiều loại hoá chất với hàm lượng rất

nhỏ Do vậy, để thuận tiện cho việc pha các môi trường nuôi cấy (môi trường làm việc),

người ta không cân hoá chất mỗi lần pha môi trường mà chuẩn bị trước dưới dạng nhiều

loại dung dịch với độ đậm đặc từ X10 – X100, chỉ cần pha với nước cất hai lần hay nước

vô khoáng khi sử dụng Các dung dịch này gọi là dung dịch mẹ (stock) Dung dịch mẹ

được bảo quản dài ngày trong tủ lạnh thường hoặc tủ lạnh sâu Thông thường pha các

dung dịch mẹ: stock đa lượng, stock vi lượng, Fe – EDTA, stock vitamin, stock chất sinh

trưởng, và các stock cần thiết khác

1.2 - Phân loại môi trường nuôi cấy mô thực vật

Tùy theo thành phần các chất có trong môi trường, có thể phân thành 3 loại môi

trường:

- Môi trường nghèo chất dinh dưỡng: như môi trường White, Knop Môi trường này

thích hợp vào các giai đoạn cuối của quy trình nuôi cấy mô thực vật khi chuẩn bị chuyển

cây từ ống nghiệm ra vườn ươm Môi trường nghèo chất dinh dưỡng cũng có thể sử dụng

trong các sinh trắc nghiệm để kiểm tra đặc tính biến dưỡng của mô thực vật

- Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: môi trường B5, Gamborg

Loại môi trường này được sử dụng đối với một số loại cây có nhu cầu các chất dinh

dưỡng trong môi trường vừa phải hoặc cũng có thể sử dụng khi nuôi cấy mô thực vật dài

ngày

- Môi trường giàu chất dinh dường: môi trường MS (Murashige – Skoog) Đây là

môi trường khởi đầu cho mọi quá trình nuôi cấy mô đối với mọi đối tượng nuôi cấy Môi

trường MS là một môi trường thích hợp với nhiều loại cây, do giàu và cân bằng về chất

2.2 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành

STT Tên dụng cụ, thiết bị Đơn vị

tính

Số lƣợng Ghi chú

3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH

Học sinh chia nhóm thực hành pha chế các dung dịch mẹ (stock) của môi trường

MS (Murashige – Skoog) như sau: dung dịch mẹ khoáng đa lượng (Skoog I), dung dịch

mẹ Fe – EDTA (Skoog II), dung dịch mẹ khoáng vi lượng (Skoog III), dung dịch mẹ chất điều hoà sinh trưởng

4 - THỰC HÀNH PHA CHẾ CÁC DUNG DỊCH MẸ (Stock) MÔI TRƯỜNG MS (Murashige – Skoog)

4.1 Pha stock khoáng đa lượng môi trường MS nồng độ đậm đặc 20 lần (x20)

Cân chính xác bằng cân phân tích các muối khoáng đa lượng Dùng ống đong, đong khoảng 400 ml nước cất hai lần vào becher 1000 ml Cho lần lượt các muối đa lượng vào

Mỗi lần cho một loại khoáng vào phải khuấy tan hoàn toàn và bổ sung thêm

100 ml nước cất hai lần trước khi bổ sung các khoáng khác vào (phương pháp pha thể tích tăng dần) Do CaCl2.2H2O có thể phản ứng tạo kết tủa với MgSO4.7H2O nên hai chất này phải pha tách rời nhau theo đúng trình tự ở trên, cho CaCl2.2H2O vào sau cùng

Cho tất cả vào bình định, dùng nước cất hai lần chuẩn lại cho đúng 1000

ml Như vậy ta có 1000 ml dung dịch mẹ khoáng đa lượng đậm đặc 20 lần Dung dịch này được bảo quả để dùng dần trong chai màu ở nhiệt độ 4 ÷ 10oC, dùng 50 ml cho một

1000 ml môi trường nuôi cấy

4.2 Pha stock khoáng vi lượng nồng độ đậm đặc 1000 lần (x1000)

Do hàm lượng một số loại khoáng vi lượng trong stock khoáng vi lượng rất nhỏ, khó có thể cân đong chính xác như một số các khoáng vi lượng khác Vì vậy ở đây,

ta phải tiến hành pha riêng dung dịch các khoáng này (CuSO4.5H2O, CoCl2.6H2O) có nồng độ đậm đặc hơn 100 lần so với dung dịch mẹ và gọi là dung dịch “bà ngoại”

Sau khi pha song các dung dịch “bà ngoại”, tiến hành pha 100 ml stock khoáng vi lượng X1000 tương tự như ở phần trên Thành phần các khoáng như sau:

Tên hoá chất trường nuôi cấy Nồng độ môi

(mg/lít)

Nồng độ dung dịch stock (x1000) (mg/lít)

Nồng độ dung dịch

“bà ngoại “(x100) (mg/lít)

CuSO4.5H2O 0,025 25 2500

4.3 Pha dung dịch mẹ Fe-EDTA nồng độ đậm đặc 200 lần (x200)

Sắt là yếu tố rất cần thiết cho thực vật Tuy nhiên, nhu cầu của thực vật đối với sắt rất nhỏ và lượng liên tục Vì vậy, để cung cấp đủ lượng sắt cho thực vật ta thường dùng sắt dưới dạng hợp chất Fe-DETA Hợp chất Fe-EDTA được hình thành do sự ngậm

Fe của EDTA dưới tác dụng của nhiệt độ Ở dưới dạng hợp chất này, sắt sẽ được phóng thích ra môi trường tuỳ theo nhu cầu của thực vật Phương pháp pha như sau:

Tên hoá chất Nồng độ môi trường nuôi cấy (mg/lít) Nồng độ dung dịch stock

Cho từ từ dung dịch FeSO4.7H2O vào dung dịch Na2 EDTA, vừa đổ vừa khuấy đều Cuối cùng bổ sung nước cho đủ 1000 ml Như vậy, ta có 1000 ml dung dịch stock Fe-EDTA đậm đặc 200 lần có màu vàng nhạt, trong suốt Dung dịch này được bảo quả để dùng dần trong chai màu ở nhiệt độ 4 ÷ 10oC, dùng 5ml cho một 1000 ml môi trường nuôi cấy

4.4 Pha stock hormon

Các hormon khác nhau sẽ tan trong các dung môi khác nhau IAA, NAA,

BA pha trong NaOH 1N (thêm 2-3 ml NaOH 1N và lắc cho đến khi tan hết, sau đó thêm nước đến thể tích cần) GA3, 2,4-D pha trong cồn 50o

cho đủ thể tích

Để pha các chất sinh trưởng, có hai cách khác nhau:

+ Cách 1: pha theo hệ mol

Ví dụ: Pha 100 ml dung dịch stock IAA (M=176,19) có nồng độ 1 mmol (milimol) từ IAA tinh khiết

176,19 g IAA pha trong 1000 ml nước 1000 ml dung dịch có nồng độ 1 mol/lít Để pha dung dịch có nồng độ 1 mmol/lít cần 0,17619 g IAA Như vậy, muốn có

100 ml dung dịch IAA nồng độ 1 mmol/lít cần 0,017619 g IAA (MNAA: 186,2; M2,4-D: 221,04; MBA: 225,2)

+ Cách 2: pha theo hệ mg/lít: làm tương tự như cách pha khoáng

Các dung dịch stock hormon sau khi pha song được bảo quản trong các chai màu ở nhiệt độ lạnh 4-10oC

4.5 Pha stock vitamin môi trường MS nồng độ đậm đặc 500 lần (x500)

Dùng ống đong, đong 50 ml nước cất hai lần vào một becher 100 ml Bổ sung các vitamin vào theo trình tự sau:

Tên hoá chất Nồng độ môi trường

nuôi cấy (mg/lít)

Nồng độ dung dịch stock (x500) (mg/lít)

4.6 Pha môi trường làm việc (môi trường nuôi cấy)

Pha 1 lít môi trường MS cơ bản:

- Dùng ống đong, đong 500 ml nước cất hai lần vào becher

- Bổ sung 30 g đường sucrose vào, khuấy tan hoàn toàn

- Bổ sung 50 ml dung dịch stock đa lượng x20, khuấy đều

- Bổ sung 1 ml dung dịch stock vi lượng x1000, khuấy đều

- Bổ sung 5 ml dung dịch stock Fe-EDTA x200, khuấy đều

- Bổ sung 2 ml dung dịch stock vitamin x500

- Bổ sung stock hormon với lượng tùy mục đích nuôi cấy

- Chuyển tất cả dung dịch vào bình định mức, dùng nước cất chuẩn lại cho đủ

5 - BÁO CÁO THỰC HÀNH

1 Trình bày cách pha Skoog I, Skoog II và Skoog III

2 Quan sát hiện tượng phản ứng khi pha stock Fe-EDTA Giải thích

3 Từ BA tinh khiết, trình bày cách pha 100 ml stock BA có nồng độ 100 mol/lít Biết MBA =225,2

4 Cần bao nhiêu ml dung dịch stock IAA có nồng độ 150 mol/lít để pha môi trường làm việc có nồng độ IAA là 0,1 mol/lít

vô cùng quan trọng

Mô cấy có thể là hầu hết các bộ phận khác nhau của thực vật như hạt giống, phôi, noãn, đế hoa, lá, đầu rễ, thân củ… tùy theo sự tiếp xúc với môi trường bên ngoài, các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn và nấm Để chuyển mô thực vật từ môi trường tự nhiên vào môi trường nuôi cấy in vitro, mô thực vật phải trải qua giai đoạn khử trùng để loại bỏ hết các mầm vi sinh vật Tuy nhiên quá trình này phải đảm bảo là mô thực vật còn sống, có khả năng tăng trưởng, phát triển tốt

Phương pháp vô trùng mô cấy thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hóa học

có hoạt tính diệt nấm khuẩn Hiệu lực diệt nấm khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ ngách lồi lõm trên

bề mặt mô cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô cấy Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, thông thường người ta lắc mô cấy với cồn 70%, sau đó mới xử lý dung dịch diệt khuẩn

Như vậy, để có thể đạt được mục đích khử trùng (loại bỏ hết mầm vi sinh vật, mô thực vật có thể tăng trưởng, phát triển), thì việc khử trùng là phải tìm ra được ba yếu tố liên quan chặt chẽ với nhau và liên quan tới mô thực vật đem khử trùng đó là:

- Ca(OCl)2 (Caxi hypoclorid)

2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành

STT Tên dụng cụ, thiết bị Đơn vị

tính

Số lƣợng Ghi chú

a Thực hiện trong phòng thí nghiệm

- Cây Trầu bà được cắt thành những đoạn nhỏ 30cm Rửa các đoạn này dưới vòi nước máy cho sạch bụi đất

- Cắt thành những đoạn Trầu bà này thành những đốt khoảng 3cm, mỗi đốt mang một chồi ngủ Cắt bỏ lá, rễ

- Rửa các đốt với nước có pha một ít xà phòng trong các erlen

- Rửa lại bằng nước máy nhiều lần cho sạch xà phòng

b Thực hiện trong tủ cấy

- Lắc các đốt thân với cồn 70o trong 1 phút

- Chiết bỏ cồn Ngâm các mẫu trong dung dịch Caxi hypoclorid 10% trong 10 phút (hay dung dịch javel được pha loãng với tỷ lệ 1:9 trong 5 phút)

- Rửa sạch dung dịch khử trùng bằng nước cất vô trùng 5-6 lần

- Gạn bỏ nước

Hình Tủ cấy mô thực vật 4.2 - Khử trùng hạt thuốc lá

- Thực hiện trong phòng thí nghiệm, rửa hạt thuốc lá dưới vòi nước máy

- Lắc hạt với nước có pha một ít xà phòng

- Rửa lại nhiều lần bằng nước máy cho sạch xà phòng

- Thực hiện trong tủ cấy, lắc hạt với cồn 70o trong 1 phút

- Chiết bỏ cồn, ngâm hạt trong dung dịch Caxi hypoclorid 10% trong 5 phút

- Rửa sạch dung dịch khử trùng bằng nước cất vô trùng 5-6 lần

- Gạn bỏ nước

4.3 - Cách cấy mẫu

a Mẫu cây Trầu bà

- Trong tủ cấy vô trùng, những đốt cây Trầu bà đã khử trùng, được đặt trên giấy cấy

- Các erlen được đặt ở nơi tối hoàn toàn

5 - BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH

1 Trình bày phương pháp khử trùng đốt thân Trầu bà, hạt thuốc lá

2 Vai trò và tác dụng của tác nhân khử trùng cồn, canxi hypoclorid

3 Ghi nhận kết quả nuôi cấy

BÀI 3

KHỬ TRÙNG, NUÔI CẤY CHỒI NGỦ CÚC

HẠT CAM

1 - NGUYÊN TẮC

Trong các phương pháp nhân giống vô tính in vitro cây trồng, bên cạnh những

phương pháp đòi hỏi người làm việc phải có kỹ thuật cao như tách và nuôi cấy đỉnh sinh

trưởng, vi ghép…, phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy chồi ngủ (chồi nách) là

phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và mang lại hiệu quả cao nhất

Ở đa số các loài thực vật, mỗi nách lá đều mang một chồi ngủ Các chồi ngủ này có

đặc tính hoàn toàn giống với các đỉnh sinh trưởng (là một đỉnh sinh trưởng ở trạng thái

tiềm sinh), có khả năng tăng trưởng phát triển thành một cơ thể thực vật toàn vẹn Các

chồi ngủ này đa số bị ức chế sự phát triển bởi các chồi đỉnh (tính ưu thế ngọn) Nếu tách

riêng một đoạn thân có mang chồi nách này ra khỏi cơ thể thực vật, dưới tác động bởi

những yếu tố kích thích sinh trưởng ngoại sinh như cytokinin, auxin thì từ một chồi nách

này có thể cho ra một cụm chồi với rất nhiều chồi mới (từ hàng chục tới hàng trăm chồi)

Với những chồi mới tạo thành, tiếp tục cấy chuyền sang những môi trường tạo chồi mới

thì hệ số nhân giống rất đáng kể

Với những loài thực vật có đỉnh sinh trưởng nhỏ (đỉnh sinh trưởng dấu hoa thị) thì

việc tách lấy đỉnh sinh trưởng rất khó thực hiện Vì vậy, với những loại thực vật này,

phương pháp nhân giống vô tính hiệu quả nhất là nuôi cấy chồi nách Chồi nách đem

nuôi cấy thường gắn liền với một đoạn thân, do đó sức sống của chồi nách thường tốt hơn

rất nhiều lần so với đỉnh sinh trưởng tách rời, hiệu quả tạo cụm chồi cũng thường tốt hơn

so với phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Việc tách chồi nách thường thực hiện với những đoạn nhánh có mang chồi của thực

vật Những đoạn nhánh này được khử trùng trước khi cắt nhỏ thành những đoạn có mang

chồi nách Bên cạnh đó, việc tách chồi nách cũng có thể thực hiện từ những cây vô trùng

trong ống nghiệm được tạo ra do việc nuôi cấy hạt giống

Trong bài thực hành này, sẽ đề cập tới phương pháp nhân giống vô tính thực vật qua

nuôi cấy chồi nách và tạo nguồn cây cho phương pháp nuôi cấy chồi nách từ hạt giống

- NAA

- BA

2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành

STT Tên dụng cụ, thiết bị Đơn vị

tính

Số lƣợng Ghi chú

- Lựa cây cúc còn tươi, non, lá ít bị dập Dùng dao cắt bỏ hoa và gốc Cắt lấy một đoạn cách gốc 1015 cm

- Rửa sạch đoạn thân cúc dưới vòi nước máy

- Cắt thành những đoạn nhỏ Cắt ở giữa hai chồi ngủ Mỗi đoạn có một chồi ngủ

- Lắc các đoạn trong nước xà phòng từ 1015 phút

- Rửa sạch xà phòng dưới vòi nước máy

- Lắc với cồn 70o trong 1 phút

- Lắc với dung dịch javel/nước ở các tỷ lệ 1/9, 2/8, 3/7, 4/6, 1/1

- Rửa sạch javel bằng nước cất vô trùng 56 lần

b Nuôi cấy

- Thân cúc sau khi khử trùng được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BA và NAA với tỷ lệ NAA/BA <1

- Cắm thân cúc vào môi trường sao cho chồi ngủ vẫn nằm trên bề mặt môi trường

Hình Quy trình nuôi cấy chồi ngủ

Hình Các bước phát triển của chồi ngủ nuôi cấy 4.2 - Khử trùng và nuôi cấy hạt cam

a Khử trùng hạt

- Rửa hạt cam dưới vòi nước máy

- Lắc hạt với nước xà phòng 1015 phút

- Rửa sạch xà phòng bằng nước máy

- Lắc với cồn 70o trong 30 giây

- Rửa sạch cồn bằng nước cất vô trùng 56 lần

b Tách vỏ hạt

- Đặt hạt cam lên trên giấy cấy Dùng kẹp giữ hạt

- Dùng dao mổ cắt hai đường dọc theo chiều dài hạt Hai đường này đối diện nhau Lưỡi dao chỉ vừa đủ cắt rách lớp vỏ, không chạm vào phần thịt hạt

- Dùng dao và kẹp tách bỏ lớp vỏ cứng (vỏ trấu) và vỏ lụa bên ngoài

- Hạt cam là hạt đa phôi, khi tách các phôi có thể tách rời nhau Ta vẫn có thể dùng những mảnh phôi để nuôi cấy, mỗi mảnh phôi sẽ phát triển thành một cây cam

c Nuôi cấy

- Đặt ngang hạt cam trên môi trường MS

- Dùng kẹp đè nhẹ hạt lên bề mặt môi trường sao cho ½ hạt nhập vào môi trường

- Đặt bình nuôi cấy trong điều kiện ánh sáng 2000 lux, nhiệt độ 25oC

5 - BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH

1 Phương pháp lựa chọn công thức khử trùng

2 Tại sao phải tách vỏ ngoài (vỏ trấu), vỏ lụa hạt cam trước khi nuôi cấy?

3 Nếu để bình nuôi cấy hạt cam trong điều kiện không có ánh sáng, phôi có nảy mầm phát triển được không? Giải thích?

Trước nhu cầu của việc mở rộng sản xuất, trong một số năm gần nay để nhân giống dứa thường tiến hành bằng nuôi cấy chồi ngủ (phương pháp nhân cụm chồi) Ưu điểm của phương pháp này là tốc độ nhân giống cao, hệ số nhân giống lớn

Đặc điểm của phương pháp này là chồi ngủ được tách từ cụm chồi ngủ ở ngọn dứa, sau đó được nuôi cấy tạo cụm chồi trên môi trường in vitro Các chồi có hình dạng giống như vảy cá hoặc hạt gạo nằm ép sát vào thân (lõi), có màu trắng Mỗi chồi được tách riêng để nuôi cấy để tạo thành cụm chồi

2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành

STT Tên dụng cụ, thiết bị Đơn vị

tính

Số lƣợng Ghi chú

STT Tên dụng cụ, thiết bị Đơn vị

tính

Số lượng Ghi chú

- Học sinh tiến hành tách bỏ lá ở các ngọn dứa để thu chồi ngủ

- Các chồi ngủ được tách rời, nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung NAA và BA

4 - THỰC HÀNH

4.1 - Phương pháp khử trùng chồi ngủ dứa

- Tách bỏ toàn bộ các lá ở phần ngọn dứa Tách lần lượt các lá từ dưới lên trên, từ ngoài vào trong để trách làm tổn thương các chồi ngủ

- Tách rời phần cùi (lõi) có mang chồi ngủ

- Rửa nhẹ nhàng cùi dứa dưới vòi nước máy, tránh làm tổ thương các chồi ngủ

- Dùng dao cắt lấy bốn mặt của cùi dứa có mang chồi ngủ

- Lắc nhẹ nhàng các mảnh có mang chồi ngủ này trong nước xà phòng trong 10 phút

- Rửa sạch nước xà phòng dưới vòi nước máy

- Lắc các mảnh mô dứa trong cồn 700 trong 2 phút

- Khử trùng với nước javel (tỷ lệ 3:7) trong 7 phút

- Rửa sạch lại bằng nước cất vô trùng 5÷6 lần

Hình 1 Cắt các mặt có mang chồi ngủ từ cùi dứa 4.2 - Phương pháp nuôi cấy

- Dùng dao mổ cắt những đường dọc, ngang tách rời từng chồi ngủ muốn lấy

- Cắt vát 4 cạnh dưới của miếng mô dứa có mang chồi ngủ tạo thành hình tháp

- Cắm phần đầu hình tháp ngập vào môi trường nuôi cấy

- Đặt các bình nuôi cấy trong điều kiện ánh sáng 3000 lux, ở nhiệt độ 25oC

4.3 - Phương pháp tạo cụm chồi

Sau thời gian nuôi cấy từ 20-30 ngày các chồi được cấy chuyền sang môi trường nuôi cấy để tạo cụm chồi Môi trường nuôi cấy có nồng độ chất điều hoà sinh trưởng NAA 1mg/lít, BA 0,1mg/lít Sau 30-40 ngày, các chồi nhỏ xuất hiện ở phía gốc chồi Số lượng các chồi nhỏ tăng dần lên, sắp xếp chồng chất lên nhau thành một cụm chồi (thường là sau 3-4 tháng nuôi cấy) Các chồi nhỏ được tách và chuyển sang môi trường tái sinh cây hoàn chỉnh Điều kiện nuôi cấy để tạo cụm chồi dứa: cường độ ánh sáng 4000 lux, thời gian chiếu sáng 10-14 giờ/ngày, nhiệt độ 25-270C

Hình 2 Cách cắt rời chồi ngủ dứa

5 - BÀI TƯỜNG TRÌNH

1 Trình bày những điểm cần lưu ý khi tách chồi ngủ dứa

2 Trình bày quy trình nhân giống dứa bằng chồi ngủ

3 Tại sao phải cắt vát 4 cạnh dưới của miếng mô dứa có mang chồi ngủ?

Mô sẹo là một khối tế bào nhu mô phát triển vô tổ chức, hiện diện trong các giai đoạn hoá lignin khác nhau của thực vật, thường do các tế bào trong vùng tượng tầng (vùng phân sinh) như tượng tầng liber –mộc, tượng tầng vỏ ở gốc của đoạn cắt tạo thành Những tế bào mô sẹo thường có hình cầu, màu trắng hoặc nâu nhạt Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích sinh trưởng tạo mô sẹo

Nuôi cấy tạo mô sẹo được thực hiện đối với các loài thực vật không có khả năng nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Những mô của thực vật có thể dùng nuôi cấy tạo mô sẹo là: tượng tầng libe mộc, tượng tầng vỏ, phôi nhũ, tế bào diệp nhục,

lá, trụ bì rễ, tử diệp… Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ Từ một cụm

tế bào mô sẹo có thể tái sinh cho cùng một lúc cho nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

A B Hình 3 Sự tái sinh chồi từ mô sẹo A: Mô sẹo, B: Chồi tái sinh

Mô sẹo thường được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan, nhất là trong sự tạo rễ Do đó, cây non hay những mảnh thân non của cây trưởng thành dễ tạo mô sẹo Ngược lại, những mảnh cơ quan trưởng thành không có khả năng tạo mô sẹo Sự tạo

mô sẹo ở thực vật xảy ra khi môi trường nuôi cấy được bổ sung một lượng auxin (2,4-D) thích hợp

Sự tạo mô sẹo do tác dụng của auxin do 3 quá trình:

- Sự phản phân hoá của tế bào nhu mô: xảy ra ở các tế bào nhu mô mộc và libe, nhu

mô vỏ hay lõi

- Sự phân chia của các tế bào tượng tầng: các tế bào bào tượng tầng của phần lớn cây hai lá mầm dễ dàng phân chia dưới tác động của auxin

- Sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ)

2 - VẬT LIỆU – HOÁ CHẤT – DỤNG CỤ

2.1 - Vật liệu

Hạt thuốc lá (Nicotiana tabacum) được gieo trên môi trường MS Sử dụng các cây

con làm vật liệu thí nghiệm

2.2 - Hoá chất

- Cồn 70o, 90o

- Môi trường MS bổ sung 2,4 - D

2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành

STT Tên dụng cụ, thiết bị Đơn vị

tính

Số lƣợng Ghi chú

4.1 - Vật liệu nuôi cấy

a Mô cấy từ cây thuốc lá tạo ra qua nuôi cấy hạt

- Tiến hành khử trùng hạt thuốc lá

- Nuôi cấy hạt thuốc lá trong môi trường MS

- Bình nuôi cấy được đặc trong điều kiện tối, nhiệt độ 250C cho nảy mầm

- Cây con được nuôi cấy trong điều kiện có ánh sáng

- Sau 15-20 ngày nuôi cấy, khi cây có từ 6-8 lá, cao khoảng 10-15cm, có thể sử dụng là nguyên liệu cho nuôi cấy mô sẹo

b Mô cấy từ cây thuốc lá mọc ngoài tự nhiên

Cây thuốc lá mọc ngoài tự nhiên có sức tăng trưởng mạnh, khả năng hình thành mô sẹo rất lớn Những mô đặt cấy lấy từ cây thuốc lá mọc ngoài tự nhiên phải trải qua giai đoạn vô trùng mẫu để loại bỏ hết nấm, khuẩn tồn tại trong và trên mẫu cấy

4.2 - Chuẩn bị mẫu cấy

a Cắt đốt thân

- Dùng kẹp gắp một cây thuốc lá trong bình nuôi cấy đặt lên giấy cấy

- Dùng dao mổ cắt rời tất cả lá, rễ ra khỏi thân

- Cắt thân thuốc lá thành những đoạn nhỏ, mỗi đoạn là một đốt thân Từ các đốt này, tiếp tục chia nhỏ thành các đoạn, mỗi đoạn có kích thước khoảng 0,2 – 0,4 cm Các đoạn nhỏ này được nuôi cấy tạo mô sẹo

- Điều lưu ý khi cắt các đoạn thân là phải bỏ tất cả các phần mắt của đốt Các phần này không có khả năng tạo sẹo, chỉ có thể được sử dụng để nuôi cấy tạo chồi

b Cắt mảnh lá

- Từ các lá ở phần trên, sử dụng dao mổ cắt bỏ gân chính và rìa lá

- Các phần lá này được cắt thành các mảnh nhỏ có kích thước 0,2 x 1 cm

- Các mảnh lá này được nuôi cấy tạo mô sẹo

Hình 4 Phương pháp cắt mảnh lá (A), đốt thân (B), đoạn rễ (C) 4.3 - Nuôi cấy tạo mô sẹo

a Nuôi cấy thân, lá

- Dùng kẹp gắp các đoạn thân mảnh lá cấy trên môi trường MS bổ sung 2,4-D

- Khoảng cách giữa các đoạn thân, mảnh lá là 1cm Tránh cấy quá dày

- Sử dụng môi trường MS bổ sung 2,4-D có nồng độ là 1µmol/lít môi trường

b Nuôi cấy đoạn rễ

- Các đoạn rễ được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 2,4-D có nồng độ 0,1 µmol/lít môi trường

Những khối mô sẹo hình thành qua quá trình nuôi cấy có thể được tách ra và chuyển sang nuôi cấy có nồng độ 2,4-D giảm (0,05µmol/lít môi trường) để tiếp tục phân chia tạo thành những khối mô sẹo mới Thời gian cấy chuyền giữa các lần nuôi cấy là 4-6 tuần Khối mô sẹo cũng có thể được cho tái sinh thành cây nếu môi trường nuôi cấy loại bỏ 2,4-D và bổ sung BA vào

A

B

C

Hình Các giai đoạn nhân giống cây từ tái sinh mô sẹo A.Cảm ứng tạo sẹo, B.Mô sẹo tăng sinh, C Tái sinh chồi từ mô sẹo, D Cây hoàn chỉnh tái sinh từ mô sẹo

5 BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH

1 Khái niệm mô sẹo? Nguyên nhân của việc hình thành mô sẹo ở thực vật?

2 Vai trò của auxin đối với việc hình thành mô sẹo ở thực vật Nồng độ thích hợp nhất kích thích tạo mô sẹo từ thân, lá, rễ cây thuốc lá

3 Phương pháp cắt đốt thân, đoạn rễ, mảnh lá để tạo mô sẹo ở cây thuốc lá