Báo cáo đồ án tốt nghiệp Viện Pasteur

Những nghiên cứu khoa học của viện rất đa dạng, ngoài nhữngnghiên cứu về vi trùng, siêu vi trùng, kí sinh trùng, giải phẩu bệnh, dịch tễ học, cácxét nghiệm sinh hóa, vi sinh, vệ sinh nướ

PHẦN 1 GIỚI THIỆU CƠ SỞ THỰC TẬP 1.1 Giới thiệu

Viện Pasteur Sài Gòn, Viện Pasteur ngoài Pháp đầu tiên trên thế giới và nay làViện Pasteur TP Hồ Chí Minh, đã được thành lập năm 1981, theo ý tưởng của nhàkhoa học Louis Pasteur Trải qua bao biến cố thăng trầm của lịch sử, bao nhiêu thế

hệ đã đi qua đã cống hiến để xây dựng và phát triển nhằm phát huy truyền thốngkhoa học của Pasteur Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh hoạt động theo quan điểm yhọc dự phòng, với các biện pháp chủ động phòng ngừa là phương cách hiệu quảnhất và ít tốt kém nhất để khống chế bệnh tật và bảo vệ sức khỏe cho một cộngđồng

Ngày nay, dưới sự quan tâm của Đảng, chính phủ và sự chỉ đạo trực tiếp của Bộ

Y Tế, sự hợp tác chặt chẽ và hiệu quả của các cơ quan chức năng, hệ thống y tế cáccấp và sự hợp tác quốc tế đa phương, toàn diện, Viện Pasteur đã trở thành một đơn

vị y tế dự phòng đầu tiên của cả nước áp dụng khoa học kỹ thuật vào hoạt động dịch

vụ của Viện bằng thực hiện dịch vụ sinh y học kỹ thuật với gần 300 xét nghiệm cácloại cho người, thực phẩm, nước, sản phẩm công nghiệp

Trong bối cảnh Việt Nam hội nhập quốc tế, phát triển nền kinh tế thị trường theođịnh hướng xã hội chủ nghĩa với nhiều yếu tố, phát triển tích cực và có cả mặt tráicủa nó, đồng thời trên thế giới cũng như ở Việt Nam đã xuất hiện các bệnh mớinguy hiểm như SARS, cúm A/H5N1, Nihpa virus,… Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh

cố gắng hoạt động theo quan điểm y học dự phòng, với các biện pháp chủ động làphương cách hiệu quả nhất và ít tốt kém nhất để khống chế bệnh tật và bảo vệ sứckhỏe cho một cộng đồng rộng lớn gồm số đông cá thể

Thời kỳ Pháp còn đô hộ

Viện Pasteur Sài Gòn là chi nhánh đầu tiên ngoài Pháp của viện Pasteur Paris.Albert Calmete, một trong những học trò của Louis Pasteur được giao nhiệm vụthành lập, tổ chức và điều hành viện đầu tiên Với không đầy 3 năm ở Sài Gòn, ông

đã khởi đầu và hoàn thành một công việc đồ sộ, vừa xây dựng cơ sở vừa cải tiến kỹthuật để làm một số xét nghiệm chẩn đoán bệnh và sản xuất được vắc xin đậu mùa,vắc xin chống bệnh dại, nghiên cứu về bệnh lý nhiệt đới, làm men rượu, sản xuấthuyết thanh chống nọc độc rắn hổ mang

Hình 1.1: Louis Pasteur (1822 - 1895)

Hình 1.2: Albert Calmette (1862 - 1993)

Năm 1939, pháp bị phát xít Đức đánh bại và chiếm đóng nên việc đầu tư từ nướcpháp, việc trao đổi chuyên gia v.v… bị hạn chế Nhưng nhờ có qui chế tự trị cao nêncác hoạt động của Pháp ở Viện Pasteur Sài Gòn vẫn được duy trì

Năm 1952, một ban điều hành hỗn hợp Pháp – Việt được thành lập Từ năm

1958, các Viện Pasteur Sài Gòn, Đà Lạt, Nha Trang hoàn toàn do người Việt Namquản lý Bs Nguyễn Văn ÁI là tổng giám đốc Việt Nam đầu tiên Tại từng Viện lại

có giám đốc riêng, Viện Pasteur Sài Gòn do Bs Lý thành Đáng làm viện trưởng, dotình hình chính sự và truyền thống Viện Pasteur mang tính tự trị cao, Viện PasteurSài Gòn tập trung nhiều vào các hoạt động labo, xét nghiệm, sản xuất một sốvăcxin, sinh phẩm để thu tiền trả lương cho nhân viên và trang trải cho các hoạtđộng của Viện Những nghiên cứu khoa học của viện rất đa dạng, ngoài nhữngnghiên cứu về vi trùng, siêu vi trùng, kí sinh trùng, giải phẩu bệnh, dịch tễ học, cácxét nghiệm sinh hóa, vi sinh, vệ sinh nước thực phẩm, độc chất học và sản xuất một

số loại văcxin, Viện còn triển khai những nghiên cứu về bệnh thú y, tầm tang, vinấm, bệnh phong, ngoài ra còn có một bộ phận do Mỹ viện trợ chuyên nghiên cứu

về dịch hạch, côn trùng và vi khuẩn đường ruột

Thời kỳ kháng chiến chống Mỹ (1954 - 1975)

Năm 1954, sau hiệp định Giơnevơ được ký kết, đất nước tạm thời chia làm haimiền, một số cán bộ y tế miền nam được tập kết ra Bắc, trong đó có một số cán bộ ởphòng sản xuất vắc xin, phần lớn cán bộ y tế Nam Bộ ở lại tiếp tục bám đất, bámdân, tiếp tục phục vụ Cách Mạng Chỉ trong một thời gian ngắn, vừa xây dựng căn

cứ, tuyển nhân viên, vừa đào tạo cán bộ chuyên môn, tiếp liệu vật tư, lo hậucần, phòng Vi Trùng Học đã sản xuất được vắc xin đậu mùa, tả, thương hàn(1964) Ngoài ra còn có một bộ phận do Mỹ viện trợ chuyên nghiên cứu về dịchhạch, côn trùng và vi khuẩn đường ruột

Thời kỳ hòa bình từ 1975 đến nay

Viện Pasteur đã có những thay đổi nổi bậc Năm 1975, do có sự hợp tác tốt củacán bộ trong viện với đoàn tiếp quản nên Viện Pasteur được tiếp quản gần nhưnguyên vẹn, bác sĩ Cao Minh Tân là viện trưởng đầu tiên từ ngày đất nước giảiphóng Tiếp theo đó là sự tiếp quản của các viện trưởng khác như GS TS Hạ BáKhiêm (viện trưởng 1985 - 2001), PGS.TS Nguyễn Thị Kim Tiến (từ 2001 - 2007),

TS Trần Ngọc Hữu (2007 - tháng 5 năm 2013) và tiến sĩ Phan Trọng Lân lãnh đạoviện từ tháng 6 năm 2013 đến nay Các vị đã góp phần đưa Viện Pasteur TP HCM

trở thành một đơn vị y tế dự phòng có vai trò quan trọng bậc nhất tại nước ta, vớiđội ngũ cán bộ nòng cốt tay nghề cao, giàu kinh nghiệm trong lĩnh vực y tế.

Qua những biến cố trong lịch sử, Viện Pasteur TP HCM đã và đang tiếp thu cáctiến bộ khoa học, kỹ thuật để phát triển trở thành trung tâm y tế chuyên sâu nhằmnâng cao chất lượng chăm sóc và bảo vệ sức khỏe nhân dân trong thời kỳ đổi mới

1.2 Chức năng và nhiệm vụ của viện Pasteur TP HCM

Viện Pasteur TP HCM với hệ thống tổ chức rõ ràng, khoa học, phân thành cácphòng ban chuyên sâu về các lĩnh vực khác nhau như Khoa Kiểm Soát phòng ngừadịch bệnh, khoa côn trùng và động vật y học, khoa vi sinh miễn dịch, khoa sản xuấtvắc xin- sinh phẩm, khoa kiểm định vắc xin và khoa xét nghiệm sinh học lâm sàngcùng với các labo đạt tiêu chuẩn chất lượng theo ISO 17025 của labo kiểm nghiệmhóa lý - vi sinh thực phẩm, vi sinh bệnh phẩm và ISO 15189 của labo xét nghiệmsinh hóa - miễn dịch - huyết học, labo HIV để đáp ứng các dịch vụ xét nghiệm, tiêmphòng, cung cấp vắc xin cho cộng đồng

Ngoài ra, viện còn đảm bảo các nhiệm vụ được giao của bộ y tế như:

- Nghiên cứu vi sinh, miễn dịch, dịch tể học, sinh học phân tử các bệnh nhiễmtrùng

- Chỉ đạo phòng chống các bệnh dịch bao gồm một số bệnh nguy hiểm (tả,thương hàn, sốt xuất huyết, dịch hạch, viêm não) và chỉ đạo thực hiện một sốchương trình mục tiêu quốc gia triển khai ở khu vực phía Nam

PHẦN 2

CƠ SỞ LÝ THUYẾT 2.1 Tổng quát về vệ sinh an toàn thực phẩm

2.1.1 Tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm hiện nay

Trong những năm gần đây, nền kinh tế nước ta chuyển sang cơ chế thị trường.Các loại thực phẩm sản xuất, chế biến trong và ngoài nước ngày càng phong phú và

đa dạng Việc sử dụng các chất phụ gia trong thực phẩm trở nên phổ biến, các loạiphẩm màu, đường hóa học đang bị lạm dụng trong pha chế nước giải khát, sản xuấtbánh kẹo, chế biến thức ăn sẵn như thịt quay, giò chả, ô mai, Nhiều loại thịt bántrên thị trường không qua kiểm duyệt thú y Tình hình sản xuất thức ăn đồ uống giả,không đảm bảo chất lượng và không theo đúng thành phần nguyên liệu cũng nhưquy trình công nghệ đã đăng ký với cơ quan quản lý, nhãn hàng và quảng cáo khôngđúng sự thật vẫn xảy ra

Ngoài ra việc sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật bao gồm thuốc trừ sâu, diệt cỏ,hóa chất kích thích tăng trưởng và thuốc bảo vệ không theo đúng quy định gây ônhiễm nguồn nước cũng như tồn dư các hóa chất này trong thực phẩm Việc bảoquản lương thực thực phẩm không đúng quy cách tạo điều kiện cho vi khuẩn vànấm mốc phát triển đã dẫn đến các vụ ngộ độc thực phẩm

Các bệnh do thực phẩm gây nên không chỉ là do các bệnh cấp tính do ngộ độcthức ăn mà còn là các bệnh mãn tính do nhiễm và tích lũy các chất độc hại từ môitrường bên ngoài vào thực phẩm, gây rối loạn chuyển hóa các chất trong cơ thể,trong đó có bệnh tim mạch và ung thư

Theo báo cáo của tổ chức Y Tế thế giới ngộ độc thức ăn còn là nguyên nhân củacác bệnh mãn tính do nhiễm và tích lũy các chất độc hại từ môi trường bên ngoàivào thực phẩm, gây rối loạn chuyển hóa các chất trong cơ thể, trong đó có bệnh timmạch và ung thư [3]

Theo báo cáo của tổ chức Y Tế thế giới đánh giá các chương trình hành độngđảm bảo chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm trên toàn cầu đã xác định đượcnguyên nhân chính gây tử vong ở trẻ em là các bệnh đường ruột, phổ biến phổ biến

là tiêu chảy Đồng thời cũng nhận thấy nguyên nhân các bệnh trên là do thực phẩm

bị nhiễm khuẩn Ở Việt Nam, theo thống kê của Bộ Y Tế, trong mười nguyên nhângây tử vong thì nguyên nhân do vi sinh vật gây bệnh đường ruột đúng thứ hai.Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới, mỗi năm Việt Nam có 8 triệu người(chiếm xấp xỉ 1/10 tổng dân số) bị ngộ độc thực phẩm hoặc ngộ độc do liên quanđến thực phẩm

Hằng năm, Việt Nam có khoảng hơn 3 triệu trường hợp nhiễm độc từ thực phẩm,gây thiệt hại hơn 200 triệu USD Đây là con số được tổ chức Y Tế thế giới (WHO)đưa ra trong một hội thảo về an toàn thực phẩm – dantri.com.vn – 18:02 15-04-2011

Theo số liệu thống kê tại Cục An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm, từ 1997 tới 2004 đã

có 2.237 vụ ngộ độc thực phẩm với 43.655 người mắc và người tử vong Nguyênnhân gây ngộ độc thực phẩm chủ yếu là do vi sinh vật ( 42,2%), sau đó là hóa chất(24,9%) và độc tố tự nhiên trong thực phẩm (25,2%), còn lại không xác định được

nguyên nhân 4 lý do chưa thể xác định được nguyên nhân các vụ ngộ độc thựcphẩm là: Lấy mẫu chậm, không lấy mẫu xác định, không có cách nào điều tra hoặccòn phải xét nghiệm…

Thông tư từ Bộ Y Tế cho biết, trong năm 2010 toàn quốc đã xảy ra 132 vụ ngộđộc thực phẩm với 4.676 người mắc 3.281 người nhập viện và có 41 trường hợp tửvong Riêng trong quý IV năm 2010, cả nước xảy ra 18 vụ ngộ độc làm 4 người tửvong do ngộ độc cá nóc tại các tỉnh Phú Yên, Bến Tre, Bình Thuận, trong đó có ba

vụ ngộ độc lớn từ 30 người trở lên Số người bị ngộ độc là 323 người với 242 ngườinhập viện So với cùng năm 2009, số người mắc giảm 189 người, số người đi việngiảm 186 người Tuy nhiên số người tử vong lại tăng thêm 2 người Số vụ ngộ độcthực phẩm có quy mô lớn (trên 30 người) giảm 3 vụ, số người mắc giảm 215 người,

số người đi viện giảm 174 người

Theo TS.Lâm Quốc Hùng – Trưởng phòng Quản lý ngộ độc thực phẩm, CụcATVSTP, trong năm 2010, hầu hết các vụ ngộ độc thực phẩm được chẩn đoán, xácđịnh nhanh nguyên nhân và xử lý kịp thời, thông tin ghi nhận nhanh chóng, chínhxác hơn Công tác quản lý ngộ độc thực phẩm đã có nhiều chuyển biến tích cực.Tuy nhiên, theo vậy TS Hùng, ngộ độc thực phẩm tại gia đình chiếm gần 60% tổng

số vụ ngộ độc thực phẩm trên cả nước, đặc biệt là ngộ độc cá nóc, điều đó cho thấycác vụ ngộ độc thực phẩm diễn ra tại khu vực hộ gia đình chưa có xu hướng giảm

Do đó người dân cần phải năng cao ý thức trong việc thực hiện an toàn vệ sinh thựcphẩm ngay chính tại bếp ăn của gia đình mình

Nếu như năm 2000, ngộ độc chủ yếu do vi sinh vật ( chiếm 70%) thì tới năm

2010, ngộ độc vi sinh vật thấp đi(<50%), ngộ độc chủ yếu do hóa chất, chiếm tớitrên 60% Riêng trong quý IV năm 2010, cả nước xảy ra 18 vụ ngộ độc thực phẩmlàm 4 người tử vong do độc tố cá nóc tại các tỉnh Phú Yên, Bến Tre, Bình Thuận,trong đó có 3 vụ ngộ độc lớn từ 30 người trở lên Xu hướng kiểm soát tốt hơnnhưng không có ý nghĩa là nguy cơ giảm đi

So với cùng kỳ năm 2009, số người mắc giảm 189 người, số người đi viện giảm

186 người Tuy nhiên số người tử vong lại tăng lên 2 người Số vụ ngộ độc thựcphẩm có quy mô lớn (trên 30 người) giảm 3 vụ, số người mắc giảm 215 người, sốngười đi viện giảm 174 người

Biểu đồ 2.1: Tỷ lệ nguyên nhân số vụ ngộ độc năm 2010

TS.Lâm Quốc Hùng – Trưởng phòng Quản Lý ngộ độc thực phẩm, Cục an toàn

vệ sinh thực phẩm – nhận xét: Các vụ ngộ độc thực phẩm được chẩn đoán, xác địnhnhanh nguyên nhân và xử lý kịp thời, thông tin ghi nhận nhanh chóng, chính xáchơn Công tác quản lý ngộ độc thực phẩm đã có nhiều chuyển biến tích cực Đặcbiệt, thời gian vừa qua, không có vụ ngộ độc nào xảy ra trong suốt thời gian diễn raĐại Lễ 1.000 năm Thăng Long – Hà Nội

Mặc dù vậy, ông Hùng cũng khuyến cáo người dân trước tình trạng ngộ độc thựcphẩm tại gia đình chiếm gần 60% tổng số vụ ngộ độc thực phẩm trên cả nước, đặcbiệt là ngộ độc cá nóc Điều đó cho thấy: Các vụ ngộ độc thực phẩm diễn ra tại khuvực hộ gia đình có xu hướng tăng, ý thức người dân chưa cao trong việc thực hiện

an toàn vệ sinh thực phẩm

Trong khi đó, theo kết quả điều tra của Cục an toàn vệ sinh thực phẩm, nhận thứccủa người dân về vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm đều được năng cao hơn từ năm2005-2008 Theo đó, nhận thức của người sản xuất thực phẩm tăng từ 47,8% lên55,7%; nhận thức của người kinh doanh thực phẩm tăng từ 38,6% lên 49,4%; nhậnthức của người sử dụng thực phẩm tăng từ 38,3% lên 48,65%

Nhờ đó, số vụ ngộ độc thực phẩm trong cả nước vẫn cao (8 triệu người/năm)nhưng đã bắt đầu đã có chiều hướng giảm Số người mắc ngộ độc thực phẩm từnăm 2005 đã giảm gần một nửa (43,34%) so với năm 1994, số ca tử vong cũnggiảm 28,17%

Các cơ sở đảm bảo ATVSTP tăng mạnh Năm 2006, cả nước chỉ có 1.106 cơ sởđạt yêu cầu Nhưng chỉ sau 2 năm, con số này đã lên tới 17.592 cơ sở

Theo báo cáo của Bộ Trưởng Bộ Y Tế Nguyễn Quốc Triệu, Trong năm 2010, tỷ

lệ người kinh doanh thực phẩm có hiểu biết đúng đắn về vệ sinh an toàn thực phẩm

đã tăng từ 65% (2008) lên 73% (2010); người tiêu dùng có hiểu biết đúng tăng từ44,4% (2009) lên 79,4% (2010) Trưởng ban chỉ đạo, Phó Thủ Tướng NguyễnThiện Nhân đánh giá sự chuyển biến trong nhận thức của người dân là một trongnhững điểm sáng của công tác vệ sinh an toàn thực phẩm

Năm 2011: Trong quý I/2011, số vụ ngộ độc thực phẩm giảm 50% và số ca tửvong giảm tới 75% so với cùng kỳ năm ngoái (2010)

Trong 3 tháng đầu năm 2011, toàn quốc xảy ra 16 vụ ngộ độc thực phẩm với 442người mắc và 5 người tử vong, trong đó có 1 vụ ngộ độc tập thể 30 người So vớicùng kỳ năm ngoái, số vụ ngộ độc giảm 10 vụ ( giảm 50%), số người mắc giảm 321người, số người tử vong giảm 11 trường hợp (giảm 75%) Theo thống kê từ Cục vệSinh an toàn thực phẩm trong 6 tháng đầu năm 2011 toàn quốc đã xảy ra 53 vụ ngộđộc thực phẩm với 1.776 nạn nhân, trong đó có 9 trường hợp tử vong Nguyên nhângây ngộ độc do vi sinh vật (17 vụ), do hóa chất (10 vụ), do độc tố tự nhiên (17 vụ)

Về lâu dài thực phẩm không những có tác động thường xuyên đối với sức khỏecủa con người mà còn ảnh hưởng đến nòi giống của dân tộc, sử dụng các thực phẩmkhông đảm bảo vệ sinh trước mắt có thể bị ngộ độc cấp tính với các triệu chứng ồ

ạt, dễ nhận thấy, nhưng vấn đề nguy hiểm hơn nữa là sự tích lũy dần các chất độchại Ở một số cơ quan trong cơ thể sau một thời gian mới phát bệnh hoặc có thể gâycác dị tật, dị dạng cho thế hệ mai sau Những ảnh hưởng đến sức khỏe đó phụ thuộcvào các tác nhân gây bệnh Ở trẻ nhỏ, người già, người ốm càng nhạy cảm với cácbệnh do thực phẩm không an toàn nên càng có nguy cơ suy dinh dưỡng và bệnh tậtnhiều hơn [7]

2.1.3 Các nguyên nhân gây bệnh ngộ độc thực phẩm

Nguyên nhân chính của việc ngộ độc thực phẩm là do ăn, uống thực phẩm đã bịnhiễm khuẩn hoặc bị nhiễm hóa học (kim loại nặng, độc tố vi nấm…) Ngộ độcthực phẩm mùa hè thường do thức ăn nhiễm vi sinh vật (vi khuẩn, ký sinh trùng), vìmùa hè nhiệt độ cao thuận lợi cho vi sinh vật sinh sôi và phát triển Đặc biệt thựcphẩm có nguồn gốc từ động vật như thịt, cá, trứng, sữa là các chất giàu đạm, rất dễtrở thành môi trường tốt cho vi sinh vật, nhất là vi khuẩn gây bệnh phát triển, khi đóthức ăn đã biến thành chất độc

Sinh vật truyền nhiễm, bao gồm các loại vi khuẩn, vi rút và ký sinh trùng và độc

tố, dịch tiết của chúng là nguyên nhân phổ biến nhất gây ngộ độc thực phẩm Cácloại vi khuẩn gây nhiễm cho thực phẩm tồn tại ở khắp mọi nơi trong không khí.Một số đối tượng thực phẩm có nguy cơ cao gây ngộ độc:

- Ăn gỏi thịt hay thịt chưa chín kỹ

- Ăn cá và hải sản (sò, trai, nghêu, cua, ghẹ…) tươi sống hay chưa chín kỹ

- Ăn các món trứng gà chưa nấu chín hoàn toàn

- Ăn một số loại rau sống như cải, xà lách

- Uống nước trái cây chưa được diệt khuẩn

- Sữa và các sản phẩm chưa qua diệt khuẩn [1], [4]

2.2 Một số vi sinh vật gây hại trong thực phẩm và trong nước

2.2.1 Vi sinh vật chỉ điểm vệ sinh thực phẩm

2.2.1.1 Coliforms, Faecal Coliforms, E.coli

Coliforms là những vi sinh vật hình que, Gram (-), không tạo bào tử, có khả năng

lên men lactose và sinh khí trong quá trình lên men này Phát triển trong khoảngnhiệt độ từ (-2 đến 440C) pH từ 4,0 đến 8,5 có thể sống hiếu khí hoặc kị khí tùy ý.Sau 12 – 16 giờ trên môi trường thạch tạo ra những khuẩn lạc có thể nhìn thấyđược

Coliform đi vào thực phẩm từ nước hoặc nguyên liệu thực phẩm có nhiễm phân.

Các loài tiêu biểu cho Coliform: Escherichia coli và Enterobacter aerogenes Tuy

nhiên, ngoài ra còn có khoảng 20 loài mang những tính chất đặc trưng cho

Coliform, trong đó bao gồm cả các Enterobacteriaceae khác và các loài thuộc Aeromonas.

Coliforms chịu nhiệt (E.coli giả định) là những Coliforms có khả năng lên men

lactose sinh hơi ở 440C/24h trong môi trường canh EC Coliforms phân (Faecal

Coliform) là coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indole khi ủ khoảng 24h ở 440Ctrong canh Trypton

Dưới đây là một vài tính chất đặc trưng cho việc làm hư hỏng thực phẩm của

Coliforms.

- Chúng có khả năng phân giải nhiều cơ chất khác nhau: Carbohydrate, các chấthữu cơ sinh năng lượng, các hợp chất chứa nitơ đơn giản…

- Có khả năng tổng hơp hầu hết các vitamin cần thiết

- Có khả năng phát triển trong môi trường có nhiệt độ từ 10-460C

- Có khả năng tạo ra acid và sinh gas từ đường

- Sinh ra mùi vị hư hỏng, khó chịu

Escherichiacoli (E.coli): Được phát hiện là vi sinh vật gây bệnh từ năm 1700 E.coli thuộc họ Enterobacteriaceae, là vi sinh vật hiếu khí tùy ý Các loài E.coli

hiện diện rộng rãi trong môi trường bị ô nhiễm phân hay chất thải hữu cơ, phát triển

và tồn tại rất lâu trong môi trường E.coli có khả năng lên men nhiều loại đường,

sinh hơi, khử nitrat thành nitrit, gây nhầy nhớt, hư hỏng thực phẩm

Hầu hết các dòng E.coli không gây hại và đóng vai trò trong ổn định sinh lý

đường ruột Tuy nhiên có 4 dòng có thể gây bệnh cho người và động vật là

Enteropthogenic E.coli (EPEC), Enterotocigenic E.coli (ETEC), Enteroinvasiae E.coli (EIEC), Enterohaemorhagic E.coli (EHEC)/Verocytocine E.coli (VTEC) hay E.coli 0157:H7

Khả năng gây bệnh của E.coli rất đa dạng: Gây nhiễm khuẩn đường tiểu, với cơ

thể yếu gây nhiễm khuẩn máu, gây viêm màng não ở trẻ sơ sinh, gây tiêu chảy

Triệu chứng chính khi bị nhiễm các dòng E.coli trên là tiêu chảy ra máu, ngoài ra có

thể đau thắt bao tử và nôn ói [5], [6]

Hình 2.1: Cấu trúc hiển vi của E.coli

Thực hiện: Định lượng coliform bằng phương pháp MPN Đầu tiên sử dụng canh

thang TLS sau đó dùng canh BGBL, ủ 370C / 24 - 48h

Cấy chuyền sang canh EC ủ ở 44,50C để kiểm tra coliform chịu nhiệt Sau đó cấy

sang môi trường Eosin Methyene Blue Agar (EMB), chọn khuẩn lạc điển hình thử

phản ứng Indol nhằm kiểm tra E.coli Xác định E.coli từ E.coli chịu nhiệt cho phản

ứng IMViC cho kết quả ++ [3]

Loài: Clostridium perfringens.

Hình 2.2: Cấu trúc hiển vi của

C.Perfingens

Clostridium perfringens là trực khuẩn Gram dương, kỵ khí tuyệt đối, ưa nhiệt và

có khả năng sinh bào tử chịu nhiệt Bào tử hình tròn, bầu dục có nhiều lớp màngbao bọc Lên men sinh hơi trong môi trường chứa glucose, fructose, galactose,lactose, maltose, sucarose Không lên men salicin, manitol, glycerin

Nguồn thực phẩm có thể chứa Clostridium perfringens thường là thịt gia cầm

như gia cầm đông lạnh sâu, thịt trong các hầm chứa và các loại thực phẩm khác

Clostridium perfringens tiết ra độc tố trong thực phẩm và ruột Độc tố này gây viêm

ruột, gây tán huyết và độc tố thần kinh Triệu chứng ngộ độc do độc tố này gây ra làtiêu chảy nước, không ói, không sốt, ít đau bụng [5], [2]

Nguyên tắc: Clostridium perfringens có khả năng khử sulfide (S2-) thành sulfuređược phát hiện nhờ sự có mặt của Fe2+ có trong môi trường nuôi cấy

Thực hiện: Khuẩn lạc trên môi trường Tryptose Sunfide Cycloserin (TSC), trongđiều kiện kị khí khuẩn lạc điển hình: hình tròn, to, có màu đen Chọn khuẩn lạc điểnhình tăng sinh trong môi trường Thioglycolate lỏng và khẳng định trong môi trườngLactose Sunfite (điều kiện kị khí) [3]

2.2.1.3 Tổng số vi sinh vật hiếu khí

Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trongđiều kiện có sự hiện diện của oxy Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫuphản ánh vệ sinh chế biến, độ tươi mới hay nguy cơ hư hỏng của thực phẩm

Chỉ số này còn có một số tên gọi khác như:

- Số vi sinh vật hiếu khí (Aerobic Plate Count_APC)

- Tổng số đếm trên đĩa (Total Plate Count_TPC)

- Tổng số vi sinh vật sống (Total Viable Count_TVC)

- Số đếm đĩa chuẩn (Standard Plate Count_SPC) [5]

Thực hiện: Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường thạch PlateCount Agar (PCA), sau đó ủ hiếu khí ở nhiệt độ 300C trong 3 ngày Số lượng vi sinhvật trong 1g hoặc 1ml mẫu thực phẩm kiểm nghiệm được tính theo số khuẩn lạcđếm được từ các đĩa nuôi cấy theo các độ pha loãng

2.2.2 Một số vi sinh vật gây bệnh và ngộ độc có trong thực phẩm và nước

2.2.2.1 Bacillus cereus

Hình 2.3: Cấu trúc hiển vi của Bacillus cereus

Bacillus cereus là những trực khuẩn, Gram (+), hiếu khí và kị khí tùy ý, tăng

trưởng được trong khoảng nhiệt độ từ 5-500C, tối ưu ở 35-400C Vi khuẩn này hiệndiện trong đất, bụi, các loại thực phẩm (sữa, thịt, rau quả, hỗn hợp gia vị, sản phẩmkhô…) di động tạo nội bào tử, lên men glucose sinh hơi

Vi khuẩn có thể tiết ra hai loại độc tố chính là diarhoeal toxin gây tiêu chảy và

emetic toxin gây nôn mửa Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi B cereus khi thực phẩm

được chuẩn bị mà không giữ lạnh vài giờ trước khi sử dụng Triệu chứng ngộ độcphổ biến là đau bụng, tiêu chảy, không sốt, bắt đầu 14-16 giờ sau khi ăn thực phẩm

bị nhiễm và kéo dài trong 12-24 giờ

Nguyên tắc: Bacillus cereus có khả năng thủy phân Protein (lòng đỏ trứng gà)

không lên men mannitol (-), trên môi trường nuôi cấy có chỉ thị màu đỏ phenol tạokhuẩn lạc hồng và có vòng đục xung quanh

Thực hiện: Trên môi trường Mossel cho khuẩn lạc to, màu hồng, có vòng đục mờxung quanh Chọn các khuẩn lạc điển hình và khẳng định lại bằng các phản ứng thửnghiệm sinh hóa: khả năng lên men glucose(+), Voges – Proskauer(+), nitrate(+)

2.2.2.2 Salmonella

Hình 2.4: Cấu trúc hiển vi của salmonella

Salmonella là trực khuẩn, Gram âm (-), hiếu khí và kị khí tùy ý, có khả năng di

động, không sinh nha bào, có tiên mao (trừ S.gallinarum) lên men được đườngglucose và mannitol sinh acid nhưng không lên men được đường saccharose vàlactose, có kích thước tế bào vào khoảng 0,5-3µm Giống như nhiều loài vi khuẩn

khác Salmonella có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ tương đối rộng từ 6

đến 45,60C, tuy nhiên nhiệt độ phát triển tối ưu là 370C Salmonella phát triển trong

khoảng pH khoảng 5,5 – 5,7 không nhận dạng được sự thay đổi mùi vị khi

Salmonella phát triển Độ ẩm tối ưu cho sự phát triển của Salmonella là 0,93 – 0,95 Salmonella xâm nhập vào cơ thể bằng hai con đường: từ phân người hoặc động

vật từ người bệnh Trong đó phải kể đến tác động của động vật lông vũ, trứng của

chúng và nhất là phân của chúng đã làm cho việc lan truyền Salmonella dễ dàng

hơn Ngoài ra chuột, mèo, ruồi cũng là những tác nhân gián tiếp dẫn đến việc

Salmonella lan rộng hơn khi chúng truyền phân vào các thực phẩm không được bảo

quản kỹ Trong quá trình giết mổ cũng cần phải đề phòng sự nhiễm của Salmonella

nếu không thực hiện đúng quy trình an toàn thực phẩm

Các loại thực phẩm có nguy cơ nhiễm Salmonella cao là thực phẩm tươi có

nguồn gốc động vật như thịt lợn, thịt gia cầm, sữa và các sản phẩm từ sữa, trứng,hải sản cùng một số rau, quả

Salmonella có độc tính cao, gây ngộ độc thực phẩm mạnh Triệu chứng nhiễm

bệnh là bắt đầu bằng việc đau bụng quằn thắt, tiêu chảy, có thể có máu, sốt nóng,

nôn mửa xuất hiện 12h – 72h sau khi ăn, bệnh kéo dài khoảng 1 tuần lễ Salmonella

typhi và Salmonella paratyphi A, B, C gây ra bệnh cảm thương hàn Bệnh rất nguy

hiểm, có thể có biến chứng xuất huyết đường tiêu hóa, ruột trở nên mỏng và có thể

bị lủng

Thực hiện: Salmonella được phân tích định tính theo một quy trình gồm 4 bước

là tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định

Salmonella thường có mặt với số lượng ít và dễ bị tổn thương nên cần bước tiền

tăng sinh trong môi trường pepton đệm, tăng sinh chọn lọc trên 2 môi trường làRappaport vassiliadis (RVS) và Muller- Kauffman (MKTTn) chứa vertmalachite và

Mg2+ giúp ức chế phát triển của vi sinh vật khác chỉ cho Salmonella phát triển Phân lập nhằm tách và nhận dạng Salmonella trên môi trường XLD (xylose

lysine decarboxylase) và Hektoen Chọn khuẩn lạc đặc trưng đem đi thử các phản

ứng sinh hóa KIA, Ure, Indol, Lysine khẳng định lại Salmonella [15], [5], [2].

2.2.2.3 Vibrio spp

Hình 2.5: Cấu trúc hiển vi của Vibrio.spp

Vibrio spp là vi khuẩn hình que, có dạng phẩy nên được gọi là phẩy khuẩn, Gram

âm (-), không sinh nha bào, phản ứng với oxydase dương tính Thuộc loài hiếu khítùy tiện Nhiệt độ phát triển tối ưu là 35 - 370C, tuy nhiên vẫn phát triển được ởkhoảng nhiệt độ từ 10-440C và pH kiềm Vibrio cholerae tạo ra độc tố cholerae-

toxin có độc tính mạnh, chỉ cần 5µg gây nhiễm qua đường miệng có thể gây tiêuchảy cho người trưởng thành Ngoài độc tố này, loài này còn tiết ra độc tố

hemolysin có độc tính tương tự tetradotoxin của cá nóc Vibrio parahaemolyticus là

vi sinh vật ưa mặn bắt buộc, tăng trưởng tốt ở nồng độ muối 2-8%, bị ức chế ở nồng

độ muối 10%

Vibrio thường có mặt ở hải sản, các sản phẩm hải sản, nước biển Nguồn thực

phẩm có nguy cơ nhiễm và lan truyền dịch tả là nước uống, nước trái cây và các sảnphẩm sữa, các loại thủy hải sản tươi sống Tuy nhiên bị tiêu diệt dưới tác động củanhiệt độ hay nói một cách khác, khi nấu chín thực phẩm thì không phải lo sợ sư tác

động của Vibrio spp Vibrio spp gây ra các bệnh dịch tả, thời gian ủ bệnh là 4 - 5

ngày, triệu chứng bệnh là tiêu chảy nhiều, đi nhiều lần trong ngày (10 - 20 lần)giống nước cơm vo [4], [5]

Nguyên tắc: Trong môi trường TCBS các VSV lên men được đường sucrose chokhuẩn lạc màu vàng và làm acid hóa môi trường Nếu VSV không lên men đượcđường sucrose sẽ cho khuẩn lạc màu xanh

Thực hiện: Tăng sinh trong môi trường Alkaline Salime Peptone Water (ASWP)tiếp theo cấy phân lập vào môi trường chọn lọc TCBS và TSAT Xác định các khuẩnlạc nghi ngờ trên môi trường phân lập bằng các thử nghiệm Oxidase, nhuộm Gram,KIA, Ure-indole, Lysine, thử nồng độ muối và sử dụng API 10S để định danh

2.2.2.4 Listeria monocytogens

Hình 2.6: Cấu trúc hiển vi của Listeria monocytogens

Listeria monocytogens là vi khuẩn Gram dương (+), không sinh bào tử, kị khí, Listeria monocytogen ưa lạnh, phát triển ở nhiệt độ từ 2-440C trong thịt ướp lạnhhay phô mai, sữa, thịt nguội (pate, chả lụa), cá, rau quả và trong nước.

Triệu chứng bệnh là tiêu chảy, sốt nhẹ, nhiễm trùng máu, tổn thương tim, hệ thầnkinh trung ương, gây sẩy thai, nhiễm trùng thai nhi ở phụ nữ có thai [2]

Thực hiện: Listeria monocytogens được tăng sinh hai giai đoạn trong môi trường

Frazer: tăng sinh sơ cấp trong 24h và tiếp tục tăng sinh thứ cấp trong 24h tiếp theo.Cấy phân lập trên môi trường chọn lọc đặc trưng, chọn các khuẩn lạc đặc trưng điểnhình khẳng định lại bằng các thử nghiệm sinh hóa và huyết thanh [5]

2.2.2.5 Psedomonas aeuruginosa

P aeruginosa là trực khuẩn hiếu khí Gram âm, tồn tại ở dạng đơn, bắt cặp hoặc

tạo chuỗi ngắn, có khả năng di động với một tiên mao đơn cực Là vi khuẩn hiếu

khí bắt buột, nhưng P aeruginosa có thể phát triển trong môi trường kị khí nếu có

NO3- làm chất nhận điện tử, phát triển tối ưu ở 370C Loài này hiện diện phổ biếntrong đất, nước, bề mặt cơ thể động thực vật là loài vi khuẩn gây bệnh cơ hội trênngười Sự nhiễm bệnh bắt đầu từ khi có những biến đổi làm suy yếu hệ bảo vệ của

tế bào chủ P aeruginosa có thể gây nhiều bệnh khác nhau ở người: Gây viêm màng

tim ở những người có van tim giả; gây viêm đường hô hấp hoặc hệ thống tự bảo vệ

bị suy yếu; gây viêm phổi ở những bệnh nhân có bệnh mãn tính về phổi và bị chứngsung huyết; gây nhiễm trùng đường máu; đường tiết niệu ở những bệnh nhân suygiảm hệ thống miễn dịch như AIDS, giảm bạch cầu trung tính, tiểu đường, bỏngnặng, gây viêm đường não mủ; gây viêm tai; viêm tủy xương; gây nhiễm trùng da,

mô mềm… P aeruginosa là vi khuẩn kháng thuốc phổ biến, do đó là một loài gây bệnh nguy hiểm, chỉ có một số ít kháng sinh có tác dụng đối với giống P.

aeruginosa là fluoroquinolone, gentamicin và imipenem.

2.2.2.6 Streptococcus feacal.

Streptococcus phân là các liên cầu khuẩn có hình cầu hay hình oval kéo dài, gram

dương Kích thước 0,8 – 1,0µm Thường tụ tập thành từng đôi hay từng chuỗi,không di động không sinh bào tử, một số có tạo vỏ nhầy

Hầu hết các loài này sống hiếu khí tùy ý nhưng phát triển tốt trong điều kiện kịkhí, tiết bacteriocin trong quá trình tăng trưởng và có thể ức chế sự tăng trưởng củacác vi khuẩn khác Mọc tốt ở nhiệt độ 42 – 450C trong môi trường có muối mật và6,5% NaCl thích hợp pH 6,9 – 7,2 nhưng có thể mọc ở pH ≥ 9,0

S.faecalis có độc tố ruột, là chỉ tiêu vi sinh vật đánh giá vệ sinh thực phẩm S.faecalis nhiễm qua đường phân tiêu hóa: gây đau bụng đi phân lỏng, viêm ruột.

2.2.2.7 Staphylococus aureus

Hiện nay tìm thấy 31 loài Staphylococus aureus là là tụ cầu khuẩn gram dương

(+), hiếu khí hay kị khí tùy ý, không di động, không tạo bào tử, các tế bào hìnhtrứng chụm lại với nhau như chùm nho Nhiệt độ tăng trưởng tối ưu là 370C Chịuđược khô hạn, hơi nóng ( ở 500C vẫn sống được trong 30 phút), pHopt =6 – 7; awopt

=0,83-0,90 Cho phản ứng coagulase (+), có khả năng lên men mannitol, trehalose,

sucrose có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15% NaCl

Hình 2.7: Cấu trúc hiển vi của Staphylococus aureus

Staphylococus aureus có khả năng phát triển trên nhiều loại môi trường khác

nhau nhất là trên các môi trường chữa chất hữu cơ Tuy nhiên phải có nitơ trong

môi trường, nguồn nitơ sử dụng là các acid amin Trong tự nhiên Staphylococus

aureus được tìm thấy trên da, mũi, tóc hay lông của các động vật máu nóng.

trong 30 phút Khi ăn phải thực phẩm có chứa độc tố này, sau 4-6 giờ người ngộ độc

có các triệu chứng tiêu chảy, nôn mửa kéo dài 6-8 giờ Ngoài ra Staphylococus

aureus còn tạo mụn nhọt, làm đông huyết tương, từ đó gây nên các bệnh như viêm

phổi, viêm màng não, viêm cơ tim, viêm thận, viêm tủy xương ở người Các loạithực phẩm chứa nhiều muối như jambon, kem tổng hợp, nước súp và các loại thủysản, thực phẩm đóng hộp thường hay nhiễm vi sinh vật này Con đường lây nhiễmchủ yếu thông qua tiếp xúc từ nhà bếp, quá trình chế biến

Đặc trưng của loài này là gây viêm ruột dẫn đến bệnh chảy máu ruột Nguồn gây

nhiễm Staphylococus aureus vào cơ thể người thường từ những người bị viêm mũi

gây nên viêm xoang, từ các ung nhọt, hoặc các vết thương nhiễm trùng, từ da người

tiếp xúc với người bệnh Staphylococus aureus còn gây nên chứng viêm vú bò dẫn

dến làm nhiễm sữa và các sản phẩm từ sữa Riêng không khí không phải là môi

trường gây nhiễm đặc trưng trừ phi trong môi trường có quá nhiều Staphylococus

aureus.

Các sản phẩm thực phẩm thường có Staphylococus aureus: Thịt và các sản phẩm

từ thịt, cá và các sản phẩm từ cá, sữa và các sản phẩm từ sữa, salad, puddind, cream

Nếu không được trữ lạnh đúng mức thì Staphylococus aureus sẽ phát triển mãnh liệt

và gây bệnh

Nguyên tắc: Staphylococus aureus có khả năng khử Tellurite Kali thành tellure

tạo khuẩn lạc màu đen và thủy phân protein (lòng đỏ trứng gà) tạo vòng sáng trongsuốt xung quanh khuẩn lạc

Thực hiện: chọn và đếm khuẩn lạc điển hình trên môi trường Baird Parker Agar(BP) và khẳng định bằng phản ứng coagulase [2], [9]

2.2.2.8 Nấm men, nấm mốc

Nấm men, nấm mốc hay còn gọi là vi nấm, là tế bào nhân thật, có vách tế bào vàlớp vỏ chitin, không có diệp lục nên chúng là cơ thể dị dưỡng, sống ký sinh và cókhả năng đồng hóa Nhiệt độ thích hợp để phát triển là 20 - 280C, có một số nhóm

ưa lạnh hoặc ưa nóng Hầu hết nấm men, nấm mốc đều thuộc nhóm hiếu khí bắtbuộc, một số nhóm phát triển tốt trong điều kiện vi hiếu khí

Nấm men có cấu trúc đơn bào, hình cầu hoặc hình bầu dục, sinh sản bằng cáchnảy chồi, có thể tồn tại dưới dạng khuẩn ty giả.

Nấm mốc hầu hết có cấu tạo dạng sợi (đơn hoặc đa bào) không di chuyển, nhiềusợi nấm hợp thành tản nấm, sinh sản bằng bào tử hay khuẩn ty

Nấm men, nấm mốc có thể có ở hầu hết các loại thực phẩm từ thực phẩm tươisống đến các loại rau, hoa quả (xanh, chín) và lương thực như gạo, ngô, mì, măng,miến…

Hình 2.8: Cấu trúc hiển vi của Nấm mốc

Có một số loại nấm men được dùng trong sản xuất thực phẩm, nhưng nấm mencũng gây nên một số điều không có lợi trong khâu sản xuất, chế biến như làm cho

sữa, sữa hộp, bơ bị đắng (nấm men Torula amara), có loại xâm nhập vào các loại hoa quả (nấm men Saccharomyces apiculatus) và khi dùng để chế biến rượu thì

nấm men sẽ làm hỏng rượu

Hình 2.9: Cấu trúc hiển vi của Nấm men

Sau khi nấm mốc trên các loại đồ ăn, thức uống, chúng sẽ làm cho thực phẩmthay đổi tính chất và đồng thời mốc tiết ra những chất hóa học mà khi người tiêudùng ăn phải sẽ bị ngộ độc làm ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe, nhất là khi bị ngộđộc nặng Ngoài ra khi nấm mốc nhiễm vào thực phẩm chúng sẽ làm mất màu vàmất vị của thực phẩm và đặc biệt là làm giảm hoặc mất hết giá trị dinh dưỡng củathức ăn

Nguyên tắc: Nấm men, nấm mốc được định lượng trên 2 môi trường thạch:

- Môi trường Dichloran Glycerol Agar (DG18) được sử dụng cho các loại mẫuthực phẩm có hàm lượng nước thấp như các loại thực phầm khô: gạo, ngũ cốc,tiêu, các loại thực phẩm có dầu, có hàm lượng đường hay muối cao

- Môi trường (DRBC) sử dụng cho các mẫu thực phẩm chứa nhiều nước [1],[8]

2.3 Quy định việc giới hạn nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm và một số chỉ tiêu co trong nước

Bảng 2.1: Quy định việc giới hạn nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm theo quyết

định số 46/2007/QĐ-BYT

Báo cáo đồ án tốt nghiệp GVHD: Thi Thanh Trung

Listeria monocytogenes Không có

- (*)Tính trên 25g hoặc 25ml đối với Salmonella, Listeria monocytogenes.

Quy định giới hạn cho phép vi sinh vật trong cá và thuỷ sản

- (*)Tính trên 25g hoặc 25ml đối với Salmonella

Quy định giới hạn cho phép vi sinh vật trong trứng và sản phẩm trứng

TT SẢN PHẨM LOẠI VI SINH VẬT GIỚI HẠN VI SINH VẬT (trong 1g hay 1ml thực

- (*)Tính trên 25g hoặc 25ml đối với Salmonella

Quy định giới hạn cho phép vi sinh vật trong ngũ cốc và sản phẩm ngũ cốc

TT SẢN PHẨM LOẠI VI SINH

VẬT

GIỚI HẠN VI SINH VẬT (trong 1g hay 1ml thực

- (*)Tính trên 25g hoặc 25ml đối với Salmonella

Quy định giới hạn cho phép vi sinh vật trong rau, quả và sản phẩm rau, quả.

TT SẢN PHẨM LOẠI VI SINH VẬT GIỚI HẠN VI SINH VẬT (trong 1g hay 1ml thực

phẩm) (*)

1 Rau quả tươi, rau

Salmonella Không có

2

Rau quả muối,

rau quả khô

- (*)Tính trên 25g hoặc 25ml đối với Salmonella

Quy định giới hạn cho phép vi sinh vật trong nước khoáng và nước giải khát

- (**)Tính trên 250ml đối với nước khoáng đóng chai.

Quy định giới hạn cho phép vi sinh vật trong kem và nước đá

- (*)Tính trên 25g hoặc 25ml đối với Salmonella

Quy định giới hạn cho phép vi sinh vật trong đồ hộp

Quy định giới hạn cho phép vi sinh vật trong dầu, mỡ

(*)Tính trên 25g hoặc 25ml đối với Salmonella [1]

Bảng 2.2: Quy định việc giới hạn nhiễm vi sinh vật trong nước sinh hoạt, nước dùng trong sản xuất, chế biến thực phẩm

2.4 Phương pháp phân lập vi sinh vật

Khái niệm: Phân lập vi sinh vật là quá trình tách riêng các loài vi sinh vật từ quầnthể ban đầu và đưa về dạng thuần khiết Vi sinh vật ở dạng thuần khiết là giống visinh vật được tạo ra từ một khuẩn lạc riêng lẻ

Nguyên tắc: Tách rời các tế bào vi sinh vật, nuôi cấy các tế bào bên trong môitrường dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau

2.4.1 Phương pháp phân lập vi sinh vật thuần khiết

Quá trình phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết (hầu hết các loại mẫu nghiêncứu) gồm các bước cơ bản sau:

- Lựa chọn nguồn phân lập

- Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật ban đầu

- Phân lập vi sinh vật thuần khiết

- Kiểm tra độ tinh khiết của các khuẩn lạc

2.4.2 Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật trên các môi trường phân lập

2.4.2.1 Một số yêu cầu khi phân lập

Nếu mẫu ban đầu ở dạng rắn phải đưa về dạng lỏng bằng cách:

- Nghiền mẫu sau đó hòa tan mẫu trong nước cất vô trùng

- Tiếp tục pha loãng ở nồng độ cần thiết

- Cấy mẫu trên môi trường đặc trưng

Để có được chủng thuần, cần tiến hành lặp lại nhiều lần các kỹ thuật pha loãngnêu trên cho đến khi tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường đồng đều nhất.Mức độ thuần khiết của chủng có thể được kiểm tra như sau:

- Việc tạo hộp ria từ một khuẩn lạc đơn của chủng thuần chỉ tạo ra một khuẩnlạc duy nhất trên bề mặt môi trường có hình thái giống với khuẩn lạc củachủng ban đầu

- Mỗi khuẩn lạc đơn chỉ chứa một loại tế bào có hình thái giống nhau trongquan sát dưới kính hiển vi.

Trong thao tác tạo khuẩn lạc đơn cần lưu ý hạn chế thấp nhất nguy cơ bị nhiễmbằng cách thực hiện nghiêm túc các yêu cầu của thao tác vô trùng [13]

2.4.2.2 Phương pháp tạo khuẩn lạc đơn

Có nhiều kỹ thuật tạo khuẩn lạc đơn như: kỹ thuật cấy ria, kỹ thuật hộp trải, kỹthuật hộp đổ

Thao tác kỹ thuật tạo khuẩn lạc đơn được thực hiện như sau:

Kỹ thuật cấy ria

- Dùng que cấy vòng thao tác vô trùng thu giống ria các đường trên môi trườngthạch thích hợp (ria chữ T và ria bốn góc) Sau mỗi đường ria, đốt khử trùngđầu que cấy và làm nguội trước khi thực hiện đường ria tiếp theo

- Bao gói đĩa petri, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ấm

vô trùng của ngọn lửa

- Mở đĩa petri, đặt nhẹ thanh gạt lên bề mặt thạch Dùng đầu thanh gạt xoay, trảiđều dịch giống lên bề mặt thạch Trong khi trải, thực hiện xoay đĩa một vàilần, mỗi lần khoảng 1/2 chu vi đĩa tạo điều kiện cho thanh gạt trải dịch giốngđều khắp bề mặt môi trường

- Rút thanh gạt khỏi đĩa, đậy đĩa, gói và ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợptrong tủ ấm

- Ưu điểm: Nhận dạng được khuẩn lạc đặc trưng

- Nhược điểm: Chỉ cấy được thể tích mẫu nhỏ

- Đậy nắp đĩa petri, để đông tự nhiên

- Ưu điểm: Cấy được thể tích mẫu lớn [13]

2.4.3 Kiểm tra độ tinh khiết của giống mới phân lập

Có nhiều cách kiểm tra:

Kiểm tra vết cấy:

Quan sát sự sinh trưởng của vi sinh vật qua vết cấy trên môi trường đặc khuẩn lạcmọc trên đường cấy

Kiểm tra lại độ thuần chủng của các loại khuẩn lạc:

- Chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trên môi trường thạch nghiêng

- Tách các khuẩn lạc này ra và hòa tan vào nước muối sinh lý NaCl 0,9%, phaloãng ở nồng độ cần thiết

- Nhỏ 1 giọt dịch trên vào đĩa petri có môi trường

- Dùng que gạt phân phối giọt dịch đều khắp mặt thạch

- Đặt các đĩa petri vào tủ ấm với thời gian và nhiệt độ thích hợp

- Sau đó lấy ra quan sát các khuẩn lạc riêng rẽ Sự thuần khiết của khuẩn lạc là

sự thuần khiết của giống

2.5 Phương pháp định lượng vi sinh vật

Có nhiều phương pháp để định lượng vi sinh vật như đếm số lượng tế bào trựctiếp trên kính hiển vi, định lượng gián tiếp thông qua mức độ cản của ánh sáng (độđục), đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường xác định, định lượng bằng phươngpháp pha loãng tới hạn (phương pháp MPN)

Trong phân tích kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm, để định lượng vi sinh vật người

ta thường sử dụng hai phương pháp truyền thống là đếm khuẩn lạc trên đĩa vàphương pháp pha loãng tới hạn (MPN).\

2.5.1 Phương pháp đếm khuẩn lạc

Nguyên tắc: Cấy một thể tích xác định dung dịch mẫu đã pha loãng lên đĩa cóchứa môi trường thích hợp bằng kỹ thuật hộp đổ hoặc hộp trải Đếm số khuẩn lạcmọc lên sau thời gian nuôi cấy, với mỗi khuẩn lạc là kết quả phát triển của mỗi tếbào

Phương pháp này cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiệndiện trong mẫu Tế bào sống là tế bào có khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạctrên môi trường chọn lọc trong nhiệt độ và thời gian ủ thích hợp

Trong phương pháp này cần thực hiện pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãngbậc 10 liên tiếp sao cho có độ pha loãng với mật độ tế bào thích hợp (30 - 300

khuẩn lạc đối với vi khuẩn hiếu khí, khoảng 15 - 150 đối với coliform, E.coli,

S.aureus) nhằm hạn chế sai số khi đếm và tính toán Những đĩa có quá nhiều khuẩn

lạc thì không thể cho kết quả đếm chính xác vì các khuẩn lạc có thể chồng lấp lênnhau hoặc tạo thành màng sinh khối

Số lượng khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa phụ thuộc vào lượng mẫu cấy, môi trường

và điều kiện ủ Các tế bào trên đĩa không tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc vớitốc độ như nhau, nhiều tế bào chưa kịp hình thành nếu thời gian ủ không đủ.Phương pháp đếm khuẩn lạc nên được thực hiện lặp lại trên ít nhất 2 đĩa để hạn chế

sai số quá lớn Ngoài ra, do có khả năng nhiều tế bào cùng hình thành chung mộtkhuẩn lạc nên số khuẩn lạc không nhất thiết trùng với số tế bào ban đầu được đưalên môi trường vì vậy kết quả đếm và mật độ tế bào thường được tính bằng số đơn

vị hình thành khuẩn lạc cfu/ml (Colony Forming Unit) thay vì số tế bào/ml

Quy trình thực hiện gồm 3 bước:

- Pha loãng mẫu theo dãy thập phân: Hút chuyển 1ml mẫu (hoặc dung dịch phaloãng trước đó) vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lí và vortex Thôngthường cần thực hiện dãy nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp để có được cácnồng độ phù hợp

- Cấy mẫu bằng phương pháp hộp đổ hay phương pháp hộp trải Sau đó đem ủ ởnhiệt độ và thời gian thích hợp

- Đếm khuẩn lạc và tính kết quả: Sau thời gian ủ, đếm khuẩn lạc có trên hai độpha loãng liền kề thích hợp (thường từ 15 - 300 khuẩn lạc/ đĩa) [3], [13], [.5]

v d n n

C N

).

1 , 0 ( 1+ 2

Trong đó:

N: Số khuẩn lạc (đơn vị hình thành khuẩn lạc CFU) vi sinh vật trong 1g hay 1mlmẫu

C: Số khuẩn lạc đếm được trong các đĩa đã chọn

n1: Số đĩa đã đếm ở độ pha loãng thứ nhất

n2: Số đĩa đã đếm ở độ pha loãng thứ hai

d: Hệ số pha loảng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất

V: Thể tích dịch mẫu cấy vào mỗi đĩa (V = 1ml) [11]

2.5.2 Phương pháp tính xác suất gần đúng (MPN)

Nguyên tắc: Phương pháp MPN ( MOST PROBABLE NUMBER) (phương pháp

có số xác xuất cao nhất, số tối khả) còn gọi là phương pháp pha loãng tới hạn hayphương pháp chuẩn độ dùng để đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinhvật có xác suất lớn nhất hiện diện trong mẫu Đây là phương pháp định lượng dựa

trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãngkhác nhau Số lượng ống nghiệm lặp lại càng cao thì trị số MPN càng lớn.

- Đem ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp

- Quan sát sự thay đổi của môi trường do sự tăng trưởng của vi sinh vật (cáchiện tượng như sinh hơi, môi trường vẫn đục, đổi màu,…) Ghi nhận nhữngống nghiệm dương tính ở từng nồng độ pha loãng dựa vào bảng Mac Cradysuy ra mật độ vi sinh vật được trình bày dưới dạng số MPN/100ml hay sốMPN/100g mẫu

Ưu điểm

- Áp dụng cho thực phẩm khó hòa tan, thực phẩm có hàm lượng chất béo caonhư dầu mỡ

Hạn chế

- Không quan sát được hình dạng khuẩn lạc

- Độ chính xác không cao, chỉ mang tính chất ước lượng xác suất

Trong đó:

a: Trị số tra từ bảng Mac Crady

V1: Thể tích mẫu sử dụng (thường là 1)

V2: Thể tích mẫu theo bảng Mac Crady ở loạt ống đầu tiên (10ml)

d: Độ pha loãng ở loạt ống đầu tiên [5]

2.6 Một số thử nghiệm sinh hóa

2.6.1 Khả năng sử dụng các nguồn hidrate cacbon

2.6.1.1 Thử nghiệm khả năng lên men đường

Nguyên tắc

- Nhằm xác định khả năng sử dụng nguồn cacbon khác nhau của một số vi sinhvật nguồn cacbon có thể chia làm 3 nhóm: monosaccharide, Oligo haypolysaccharide, ancohol

- Khả năng lên men của vi sinh vật được xác định bằng sự thay đổi màu của môitrường Vi sinh vật sử dụng nguồn cacbon để lên men, tùy theo phương thứclên men mà vi sinh vật sẽ tạo ra các sản phẩm khác nhau như rượu, các acidhữu cơ, CO2… làm giảm pH môi trường dẫn đến sự thay đổi màu chỉ thị pHcủa môi trường.

Môi trường và thuốc thử

- Môi trường phenol red broth bổ sung 0.5 – 1% đường cần thử nghiệm, pH =7.4, sử dụng chỉ thị là phenol red, từ màu đỏ sẽ chuyển sang vàng khi pH <6.8

Đọc kết quả

- Phản ứng (+): Môi trường chuyển sang màu vàng

- Phản ứng (-): Môi trường không chuyển màu [9]

2.6.1.2 Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer)

Nguyên tắc:

Vi sinh vật chuyển hóa glucose thành acid pyruvic, rồi tiếp tục chuyển hóa acidpyruvic thành acetyl methyl carbinol (AMC) AMC tác dụng với α – naphtol trongmôi trường kiềm tạo thành diacetyl Diacetyl tác dụng với nhân guandine có trongpeptone tạo thành phức Biacetyl – guandine có màu đỏ

Môi trường và thuốc thử

- Môi trường: CLark –CLubs (MR – VP broth)

- Thuốc thử: α – naphtol và KOH 40%

- VP (+): Môi trường chuyển màu đỏ cam

- VP (-): Không đổi màu môi trường [9]

2.6.1.3 Thử nghiệm MR (Methyl Red)

Nguyên tắc:

- Xác định vi sinh vật có khả năng tạo ra các acid bền trong quá trình lên menglucose Chỉ thị methyl red thay đổi màu môi trường khi pH thay đổi

Môi trường và thuốc thử:

- Môi trường: Clakr – Lubs (MR – VP broth)

- Thuốc thử: Methyl red

Thực hiện:

- Cấy sinh khối khuẩn lạc lên môi trường MR – VP, ủ 370C trong khoảng 2 – 5ngày Sau đó nhỏ thêm vào các ống nghiệm 2 – 5 giọt thuốc thử methyl red.Quan sát và đọc kết quả.

Kết quả:

- MR (+): Môi trường vẫn giữ nguyên màu đỏ

- MR (-): Môi trường chuyển từ đỏ sang vàng [9]

2.6.2 Khả năng phân giải các hợp chất chứa nitrogen

2.6.2.1 Thử nghiệm Indol

Vi sinh vật có hệ enzyme tryptophanase chuyển hóa triptophan tạo thành các sảnphẩm chứa gốc indol Nhân pyrol của indol phản ứng với gốc aldehyde của para –dimethyllaminobenzaldehyd trong thuốc thử Kovac’s qua 2 giai đoạn tạo thànhphức chất dạng quinine có màu đỏ

Môi trường và thuốc thử:

- Môi trường: Canh tryptone

- Thuốc thử Kovac’s

Thực hiện:

- Cấy sinh khối vi sinh vật vào môi trường canh tryptone, ủ 440C/24 – 48h Sau

đó nhỏ 3 – 5 giọt thuốc thử Kovac’s vào mỗi ống nghiệm Quan sát màu thuốcthử

Kết quả:

- Indol (+): Lớp trên bề mặt môi trường xuất hiện 1 vòng đỏ

- Indol (-): Lớp mặt môi trường có màu vàng chanh của thuốc thử [9]

Môi trường và thuốc thử:

- Urea Broth và Chiristensen Urea (môi trường thạch nghiêng)

- Chỉ thị màu phenol red, pH = 7.2

Thực hiện:

- Cấy sinh khối vi sinh vật vào môi trường, ủ ở 370C/24h Đọc kết quả

Đọc kết quả:

- Phản ứng (+): Phenol red chuyển sang màu đỏ cánh sen

- Phản ứng (-): Chỉ thị không đổi màu [9]

2.6.2.3 Thử nghiệm nitratase

 Nguyên tắc:

- Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme nitratase Enzyme này xúctác phản ứng khử nitrat thành nitric và thành NH3 và N2 Đây là cách biếndưỡng theo phương thức hô hấp kị khí

- Nitrite được tạo thành do nitrate tác dụng với N – nathylethylenediaminhydrochloride ở pH acid cho hợp chất màu hồng Nếu không có sự chuyển hóanitrate tức là không có enzyme nitratase thì nitrate sẽ phản ứng với bụi kẽmtạo màu hồng

Môi trường và thuốc thử:

- Nitrate broth

- HCl 1N, Bụi kẽm kim loại

- Thuốc thử nitric (acid sufanilamide 0.2% và N – nathylethylenediaminehydrochloride)

Thực hiện:

- Cấy sinh khối vi sinh vật vào môi trường Nitrate broth ủ ở 370C/24h Sau đónhỏ vài giọt HCl 1N để acid hóa môi trường, cho thêm 0.5ml dung dịchsufanilamide 0.2% và 0.5ml N – nathylethylenediamine hydrochloride để xácđịnh nitrite

- Nếu phản ứng định tính nitrite (-) thì bổ sung một lượng nhỏ bụi kẽm để xácđịnh sự có mặt của nitrat

- Trường hợp 1 (-): NO3– không chuyển hóa thành NO2

- Trường hợp 2 (+): NO3– chuyển hóa thành NO2–, sau đó NO2– tiếp tục bịchuyển thành khí NH3 hay N2 bay lên nên thuốc thử không phát hiện được

- Sau khi cho bột kẽm vào, nếu xuất hiện màu đỏ thì kết quả là (-), nếu không cóhiện tượng đổi màu thì là (+) [9]

2.6.3 Xác định một số đặc tính sinh hóa khác

2.6.3.1 Thử nghiệm KIA

Nguyên tắc:

- Được sử dụng để thử nghiệm đồng thời các khả năng: khả năng sử dụng cácnguồn cacbon khác nhau (glucose và lactose) của vi sinh vật, khả năng sinh

H2S và khả năng sinh hơi

- Khả năng sử dụng cacbon có 3 trường hợp xảy ra, nhận biết nhờ vào sự thayđổi pH của môi trường với chất chỉ thị màu là phenol red

 Chỉ sử dụng glucose:

Sau 18-24h nuôi cấy, phần thạch nghiêng trở nên pH kiềm và phần thạch sâu có

pH acid Do glucose trên bề mặt môi trường nuôi cấy được vi sinh vật oxy hóa hoàntoàn thành CO2 và H2O, để đáp ứng nhu cầu năng lượng cho tăng trưởng, vi sinh vậttiếp tục dị hóa peptone giải phóng NH3 làm phần thạch nghiêng của môi trường (có

CO2) có pH kiềm Trong khi đó phần thạch sâu trong môi trường có điều kiện O2không đủ, glucose bị lên men kị khí sinh acid hữu cơ làm pH môi trường giảm nênphần thạch nghiêng sẽ có pH kiềm và phần thạch sâu sẽ có pH acid

 Sử dụng cả glucose và lactose:

Sau 18-24h nuôi cấy, toàn bộ môi trường đều có pH acid vì sự biến dưỡng đồngthời cả 2 loại đường giúp vi sinh vật đủ năng lượng để tăng trưởng mà chưa cần sửdụng đến peptone Tuy nhiến, nếu kéo dài thời gian nuôi cấy quá 24h thì vi sinh vật

sẽ sử dụng đến peptone làm phần thạch nghiêng trở nên kiềm làm sai lệch kết quả

 Không sử dụng glucose và lactose:

Vi sinh vật sẽ biến dưỡng peptone để lấy năng lượng và làm kiềm hóa phần thạchnghiêng của môi trường

 Khả năng sinh H 2 S:

Trong môi trường có sodium thiosunfate, vi sinh vật tiết ra enzyme thiosunfatereductase khử sodium thiosunfate có trong môi trường và giải phóng H2S H2S sẽphản ứng với ion Fe2+ của chỉ thị ferric ammonium citrate tạo kết tủa màu đen vớiFeS

 Khả năng sinh hơi:

Nếu sự lên men đường tạo sản phẩm khí thì sẽ kết tụ thành bọt khí trong ốngnghiệm hoặc làm vỡ thạch

Môi trường và thuốc thử:

- Kligler Iron Agar (KIA) chứa 2 loại đường 0,1% glucose và 1% lactose

- Chỉ thị màu là phenol red

Thực hiện:

- Lấy sinh khối vi sinh vật cấy ria lên môi trường thạch nghiêng, sau đó cấyđâm sâu vào ống nghiệm nhưng tránh chạm đáy ống, ủ ở 370C trong 18 - 24h

Đọc kết quả:

- Phần thạch nghiêng đỏ, phần thạch sâu vàng : Chỉ lên men đường glucose

- Phần thạch nghiêng và thạch sâu đều chuyển vàng : Lên men cả glucose vàlactose

- Môi trường vẫn đỏ, phần bề mặt đỏ đậm hơn: không lên men glucose vàlactose.

- Trong ống nghiệm có sinh kết tủa đen: Có sinh H2S

- Có bọt khí, làm vỡ thạch hoặc đẩy khối thạch lên trên: Có sinh hơi (gas) [9]

2.6.3.2 Thử nghiệm Coagulase

Các loài thuộc giống Staphylococcus có khả năng tổng hợp enzyme coagulase.Enzyme coagulase có khả năng làm đông tụ các thành phần của huyết tương tạothành các khối đông

- Thử trong ống nghiệm: Cho vào ống nghiệm 0.5ml huyết tương, bổ sung thêm0.5ml dịch nuôi cấy chủng thuần hoặc một lượng lớn sinh khối vi sinh vật Lắcnhẹ ống để trộn đều vi sinh vật Ủ ống nghiệm ở 370C trong 4h

Kết quả:

- Coagulase (+): Xuất hiện khối đông huyết tương

- Coagluase (-): Không xuất hiện đông tụ, môi trường đồng nhất như đối chứngâm.[1.9]

2.6.3.3 Thử nghiệm Oxidase

Nguyên tắc:

- Phát hiện khả năng sinh enzyme cytochrom oxidase ở vi sinh vật Hệ thốngenzyme cytochrom có ở vi sinh vật hiếu khí, hiếu kỵ khí tùy ý Hệ thống nàyhoạt động như chất liên kết trong quá trình hô hấp, vận chuyển H+ => O2 tạothành nước

- Trong điều kiện có enzyme cytochrom oxidase thuốc thử p- phenylenediamine

bị oxi hóa thành hợp chất iodolphenol có màu xanh dương

Thực hiện:

- Dùng que thủy tinh lấy một ít sinh khối vi sinh vật chấm lên giấy có tẩm thuốcthử tetra methyl - p - phenylenediamine Độ kết quả trong vòng 10 - 30 giây

Đọc kết quả:

- Oxidase (+): Xuất hiện màu xanh dương đậm

- Oxidase (-): Không đổi màu thuốc thử.[1.9]

2.6.3.4 Thử nghiệm CAMP

Thử nghiệm khả năng cộng hưởng tan huyết của vi sinh vật Phản ứng phối hợp

giữa nhân tố protein được gọi là nhân tố CAM (tiết bởi các loài Streptococcus nhóm B) với nhân tố beta - hemolysin (tiết ra bởi Staphylococcus aureus) gây ra hiện

tượng tan huyết trên môi trường thạch máu Trong kiểm nghiệm CAMP, người ta

tiến hành cấy chủng kiểm nghiệm cùng với một chủng Staphylococcus tạo nhiều

beta - hemolysin trên môi trường thạch máu được bổ sung máu cừu hoặc máu thỏ.Nếu chủng kiểm nghiệm là CAMP (+) thì sẽ xuất hiện đường tan huyết ở vùng lân

cận chung của đường cấy chủng kiểm nghiệm và chủng Staphylococcus.

Môi trường: Thạch máu.

Thực hiện:

Cấy chủng Staphylococcus aureus thành đường thẳng vào đĩa thạch máu, sau đó

cấy chủng thử nghiệm vuông gốc với đường cấy trước Ủ trong điều kiện kị khí ở

370C trong 6 - 18h

Đọc kết quả:

- Phản ứng (+): Có sự hình thành vùng tan huyết tại vùng tiếp giáp giữa đường

cấy chủng thử nghiệm và đường cấy chủng Staphylococcus.

- Phản ứng (-): Không có vùng cộng hưởng tan huyết.[1.9]

- Môi trường: Simmons citrate agar (SCA)

- Chỉ thị màu: Brommothymol blue

- Thực hiện: Cấy ria khuẩn lạc lên môi trường SCA trong ống nghiệm thạchnghiêng Ủ ở 370C trong 24 - 48h

Kết quả:

- Citrate (+): Môi trường chuyển từ màu lục sang màu xanh dương

- Citrate (-): Môi trường giữ nguyên màu xanh lục [9]

2.6.3.6 Thử nghiệm Catalase

Thử nghiệm nhằm xác định các vi sinh vật có khả năng sinh enzyme catalase.Enzyme catalase thường gặp ở vi khuẩn hiếu khí tuyệt đối hay tùy nghi Catalase cókhả năng xúc tác cho các phản ứng phân giải peroxide tạo ra oxy và nước

Thuốc thử:

- Dung dịch H2O2 - giữ lạnh trong chai màu nâu và tránh ánh sáng

- Dung dịch đệm phosphate pH 7.0

- Thực hiện: Dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối vi khuẩn hòa vào một giọt

H2O2 trên lam kính, quan sát hiện tượng

Đọc kết quả:

- Catalase (+): Giọt H2O2 sủi bọt khí

- Catalase (-): Không có hiện tượng sủi bọt khí [9]

2.7 Khảo sát chỉ tiêu VSV có trong nước

• Giặt giũ, tắm rửa gần sát nguồn nước

• Nước thải từ nhà máy không được sử lý

• Sử dụng phân hóa học, thuốc trừ sâu trên đồng ruộng

• Chất thải từ hoạt động chăn nuôi thải trực tiếp vào nguồn nước

• Đục phá ống nước làm cho chất bẩn ngấm vào nguồn nước

Ảnh hưởng của nguồn nước bị nhiễm bẩn đến sức khỏe:

• Các bệnh đường tiêu hóa: Tiêu chảy, tả, lỵ, thương hàn…

• Các bệnh ký sinh trùng: Giun, sán, chấy, rận…

• Các bệnh côn trùng lien quan tới nước: Sốt rét, sốt xuất huyết…

• Các bệnh do siêu vi trùng: Bại liệt, viêm gan A…

• Các bệnh ngoài da: Hắc lào, lang ben, đau mắt hột, phụ khoa…

• Các bệnh nhiễm do chất độc có trong nước

có cùng tần suất trong tháng giáp vòng trong năm

2.7.2 Phương pháp màng lọc

Phương pháp này được dùng để định lượng vi sinh vật trong mẫu nước khitiến hành các thử nghiệm trong môi trường nơi có mật độ vi sinh tương đối thấp.Phương pháp này gồm các bước lọc để tập trung vi sinh vật dựa vào số lượng khuẩnlạc đếm được sau khi đặt màng lọc trên môi trường thạch có phần dinh dưỡng thíchhợp cho loại vi sinh vật cần kiểm

Dựa trên khối lượng mẫu nước ban đầu và quy ước là mỗi khuẩn lạc đượchình thành từ 1 tế bào vi sinh vật, người ta quy ra số lượng vi sinh vật có trong mộtđơn vị thể tích nước Như vậy, phương pháp này là sự kết hợp giữa phương pháp lọc

vô trùng và phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa petri

Trước khi thao tác cần phải khử trùng tay bằng cồn Gồm các bước:

Bước 1: Để đĩa thạch ra ngoài cho nguội (thạch được đổ vào trong các đĩapetri và được bảo quản trong tủ lạnh)

Bước 2: Đánh số thứ tự mẫu, thể tích mẫu, ngày làm mẫu lên mặt đáy đĩa.Bước 3: Mở nắp phễu lọc, đốt phễu lọc và chung quanh phễu bằng cồn

Bước 4: Tráng phễu bằng nước cất

Bước 5: Mở máy, mở van xả

Bước 6: Đóng van, mở phễu lọc ra (cầm trên tay)

Bước 7: Đặt tấm giấy lọc vào ( giấy lọc màu trắng mặt hướng lên trên)

Bước 8: Mở van cho nước thấm ướt giấy lọc

Bước 9: Gắn phễu lọc, khóa van cho mẫu vào

Bước 10: Mở van đến khi hết nước, khóa van lại

Bước 11: Đốt nóng pence, dùng pence gắp giấy lọc ra (gấp ở mép giấy lọc)Bước 12: Đặt từ từ lên mặt đĩa thạch để tránh bọt khí

Bước 13: Để ngửa hộp khi ủ vào tủ ấm

Bước 14: Đốt lại phễu lọc, đậy nắp, tắt máy

2.7.3 Phân tích chỉ tiêu vi sinh trong nước

2.7.3.1 Sơ đồ kiểm tra chỉ tiêu nước sinh hoạt

Nước sinh hoạt là nước phục vụ cho nhu cầu sống hằng ngày như nấu ăn, vệsinh và sản xuất chế biến Bao gồm nước máy trên mạng, nước máy trên bồn vànước giếng đã hoặc chưa xử lý

Mẫu nước 100ml

Chromocult Coliform agar

(CA)Lọc

Sơ đồ2.1: tổng quát kiểm nghiệm vi sinh vật trong nước sinh hoạt

2.7.3.2 Sơ đồ kiểm tra chỉ tiêu nước uống

Nước uống bao gồm nước khoáng đóng chai, bình, nước đá

Chọn khuẩn lạc điển hình Ủ 370C/24h

Nutrient agar(NA)

Cấy chuyên khuẩn lạc

Cấy chuyển khuẩn lạc

Sơ đồ2.2: Tổng quát kiểm nghiệm chỉ tiêu nước uống

2.7.4 Kỹ thuật định lượng vi sinh vật trong nước bằng phương pháp màng lọc

2.7.4.1 Định lượng Coliform và E coli

a)Nguyên tắc

Sử dụng phương pháp màng lọc để lọc nước

Chọn khuẩn lạc điển hình từ môi trường CA ủ ở 370C/24h cấy ria sang môitrường thạch nghiêng NA Sau đó ủ ở 370C/24h và cấy chuyển sang BGBL và thử

Indole để xác định sự hiện diện của coliform và E.coli trong nước.

b)Hóa chất môi trường và thuốc thử

Môi trường nuôi cấy:

Chromocult

Chọn khuẩnlạc điểnhình

Chọn khuẩnlạc điểnhình

Chọn khuẩnlạc điểnhình

BGBL BGBL Test sinh hóa Test Catalase (-)

Streptococcus faecalis

Vi khuẩn

kỵ khí