PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH DẤU ACID NUCLEIC pptx

MỤC ĐÍCH ĐÁNH DẤUTạo mẫu dò cho lai phân tử để xác nhận sự hiện diện của yếu tố đặc hiệu của sinh vật đích dựa vào đặc tính bắt cặp bổ sung của acid nucleic... Nguyên tắc làm việc Với ph

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP HỒ CHÍ MINH

Viện: Công Nghệ Sinh Học và Thực Phẩm

Bộ môn: Hóa sinh động vật



GVHD: Th.S Trần Hồng Bảo Quyên

DANH SÁCH NHÓM

TT HỌ TÊN SINH VIÊN

1 Trương Văn Hiền

2 Nguyễn Xuân Giang

3 Hoàng Thị Lộc

4 Trương Thị Thúy Nga

5 Mai Nguyễn Bảo Ngân

6 Bùi Thị Hồng Ngọc

7 Nguyễn Kiều Oanh

NỘI DUNG CHÍNH

I Mục đích đánh dấu

II Tác nhân đánh dấu

III Phương pháp đánh dấu

IV Các enzyme tham gia

I MỤC ĐÍCH ĐÁNH DẤU

Tạo mẫu dò cho lai phân tử để xác nhận sự hiện diện của yếu tố đặc hiệu của sinh vật đích dựa vào đặc tính bắt cặp bổ sung của acid nucleic.

II TÁC NHÂN ĐÁNH DẤU 2.1 BẰNG ĐỒNG VỊ PHÓNG XẠ

2.1.1 Nguyên tắc làm việc

Với phương pháp đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ, người ta thường dùng 32P, 35S, 3H phát ra tia Beta năng lượng cao Việc phát hiện các mẫu dò được tiến hành nhờ kĩ thuật phóng xạ tự ghi.

II TÁC NHÂN ĐÁNH DẤU 2.1 BẰNG ĐỒNG VỊ PHÓNG XẠ

2.1.2 Ưu – nhược điểm

Ưu điểm:

Nhược điểm:

và xử lí chất thải

chu kì bán rã của các đồng vi phóng xạ

II TÁC NHÂN ĐÁNH DẤU

2.2 BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC

2.2.1 Sử dụng avidine – biotine:

Avidine được gắn với một nhóm phát huỳnh

quang hay một enzim xúc tác cho phản ứng tạo

màu.

Biotine được gắn vào DNA nhờ phản ứng hóa học hoặc DNA được tổng hợp từ những nucleotide có gắn biotine

II TÁC NHÂN ĐÁNH DẤU 2.2 BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC

2.2.1 Sử dụng avidine – biotine:

Sau đó, biotine hiện diện trong phân tử lai được phát hiện khi cho ligand của nó là avidine vào phản ứng Kết quả là những tín hiệu màu nhận được trên màng lai.

II TÁC NHÂN ĐÁNH DẤU 2.2 BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC

2.2.2 Dựa trên sự phát quang sinh học:

Đầu tiên mẫu dò được đánh dấu bằng peroxidase

Sau đó cho tiếp xúc với một cơ chất của

peroxidase có khả năng phát sáng khi bị biến đổi.

Ánh sáng sẽ phát sáng lên phim và kết quả thu nhận là những chấm trên phim.

II TÁC NHÂN ĐÁNH DẤU 2.2 BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC

2.2.3 Ưu – nhược điểm:

Ưu điểm:

Nhược điểm: độ nhạy kém

III PHƯƠNG PHÁP DÁNH DẤU 3.1 PHƯƠNG PHÁP NICK – TRANSLATION

III PHƯƠNG PHÁP DÁNH DẤU 3.2 PHƯƠNG PHÁP RANDOM PRIMING

III PHƯƠNG PHÁP DÁNH DẤU 3.3 PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH DẤU CÁC

OLIGONUCLEOTIDE

III PHƯƠNG PHÁP DÁNH DẤU 3.4 PHƯƠNG PHÁP TẠO MẪU DÒ RNA

(a)Gắn DNA vào vùng PCS

(b)Cắt plasmid ở vị trí ngay sau đoạn gene (so với promoter định sử dụng), tạo dạng thẳng

(c)Thêm SP6 hoặc T7 RNA pol và các nucleotide tự do, trong đó

có 1 loại nucleotide đánh dấu

(d)Chọn lại các phân tử đánh dấu

có trình tự và kích thước mong muốn

IV CÁC ENZYME THAM GIA

DNAse I có tác dụng:

•Loại DNA tạp nhiễm trong các phân đoạn RNA hay protein

•Tạo các chỗ đứt (nick) trên DNA trong kĩ thuật đánh dấu mẫu

dò kiểu Nick – translation

•Phát hiện các gen hoạt động trên nhiễm sắc chất

IV CÁC ENZYME THAM GIA

DNA polymerase I có hoạt tính:

•Exonuclease: thủy giải dần liên kết giữa các nucleotide từ

đầu phân tử DNA theo 2 chiều 5’ – 3’ và 3’ – 5’

•Polymerase: tổng hợp theo chiều 5’ – 3’

Klenow của DNA pol I

•Có hoạt tính polymerase và exonuclease

•Mất đi hoạt tính 5’ – 3’ không mong muốn

IV CÁC ENZYME THAM GIA

Enzim t4 polynucleotid kinase: xúc tác sự chuyển nhóm

gama-phosphate của ATP cho đầu 5’ của DNA hay RNA Có hai kiểu phản ứng:

•Nhóm gama- phosphate được chuyển đến đầu 5’ của một

DNA đã mất nhóm phosphate

•Khi có một lượng thừa ADP, DNA chuyển nhóm phosphate cho ADP và nhận nhóm gama- phosphate

T4 DNA ligase: nối 2 trình tự DNA đầu bằng

IV CÁC ENZYME THAM GIA

T7 RNA polymerase: có nguồn gốc từ phage xâm nhiễm

E.coli, xúc tác sự tổng hợp RNA từ một mạch của một phân tử DNA mạch đôi theo chiều 5’ – 3’

SP6 RNA polymerase: có nguồn gốc từ phage xâm nhiễm

Salmonella Typhimurium, có chức năng giống với T7