Họ và tên Nguyễn Thị Thu Hoài Lớp Dược 2 Mã sinh viên 20010524 Môn Thực hành hóa sinh BÁO CÁO THỰC HÀNH BÀI 2 ĐỊNH TÍNH PROTEIN VÀ MỘT SỐ PHẢN ỨNG KẾT TỦA PROTEIN I Phản ứng Biuret xác định liên kết peptid 1 Chuẩn bị Thuốc thử Dung dịch protein trứng khoảng 1% pha loãng 1 lòng trắng trứng với 15 thể tích nước cất, lọc qua vài lần vải gạc, bảo quản ở 4C Khi dùng pha loãng 0,1% Dung dịch gelatin 0,1% trong nước Dung dịch glycin 0,1% trong nước Dung dịch CuSO4 1% trong nước Dung dịch NaOH 10% trong.
Trang 1Họ và tên: Nguyễn Thị Thu Hoài
Lớp: Dược 2
Mã sinh viên: 20010524
Môn: Thực hành hóa sinh
BÁO CÁO THỰC HÀNH
BÀI 2: ĐỊNH TÍNH PROTEIN VÀ MỘT SỐ PHẢN ỨNG KẾT TỦA
PROTEIN
I Phản ứng Biuret xác định liên kết peptid
1.Chuẩn bị:
Thuốc thử:
- Dung dịch protein trứng khoảng 1%:
pha loãng 1 lòng trắng trứng với 15 thể
tích nước cất, lọc qua vài lần vải gạc,
bảo quản ở 4°C Khi dùng pha loãng
0,1%
- Dung dịch gelatin 0,1% trong nước
- Dung dịch glycin 0,1% trong nước
- Dung dịch CuSO4 1% trong nước
- Dung dịch NaOH 10% trong nước
Dụng cụ:
- Ống nghiệm nhỏ, giá
- Pipet Pasteur
- Quả bóp cao su 2 mL hoặc 1 mL
2.Cách tiến hành:
Dung dịch protein trứng 0,1%
Dung dịch gelatin 0,1% (giọt) 5
Dung dịch glycin 0,1% (giọt) 5
Dung dịch NaOH 10%
Dung dịch CuSO4 1%
Lắc đều, phản ứng được coi là dương tính khi có màu tím rõ rệt Quan sát sự thay đổi màu trong các ống
Trang 23 Kết quả thí nghiệm
Ống 1: Trong Protein trứng có chứa liên kết peptid (do chứa rất nhiều loại acid
amin liên kết với nhau) nên trong MT kiềm và có mặt Cu2+ sẽ tạo ra phức hợp anion có màu tím
Ống 2: Trong Gelatin có chứa liên kết peptid (do chứa rất nhiều loại acid amin
liên kết với nhau) nên trong MT kiềm và có mặt Cu2+ sẽ tạo ra phức hợp anion có màu tím
Ống 3: Glycin là một acid amin không chứa liên kết peptid, phản ứng không có
màu
II Xác định điểm đẳng điện của protein.
1.Chuẩn bị:
Thuốc thử và vật liệu thí nghiệm:
Pha dung dịch đệm acetat có pH=3,6-5,8
Ống số CH 3 COOH 0,2M
(ml)
CH 3 COONa 0,2(ml)
pH của dung dịch
- Dung dịch tanin 0,1%
Không màu Màu tím Màu khác
(ghi rõ)
Trang 3- Dung dịch albumin trứng 1% (chuẩn bị giống bài 1)
Dụng cụ:
- Pipet 1 ml
- Ống nghiệm nhỏ
2.Cách tiến hành:
Dung dịch đệm pH=3,6 (ml) 1
Dung dịch protein trứng (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Lắc đều Để 5 phút So sánh độ đục của các ống trước và sau khi cho tanin: Phân biệt mức độ đục (không đục, đục ít, nhiều, rất nhiều)
3 Kết quả thí nghiệm
Không đục
Đục ít Đục
nhiều
Đục rất nhiều
Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5
Giả sử sau khi kết thúc phản ứng ta thấy ống 2 đục rất nhiều, các ống còn lại đục ít
và không đục
Giải thích hiện tượng:
Trang 4Ống 2 có pH=3,8 có hiện tượng đục rất nhiều nói cách khác với dung dịch đệm có pH=3,8 làm cho protein tủa mạnh nhất chứng tỏ pH=3,8 gần với giá trị pI (điểm đẳng điện) của protein
III Phân lập protein bằng phương pháp diêm tích.
1.Chuẩn bị:
Thuốc thử và vật liệu thí nghiệm:
- Dung dịch protein trứng: Khuấy kỹ 3 lòng trắng trứng trong 1000 ml nước cất Lọc qua vài lớp vải gạc (Tương ứng với protein 1%)
- Dung dịch (NH4)2SO4 bão hoà
- Bột (NH4)2SO4 bão hoà
- Bột (NH4)2SO4 mịn
- Bột NaCl mịn
- Dung dịch CH3COOH 1% ( AcOH 1%)
- Thuốc thử Biuret (dd NaOH 10% và CuSO4 1%)
Dụng cụ:
- Ống nghiệm
- Pipet 5 ml
- Pipet Pasteur
- Phễu nhỏ, Giấy lọc
2.Cách tiến hành:
Diêm tích albumin và globulin bằng NaCl:
Bước 1: Trong 1 ống nghiệm: cho 4 ml dung dịch protein trứng 1% Thêm bột NaCl đến bão hoà hoàn toàn (còn một ít bột không tan) Sau vài phút, globulin sẽ tủa
Bước 2: Lọc bỏ tủa globulin (pha NaCl rồi thấm qua giấy lọc trước khi lọc) Dịch còn lại là albmin (không tủa trong NaCl bão hoà) Thêm vào dịch lọc 2 giọt acid
acetic 1% rồi đun sôi, albumin sẽ kết tủa Sau vài phút, lọc loại tủa albumin rồi làm phản ứng Biuret tìm protein trong dịch lọc
Trong 1 ống nghiệm cho: 10 giọt dịch hoà tan và 10 giọt thuốc thử Biuret
Trang 5Lắc đều Quan sát.
Kết quả thí nghiệm:
Phản ứng âm tính (dung dịch sau phản ứng có màu xanh da trời nhạt)
Giải thích hiện tượng:
Do trước khi làm phản ứng Biuret để tim protein thì ta đã lọc bỏ hết globulin và albumin (2 thành phần chủ yếu cấu tạo nên protein trứng) nên dung dịch sau phản ứng không có màu tím và phản ứng âm tính
Diêm tích albumin và globulin bằng (NH 4 ) 2 SO 4 :
Bước 1: Trong 1 ống nghiệm: cho 2ml dung dịch protein trứng 1%, thêm 2ml dung dịch sulfat amon bão hoà, globulin sẽ tủa Sau 5 phút, lọc để loại tủa globulin Trong dịch lọc còn lại albumin Thêm một ít bột sulfat amon cho đến bão hoà (còn
dư một ít không tan), tủa albumin sẽ nổi lên trên
Bước 2: Thêm nước cất vào ống nghiệm để làm mất nồng độ bão hoà của sulfat amon Tủa albumin sẽ hoà tan trở lại Dùng dung dịch hoà tan tủa ở trên làm phản ứng Biuret để tìm protein
Trong 1 ống nghiệm cho: 10 giọt dịch hoà tan
10 giọt thuốc thử Biuret
Lắc đều Quan sát
Kết quả thí nghiệm:
Phản ứng dương tính và dưng dịch sau phản ứng có màu tím
Giải thích hiện tượng:
Do tủa albumin đã hoà tan trở lại ở bước 2, tức là trong dung dich vẫn còn albumin nên sau khi thực hiện phản ứng Biuret dung dịch có màu tím và phản ứng dương tính