Tài liệu Giới thiệu một số phương pháp tách ADN từ máu toàn phần pot

TCNCYH 23 3 2003 Giới thiệu một số phương pháp tách ADN từ máu toàn phần Lê Hoàn, Trần Khánh Chi, Phạm Thị Nguyệt Hằng, Bạch Khánh Hòa Đại học Y Hà Nội Tách chiết ADN là khâu cơ bản

TCNCYH 23 (3) 2003

Giới thiệu một số phương pháp tách ADN

từ máu toàn phần

Lê Hoàn, Trần Khánh Chi, Phạm Thị Nguyệt Hằng, Bạch Khánh Hòa

Đại học Y Hà Nội

Tách chiết ADN là khâu cơ bản và rất quan trọng trong kỹ thuật sinh học phân tử Chúng tôi đã tiến hành một số kỹ thuật tách chiết ADN từ máu ngoại vi: kỹ thuật Perchlorate sodium, kỹ thuật Acetate amonium, kỹ thuật QIA ampkit Đồng thời so sánh các kỹ thuật đó với nhau dựa trên một

số tiêu chuẩn Kết quả cho thấy kỹ thuật Perchlorate sodium có nhiều ưu điểm nhất Kỹ thuật này

đang được sử dụng thường qui tại Labo Trung tâm Y sinh học, Đại học Y Hà Nội

I Đặt vấn đề

ADN (Acid Deoxyribose Nucleic) là một

đại phân tử được cấu thành từ các đơn phân là

nucleotid Trong cơ thể, tất cả các tế bào có

nhân đều chứa phân tử ADN Phân tử này mang

toàn bộ thông tin di truyền của cá thể Nguồn

thông tin di truyền đó được ổn định nhờ hoạt

động tự sao chép của ADN theo nguyên tắc

“bán bảo tồn" Đồng thời thông qua hoạt động

của các bộ máy tế bào, nguồn thông tin này

được chuyển sang các phân tử ARN thông tin

ra ngoài bào tương tổng hợp nên phân tử

protein:

ADN sao mã mARN dịch mã Protein

Trên cơ sở đó, sinh học phân tử đã phát triển

các kỹ thuật di truyền trên ADN vào nghiên

cứu và chẩn đoán một số bệnh Để thực hiện kỹ

thuật này đòi hỏi phải có nguồn nguyên liệu

ADN đảm bảo cả về chất và lượng Vì vậy, tách

chiết ADN là khâu đầu tiên, cơ bản và rất quan

trọng trong các qui trình thao tác trên ADN

Với tầm quan trọng đó, đề tài này tiến hành

ứng dụng một số kỹ thuật tách ADN khác nhau

và so sánh chúng với nhau

Mục đích của đề tài là tìm ra một kỹ thuật

phù hợp nhất với các tiêu chuẩn về: chất lượng

ADN, hàm lượng ADN, thời gian tiến hành, chi

phí thực hiện và mức độ độc hại đối với người thực hiện

II Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

1 Đối tượng

Máu ngoại vi chống đông bằng EDTA

2 Phương pháp nghiên cứu

Thực hiện một số kỹ thuật tách ADN khác nhau với nguyên lý cơn bản gồm 4 bước:

• Phá vỡ hồng cầu

• Phá vỡ bạch cầu

• Loại bỏ protein

• Tủa ADN

2.1 Kỹ thuật tách ADN bằng Perchlorate sodium

(Kỹ thuật của S.A Miller, D.D Dykes, H.F Polesky - 1988)

• Hoá chất:

- Dung dịch I (cho 1 lít):

Sucrose 0,3M 102g Tris HCl 1M pH7.5 10mM 10ml

TCNCYH 23 (3) 2003

MgCl2 5mM 1g

Triton 100 1% 10ml

- Dung dịch II (cho 500ml):

NaCl 0,0075M 2,19g

EDTA 0,024M 4,46g

- SDS (Sodium Dodecyle Sunfate) 10%

- Perchlorate sodium 5M

- NaCl 6M

- Cồn tuyệt đối

- Cồn 70%

- T.E (cho 1lít) gồm:

Tris HCl 1M pH8 10ml

EDTA 0,5M pH8 2ml

• Qui trình tách:

➢ Phá vỡ hồng cầu:

- Lấy 10ml máu chống đông bằng EDTA

- Thêm vào đó dung dịch I cho đủ 50ml

- Trộn đều, ly tâm 4200 vòng/ 10 phút/ 40C

- Loại bỏ nước nổi, thu được cặn trắng (nếu

còn hồng cầu thì tiếp tục loại bỏ hồng cầu bằng

dung dịch I)

➢ Phá vỡ bạch cầu:

- Sau khi thu được cặn trắng cho thêm vào:

4,5ml dung dịch II

125àl SDS 10%

1,1ml perchlorate sodium 5M

10àl Proteinase K 10mg/ ml

- Trộn đều, ủ 420C/ 30 phút, lắc nhẹ

- Thêm 2ml NaCl 6M

- Trồn đều, ly tâm 3500 vòng/ 15 phút/ 40C

➢ Tủa ADN:

- Lấy nước nổi sang một tube khác

- Thêm vào 2,5 thể tích cồn tuyệt đối, lắc

nhẹ, ủ ở -300C qua đêm thu được tủa ADN dạng hình sứa

- Rửa tủa bằng cồn 70%, để khô, hoà tủa

bằng T.E

2.2 Kỹ thuật tách ADN bằng acetate d'ammonium

(Kỹ thuật của S.A.Miller, D.D.Dykes, H.F.Polesky - 1988)

• Hoá chất T.E 20-5: TrisHCl 20mM EDTA 5mM

- Sarkosyl 20%

- Proteinase K 10mg/ ml

- Acetate d'ammonium

- Cồn tuyệt đối

- Cồn 70%

• Qui trình tách

➢ Phá vỡ hồng cầu:

- Lấy máu chống đông bằng EDTA

- Trộn đều, ly tâm nhẹ 2000 vòng/ 15 phút

- Lấy phần huyết tương giàu bạch cầu, đặt

trong đá 30 phút

- Thêm vào 15ml dung dịch T.E 20-5, trộn

đều, ly tâm 1500 vòng/ 10 phút

- Loại bỏ nước nổi, thu cặn trắng

• Phá vỡ bạch cầu và loại protein:

- Sau khi thu được cặn trắng, thêm vào:

3,5ml T.E 20-5

TCNCYH 23 (3) 2003

175àl Sarkosyl 20%

75àl proteinase K

- Lắc đều, ủ 370C qua đêm

- Loại bỏ protein

- Thêm 2ml acetate d'ammonium 7,5M

- Ly tâm 3500 vòng/ 15 phút/ 40

C

• Tủa ADN:

- Lấy nước nổi sang một tube khác

- Thêm 15ml cồn tuyệt đối

- Trộn đều thu được tủa ADN hình sứa

- Rửa tủa bằng cồn 70%, để khô, hoà tan tủa

bằng T.E

2.2.3 Kỹ thuật tách ADN bằng QIA

ampkit (Microtechnique)

• Nguyên tắc: Kỹ thuật này tách ADN từ

máu ngoại vi bằng QIAamp minikit có sẵn

• Qui trình tách:

- Cho 20àl QIAGEN protease (hoặc

proteinase K) vào eppendorf 1,5ml

- Thêm vào đó 200àl Buffer AL, lắc bằng

máy khuấy trộn Vortex 15 giây

- ủ 560C/ 10 phút

- Thêm 200àl cồn tuyệt đối, trộn đều bằng

máy Vortex

- Chuyển sang cột QIAGEN, ly tâm 8000

vòng/ 10 phút, sau đó chuyển cột QIAGEN vào tube 2ml sạch khác

- Thêm 500àl Buffer AW1 vào cột

QIAGEN, ly tâm 8000 vòng/ 1 phút, đặt cột QIAGEN vào tube 2ml sạch khác

- Thêm 500àl Buffer AW2, ly tâm 14000

vòng/ 3 phút

- Đặt cột QIAGEN vào tube ly tâm 1,5ml,

thêm 200àl Buffer AE, để ở nhiệt độ phòng 1 phút, sau đó ly tâm 8000 vòng/ 1phút

III Kết quả

1 Đo hàm lượng và đánh giá độ tinh khiết của ADN bằng máy quang phổ kế

- Đo mật độ quang của dung dịch ADN ở

bước sóng 260nm và ở bước sóng 280nm

- Hàm lượng ADN được xác định theo công

thức:

[ADN] àg/ml = OD260*Hệ số pha loãng*50

- Đánh giá độ tinh khiết của ADN qua tỷ số

OD260/ OD280 ADN được coi là tinh khiết khi: 1,6<OD260/ OD280<2

Bảng 1: Hàm lượng và độ tinh khiết của ADN tách bằng các kỹ thuật khác nhau

KT OD260 OD280 OD260/ OD280 ADN (àg/ml)

Acetate amonium 0.838 0.513 1.64 16.76

TCNCYH 23 (3) 2003

2 Điện di kiểm tra ADN

- Bản gel điện di có 6 giếng, cho vào mỗi

giếng một thể tích ADN như nhau

Hình 1: Điện di kiểm tra ADN trên gel

agarose 0,8%, điện thế 100 V, thời gian 20

phút

- Giếng số 1, 2: ADN tách từ kỹ thuật Perchlorate sodium

- Giếng số 3, 4: ADN tách từ kỹ thuật QIA ampkit

- Giếng số 5: ADN tách từ kỹ thuật Acetate Ammonium

- Giếng số 6: ADN chuẩn nông độ 12 àg/ml

- Kết quả cho thấy các băng sáng hiện rõ

nét, gọn và khá đều nhau

IV Bàn luận

Kỹ thuật QIA amp cho ADN chất lượng tốt

dù chỉ đi từ một lượng máu rất ít (200àl) Tuy

nhiên, chi phí cho kỹ thuật này khá cao nên

chưa được áp dụng rộng rãi

Hai kỹ thuật Perchlorate Sodium và Acetate d'ammonium có ưu điểm là dễ tiến hành, thời gian ngắn và chi phí vừa phải mà vẫn thu được ADN đảm bảo cả về chất và lượng Hơn nữa, hai kỹ thuật này đi từ một lượng máu khá lớn (10ml) nên lượng ADN thu được có thể sử dụng trong những kỹ thuật đòi hỏi một lượng ADN lớn như định nhóm kháng nguyên bạch cầu, định nhóm kháng nguyên tiểu cầu

ADN tách từ kỹ thuật perchlorate sodium có

độ tinh khiết cao hơn ADN tách từ kỹ thuật Acetate d'ammonium

V Kết luận Qua quá trình tiến hành các kỹ thuật trên cùng với kết quả thu được, chúng tôi nhận thấy rằng kỹ thuật Perchlorate Sodium là phù hợp nhất với những tiêu chuẩn đã đặt ra Hiện nay,

kỹ thuật này đang được sử dụng thường qui tại Labo Trung tâm Y Sinh học, Đại học Y Hà Nội

để tách ADN từ máu ngoại vi

Tài liệu tham khảo

1 Laboratoire d’immunologie plaquettaire: Fiches Techniques 1998, Vol.2

2 Biologie Moleculaire: Principes et techniques de base - Les techniques de PCR

3 Lê Đình Lương : Nguyên lí kỹ thuật di truyền 2001

Summary

Application and comparison of some methods of

extraction DNA from peripheral blood

DNA extraction is a basic and importance step in molecular biology technical DNA has been extracted from peripheral blood by some techniques as: Perchlorate sodium, Acetate amonium, QIA amp minikit At the same time, the comparison of those techniques depend on some standard

The result indicated: Perchlorate sodium DNA extraction is the best technique among the techniques mentioned above

This technique is daily used to extract DNA from peripheral blood at the Bio - Medical Centre Laboratory, Hanoi Medical University