Bài thuyết trình môn kỹ thuật gen

Bài thuyết trình kỹ thuật gen:Cắt nối chọn lọc tiền mRNA của gen sterol 27-hydroxylase CYP 27 gây ra bởi đột biến G thành A ở nucleotide cuối cùng của exon 6 trong bệnh nhân mắc bệnh ce

Bài thuyết trình kỹ thuật gen:

Cắt nối chọn lọc tiền mRNA của gen

sterol 27-hydroxylase (CYP 27) gây ra bởi đột biến G thành A ở nucleotide cuối cùng của exon 6 trong bệnh nhân mắc bệnh cerebrotendinous xanthomatosis (CTX).

Nhóm 6 _ Lớp 10-03

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học

Tìm hiểu về bệnh cerebrotendinous

xanthomatosis (CTX)

Bệnh cerebrotendinous xanthomatosis (CTX) cũng gọi là cholesterosis não là bệnh di truyền tính trạng trên

alen lặn, gây rối loạn chuyển hóa chất béo (cholesterol) Những người bị rối loạn này không thể phá vỡ chất béo cố định, gây dư thừa, do đó, các chất béo tích tụ ở nhiều nơi khác nhau trong cơ thể.

Xanthomatosis đề cập đến sự hình thành nốt sần mỡ màu vàng (xanthoma).

Cerebrotendinous đề cập đến các địa điểm điển hình của xanthoma (cerebro-có nghĩa là não bộ và các mô liên kết thuộc về gân được gọi là gân chú cơ xương).

Các biểu hiện khác của CTX bao gồm tiêu chảy mãn tính ở trẻ

sơ sinh, làm đục ống kính của mắt (đục thủy tinh thể), phát triển

chậm ở trẻ nhỏ, xương dần dần giòn dễ gãy, có các vấn đề về thần kinh ở tuổi trưởng thành, chẳng hạn như mất trí nhớ, co giật, ảo

giác, trầm cảm, và khó khăn với các phản ứng phối hợp (mất điều hòa) và nói

Các triệu chứng thần kinh gây ra bởi sự tích tụ các chất béo và ngày càng tăng số lượng của xanthoma trong não Xanthoma cũng

có thể tích tụ trong dây thần kinh (myelin), làm gián đoạn các tín

hiệu thần kinh trong não Thoái hóa (teo cơ) của mô não gây ra bởi

dư thừa tiền lipid cũng góp phần tăng các vấn đề về thần kinh

Xanthoma dây chằng (thường gặp nhất ở gân Achilles, gân kết nối gót chân của bàn chân cơ bắp chân) bắt đầu hình thành ở đầu tuổi trưởng thành Xanthoma gân có thể gây khó chịu và can thiệp tới sự linh hoạt gân

CTX cũng tăng nguy cơ phát triển bệnh tim mạch, sớm xơ vữa động mạch

Đột biến trong gen CYP27 là nguyên nhân gây bệnh CTX Gen CYP27 sản xuất enzyme sterol 27-hydroxylase, enzym đóng một vai trò quan trọng trong việc duy trì mức cholesterol bình thường trong cơ thể Enzyme này hoạt động phân hủy cholesterol được sử dụng trong quá trình tiêu hóa chất béo Đột biến trong sterol 27-hydroxylase làm giảm khả năng của acid mật để phá vỡ cholesterol Kết quả là, phân tử cholestanol, tương tự như cholesterol tích tụ xanthoma trong tế bào thần kinh, và não

Mức cholesterol không tăng trong máu, nhưng nó tăng cao ở các mô khác nhau khắp cơ thể Sự tích tụ cholesterol và cholestanol trong não, gân, và các mô khác gây ra các dấu hiệu và triệu chứng của Cerebrotendinous Xanthomatosis (CTX)

Hơn 50 đột biến gây CTX đã được xác định ở gen CYP27 Hầu hết những đột biến này thay đổi một codon của protein (amino acid) trong các enzyme sterol 27-hydroxylase Đột biến phổ biến nhất thay đổi A thành C ở

vị trí 362 trong protein Trong nghiên cứu này, chúng ta tìm hiểu về đột biến thay thế G thành A ở vị trí 362

Gen sterol 27-hydroxylase (CYP27)

Tóm tắt nghiên cứu

Nghiên cứu xác định được rằng đột biến G thành A tại nucleotide cuối cùng của exon 6 của gen sterol 27-hydroxylase (CYP 27) trong bệnh nhân mắc cerebrotendinous xanthomatosis (CTX) dẫn đến sự cắt nối chọn lọc tiền mRNA của gen.

Các đột biến tại vị trí -1 G của đầu nối 5’ (tương ứng với nucleotide cuối cùng của một exon) là tương đối hiếm vậy nên ảnh hưởng của những đột biến đến quá trình cắt nối tiền RNA ít được quan tâm để ý đến Bài báo cáo này là ví dụ đầu tiên của sự thay thế

G thành A tại nucleotide cuối cùng của exon 6 trên gen CYP 27 dẫn đến cắt nối chọn lọc của tiền mRNA, bao gồm 3 dạng: bỏ qua exon 6, kích hoạt một vùng mã hóa chưa rõ tại đầu nối 5’ và nối chính xác tiền mRNA mang theo đột biến G thành A Nghiên cứu đã tiến hành phân tích các sản phẩm phiên mã của gen đột biến này trong cơ thể

và khẳng định sự bất thường trong qúa trình cắt nối tiền mRNA.

Các phương pháp, kỹ thuật của

nghiên cứu

Điện di là kỹ thuật được dùng để phân tách và để tinh sạch các đại phân tử protein và các nucleic acid trên cơ sở kích thước/khối lượng, điện tích và cấu hình của chúng.

Trong nghiên cứu này,người ta sử dụng gel của agarose và polyacrylamide để phân tích các kết quả thí nghiệm.

Kỹ thuật điện di

I Kỹ thuật lai Northern blot

Phân tích RNA là công việc quan trọng của nhiều nghiên cứu về sinh học phân tử, vì nó có thể cung cấp thông tin về sự biểu hiện của gen trong cơ thể sống Phương pháp này được sử dụng nhằm phát hiện kích thước và trình tự nhất định của phân tử mRNA đặc trưng trong một hỗn hợp RNA cho phép người ta liên kết các mức độ biểu hiện mRNA với các tính chất hình thái và sinh lý của cơ thể sống Bằng cách lai RNA bằng các mẫu dò DNA (RNA) tạo nên các phân tử lai RNA-DNA (RNA-RNA).

Phương thức này bắt nguồn từ phân tích Southern blot dựa trên cơ

sở khả năng bổ sung của các nucleic acid sợi đơn để tạo thành các phân tử lai

Các bước thực tế

 30 µg ARN tổng số được tách chiết từ tế bào của 1 người khỏe mạnh và1 bệnh nhân sau đó được biến dị bởi điện di 1.6% formaldehyde trên gel agarose.

 Chuyển mẫu sang một màng nylon có điện tích dương.

 Sau khi prehybridization có nồng độ đệm cao trong SDS ở 50ºC trong 24h, lớp màng được lai tạo ở 50ºC trong 48h với các cDNA thăm dò mạch kép của sterol hydroxylase-27 hoặc β-actin thăm dò, đánh dấu bằng dygoxigenin-11-dUTP bởi phương pháp mồi ngẫu nhiên.

 Phát hiện được thực hiện với thuốc thử phát hiện màu từ Boehringer Mannheim

 Phân tích định lượng được thực hiện bằng cách bình thường hóa các tín hiệu để phân tích trung tâm β-actin của ARN sử dụng phần mềm NIH Image, 1.61.

Kết quả

Khi đột biến xảy ra tại nucleotide cuối cùng của exon 6, hiệu quả của nó trên phiên mã mRNA được phân tích trong in vivo Phân tích Northern blot RNA của bệnh nhân cho thấy một vạch rộng hơn so với mẫu bình thường (2.2 kb), chỉ ra rằng

có thể tồn tại loại nối mRNA khác ở bệnh nhân Không giảm rõ ràng hiệu quả phiên

mã, ở bệnh nhân (0,90) so với mẫu bình thường (0,97) được xác định bằng cách phân tích định lượng của các tín hiệu.

II Kỹ thuật PCR đảo ngược

RT-PCR (inverse PCR)

Phản ứng RT-PCR là phản ứng khuếch đại một đoạn khuôn mẫu RNA theo nguyên lý của PCR Do trong tự nhiên một số virus có hệ gen là RNA nên muốn khuếch đại một đoạn gen của nó thì người ta phải dùng kỹ thuật RT-PCR

Gồm 2 giai đoạn:

−Phản ứng biến đổi RNA hệ gen thành sợi cDNA thứ nhất

phải nhờ đến một enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) do vậy giai đoạn này được gọi là phiên mã ngược (RT) Sau đó quá trình tổng hợp sợi cDNA thứ hai lại nhờ một enzyme khác là cDNA polymerase I

−Khi đã có DNA sợi đôi từ khuôn mẫu RNA thì phản ứng tiếp

theo sẽ là khuếch đại gen nhờ kỹ thuật PCR được thực hiện với

ba mức nhiệt độ phù hợp ở mỗi chu kỳ, để nhân đoạn cDNA, tạo nên số lượng bản sao DNA cần thiết.

Kỹ thuật chung

Quá trình khuếch đại cDNA mạch

kép của gen sterol 27-hydroxylase

• 1 µg RNA tổng số được phiên mã ngược sang cDNA trong 20µl hỗn

hợp phản ứng có chứa 5 mm MgCl2, 1 x PCR đệm II, 1 mm của mỗi dNTP, 1 U chất ức chế RNase, 1 µm dT oligonucleotide và 5 U phiên mã ngược.

• Ống phản ứng được ủ ở 42ºC trong 60 phút (ghép và kéo dài), gia

nhiệt ở 95ºC trong 5 phút (bất hoạt phiên mã ngược và biến tính cDNA lai), sau đó ngâm ở 5ºC trong 5 phút trong một chu trình nhiệt.

RNA-• Khuếch đại PCR được thực hiện ngay sau phản ứng RT bằng cách

thêm 80 µl PCR Master Mix có chứa 1,25 mm MgCl2, 1 x PCR đệm II,

0,25 µm, đoạn mồi mạch 5’ FLup (nucleotide: 20-40,

5’CCATGGCTGCGCTGGGCTGCG 3’) và đoạn mồi mạch 3’ FLd

(nucleotide 1639-1618, 5’CCCAGCAAGGCGGAGACTCAGC 3’), 11.4 µl DMSO và 2.5 U Taq DNA polymerase

• Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong 30 chu kỳ dưới các điều

kiện sau đây: 1.5 phút ở 90ºC cho biến tính, 30 giây ở 68ºC cho gắn mồi,

và 2 phút (tăng 4 giây sau mỗi chu kỳ kế tiếp) tại 72ºC cho kéo dài

• Điện di được thực hiện trên một gel agarose 2% Phân tích định

lượng được thực hiện bằng cách quét gel, mật độ của các vạch đã được phân tích sử dụng phần mềm NIH Image, 1.61 β-actin được khuếch đại như một điều khiển cho việc phân tích định lượng.

Kết quả

Trong sản phẩm RT-PCR của bệnh nhân, tìm thấy hai mạch nhỏ hơn ngoài đoạn

có kích thước bình thường

so với mẫu bình thường Tỷ

lệ của ba loại là 1 : 0,84 : 0,16 (kích thước bình thường: kích thước ở giữa: kích thước nhỏ nhất) bằng cách phân tích định lượng

Số lượng kích thước bình thường ở bệnh nhân chiếm 54,1% RNA so với RNA của người khỏa mạnh được xác định bằng cách phân tích định lượng

III Phân tích trình tự gen

Phân tích trình tự gen là kỹ thuật xác định trình tự theo cấu trúc bậc một của chuỗi các nucleotide trong một phân tử nucleic acid, xác đinh vị trí, sắp xếp các nucleotide trong phân

tử DNA Trong những năm gần đây, một số phương pháp xác định trình tự mới nhờ sự hỗ trợ của máy tính_ Giải trình tự gen trên máy tự động.

Các bước thực tế

Trình tự phân tích DNA được thực hiện bằng cách sử dụng ABI PRISM™ 310 Genetical Analyzen

•Sản phẩm PCR hoặc là plasmid được đánh dấu bằng Taq kết thúc trình tự

phản ứng trong một chu trình nhiệt, dưới những điều kiện sau: 96ºC trong 10 giây, 50ºC trong 5 giây, và 60ºC trong 4 phút cho tổng cộng 25 chu kỳ.

•Sau khi loại bỏ các hợp chất nhân tố kết thúc dư thừa sử dụng cột Centri-Sep

Spin, các sản phẩm được đánh dấu phải được sấy khô, lơ lửng trong 25 µl phản ứng Suppression Template, và gia nhiệt đến 92ºC trong 2 phút cho biến tính

•Sau đó, các mẫu đã được nạp vào một ABI PRISM™ 310 Genetical Analyzer

để phân tích trình tự sử dụng các thuốc thử huỳnh quang Tất cả các mẫu được sắp xếp theo trình tự ở cả 2 đầu để xác nhận các đột biến đã được xác định Đoạn mồi sử dụng cho trình tự là:

+ FLup (nucleotide:20–40, 5’CCATGGCTGCGCTGGGCTGCG3’)

+ P357 (nucleotide 382–402, 5’GAGGGAAAGTACCCAGTACGG3’)

+ P359 (nucleotide:737–758, 5’CCTTCGTCAGATCCATCGGGTT3’)

+ P372 (nucleotide:1159–1181, 5’TTTGCCCACATGCCGTTGCTCAA3’)

+ FLd (nucleotide:1639–1618, 5’CCCAGCAAGGCGGAGACTCAGC3’)

Vector biểu hiện (expression vector) Phân tử DNA mạch

kép có mang các tín hiệu cần thiết (promoter, terminator và vùng liên kết ribosome) cho sự biểu hiện của một khung đọc mở (gen)

sẽ được nhân dòng và sản xuất protein tương ứng trong tế bào vật chủ Là vector có thể mang các gen ngoại lai mong muốn cho phép thực hiện sự phiên mã của các bản sao được tạo dòng và

sự dịch mã các mRNA của chúng trong tế bào vật chủ Để biểu hiện các gen ngoại lai trong tế bào bắt đầu bằng việc gắn nó vào trong vector biểu hiện (thường là plasmid)

IV Xây dựng vecter biểu hiện gen

Để quan sát kiểu nối khác nhau gây ra bởi sự đột biến G thành A

ở nucleotide cuối cùng của exon 6, hai minigene cấu tạo, có và không có đột biến, đã được tạo ra và được chuyển nạp vào các tế bào COS

Trình tự hệ gen từ exon 5 exon 9 của gen CYP27 từ bệnh nhân

và một đối tượng khỏa mạnh được khuếch đại bằng cách sử dụng mồi SPup 5’CGAAGATATGGAGGCCCAACT 3’ (nucleotide: 891-911)

và SPd 5’TCAGCACTGTCTCTGCAGGAAC 3’ (nucleotide: 1617)

1596-Phản ứng khuếch đại PCR được thực hiện trong 30 chu kỳ trong điều kiện sau: 1 phút ở 95ºC cho biến tính và 4 phút ở 68ºC gắn mồi

và kéo dài Phần đầu (5’) đoạn mồi Spup chứa một codon bắt đầu ATG và vị trí tương đối -3 của ATG là một G được coi đảm bảo dịch hiệu quả Phần cuối (3’) đoạn mồi SPd chứa codon kết thúc TGA Sau khi xác nhận khuếch đại thành công đoạn dài 2111 bp bằng điện di agarose gel, chèn trực tiếp vào vector biểu hiện gen pTARGET ™ trong đó có chứa CMV ngay đầu khu vực enhancer / promoter, một intron khảm biểu hiện mức độ cao chèn, và các tín hiệu SV40 polyadenylation ở cuối Plasmid của các cấu trúc minigene bằng JETSTAR plasmid Kit Hai minigenes có cấu trúc tương tự, ngoại trừ đột biến G-A ở nucleotide cuối cùng của exon

6, có xác nhận bởi phân tích trình tự.

V Gây đột biến điểm định hướng

(site-directed mutagenesis)

Gây đột biến điểm định hướng (site-directed mutagenesis) là quá trình tạo ra một biến đổi xác định trên DNA bằng cách sử dụng một oligonucleotide tổng hợp (primer) có một biến đổi trong trình tự nucleotide.

Để phân tích biểu hiện đột biến của cDNA chuỗi kép mang đột biến

G thành A được tái tạo trong một cDNA thể mã hóa sterol hydroxylase người Đột biến định hướng của cDNA được thực hiện bằng cách sử dụng pKF18k vector và kit của Takara Sau đó, cDNA bình thường và cDNA đột biến của sterol 27 hydroxylase được chèn vào vecter biểu hiện gen pTARGET ™ bởi vùng Eco RI Các trình tự nucleotide của cDNA bình thường và đột biến cDNA được xác nhận bởi phân tích trình tự Plasmid cho chuyển nhiễm đã được chuẩn bị bằng cách sử dụng JETSTAR plasmid Kit.

27-VI Kỹ thuật chuyển nhiễm

Chuyển nhiễm là quá trình cố tình chuyển các axit nucleic

vào các tế bào Thuật ngữ này được sử dụng đặc biệt là cho các phương pháp không virus trong tế bào nhân chuẩn Vật chất di truyền (như DNA plasmid supercoiled hay siRNA xây dựng), hoặc thậm chí protein như các kháng thể, có thể được chuyển nhiễm Chuyển nhiễm của tế bào động vật thường liên quan đến việc mở các "lỗ hổng" trong màng tế bào , cho phép

sự hấp thu của vật liệu Chuyển nhiễm có thể dẫn đến hình thái bất ngờ và bất thường trong các tế bào mục tiêu.

COS-1 tế bào thu được từ Ngân hàng tế bào JCRB đã được duy trì trong DMEM có chứa 10% huyết thanh thai bê và được sử dụng

Để xác định hiệu quả của đột biến G thành A sterol hydroxylase hoạt động, 20 µg plasmid mang cDNA bình thường hoặc cDNA đột biến tương tự được chuyển nạp ba lần vào 1 x 10^6 tế bào.

27-Sau 48h, các tế bào đã được thu hoạch chuyển vào các ty thể

bị cô lập tiểu phần nhỏ được sử dụng cho khảo nghiệm sterol hydroxylase.

27-Các bước thực tế

Phân tích trình tự xác nhận vạch ở 726

bp quan sát trong minigen bình thường tương ứng với loại RNA có cách cắt nối chính xác Mặt khác, vạch đậm được quan sát thấy trong các minigen đột biến thiếu exon 5 và exon 6, và một vạch mờ

là minigen thiếu exon 6, vạch mờ còn lại mất 1 đoạn 88 bp (tính ngược từ đầu 3’ của exon) và sử dụng một mối nối chưa

rõ nào đó ở đầu 5’ (Hình A)

Xác định các mạch cDNA bất thường được tạo ra bởi cắt nối chọn lọc tiền mRNA do đột biến, minigen cấu trúc gồm trình tự gen từ exon 5 đến exon 9 của gen CYP27, có hoặc không có đột biến, được chuyển nạp vào các tế bào COS RT-PCR phân tích của RNA tổng

số được chiết xuất từ các tế bào chuyển nạp sử dụng mồi SPup và SPd, cho thấy một vạch duy nhất ở 726 bp ở minigen bình thường Trong khi ở minigen đột biến, có 1 vạch đậm ở 412 bp và 2 vạch

mở 560 và 638 bp (Hình B)