ĐỒ án PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH

MỤC LỤC LỜI NÓI ĐẦU 1 CHƯƠNG I TỔNG QUAN VỀ VI SINH VẬT SALMONELLA 2 1 1 Lịch sử phát hiện 2 1 2 Phân loại 3 1 3 Đặc điểm 5 1 3 1 Đặc điểm chung và đặc điểm nuôi cấy 5 1 3 2 Tính chất hóa sinh 5 1 3 3 Cấu trúc của Salmonella 6 1 3 4 Cơ chế gây bệnh 8 1 3 5 Nguồn gốc lây bệnh 9 1 3 6 Tình hình nhiễm Salmonella trong nước và trên thế giới 10 1 3 6 1 Trong nước 10 1 3 6 2 Trên thế giới 10 1 3 7 Các chỉ tiêu Salmonella trong thực phẩm 11 CHƯƠNG II QUY TRÌNH PHÂN TÍCH VI SIN.

MỤC LỤC

LỜI NÓI ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN VỀ VI SINH VẬT SALMONELLA 2

1.1 Lịch sử phát hiện 2

1.2 Phân loại 3

1.3 Đặc điểm 5

1.3.1 Đặc điểm chung và đặc điểm nuôi cấy 5

1.3.2 Tính chất hóa sinh 5

1.3.3 Cấu trúc của Salmonella 6

1.3.4 Cơ chế gây bệnh 8

1.3.5 Nguồn gốc lây bệnh 9

1.3.6 Tình hình nhiễm Salmonella trong nước và trên thế giới 10

1.3.6.1 Trong nước 10

1.3.6.2 Trên thế giới 10

1.3.7 Các chỉ tiêu Salmonella trong thực phẩm 11

CHƯƠNG II QUY TRÌNH PHÂN TÍCH VI SINH VẬT SALMONELLA 13

2.1 Thu và bảo quản mẫu thực phẩm 13

2.1.1 Lấy mẫu theo lô hàng 13

2.1.2 Lấy mẫu theo dây chuyền sản xuất 13

2.1.3 Thu mẫu vệ sinh công nghiệp 13

2.1.4 Thu mẫu ở cửa hàng hoặc chợ 13

2.1.5 Dụng cụ lấy mẫu 13

2.1.6 Bảo quản và vận chuyển 13

2.1.7 Chuẩn bị mẫu thực phẩm 14

2.2 Sơ đồ phân tích tổng quát vi sinh vật Salmonella 15

2.3 Phương pháp truyền thống ( Phương pháp nuôi cấy ) 16

2.3.1 Nguyên tắc xác định 16

2.3.2 Môi trường nuôi cấy 17

2.3.3 Quy trình xác định 19

2.3.4 Thuyết minh quy trình 19

2.3.4.1 Tăng sinh 19

2.3.4.2 Tăng sinh chọn lọc 20

2.3.4.3 Phân lập và nhận diện 20

2.3.4.4 Khẳng định 22

2.3.4.5 Khẳng định Salmonella bằng kháng huyết thanh 25

2.4 Phương pháp hiện đại 26

2.4.1 Phương pháp định tính Salmonella sử dụng kit thử nhanh 3M TM Petrifilm TM Salmonella Express System 26

2.4.2 Phương pháp định tính Salmonella sử dụng kit thử nhanh IRIS Salmonella 28

2.4.3 Phương pháp phát hiện Salmonella sử dụng bộ kit xét nghiệm MCC test (Mỹ) 30

2.4.4 Định tính Salmonella bằng phương pháp PCR 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO 34

LỜI NÓI ĐẦU

Vi sinh vật sống ở khắp mọi nơi trên Trái Đất, từ đỉnh núi cao đến tận đáy biển sâu,

trong đất, trong không khí, trong hầm mỏ, sông ngòi, ao hồ, trên da, trong từng bộ phận cơthể người, động vật, thực vật, trong các sản phẩm lương thực, thực phẩm, vật liệu, hànghóa… Ngay cả trong những nơi mà điều kiện sống tưởng chừng hết sức khắc nghiệt vẫnthấy sự phát triển của vi sinh vật

Trong những năm gần đây, vấn đề ngộ độc thực phẩm ngày càng trở nên cấp thiết,các báo cáo cho thấy phần lớn các vụ ngộ độc thực phẩm là do vi sinh vật Đã có nhiềucảnh báo, nhưng tình trạng ngộ độc thực phẩm vẫn đang leo thang và ngày càng nghiêmtrọng

Có rất nhiều vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm, ví dụ như Clostridium butolinum,

Escherichia Coli, Listeria monocytogenes… trong đó, Salmonella là loài vi sinh vật gây

ngộ độc rất nguy hiểm Salmonella thuộc họ Enterobactriaceae, gây ra bệnh thương hàn,

nhiễm trùng huyết và nhiều bệnh nghiêm trọng khác

Xuất phát từ nhu cầu tìm hiểu về độc tố, khả năng gây bệnh và cách phát hiện cũng

như cách phòng phòng chống bệnh vi khuẩn Salmonella, chúng tôi thực hiện nghiên cứu

đề tài “Xây dựng quy trình phân tích vi khuẩn Salmonella” để có cái nhìn tổng quan hơn về

vi khuẩn Salmonella và một số chủng vi sinh vật khác.

Chương I Tổng quan về vi sinh vật Salmonella

1.1 Lịch sử phát hiện

Năm 1885 Slamon và Smith (Mỹ) tìm được Salmonella từ lợn mắc bệnh dịch tả và gọi tên là Bacilus cholerasuis, hiện nay gọi là Salmonella Nhưng sau đó Schweinittz và

Dorset 1903 đã chứng minh bệnh dịch tả là do một loại vi rút gây nên và đã xác định

S.choleraesuis là vi khuẩn gây bệnh phó thương hàn

Năm 1888 A.Gartner phân lập được mầm bệnh từ thịt bò và lách người bệnh, ông gọi

vi khuẩn này là Bacillus enteritidis và ngày nay vi khuẩn này được gọi là S.enteritidis Vi khuẩn này cũng được gọi bằng nhiều tên khác như: Bacterium enteritidis, Bacillus

gartner…

Năm 1889 Klein phân lập được S.gallinarum và Rettger cũng đã phân lập được

S.pullorum năm 1909 Trước đây người ta cho rằng đây là hai loại vi khuẩn gây ra hai bệnh

khác nhau lên đã gọi chung là bệnh phó thương hàn gà (Typhus avium) và căn bệnh có tên chung là S.gallinarum–pullorum

Năm1896 C.Archard và Rbensauded đã phân lập được vi khuẩn S.paratyphi equi và

S.paratyphi bacilus Ngày nay vi khuẩn này được gọi tên là S.paratyphi B và đến năm

1898, S.paratyphi A đã tìm được do N.Guynvà H Keyser.

Hình 1.1 Vi Khuẩn Salmonella

 Salmonella typhi: Chỉ gây bệnh cho người Ở nước ta bệnh thương hàn chủ

yếu do S.typhi gây ra

Hình 1.2 Vi KhuẩnSalmonella typhi

 Salmonella choleraesuis: Gây bệnh nhiễm trùng máu

Hình 1.3 Vi Khuẩn Salmonella choleraesuis

 Salmonella entertidis: Gây rối loạn tiêu hóa

Hình 1.4 Vi Khuẩn Salmonella entertidis

Lúc đầu, các loài Salmonella được đặt tên theo hội chứng lâm sàng của chúng như

S.typhi hay S.paratyphi A, B, C (typhoid = bệnh thương hàn, para = phó), hoặc theo vật chủ

như S.typhimurium gây bệnh ở chuột,về sau người ta thấy rằng 1 loài Salmonella có thể

gây ra nhiều hội chứng và có thể phân lập được ở nhiều loài khác nhau Vì những lý do đó

mà các chủng Salmonella mới phát hiện được đặt tên theo nơi mà nó được phân lập như

S.teheran,S.congo,S.london

Hiện nay theo phân loại của hệ thống Viện Pasteur thế giới, Trung tâm Kiểm soát vàngăn ngừa dịch bệnh của Mỹ CDC (Control and Prevent Disease Center), giống

Salmonella được chia làm hai loài: S enterica và S bongori Trong đó S bongori gồm tất

cả các kiểu huyết thanh (serotype) của loài phụ số V, và S enterica được chia làm 6 loài

phụ đánh số: I, II, IIIa, IIIb, IV và VI Các loài và loài phụ này có thể phân biệt được bằngphản ứng sinh hóa Trong mỗi loài phụ có nhiều kiểu huyết thanh

Cho đến nay đã xác định được trên 2463 kiểu huyết thanh thuộc giống Salmonella.

Theo hệ thống của Kauffman White, các kiểu huyết thanh này được chia dựa trên khángnguyên thân O, kháng nguyên tiêm mao H và kháng nguyên bề mặt Vi Phần lớn các kiểuhuyết thanh được đặt tên theo công thức kháng nguyên, một số khác được đặt tên riêng như

Enteritidis (S enteritidis), Typhi (S typhi), Paratyphi (S paratyphi), Typhimurium (S typhimurium)…

1.3 Đặc điểm

1.3.1 Đặc điểm chung và đặc điểm nuôi cấy

Salmonella là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi kích thước trung bình từ 0,5-3

µm, di chuyển bằng tiên mao trừ S gallimarum và S pullorum, không tạo bào tử, chúng

phát triển tốt ở nhiệt độ 60C – 45,60C, thích hợp nhất ở 370C, phát triển trong pH 4.1- 9.0.Ở nhiệt độ từ 180C – 400C vi khuẩn có thể sống đến 15 ngày

Salmonella phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường Trên môi

trường thích hợp, vi khuẩn sẽ phát triển sau 24 giờ Có thể mọc trên những môi trường cóchất ức chế chọn lọc như DCA (deoxycholate citrate agar) và XLD (xylose lysinedeoxycholate).Trong đó môi trường XLD ít chất ức chế hơn nên thường được dùng để

phân lập Salmonella.

Khẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên môi trường này là tròn, lồi, trong suốt, có

tâm đen, đôi khi tâm đen lớn bao trùm khẩn lạc,môi trường xung quanh chuyển sang màuđỏ

1.3.2 Tính chất hóa sinh

Salmonella lên men glucose và mannitol sinh acid nhưng không lên men

saccharose, lactose, salicin và inositol, không sinh indole, không phân giải ure, không cókhả năng tách nhóm amine từ tryptophane, hầu hết các chủng đều sinh H2S,sử dụng đượccitrate ở môn trường Simmons

Tuy nhiên không phải loài Salmonella nào cũng có những tính chất trên, các ngoại

lệ được xác định là S.typhi lên men đường glucose không sinh hơi, không sử dụng citrate trong môi trường Simmon, hầu hết các chủng S.paratyphi và S.Cholerasuis không sinh

H2S, khoảng 5% các chủng Salmonella sinh độc tố sinh bacteriocin chống lại E.Coli,

Shigella và ngay cả 1 số chủng Salmonella khác

1.3.3 Cấu trúc của Salmonella

Salmonella có ba loại kháng nguyên, đó là những chất khi xuất hiện trong cơ thể thì

tạo ra kích thích đáp ứng miễn dịch và kết hợp đặc hiệu với những sản phẩm của sự kíchthích đó, gồm: kháng nguyên thân O, kháng nguyên tiên mao H và kháng nguyên vỏ K Vi

khuẩn thương hàn (S.typhi) có kháng nguyên Vi (Virulence) là yếu tố chống thực bào giúp

cho vi khuẩn thương hàn phát triển bên trong tế bào bạch cầu

- Kháng nguyên vách tế bào (kháng nguyên thân O)

 Thành phân cơ bản là vách tế bào có cấu trúc phức tạp gồm 2 lớp Trong cùng làmột lớp peptidoglycan mỏng, cách một lớp không gian chu chất và tới lớp màng ngoài(outer membrane) là phức hợp lipidpolysaccharide gồm lipoprotein và lipopolysaccharide

 Bao bên ngoài lớp peptidoglycan là lớp phospholipid A và B (quyết định độc tố củaNội độc tố), sau đó là hai lớp polysaccharide không mang tính đặc hiệu Kháng nguyên củanội độc tố có bản chất hóa học là lypopolysaccharide (LPS) Tính đặc hiệu của khángnguyên O và LPS là một, nhưng tính miễn dịch thì khác nhau : kháng nguyên O ngoài LPScòn bao gồm cả lớp peptidoglycan nên tính sinh miễn dịch của nó mạnh hơn LPS Màngngoài có cấu trúc gần giống tế bào chất nhưng phospholipid hầu như chỉ gặp ở lớp trong,còn ở lớp ngoài là lipopolysaccharide dày khoảng 8- 10 nm gồm 3 thành phần : Lipid A,polysaccharide lõi, kháng nguyên O Màng ngoài còn có thêm các protein: Protein cơ chất:porin ở vi khuẩn còn gọi là protein lỗ xuyên màng với chức năng cho phép một số loạiphân tử đi qua chúng như dipeptide, disaccharide, các ion vô cơ Protein màng ngoài: chứcnăng vận chuyển một số phân tử riêng biệt và đưa qua màng ngoài Lipoprotein: đóng vaitrò liên kết lớp peptidoglycan bên trong với lớp màng ngoài

- Kháng nguyên H: Chỉ có ở các Salmonella có lông Hầu hết Salmonella đều có lông chỉ trừ S.galilarum, S.pulorum gây bệnh cho gia cầm Kháng nguyên H là một loại kháng

nguyên có bản chất là protit, kém bền hơn kháng nguyên O Kháng nguyên H rất dễ bịpháhuỷở nhiệt độ cao hoặc xử lý bằng cồn, axit yếu

 Kháng nguyên H chia làm 2 phase :

 Phase 1: Có tính chất đặc hiệu gồm có 28 loại kháng nguyên lông được biểu thịbằng chữa số Latinh thường: a, b, c…

 Phase 2: Không có tính chất đặc hiệu, loại này có thể ngưng kết với các loại khácđôi khi thành phần này có thể gặp ở E.coli Pha 2 gồm có 6 loại được biểu thị bằng chữa số

Ả Rập 1-6 hay chữa số La Tinh e, n, x…

 Kháng thể kháng kháng nguyên H ngưng kết vi khuẩn bởi các roi của chúng Sựngưng kết này sẽ tạo thành những mảng kết tụ, chúng có thể bị tách bởi các yếu tố có khảnăng cắt roi của vi khuẩn

 Kháng nguyên H không có tác dụng gây bệnh, không gây miễn dịch, nó đặc hiệucho các loài vi khuẩn dựa vào kháng nguyên H để phân loại bằng phương pháp huyếtthanh

- Kháng nguyên vỏ K

 Kháng nguyên K: là kháng nguyên nằm ngoài kháng nguyên O và là nơi biểu hiệnđộc tố, được cấu tạo bởi polysaccharide của vỏ ngoài vách tế bào, thường kết hợp với tínhgây độc chuyên biệt cho vật chủ Nó ức chế sự biểu hiện của kháng nguyên O khi nó pháttriển nhiều, ổn định với nhiệt độ, cồn và HCl

 Không phức tạp, có một kháng nguyên vỏ là kháng nguyên Vi và cũng có ở 2 type

huyết thanh S.typhi và S.paratyphi Kháng nguyên Vi-angtigen được Felix và các cộng sự

phát hiện năm 1935 Kháng nguyên Vi gây hiện tượng ngưng kết chậm và xuất hiện các hạt

vỏ, kháng nguyên Vi là kháng nguyên vỏ bao bọc bên ngoài kháng nguyên O, khánhnguyên Vi không tham gia vào quá trình gây bệnh

Hình 1.5 Vị trí của các kháng nguyên của Salmonella

1.3.4 Cơ chế gây bệnh

Salmonella có thể gây ngộ độc thực phẩm khi hiện diện đến mức cả triệu tế bào

trong một gram thực phẩm Các triệu chứng do Salmonella gây ra thường là tiêu chảy, ói

mửa, buồn nôn Thời gian ủ bệnh kể từ khi tiêu thụthực phẩm bị nhiễm cho đến khi cáctriệu chứng được biểu hiện là 12 – 36 giờ Triệu chứng ngộ độc thường kéo dài từ 2 – 7

ngày Không phải tất cả mọi người khi tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm Salmonella đều bị ngộ độc Các loại thực phẩm có nguy cơ bị nhiễm Salmonella cao là thịt gia cầm, sản phẩm

thịt, trứng và các sản phẩm từ trứng, thủy sản Nguồn gây nhiễm các loại thực phẩm nàythường là phân người và động vật, được nhiễm gián tiếp hay trực tiếp Đặc biệt nguy hiểm

cho người là các loài Salmonella typhi, S.paratyphi A, B, C gây sốt thương hàn.

Hình 1.6 Các chủng Salmonella và các biểu hiện bệnh thường gặp

1.3.5 Nguồn gốc lây bệnh

Các sản phẩm thịt nói chung, nhất là thịt gia cầm và thịt lợn Tất cả các thức ăn tươi

sống có nguồn gốc động vật đều có thể là nguồn vi khuẩn Salmonella Vi khuẩn này sống

tự do trong ruột động vật và có trên lông Gia cầm có nhiều Salmonella nhất, tiếp theo là

các động vật nuôi trong nhà và động vật hoang (vẹt, rùa, chó, ếch, chim mông biển, loàigặm nhấm, rắn) Vi khuẩn này có thể có trong thành phần dẫn xuất các chất từ động vậtnhư gelatin hoặc nước bọt động vật, bởi côn trùng, loài gặm nhấm, chim hoặc các sảnphẩm thịt nhiễm khuẩn gây nhiễm vào thực phẩm

Ngoài ra có thể bị nhiễm từ người khỏe mạnh có mang vi khuẩn này Thực phẩm cónguồn gốc thực vật ít có nguy cơ nhiễm khuẩn Vì lí do bị ức chế bởi pH < 4 và có mặt vikhuẩn lactic nên các sản phẩm lên men ít bị nhiễm Trứng và các sản phẩm trứng ví dụ nhưbột nhào, nước sốt mayonnaise, protit đông tụ tách từ sữa, gia cầm là nguồn mang nhiều

Salmonella, nên trứng của nó cũng bị nhiễm vì vi khuẩn này có thể xuyên qua vỏ trứng và

sinh sản trong lòng đỏ trứng

Các sản phẩm sữa như sữa không thanh trùng, phomát từ sữa tươi, kem chất béosữa, và các sản phẩm từ sữa nói chung được chế biến từ các nông trại, các thiết bị đều có

thể gây nhiễm vào nguyên liệu, tạo môi trường thuận lợi cho Salmonella, và từ đó gây

nhiễm độc cho sản phẩm sữa Nếu tiến hành axit hóa chậm thì vi khuẩn dễ dàng sinh sảntrong phomát nhưng nó bị phá hủy với pH < 4,5 Những sản phẩm có sữa phải được giám

sát chặt chẽ bởi chúng không được thanh trùng nữa, vì vậy nếu có Salmonella trong sữa bột

thì chúng vẫn có thể sinh sản được bởi chúng có khả năng tồn tại ở điều kiện khô hạn vàlây nhiễm sang các sản phẩm khác

1.3.6 Tình hình nhiễm Salmonella trong nước và trên thế giới

1.3.6.1 Trong nước

Theo ông Nguyễn Công Khẩn, Cục trưởng Cục ATVSTP cho biết, hiện nay, mạnglưới kiểm nghiệm ATVSTP đã được hình thành rộng khắp trong cả nước nhưng thực tếnăng lực kiểm nghiệm nhiều chỉ tiêu về an toàn thực phẩm tại các địa phương vẫn rất hạnchế Trong 330 mẫu hoa quả có tới 2,7% số mẫu có tỷ lệ tồn dư thuốc bảo vệ thực vật cao,nhất là ở táo đỏ, quýt và lê Đặc biệt, trong số 1.416 mẫu thịt và sản phẩm từ thịt đã phát

hiện tới 40,9% số mẫu nhiễm khuẩn Salmonella gây ra các bệnh về đường tiêu hóa Hơn

nữa, khu vực TP Hồ Chí Minh và Đồng Nai là những địa phương có tỷ lệ mẫu thực phẩm

nhiễm Salmonella cao nhất, chiếm từ 84- 95% mẫu được giám sát

1.3.6.2 Trên thế giới

Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở châu Âu giảm đều đặn từ những năm 1990 trở lại đây, trong năm 2007 có khoảng 152.000 ca nhiễm Salmonella trên người được phát hiện, sự sai

lệch của báo cáo này là rất lớn, số lượng thực tế rất có thể gấp 10 lần như thế Ở Mỹ, tìnhtrạng có khá hơn, ổn định ở mức 15 ca trên 100.000 người từ năm 2001 do kiểm soát tốt

Salmonella trong thực phẩm từ năm 1990, bao gồm các thực phẩm sữa, trứng, nước trái

cây, sản phẩm tươi sống, rau, bánh kẹo, và đặc biệt là thịt.Một đợt dịch gần đây ở Mỹ gây

ra bởi S.typhimurium nhiễm trong bơ đậu phộng đã gây ảnh hưởng đến hơn 700 người trên

khắp nước Mỹ

Từ tháng 7/2009 tới nay, số ca nhiễm khuẩn Salmonella được phát hiện ở Mỹ đã

tăng lên 184 người, thuộc 38 bang khác nhau Cơ quan y tế của nước này vẫn chưa xác

định nguyên nhân chính xác khiến số ca nhiễm khuẩn Salmonella tăng nhanh như vậy Tuy

nhiên, mới đây các chuyên gia y tế của bang Oregon cho rằng nguồn lây lan vi khuẩn

Salmonella từ các sản phẩm xúc xích.Vừa qua, các cơ quan điều tra Mỹ đã thu hồi hơn 560

tấn xúc xích do nghi bịnhiễm vi khuẩn Salmonella, tất cả số lượng này đều do Công ty

Daniele International sản xuất.Tuy nhiên, ông Jason Maloni, phát ngôn viên của công tynày khẳng định: “Chưa có bằng chứng nào chứng minh các sản phẩm xúc xích của chúng

tôi bị nhiễm vi khuẩn Salmonella” Sự bùng nổ của số ca nhiễm khuẩn Salmonella ở khu

vực tây bắc Thái Bình Dương đã khiến các cơ quan điều tra nghi ngờ rằng nguồn gây bệnhcho ổ dịch này là từ các sản phẩm xúc xích sau khi họ phát hiện rất nhiều người ăn xúc

xích mua tại các cửa hàng ở khu vực này bịnhiễm khuẩn Salmonella Các nhân viên điều tra tại bang Washington cũng cho biết 14 bệnh nhân bị nhiễm khuẩn Salmonella ở bang

này, đã từng ăn xúc xích của hãng Daniele Ngoài ra, các chuyên gia y tế khẳng định họ đã

kiểm tra và phát hiện khuẩn Salmonella có trong các mẫu xúc xích của công ty này Hiện

tại, các nhân viên điều tra liên bang Mỹ vẫn đang làm việc để tìm ra nguyên nhân chính

xác gây ra dịch nhiễm khuẩn Salmonella ở nước này Vì thế, họ vẫn chưa thể kết luận sản

phẩm xúc xích của Công ty Daniele có phải là nguồn lây bệnh chính hay không Vì thế,những sản phẩm xúc xích của công ty này bị thu hồi là do kiểm tra bịnhiễm khuẩn

Salmonella.

1.3.7 Các chỉ tiêu Salmonella trong thực phẩm

Hầu hết các tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm của Việt Nam cũng như các nước

trên thế giới đều không cho phép sự có mặt của Salmonella trong thực phẩm Vì vậy các phương pháp phân tích Salmonella là quy trình định tính trong một lượng mẫu thực phẩm

nhất định Sự hiện diện của chúng được kiểm tra gắt gao bởi các cơ quan chức năng Theotiêu chuẩn cho phép vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm của Bộ Y tế 4/1998, quy định

không chấp nhận sự hiện diện của Salmonella trong 25 g hay 25 ml đối với tất cả các loại

thực phẩm Theo thông tư đã ban hành số 01/2000/TT – BYT của Bộ Y tế đối với thực

phẩm sản xuất trong nước thì chỉ tiêu Salmonella bắt buộc phải kiểm tra đối với tất cả các loại thực phẩm Ủy Ban Châu Âu quy định không được phát hiện Salmonella /25 g trong

bất kỳ loại thực phẩm nào

Theo phương pháp truyền thống việc phát hiện Salmonella bao gồm những bước

như tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, các thử nghiệm sinh hóa và cuối cùng là thử nghiệmhuyết thanh, tính chung mất khoảng 7 ngày để có kết quả.Hiện nay đã có nhiều nỗ lực để

rút ngắn thời gian phát hiện Salmonella bằng những phương pháp như thử nghiệm ELISA,

và thử nghiệm DNA Việc khẳng định kết quả âm tính trong vòng 48 giờ đã là chuyện bìnhthường Tuy nhiên một khi mẫu có khả năng dương tính, cần tiến hành các thao tác truyền

thống để khẳng định sự có mặt của Salmonella.

Trong các yêu cầu về vi sinh đối với thực phẩm, Salmonella là một chỉ tiêu đặc biệt nhạy cảm, do tính chất gây bệnh của một số kiểu huyết thanh của Salmonella.

Yêu cầu của kiểm tra bắt buộc đối với Salmonella trong các loại thực phẩm theo

Thông tư 01/2000/TT-BYT của Bộ Y tế

Chương II Quy trình phân tích vi sinh vật Salmonella

2.1 Thu và bảo quản mẫu thực phẩm

2.1.1 Lấy mẫu theo lô hàng :

Thông thường vị trí lấy mẫu như sau: lô hàng  mẫu chung mẫu trung bình  mẫuphân tích (cảm quan, kháng sinh, vi sinh)

2.1.2 Lấy mẫu theo dây chuyền sản xuất :

Khi tiến hành thu mẫu thì ở công đoạn nguyên liệu và thành phẩm là bắt buộc, trongkhi đó giai đoạn bán thành phẩm thì tuỳ từng loại mặt hàng sản phẩm mà sẽ có các côngđoạn khác nhau và số lượng công đoạn cũng nhiều ít khác nhau Không thể thu hết tất cảcác công đoạn ở giai đoạn bán thành phẩm mà chỉ thu ở 2 công đoạn liên tiếp trong một lầnthu mẫu

2.1.3 Thu mẫu vệ sinh công nghiệp :

Là thu mẫu trong quá trình sản xuất chế biến của công nhân, các dụng cụ sản xuất cũngnhư vệ sinh, đồ bảo hộ lao động của công nhân như găng tay, yếm, ủng, … các máy móctrực tiếp sản xuất nhằm xác định có sự lây nhiễm hay không

2.1.4 Thu mẫu ở cửa hàng hoặc chợ :

Chủ yếu dựa vào kinh nghiệm và sự quan sát của người thu mẫu Khi thu mẫu cầnmang tính đại diện và đảm bảo không bị tạp nhiễm

2.1.5 Dụng cụ lấy mẫu

Thường là thùng nhựa, sử dụng bao nylon để chứa mẫu Không dùng các bình thuỷ tinh

vì dễ vỡ làm nhiễm mẫu hay gây tai nạn cho người thu mẫu Các dụng cụ thu mẫu như dao,kéo, … đã được khử trùng

2.1.6 Bảo quản và vận chuyển :

- Các mẫu sau khi được lấy bảo quản tách biệt nhau trong thùng chứa mẫu, được giữ lạnhbằng các bao nước đá Tại phòng kiểm nghiệm , mẫu được chuyển tủ đông và đượcphân tích ngay trong thời gian có thể

- Nếu không phân tích ngay được, mẫu phải được bảo quản ở -200C cho đến khi phântích Nếu mẫu không thể bảo quản đông, có thể bảo quản ở 40C nhưng không quá 36h.Các loại đồ hợp, thực phẩm có độ ẩm thấp hay khó hư có thể bảo quản ở nhiệt độphòng

2.1.7 Chuẩn bị mẫu thực phẩm :

- Rã đông trong điều kiện vô trùng, nhiệt độ có thể là 2 – 5°C trong 18h, nếu cần nhanh

có thể ở nhiệt độ phòng trong 2h hoặc 45°C trong 15phút

- Cân một lượng mẫu xác định để phân tích tuỳ theo từng chỉ tiêu yêu cầu, sai số chophép là ± 0,1g Lượng mẫu phân tích cho vào các bình chứ bằng nhựa hoặc bao nylon

2.3 Phương pháp truyền thống ( Phương pháp nuôi cấy )

25g mẫu+225ml BPW -> đồng nhất mẫu

trong 30 giây -> độ pha loãng 10

Ủ ở nhiệt

độ 37

Hút 0,1ml mẫu tăng sinh cho vào ống

nghiệm chứa 10ml môi trường RVS

Đọc kết quả trên các môi trường thử

nghiệm sinh hóa

Kết luận: Phát hiện hay

không phát hiện

2.3.1 Nguyên tắc xác định

Phương pháp truyền thống mất khá nhiều thời gian (5 ngày) để cho ra kết quả, do đó

người ta đã phát triển rất nhiều phương pháp thử nhanh để phát hiện Salmonella trong các

mẫu thực phẩm và mẫu nước trong thời gian ngắn, từ đó có biện pháp xử lý kịp thời đốivới các mẫu nhiễm Xu hướng sử dụng PCR và IMS thường được sử dụng Phương phápPCR giúp phát hiện nhanh; tuy nhiên dễ xảy ra hiện tượng âm tính giả, đòi hỏi các thao tácphải thành thạo Multiplex PCR giúp tiết kiệm thời gian, số lượng mẫu và chi phí; tuynhiên lại có độ nhạy kém hơn Người ta đã phát triển thêm phương pháp Real Time PCR từPCR truyền thống Phương pháp này có độ nhạy rất cao, cho kết quả sớm hơn, không cầnphải chạy điện di sau phản ứng khuếch đại Phương pháp miễn dịch từ phân tách là một lựachọn tốt hơn Nó có độ nhạy cao (< 104 CFU/ml), thời gian ngắn (thí nghiệm được thựchiện trong 4-5 giờ)

Bên cạnh những kỹ thuật Sinh học phân tử cơ bản để phát hiện và định danh

Salmonella, còn có những phương pháp khác, như: phương pháp miễn dịch (huyết thanh

học, kỹ thuật ELISA, Western blot) Và đôi khi để tăng hiệu quả, độ tin cậy cho xét nghiệmngười ta còn kết hợp nhiều phương pháp với nhau, ví dụ: IMS-PCR assay

(Immunomagnetic Separation and Polymerase Chain Reaction) để phát hiện Salmonella

trong thực phẩm

Salmonella có thể được phát hiện ( phân tích định tính ) bằng một quy trình bao

gồm 4 bước là tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định Salmonella thường có

mặt trong mẫu với một số lượng nhỏ, bị tổn thương và cùng hiện diện chung với một số

lượng lớn vi sinh vật thuộc họ Enterobacteriaceae có tính cạnh tranh mạnh vàức chế sự tăng trưởng của Salmonella

2.3.2 Môi trường nuôi cấy