phòng bệnh ( các phương pháp phân tích vi sinh)

Nem chua truyền thống Mẫu Đồng nhất mẫu Pha loãng và cấy trang trên môi trường thạch MRS agar Tăng sinh trong canh trường MRS với khuẩn lạc đặc trưng Cấy ria thuần trong môi trường MRS a

QUY TRÌNH PHÂN LẬP VI KHUẨN LACTIC ỨNG DỤNG TRONG PHÒNG BỆNH TIÊU

CHẢY TRÊN HEO CON

1 Sơ đồ quy trình phân lập

2 Thuyết minh quy trình:

2.1 Bước 1: Nguồn mẫu:

- Mẫu: nem chua truyền thống nhà làm

- Bảo quản mẫu: trong túi nhựa PE vô trùng

2.2 Bước 2: Đồng nhất mẫu

- Chuẩn bị: dung dịch canh trường BPW đã được tiệt trùng và làm nguội

- Yêu cầu: + lấy mẫu và xử lí mẫu trong điều kiện vô trùng

+ mẫu phải được đảm bảo đồng nhất

Nem chua truyền thống Mẫu

Đồng nhất mẫu

Pha loãng và cấy trang trên môi trường thạch MRS agar

Tăng sinh trong canh trường MRS với khuẩn lạc đặc trưng

Cấy ria thuần trong môi trường MRS agar

Đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa của vi khuẩn lactic

Khả năng sinh acid lactic Đặc điểm có lợi

Khả năng kháng vi khuẩn gây

bệnh Định danh

- Cân 10g mẫu cùng với 90ml dung dịch BPW đã chuẩn bị trước cho vào túi nhựa PE vô trùng, ghép mí bao nhựa PE vô trùng Sau đó tiến hành đồng nhất mẫu bằng thiết bị hoặc bằng thủ công Ta thu được mẫu dịch huyền phù nồng độ 10-1

2.3 Bước 3: Pha loãng và cấy trang trên môi trường thạch MRSA

* Pha loãng:

- Chuẩn bị: ống nghiệm chứa 9ml dung dịch nước muối sinh lí đã được vô trùng

- Dùng micropipet hút 1ml dung dịch mẫu trong túi nhựa PE cho vào ống nghiệm nước muối sinh lí đã được vô trùng đã chuẩn bị trước, ta thu được ống nghiệm dung dịch pha loãng 10-2 Tiếp tục cho đến khi ta pha loãng được các nồng độ 10-5 , 10-6, 10-7

- Yêu cầu: + Thực hiện trong điều kiện vô trùng

+ trước khi hút chuyển đổi ở mỗi nồng độ phải lắc đều

* Cấy trang:

- Chuẩn bị các đĩa petri có chứa môi trường thạch MRS agar đã hấp khử trùng

- Hút 0,1 ml dung dịch pha loãng ở các nồng độ pha loãng 10-5 , 10-6, 10-7 thực hiện phương pháp cấy trang trong điều kiện vô trùng, yêu cầu thu được khuẩn lạc rời rạc, trang đều và khô, không nát thạch Sau đó đem ủ ở nhiệt độ 30ºC trong 24h-48h

- Xác định khuẩn lạc: đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn lactic là tròn, lồi, bóng, trắng đục

2.4 Bước 4: Tăng sinh

- Bắt những khuẩn lạc nghi ngờ là vi khuẩn lactic với những đặc điểm khuẩn lạc đặc trưng

- Khuẩn lạc sau đó đem tăng sinh trong canh trường MRS đã được hấp tiệt trùng, thực hiện thao tác trong điều kiện vô trùng Sau đó đem lắc 150-200 vòng/phút trong 24h-48h

2.5 Bước 5: Cấy ria

- Mẫu sau tăng sinh, Thực hiện phương pháp cấy ria trên đĩa petri có chứa môi trường MRS agar

đã hấp tiệt trùng, thực hiện trong điều kiện vô trùng, yêu cầu thu được khuẩn lạc rời rạc, các đường cấy liên tục, không làm rách thạch Mục đích làm thuần và giữ giống

2.6 Bước 6: Xác định đặc điểm sinh lí, sinh hóa của vi khuẩn

- Hình thái khuẩn lạc: tròn, có màu trắng đục, lồi, bóng

- Nhuộm Gram: vi khuẩn Lactic là vi khuẩn Gram dương bắt màu tím, không sinh bào tử

-Các đặc điểm sinh hóa:

-2.6 Bước 6: Xác định đặc điểm có lợi

a) Xác định khả năng sinh acid lactic giúp giảm pH

*Định tính:

- Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi khuẩn lactic trên môi trường thạch MRS agar có bổ sung thêm CaCO3

+ Chuẩn bị môi trường MRS agar đã hấp khử trùng và để nguội (50-55ºC) Sau đó tiến hành phương pháp đổ đĩa trên đĩa petri đã hấp khử trùng, thực hiện thao tác trong điều kiện vô trùng Đem ủ ở nhiệt độ 30ºC trong 24h-48h

+ Quan sát khuẩn lạc: nếu vi khuẩn lactic thì trên đĩa petri xuất hiện khuẩn lạc trắng đục, tròn, lồi, có bờ láng và xung quanh khuẩn lạc có vòng trong suốt do tiết acid phân giải CaCO3

- Sử dụng thuốc thử Uffelmann:

+ Tăng sinh vi khuẩn phân lập trong canh trường MRS đã hấp tiệt trùng và thực hiện trong điều kiện vô trùng Đem lắc 150-200 vòng, 24h-48h

+ Thử nghiệm bằng cách nhỏ vài giọt thuốc thử Uffelmann vào dịch sau tăng sinh, nếu dịch chuyển sang màu vàng thì kết luận trong dung dịch có acid lactic

*Định lượng:

- Sử dụng phương pháp chuẩn độ acid-base:

+Lấy 10ml dịch lên men đã li tâm bỏ sinh khối, bổ sung thêm 20ml nước cất và 2-3 giọt phenolphtalein 1% Sau đó chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N đến kkhi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt bền trong 30 giây thì dừng lại Ghi lại kết quả thể tích NaOH (ml) đã dùng Lượng acid được tính theo công thức sau:

Cacid= (VNaOH.CNaOH)/Vacid

b) Khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh

Vi khuẩn lactic vừa phân lập Vi kkuẩn gây bệnh phân lập từ phế phẩm của

heo con bị bệnh tiêu chảy Tăng sinh

Xác định mật độ bằng phương pháp đo OD ở

bước sóng 600nm Tính tóan theo công thức

A=OD600nm*1,02*109 (cfu/ml)

Đưa về mật độ 107 (áp dụng công thức

C1V1=C2V2)

Cấy trang trên môi trường MRS agar đã hấp

tiệt trùng Đem ủ ở nhiệt độ 37 trong 24-48h

Đục lỗ thạch

Tăng sinh Xác định mật độ bằng phương pháp đo OD ở bước sóng 600nm Tính tóan theo công thức A=OD600nm*1,02*109 (cfu/ml)

Đưa về mật độ 106 (áp dụng công thức C1V1=C2V2)

Cấy trang trên môi trường TSA agar đã hấp khử trùng Đục lỗ thạch

- Sau khi lắp giếng thạch xong Đem ủ ở nhiệt độ 37 trong 24-48h

- - Yêu cầu: Các đĩa thạch phải tương đối đều nhau

Kết luận: Vòng đối kháng càng lớn thì khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh của vi khuẩn lactic càng mạnh

Lắp khối thạch chứa vi khuẩn lactic vào giếng trên môi trường chứa vi khuẩn gây bệnh vừa trang xong

2.7 Bước 7 Định danh

- Phương pháp PCR

- Giải trình tự gene

- RFLP