Báo cáo thí nghiệm vi sinh vật

LỜI MỞ ĐẦU Xã hội ngày càng đi lên phát triển không ngừng theo hướng công nghiệp hóa, các vấn đề về ô nhiễm môi trường luôn tồn đọng và được quan tâm một cách cần thiết Trong đó việc kiểm tra vi sinh vật trong kiểm soát ô nhiễm môi trường giúp xác định mức độ ô nhiễm môi trường bằng cách nhận diện, thống kê các sinh vật chỉ thị 1 cách chính xác Môn học thí nghiệm vi sinh giúp sinh viên nắm bắt được các vấn đề trên không chỉ về lí thuyết mà còn ở việc nghiên cứu thực tế thông qua các phòng thí ng.

LỜI MỞ ĐẦU

Xã hội ngày càng đi lên phát triển không ngừng theo hướng công nghiệp hóa, các vấn

đề về ô nhiễm môi trường luôn tồn đọng và được quan tâm một cách cần thiết Trong

đó việc kiểm tra vi sinh vật trong kiểm soát ô nhiễm môi trường giúp xác định mức độ

ô nhiễm môi trường bằng cách nhận diện, thống kê các sinh vật chỉ thị 1 cách chínhxác

Môn học thí nghiệm vi sinh giúp sinh viên nắm bắt được các vấn đề trên không chỉ về

lí thuyết mà còn ở việc nghiên cứu thực tế thông qua các phòng thí nghiệm đượcTrường Đại Học Bách Khoa Thành Phố Hồ Chí Minh trang bị, qua đó giúp sinh viêntiếp cận nắm bắt gần hơn với chuyên ngành của mình trong tương lai Mặc dù đã hếtsức cố gắng nhưng không thể tránh khỏi những thiếu sót, bất cập Rất mong nhận được

sự đánh giá, phản hồi

M C L CỤC LỤC ỤC LỤC

NHỮNG NGUYÊN TẮC AN TOÀN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI

SINH VẬT 2

TUẦN 1: CÁC KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT 10

I/ Chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi sinh vật: 10

II/ Kỹ thuật vô trùng trong phòng thí nghiệm vi sinh vật: 11

III/ Kết quả: 13

IV/ Tài liệu tham khảo: 14

TUẦN 2: TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ-KÍNH HIỂN VI 15

I/ Giới thiệu: 15

II/ Vật liệu thí nghiệm: 15

III/ Kết quả và bàn luận: 16

IV/ Trả lời câu hỏi: 18

V/ Tài liệu tham khảo: Giáo trình thí nghiệm vi sinh vật môi trường 19

VI/ Kết luận: 19

TUẦN 3: CẤY PHÂN LẬP- CẤY CHUYỀN – NHUỘM GRAM 21

I Cấy phân lập 21

1 Mục đích và nguyên tắc: 21

2 Vật liệu và phương pháp thí nghiệm 22

3 Kết quả 22

4 Tài liệu tham khảo: Bài 5, sách giáo trình thí nghiệm vi sinh vật môi trường 24

II Cấy chuyền 24

III Nhuộm gram 27

TUẦN 4: XÁC ĐỊNH ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG 31

I/ Mục đích và nguyên tắc: 28

II/ Vật liệu thí nghiệm: kính hiển vi, máy đo độ đục, lamme, buồng đếm, mẫu

vi sinh vật 30

III/ Quy trình thực hiện: 30 IV/ Kết quả và bàn luận: 30

NGUYÊN TẮC AN TOÀN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM

3 Bắt buộc phải có áo khoác và khẩu trang trong suốt quá trình làm thí nghiệm Điềunày giúp bảo vệ quần áo, da trong quá trình làm thí nghiệm

4 Chỉ mang những dụng cụ cần thiết dùng cho thí nghiệm, vở ghi chép và bút Cácvật dụng khác như túi xách, áo khoác, sách vở phải được để ở nơi riêng biệt Tránhtình trạng lộn xộn trong quá trình làm thí nghiệm

5 Trước khi bắt đầu hay sau khi thí nghiệm cần phải tẩy trùng khu vực làm việc vớidung dịch 5% lysol, amphyl hay 10% chlorox

6 Tất cả môi trường phải được dán nhãn ghi đầy đủ tên, ngày và thí nghiệm Việcdán nhãn sẽ giúp chúng ta không sử dụng nhầm lẫn các môi trường cũng như cóthể theo dõi thời gian sử dụng môi trường

7 Nếu môi trường bị trào, đổ… phủ ngay bằng khăn lau Báo ngay với người hướngdẫn phòng thí nghiệm Tẩy trùng sau khi đã lau sạch

8 Tuân thủ những biển báo ghi trên các chau đựng hóa chất để đảm bảo an toàn trong

sử dụng hoặc có thể xử lý kịp thời khi gặp sự cố

9 Cẩn thận với đèn khử trùng (ví dụ: đèn cồn) Cần tắt đèn khi không sử dụng đểtránh bị thương Khi cầm nắm các dụng cụ cần chú ý không để tay chạm vào ngọnlửa Những sinh viên có mái tóc dài đặc biệt cần lưu ý vì mái tóc có thể dễ dàngbắt lửa

10 Không sử dụng pipette bằng miệng để tránh nuốt môi trường và hóa chất gây tổnthương hoặc gây bệnh Sử dụng pipette bằng bóng cao su hay tay máy, việc gắnpipette cần phải tiến hành nhẹ nhàng, tránh mạnh tay có thể gây vỡ.

11 Khi các vật liệu thủy tinh bị vỡ, cần đảm bảo thu dọn sạch sẽ Sử dụng những baotay bảo vệ và mảnh thủy tinh cần vứt bỏ vào hộp riêng, không được để lẫn vàonhững bao rác thông thường sẽ gây thủng bao

12 Cẩn thận với những dụng cụ có cạnh sắc nhọn

13 Tất cả dụng cụ bỏ đi cần tẩy trùng trước khi bỏ hoặc tái sử dụng lại Không đượcrót môi trường vào bồn rửa, mà phải bỏ vào những nơi riêng Vi sinh vật khôngcòn tham gia thí nghiệm nữa trước khi vứt bỏ cần phải diệt hết chúng Có thể tiêudiệt chúng bằng autoclave, sử dụng áp suất hơi với nhiệt độ nâng lên đạt đến điểmcần thiết Một số trường hợp có thể sử dụng những hóa chất kháng vi sinh vật đểlàm sạch vật dụng Pipette sử dụng nên để ở nơi đã vô trùng Những cục đông nhưsữa đông, thạch đông cần phải loại bỏ để tránh tối đa việc lây nhiễm của vi sinhvật

14 Không được xếp petri quá 3 cái ngoại trừ chúng được giữ vững trong giá kim loạihoặc nhựa đặc biệt Điều này giúp giảm việc phóng thích vi sinh vật ra khỏi môitrường ngoài khi petri bị ngã và bung nắp

15 Không mở nắp petri để ngửi môi trường Điều này sẽ dẫn đến việc vi sinh vật xônglên hoặc gây nhiễm

16 Khi hơ que cấy trên ngọn lửa, cần để que cấy gần gốc của ngọn lửa để đảm bảo visinh vật trên que cấy bị đốt cháy hoàn toàn Điều này rất quan trọng vì chỉ cần mộtkhóm bụi vi sinh vật còn lại trên que cấy sẽ là nguyên nhân gây phát tán vi sinh vậttrong môi trường

17 Sau buổi thí nghiệm cần phải vệ sinh bàn tay cẩn thận trước khi rời khỏi phòng thínghiệm

18 Ngay cả khi bị vết thương hoặc sự cố nhỏ nào cần báo ngay cho người hướng dẫn

I CÁC DỤNG CỤ, THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG MÔN HỌC:

cấy hay dung môi hóa chất trong pha chế môi trường

chất …

Que trang Trải giọt sinh khối VSV

lên bề mặt thạch

phân lập VSV trên bề mặtthạch hoặc cấy truyền

khử trùng các loại que cấy

lăn ra ngoài

Bình tia Chứa nước cất

chất thông qua pipet

chính xác VSV, môi trường nuôi cấy hay dungdịch hóa chất

khối lượng hóa chất cần lấy

Nồi hấp Vô trùng

TUẦN 1:

CÁC KĨ THUẬT CƠ BẢN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT

MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT

I Chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi sinh vật:

 Mục đích:

- Giúp sinh viên chuẩn bị môi trường hỗn hợp, cách phối hợp các thành phần

thích hợp để giúp vi sinh vật phát triển và vô trùng môi trường, kiểm tra vànghên cứu vi sinh vật, nuôi cấy chúng

- Nắm bắt các kỹ thuật như chuẩn bị thanh trùng môi trường, vô trùng các

dụng cụ, nuôi cấy vi sinh và chuẩn

 Nguyên tắc: Khu vực làm thí nghiệm và dụng cụ cấy cần được vô trùng, côngviệc cần thực hiện nhanh chóng và hiệu quả, đáp ứng các nguyên tắc phòng thínghệm

- Cặp đĩa petri, ống nghiệm, giá để ống nghệm, pipet, becher 100ml và 250ml,

cân điện tử, nồi hấp khử trùng, và các hóa chất cần dùng

 Chuẩn bị môi trường Hasen:

Cân 7,5g Glucose +1,5g Pepton + 0.45g KH2PO4 + 0.45g MgSO4 + 3g Agar

Đậy nút bông và đem hấp vô trùng

Lấy 150 ml nước cất vào erlen 250 ml

 Kết quả:

II Kỹ thuật vô trùng trong nuôi cấy vi sinh vật:

 Mục đích:

- Gíup sinh viên hiểu rõ hơn phương pháp cấy truyền và kỹ thuật vô trùng

trong cấy truyền

- Học được cách đảm bảo an toàn trong việc cấy vi sinh từ môi trường này

sang môi trường khác mà không bị lây nhiễm

 Nguyên tắc:

- Khu vực làm việc cần được tẩy trùng để giảm tối đa các mầm mống gây

bệnh

- Dụng cụ cấy truyền phải được vô trùng

- Công việc cấy cần phải được thực hiện nhanh chóng hiệu quả để giảm thiểu

thời gian tiếp xúc giữa môi trường cấy và các tác nhân gây nhiễm bên ngoài

- Đưa que cấy vào môi trường di chuyển lướt trên môi trường, nhanh chóng

hơ lửa miệng ống nghiệm và đậy kín lại

- Đậy đúng nắp không nhầm lẫn và luôn giữ nắp trên ngón út trong suốt quátrình mở nắp để thao tác

- Đối với đĩa petri mở nghiêng nắp 1 góc 300-450 trong suốt quá trình nuôicấy

- Không để nắp ống nghiệm hoặc petri chạm vào bất cứ vật nào

 Ưu điểm:

- Định lượng được các vi sinh vật nhạy nhiệt

- Nhận dạng được dạng khuẩn lạc đặc trưng

- Làm thuần chủng vi sinh vật mục tiêu

 Nhược điểm:

- Chỉ cấy được thể tích mẫu vật nhỏ

- Chỉ cho phép đếm được số lượng khuẩn lạc thấp

Ưu điểm:

 Định lượng được các vi sinh vật nhạy nhiệt

 Nhận dạng được dạng khuẩn lạc đặc trưng

 Làm thuần chủng vi sinh vật mục tiêu

Nhược điểm:

 Chỉ cấy được thể tích mẫu vật nhỏ

 Chỉ cho phép đếm được số lượng khuẩn lạc thấp

 Thời gian thí nghiệm: 29/03/2019

IV/ Tài li u tham kh o: ệu tham khảo: ảo:

Giáo trình thí nghiệm vi sinh vật môi trường- Đặng Vũ Bích Hạnh

TUẦN 2: TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ

- Phương pháp trải đĩa (spread plate method) không bị sốc nhiệt do nhiệt độcủa thạch Thêm vào đó, tất cả khuẩn lạc mọc trên mặt thạch có thể đươchnhìn thấy và đếm dễ dàng và cũng dễ dàng phân biệt những khuẩn lạc riêngbiệt hoặc những bong bóng khí Kỹ thuật này đòi hỏi ít thời gian và khônggian hơn phương pháp đổ đĩa nhưng có hạn chế là chỉ sử dụng được 0 thểtích mẫu nhỏ: 0,1 = 0,5ml phụ thuộc vào khả năng hấp thụ của thạch

II) Vật liệu thí nghiệm

- Môi trường hansen đã chuẩn bị

- Dung dịch 8 ống nước muối sinh lý đã chuẩn bị

- Que trang, đèn cồn , micropipet và các đầu típ

- Pha loãng thành tám ống nghiệm có hệ số pha loãng lần lượt từ 10−3đến 10−8

b) Các bước tiến hành:

b) Các bước tiến hành:

1 Hút vào petri đã khử trùng 1ml mẫu pha loãng

2 Khử trùng que trang ( đốt trên đèn cồn 2 lần)

3 Kiểm tra que trang nguội hay chưa bằng cách đưa que trang vào nắppetri và cảm nhận

4 Khi que trang nguội, dùng que trang dàn đều mẫu xoay nhẹ petri đểphân bố cho đều VSV cho đến khi mặt thạch không còn trơn

5 Lật ngược petri , gói lại bằng giấy và lưu trữ trong tủ sấy

6 Sau 24h đến 48h quan sát và đếm khuẩn lạc

III) Kết quả

** Mẫu 1

 Hệ số pha loãng: 10-4

 Từ đó dẫn đến việc các mẫu sau ko có vi sinh vật

 Tại sao mẫu 10-6 lại có khuẩn lạc bất thường?

ảnh mẫu 3

- Có thể do trong quá trình cấy có thành viên không trang bị bao tay , khẩutrang nên đã gây ảnh hưởng đến môi trường Suy đoán có thể khuẩn lạc từngười của thành viên đó nhiễm vào do quá trình giao tiếp trong khi cấy.

 Thời gian thí nghiệm: 05/04/2019

V) Tài liệu tham khảo : Giáo trình thí nghiệm vi sinh vật môi trường.

1.S lo i khu n l c? S lại khuẩn lạc? Số lượng từng loại? Mô tả đặc điểm của khuẩn lạc? ẩn lạc? Số lượng từng loại? Mô tả đặc điểm của khuẩn lạc? ại khuẩn lạc? Số lượng từng loại? Mô tả đặc điểm của khuẩn lạc? ượng từng loại? Mô tả đặc điểm của khuẩn lạc?ng t ng lo i? Mô t đ c đi m c a khu n l c?ừng loại? Mô tả đặc điểm của khuẩn lạc? ại khuẩn lạc? Số lượng từng loại? Mô tả đặc điểm của khuẩn lạc? ả đặc điểm của khuẩn lạc? ặc điểm của khuẩn lạc? ểm của khuẩn lạc? ủa khuẩn lạc? ẩn lạc? Số lượng từng loại? Mô tả đặc điểm của khuẩn lạc? ại khuẩn lạc? Số lượng từng loại? Mô tả đặc điểm của khuẩn lạc?

- Có hai lo i khu n l cại khuẩn lạc? Số lượng từng loại? Mô tả đặc điểm của khuẩn lạc? ẩn lạc? Số lượng từng loại? Mô tả đặc điểm của khuẩn lạc? ại khuẩn lạc? Số lượng từng loại? Mô tả đặc điểm của khuẩn lạc?

 Lo i 1: 1 con có hình tròn tr ng s a tr nại khuẩn lạc? Số lượng từng loại? Mô tả đặc điểm của khuẩn lạc? ắng sữa trơn ữa trơn ơn

 Lo i 2: 1 con d ng hình tròn có vài ch m trên b m tại khuẩn lạc? Số lượng từng loại? Mô tả đặc điểm của khuẩn lạc? ại khuẩn lạc? Số lượng từng loại? Mô tả đặc điểm của khuẩn lạc? ấm trên bề mặt ề mặt ặc điểm của khuẩn lạc?

+ Ghi chú: trong dĩa có xu t hi n m t lo i vi sinh v t l do b nhi m không th ấm trên bề mặt ện một loại vi sinh vật lạ do bị nhiễm không thể ột loại vi sinh vật lạ do bị nhiễm không thể ại khuẩn lạc? Số lượng từng loại? Mô tả đặc điểm của khuẩn lạc? ật lạ do bị nhiễm không thể ại khuẩn lạc? Số lượng từng loại? Mô tả đặc điểm của khuẩn lạc? ị nhiễm không thể ễm không thể ểm của khuẩn lạc?

đ m s lếm số lượng ượng từng loại? Mô tả đặc điểm của khuẩn lạc?ng

2 Đ nh lị nhiễm không thể ượng từng loại? Mô tả đặc điểm của khuẩn lạc?ng t ng vi sinh v t hi u khí c a m u ban đ u?( đ n v CFU/ml)ổng vi sinh vật hiếu khí của mẫu ban đầu?( đơn vị CFU/ml) ật lạ do bị nhiễm không thể ếm số lượng ủa khuẩn lạc? ẫu ban đầu?( đơn vị CFU/ml) ầu?( đơn vị CFU/ml) ơn ị nhiễm không thể

Công th c tínhức tính

(n1v d1+…+n i v d i)Trong đó

- N: s t bào ( đ n v hình thành khu n l c) vi khu n trong m t gam hayếm số lượng ơn ị nhiễm không thể ẩn lạc? Số lượng từng loại? Mô tả đặc điểm của khuẩn lạc? ại khuẩn lạc? Số lượng từng loại? Mô tả đặc điểm của khuẩn lạc? ẩn lạc? Số lượng từng loại? Mô tả đặc điểm của khuẩn lạc? ột loại vi sinh vật lạ do bị nhiễm không thể

m t ml m u (CFU: colony forming units)ột loại vi sinh vật lạ do bị nhiễm không thể ẫu ban đầu?( đơn vị CFU/ml)

- C: t ng s khu n l c đ m đổng vi sinh vật hiếu khí của mẫu ban đầu?( đơn vị CFU/ml) ẩn lạc? Số lượng từng loại? Mô tả đặc điểm của khuẩn lạc? ại khuẩn lạc? Số lượng từng loại? Mô tả đặc điểm của khuẩn lạc? ếm số lượng ượng từng loại? Mô tả đặc điểm của khuẩn lạc?c trên các h p petri đã ch n (có s khu nột loại vi sinh vật lạ do bị nhiễm không thể ọn (có số khuẩn ẩn lạc? Số lượng từng loại? Mô tả đặc điểm của khuẩn lạc?

l c n m trong kho ng 25-250 khu n l c trên đĩa)ại khuẩn lạc? Số lượng từng loại? Mô tả đặc điểm của khuẩn lạc? ằm trong khoảng 25-250 khuẩn lạc trên đĩa) ả đặc điểm của khuẩn lạc? ẩn lạc? Số lượng từng loại? Mô tả đặc điểm của khuẩn lạc? ại khuẩn lạc? Số lượng từng loại? Mô tả đặc điểm của khuẩn lạc?

- n i: s h p petri c y t i đ pha loãng th iột loại vi sinh vật lạ do bị nhiễm không thể ấm trên bề mặt ại khuẩn lạc? Số lượng từng loại? Mô tả đặc điểm của khuẩn lạc? ột loại vi sinh vật lạ do bị nhiễm không thể ức tính

- d i: h s pha loãng tện một loại vi sinh vật lạ do bị nhiễm không thể ươnng ngức tính

- v : th tích dung d ch m u(ml) c y vào trong m i đĩaểm của khuẩn lạc? ị nhiễm không thể ẫu ban đầu?( đơn vị CFU/ml) ấm trên bề mặt ỗi đĩa

4 Xác đ nh khu n l c c a n m men (saccharomyces cerevisiae):ị nhiễm không thể ẩn lạc? Số lượng từng loại? Mô tả đặc điểm của khuẩn lạc? ại khuẩn lạc? Số lượng từng loại? Mô tả đặc điểm của khuẩn lạc? ủa khuẩn lạc? ấm trên bề mặt

Lo i 2 d ng hình tròn có vài ch m trên b m t là khu n l c c a n m menại khuẩn lạc? Số lượng từng loại? Mô tả đặc điểm của khuẩn lạc? ại khuẩn lạc? Số lượng từng loại? Mô tả đặc điểm của khuẩn lạc? ấm trên bề mặt ề mặt ặc điểm của khuẩn lạc? ẩn lạc? Số lượng từng loại? Mô tả đặc điểm của khuẩn lạc? ại khuẩn lạc? Số lượng từng loại? Mô tả đặc điểm của khuẩn lạc? ủa khuẩn lạc? ấm trên bề mặt

 Khuẩn lạc của Nấm men ( saccharomyces cerevisiae) là các khuẩn lạc tròn

có các chấm liti trên bề mặt

TUẦN 3: CẤY PHÂN LẬP - CẤY CHUYỀN – NHUỘM GRAM

I/ Cấy phân lập:

- Giúp sinh viên thực hành phương pháp nuôi cấy và tách riêng lẻ từng loại vi

sinh vật ra khỏi môi trường vi sinh vật đa dạng

- Để nghiên cứu một loại đơn lẻ nào đó trong cộng đồng vi sinh vật cần phảiphân lập chúng ra khỏi cộng đồng đó đồng thời nuôi cấy thuần khiết chúng,việc này chỉ được thực hiện thông qua những nghiên cứu về sinh lí sinh hóacũng như quan sát bằng kính hiển vi Phần lớn những nghiên cứu vi sinh vật

đó đòi hỏi phải sử dụng môi trường thuần khiết

- Phần lớn những phương pháp nuôi cấy thuần khiết dựa vào kỹ thuật phaloãng Hiện nay, phương pháp tỏ ra hữu dụng và thực tế là phương pháp nuôicấy trên đĩa trong một môi trường hỗn hợp, người ta trải hoặc cấy những vếtbôi trên bề mặt môi trường dinh dưỡng như vậy những tế bào vi sinh vật sẽđược tách riêng từng tế bào một

- Mỗi một tế bào phân lập sẽ phát triển thành một khuẩn lạc lúc đó chúng ta đãhoàn tất công việc nuôi cấy thuần chủng

- Việc tách nhưng tế bào riêng lẻ để phát triển thành một khuẩn lạc không phải

là một công việc đơn giản, không phải tất cả các khuẩn lạc đều phát triển từmột tế bào ban đầu, ví dụ: chủng streptococcus thường kết hợp thành mộtchuỗi tế bào nên không thể tách riêng từng tế bào riêng biệt Một số tế bào visinh vật bài tiết ra môi trường bên ngoài các chất như vật liệu màng nhầyhoặc các thể nhớt, chúng sẽ kết dính các tế bào lại với nhau

2) Phương pháp hạn chế các nhược điểm trong nuôi cấy phân lập:

- Bảo đảm que cấy nguội trước khi đưa vào thạch