BÁO cáo THÍ NGHIỆM VI SINH vật THỰC PHẨM môi TRƯỜNG DINH DƯỠNG các PHƯƠNG PHÁP GIEO cấy VI SINH vật

Phương pháp nghiên cứu  Sử dụng phương pháp phân lập nuôi cấy trên môi trường đặc  Với vi sinh vật kị khí: sử dụng phương pháp đổ thạch 2 lớp để nuôi cấy  Ưu điểm: Nhanh, đơn giản, th

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẦM

BÀI 1: MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY VI SINH VẬT

I Mục đích thí nghiệm

 Tìm hiểu môi trường dinh dưỡng, các loại môi trường dinh dưỡng và cách tạo ra môi trường dinh dưỡng (môi trường Czapek)

 Thực hiện được cơ bản các thao tác gieo cấy vi sinh vật

II Nội dung thực hiện

 Phương pháp tiến hành:

Đổ hộp petri

Lọc, điều chỉnh pH nếu cần thiết

Môi trường thạch nghiêng

Môi trường thạch đứng

Hòa tan trong nước Cân thành phần môi trường

1 Tạo môi trường dinh dưỡng và khử trùng

 Thành phần môi trường Czapek

 Cân đong chính xác theo đơn (chia tỷ lệ cho 250ml nước)

 Cho vào bình sạch đã sấy khô 1/3 lượng nước cần thiết, hòa tan trước cácchất có khối lượng nhỏ hơn các chất có khối lượng lớn hơn rồi đến dung dịch Dùng lượng nước còn lại tráng rửa bình, phễu… Thể tích của môi trường nhỏ hơn ½ thể tích dụng cụ chứa

 Phân phối 50ml dung dịch lỏng vào 6 ống nghiệm (không quá ½ thể tích), còn 200ml còn lại cho 2% agar vào, đun và khuấy đều trên bếp điệnđến khi tan hoàn toàn, phân phối vào 6 ống thạch đứng (không quá 1/3 thể tích), 6 ống thạch nghiêng (không quá ¼ thể tích)

 Dùng nút bông (không thấm nước) đậy kín

 Ghi tên lên môi trường rồi đem đi tiến hành thanh trùng

2 Cách làm nút bông

Lấy một lượng bông vừa đủ, gấp gọn phần rìa ở xung quanh vào phía bên trong Nhấn phần giữa đồng thời túm gọn xung quanh lại để được một hình

không nên ấn quá mạnh vì có thể làm vỡ bình, trong lúc ấn kết hợp với xoay để nút vào dễ dàng hơn Nút đậy đạt yêu cầu khi rút bông ra có thể nghe được tiếng kêu.

3 Tiến hành gieo cấy vi sinh vật

b Các bước tiến hành gieo cấy:

 Lau sạch bề mặt xung quanh khu vưc gieo cấy bằng bông có tẩm cồn

 Thắp đèn cồn để tạo môi trường vô trùng xung quanh, luôn thực hiện các thao tác gieo cấy cạnh ngọn lửa đèn cồn để đảm bảo môi trường vô trùng

 Trước khi thực hiện cấy đều phải hơ que cấy trên ngọn lửa để sát khuẩn

 Sau khi sát khuẩn que cấy xong tiến hành các thao tác gieo cấy

c Cách cấy.

 Cấy từ đặc sang lỏng: dung que cấy nhọn chấm vào canh trường (sau khi đã thực hiện các thao tác sát trùng và thao tác cấy được thực hiện cạnh ngọn lửađèn cồn), hơ miệng của ống nghiệm rồi đóng nắp lại Mở nắp ống chứa môi trường lỏng tiến hành chấm trên bề mặt, hơ miệng ông lên ngọn lửa rồi đóngnắp lại,

 Cấy từ canh trường đặc sang môi trường đặc

 Cấy trên ống thạch đứng: tương tự như cấy từ canh trường đặc sang môi trường lỏng

 Cấy trên ống thạch nghiêng: dung que cấy vòng

 Cấy trên hộp pettri: Cấy chấm điểm

5 Thanh trùng bằng nồi hấp.

- Nguyên tắc: Dựa trên khả năng tăng nhiệt độ sôi của các chất lỏng khi áp suất tăng Người ta gia nhiệt các vật bằng hơi nước bão hòa dưới một áp suấtlớn hơn áp suất khí quyển Khi áp suất tăng lên thì nhiệt độ cũng tăng theo Người ta khống chế nhiệt độ thanh trùng thông qua điều khiển áp suất

 Cách vận hành nồi hấp áp lực:

 Kiểm tra mức nước của thiết bị thông qua mức nước ở ống thủy, khoảng từ 1/3 đến ½ poongas thủy Nếu thiếu phải bổ sung nước Nước thêm vào phải là nước mềm như nức cất, nước ngưng hoặc nước đã loại bỏ bớt phần cứng bằng cách đun sôi để nguội

 Đặt môi trường, vật cần thanh trùng vào nồi trong sao cho nút bông hướng vào giữa nồi Lưu ý vật liệu cần thah trùng chỉ chiếm 2/3 thể tích

 Lưu ý:

 kiểm tra mức nước trước khi vận hành thiết bị

 tuyệt đối không mở nắp thiết bị khi kim áp kế chưa về 0

- Ưu điểm: Nhiệt độ thanh trùng không làm biến tính các sản phẩm có bên

thí nghiệm tường kết hợp phương pháp này với phương pháp tyndal để thanh trùng các môi trường dinh dưỡng

- Nhược điểm: không tiêu diệt được các tế bào sinh bào tử

III Kết quả và thảo luận

 Tạo được môi trường dinh dưỡng theo đúng yêu cầu (môi trường Czapek)

 Biết thực hiện cơ bản thao tác cấy tuy nhiên vẫn còn chưa thành thạo: trong quá trình cấy còn gây xước bề mặt của môi trường trong hộp petri, và đường gieo cấy còn ngắn nên mật độ vi sinh vật nhỏ

 Cách khắc phục: thực hiện thao tác nhiều

BÀI 2: PHÂN LẬP VI SINH VẬT

I Mục đích thí nghiệm và phương pháp nghiên cứu

2 Phương pháp nghiên cứu

 Sử dụng phương pháp phân lập nuôi cấy trên môi trường đặc

 Với vi sinh vật kị khí: sử dụng phương pháp đổ thạch 2 lớp để nuôi cấy

 Ưu điểm: Nhanh, đơn giản, thao tác dễ thực hiện

 Nhược điểm: Chỉ sử dụng cho các vi sinh vật yếm khí không bắt buộc

và các vi sinh vật có thể chịu được nhiệt độ 50-55oC

II Dụng cụ thí nghiệm và cách thức tiến hành

1 Dụng cụ thí nghiệm

 Mẫu vi sinh vật hiếu khí: nước tương bần

 Mẫu vi sinh vật kị khí: Lactobacillus trong men vi sinh

a Chuẩn bị môi trường và dịch thạch đổ lớp trên cùng, pha nước muối sinh lý 0,9%

* Chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi sinh vật kị khí: MRS Agar

 Chuẩn bị 2 bình tam giác

 Cân mỗi bình 10,1g MRS và 3g agar

 Đổ nước cất định mức đến 150ml

 Bọc kín đầu bình và đem thanh trùng bằng phương pháp áp suất hơi bão hòa

* Chuẩn bị dịch thạch đổ trên cùng

 Chuẩn bị 2 bình tam giác

 Cân mỗi bình 3g agar

 Đổ nước cất định mức đến 150ml

 Bọc kín đầu bình và đem thanh trùng theo phương pháp áp suất hơi bão hòa

* Pha nước muối sinh lý 0,9%

 Cân 13,5mg NaCl cho vào bình tam giác

 Định mức đến 1500ml rồi bọc lại đem thanh trùng

b Phân lập vi sinh vật hiếu khí

 Pha loãng dung dịch mẫu

 Lấy 1ml nước tương bần cho vào bình tam giác đã chứa sẵn 99ml nước muối sinh lý 0,9%, ta thu được dung dịch pha loãng 10-2, lắc đều

 Tiến hành pha loãng tiếp bằng cách cho 0,9ml nước muối sinh lý vào

4 ống Eppendorf, sau đó lấy 0,1 ml dung dịch từ bình tam giác cho vào ống Eppendorf đầu tiên sau đó Votex để thu được dung dịch pha loãng 10-3, đánh dấu ống

 Lấy 0,1ml dung dịch từ ống pha loãng 10-3 cho vào 1 ống Eppendorf đang chứa nước muối sinh lý, Votex đều thu được dung dịch pha loãng 10-4, đánh dấu ống

 Lấy 0,1ml dung dịch từ ống pha loãng 10-4 cho vào ống Eppendorf đang chứa nước muối sinh lý, Votex đều thu được dung dịch pha loãng 10-5, đánh dấu ống

 Lấy 0,1ml dung dịch từ ống pha loãng 10-5 cho vào ống Eppendorf đang chứa nước muối sinh lý, Votex đều thu được dung dịch pha loãng 10-6, đánh dấu ống

 Phân lập vi sinh vật bằng nuôi cấy trên môi trường đặc

 Sử dụng 3 hộp petri đã vô trùng và có chứa sẵn môi trường dinh dưỡng để tiến hành nuôi cấy

 Ghi nồng độ dung dịch 10-4, 10-5, 10-6 ở dưới đáy hộp

 Dùng pipet lấy 0,1 ml dung dịch từ ống Eppendorf 10-4 cho vào hộp petri 10-4, sau đó dung que chang đã vô trùng để chang đều phần dịch mẫu vi sinh vật lên đầu khắp mặt thạch, vừa chang vừa xoay hộp petri

 Sau khi thấy dung dịch mẫu đã đợc ria đều kháp mặt thạch để hộp petri này sang 1 bên

 Làm tương tự với các mẫu pha loãng 10-5, 10-6

 Sau khi cấy xong 3 hộp petri này xong, lật ngược lại rồi bọc kín lại bằng giấy báo, ghi tên mẫu, nhóm và ngày nuôi cấy lại, cho lên tủ cấy

vi sinh vật, sau 2 hôm tới xem kết quả nuôi cấy

 Lưu ý khi phân lập vi sinh vật hiếu khí:

 Pha loãng dung dịch mẫu đến 1 nồng độ nhất định để đảm bảo lượng

vi sinh vật là ít nhất khi lấy mẫu để nuôi cấy

 Tất ngọn lửa cả quá trình nuôi cấy phải đặt gần ngọn lửa đèn cồn để

vô trùng

 Hộp petri khi cấy không được cầm lên mà phải để trên mặt bàn, mở hé

 Phải đặt ngược hộp petri khi nuôi cấy trong tủ nuôi

 Mẫu là nước tương bần đặc nên rất khó lấy, cần phải cắt to phần đầu ống pipet, thao tác nhanh dứt khoát

c Phân lập vi sinh vật kị khí

 Pha loãng dung dịch mẫu:

 Chuẩn bị 7 ống Eppendorf chứa 9ml nước muối sinh lý để trên giá

 Lấy 0,1 ml dung dịch mẫu men vi sinh cho vào ống Eppendorf đầu tiên, sau đó Votex ta được mẫu pha loãng 10-1, đánh dấu ống

 Lấy 0,1 ml dung dịch của ống 10-1 cho vào ống Eppendorf, sau đó đem Votex đều ta thu được mẫu ph loãng 10-2, đánh dấu ống

 Tiếp tục làm như vậy đến khi làm xong ống pha loãng 10-7

 Phân lâp vi sinh vật kị khí

 Chuẩn bị 3 hộp petri đã vô trùng chứa môi trường MRS

 Ghi nồng độ 10-5, 10-6, 10-7 vào dưới đáy hộp petri

 Lấy 0,1 ml dịch mẫu từ ống Eppendorf 10-5 cho vào hộp Petri 10-5, dùng que chang đã vô trùng ria đều dung dịch mẫu ra khắp mặt thạch, vừa chang vừa xoay hộp petri

 Sau khi làm xong với hộp petri 10-5, để hộp này sang 1 bên thao tác tương tự với 2 hộp petri 10-6 và 10-7

 Đổ thạch lớp thạch trên cùng:

 Mở hé nắp hộp petri sau đó đổ dịch thạh đã chuẩn bị sẵn, sau đó nghiêng hộp petri để thạch dàn đều khắp bề mặt hộp petri

 Làm tương tự với 3 hộp petri

 Đợi thạch đông lại, sau đó lật ngược hộp petri, gói lại bằng giấy, ghi tên nhóm, mẫu và ngày nuôi cấy sau đó để lên tủ nuôi, đợi 2 hôm sau đến xem kết quả

 Lưu ý khi phân lập vi sinh vật kị khí

 Phải thao tác thật nhanh tránh để nhiễm oxi vào

 Đổ thạch sau khi thạch đã thanh trùng, nhiệt độ thạch vào khoảng

50-55oC

 Phải đợi thạch đông hoàng toàn mới lật ngược hộp petri

IV Kết quả và thảo luận

Sau thí nghiệm thu được:

1 Mẫu hiếm khí

a) Độ pha loãng 10-3

b) Độ pha loãng 10-4

c) Độ pha loãng 10-5

Do trong quá trình pha loãng, nhóm em đã pha loãng sai nên mẫu hiếm khí

đã bị pha loãng với nồng độ như trên Vì vậy, với nồng độ đó rất khó quan sát

sự xuất hiện của các khuẩn lạc và chỉ quan sát thấy sự phát triển của nấm với bềmặt xù xì

2 Mẫu kỵ khí

a) Độ pha loãng 10-8 : các khuẩn lạc màu đục mọc riêng lẻ giữa 2 lớp thạch, xuất hiện 1 vài loài vi sinh vật, chứng tỏ bị nhiễm khuẩn trong quá trình thao tác

b) Độ pha loãng 10-9 : khuẩn lạc mọc rất ít giữa 2 lớp thạch, cũng xuất hiện 1 vài loài vi sinh vật, cũng chứng tỏ bị nhiễm khuẩn trong quá trình thao tác

Do trong quá trình pha loãng, nhóm em đã pha loãng sai nên mẫu kỵ khí đã

bị pha loãng với nồng độ như trên Vì vậy, với nồng độ đó rất khó quan sát sự xuất hiện của các khuẩn lạc

IV Thảo luận

1 Môi trường hiếu khí

 Chưa đạt vì xuất hiện rất ít khuẩn lạc và có sự nhiễm khuẩn

 Trong hộp petri hầu như xuất hiện rất ít khuẩn lạc vì độ pha loãng này đã bị pha loãng sai

 Trong quá trình thao tác còn nhiều sai sót Sự nhiễm khuẩn có thể bị nhiễm

quá trình di chuyển thạch để đổ từ nhóm này sang nhóm khác, thao tác xa đèn cồn, không khử trùng các dụng cụ cấy

2 Môi trường kỵ khí

 Chưa đạt vì xuất hiện rất ít khuẩn lạc và có sự nhiễm khuẩn

 Trong hộp petri hầu như xuất hiện rất ít khuẩn lạc vì độ pha loãng này đã bị pha loãng sai

 Trong quá trình thao tác còn nhiều sai sót Sự nhiễm khuẩn có thể bị nhiễm trong lúc đổ thạch, quá trình chuyển mẫu từ nhóm này sang nhóm khác, hay quá trình di chuyển thạch để đổ từ nhóm này sang nhóm khác, thao tác xa đèn cồn, không khử trùng các dụng cụ cấy

 Vi khuẩn phân bố giữa 2 lớp thạch không đều, dẫn đến khi quan sát chưa thấy rõ các khuẩn lạc Nguyên nhân có thể do lắc bình tam giác và ống effendorf không kỹ, dẫn đến khi pha loãng không được đồng đều, cũng có thể do trang không kĩ

 Cách khắc phục sự cố sảy ra:

 Pha loãng nồng độ phù hợp, lắc đều trước khi tiến hành pha loãng

 Thao tác trang tốt hơn, tập luyện nhiều

 Khi thí nghiệm cần chú ý làm việc xung quanh ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiễm vi sinh vật từ bên ngoài

 Để nguội thạch rồi mới đổ vào để tránh tiêu diệt hết vi sinh vật

Bài 3: Định lượng vi sinh vật bằng cách đếm khuẩn lạc

2 Các phương pháp định lượng vi sinh vật.

- Trong bài thí nghiệm này ta chủ yếu tìm hiểu và thực hành phương pháp định lượng gián tiếp

a) Định lượng trực tiếp.

- Định lượng trực tiếp: là những phương pháp đếm trực tiếp số tế bào vi sinh

Ưu điểm: Cho kết quả nhanh chóng.

Nhược điểm: Kém chính xác vì khi đếm nhữ vậy ta đếm cả những tế bào đã chết trước lúc làm tiêu bản

Các phương pháp định lượng trực tiếp

- Phương pháp dùng buồng đếm hồng cầu: thường dùng để đếm vi sinh vật

mà tế bào có kích thước lớn như nấm men, bào tử nấm mốc

- Phương pháp Brit: phương pháp này dùng để định lượng vi sinh vật có trongsữa hay một số vật phẩm lỏng

- Phương pháp Vinogratxki – Sungina: Phương pháp này thường dùng để địnhlượng vi sinh vật trong đất hay vật phẩm đặc, rắn

b) Định lượng gián tiếp

Định nghĩa: Định lượng gián tiếp là những phương pháp định lượng vi sinh vật

bằng cách gieo cấy một lượng nhất định vật phẩm nghiên cứu lên môi trường thức

ăn thích hợp, nuôi trong 36 - 48 giờ, sau đó đếm số khuẩn lạc rồi suy ra số tế bào

có trong một đơn vị vật phẩm ban đầu

Ưu điểm: Chỉ đếm những tế bào vi sinh vật còn sống nên kết quả chính xác hơn Nhược điểm:

- Tốn thời gian, công sức

- Khi cấy từ các vật phẩm pha loãng chênh nhau 10 lần không bao giờ thấy số khuẩn lạc chênh nhau 10 lần; vì thế để kết quả kiểm tra vi sinh vật có giá trị

so sánh tốt nên sử dụng một độ pha loãng thống nhất đối với từng loại vật phẩm

- Đối với những vi sinh vật mà bào tử thường dính chặt với nhau thành từng chuỗi, từng đôi, từng khối thì khi phát triển trên môi trường, mỗi chuỗi, mỗi khối đó chỉ tạo thành một khuẩn lạc

Vì thế, số khuẩn lạc chưa phản ánh được chính xác số tế bào vi sinh vật có trong vật phẩm nghiên cứu

- Không có loại môi trường dinh dưỡng nào cho phép tất cả các nhóm vi sinh vật cùng phát triển.

Phương pháp đếm số khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch

Nguyên tắc: Gieo cấy một lượng vật phẩm nhất định lên môi trường đặc trong hộp

petri, nuôi ở nhiệt độ thích hợp Sau đó đếm số khuẩn lạc mọc lên rồi suy ra kết quả

III Tiến hành thí nghiệm

1 Chuẩn bị thí nghiệm

a) Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng.

Mỗi nhóm cần chuẩn bị 8 đĩa thạch để nuôi cấy vi sinh vật ( mẫu không khí 2 đĩa, mẫu đất 3 đĩa, mẫu nước 3 đĩa) à cần 48 đĩa cho 6 nhóm, mỗi đĩa đổ 12-15ml môitrường à pha 750ml môi trường

Dùng bình tam giác 250ml, mỗi bình chỉ yêu cầu chứa khoảng 150ml môi trường

Dung dịch FeSO4 1%, mFeSO4 = 0,0075g è Vdd FeSO4 = 0,75ml

- Dùng cốc 1 lít để pha môi trường Cho vào cốc 200ml nước cất, hòa tan các chất theo thứ tự khối lượng từ nhỏ đến lớn, cuối cùng là các chất đông dính Dùng lượng nước còn lại để tráng rửa cổ bình, phễu, chuẩn đến 750ml Khuấy đều

- Đặt lên bếp đun, dùng đũa thủy tính khuấy đều liên tục cho tới khi sôi nhẹ để thạch nóng chảy và quyện với hóa chất khác

- Phân phối môi trường vào các bình tam giác 250ml, mỗi bình 150ml môi trường Nút bông, làm nắp giấy, sau đó đem đi khử trùng môi trường ( sử dụng nồi hấp áp lực)

- Sau khi khử trùng, phân phối môi trường vào hộp petri, để nguội và chuẩn bị nuôi cấy vi sinh vật

Yêu cầu: thao tác phân phối môi trường vào hộp petri gần ngọn lửa đèn cồn để

hạn chế tối đa sự nhiễm tạp của vi sinh vật từ môi trường xung quanh Đậy kín nắp hộp để giữ môi trường vô trùng

b) Pha nước muối sinh lý 0,9%

Yêu cầu: mỗi nhóm cần 99ml/bình tam giác x 2 bình + 40ml ống falcon ≈

250ml

6 nhóm x 250ml/nhóm = 1500ml.

Cách pha: cân 13,5g NaCl hòa tan hoàn tan vào 1500ml nước cất Chia đều ra

cốc cho mỗi nhóm 250ml dd NaCl 0,9%

- 2 bình tam giác, mỗi bình chứa 99ml dd NaCl 0,9%

- 1 ống falcon chứa 40ml dd NaCl 0,9%

Nước muối pha được khử trùng, đậy kín, làm nguội để chuẩn bị làm thí nghiệm

2 Nuôi cấy vi sinh vật

- Mẫu đất

Cân 7g mẫu đất, nghiền nhỏ, đều Mỗi nhóm cân đúng 1g mẫu đất cho vào bình tam giác chứa 99ml nước muối sinh lý ( đã chuẩn bị trước đó) Lắc đều để tách các vi sinh vật có trong mẫu rời nhau

- Mẫu nước

Dùng pipet hút 1ml mẫu nước cho vào bình tam giác chứa 99ml nước muối sinh

lý ( đã chuẩn bị trước), lắc đều

Thao tác trên cũng chính là pha loãng mẫu 10-2

Pha loãng đến các nồng độ tiếp theo.

+ Lấy ống Eppendorf đã được vô trùng (đựng trong các cốc có bọc kín) xếp lên kệ Các thao tác cần được làm quanh ngọn lửa đèn cồn để hạn chếtối đa vi sinh vật nhiễm tạp

Dùng pipet hút 0,9ml dd NaCl 0,9% trong ống falcon cho vào mỗi ống

Eppendorf

Trong thí nghiệm này, ta pha loãng đến 10-5 è chuẩn bị 3 ống Eppendorf

+ Pha loãng 10-3: dùng pipet hút 0,1ml mẫu đã pha loãng 10-2 cho vào ốngEppendorf đã bố sung 0,9ml nước muối, đậy kín nắp ống Eppendorf rồi lắc đều bằng máy lắc rung Vortex

+ Thao tác lặp lại tương tự với mẫu pha loãng 10-4, 10-5

Sau khi pha loãng mẫu, tiến hành gieo cấy vi sinh vật vào môi trường

+ Dùng pipet hút khoảng 50µl cho vào hộp thạch

+ Khử trùng que trang trên ngọn lửa đèn cồn, làm nguội và tiến hành trang đều mẫu trên bề mặt thạch cho đến khi mẫu được trải đều, cảm giác

có độ dít khi trang à tách riêng biệt các tế bào vi sinh vật

+ Đậy kín, ghi đầy đủ thông tin, bọc và được đem đi nuôi ở điều kiện thích hợp

- Mẫu không khí

Phương pháp lắng của Omelianxki

Nguyên tắc: theo Omelianxki ước tính trên một diện tích rộng 100 cm2, mở ra

trong 5 phút thì lượng vi sinh vật rơI xuống tương đương với lượng vi sinh vật

có trong 10 lít không khí

Ưu điểm: Đây là phương pháp đơn giản nhất thường dùng.

Nhược điểm: Không thật chính xác vì dựa trên cách ước tính.

Cách tiến hành:

- Đặt hộp petri có môi trường đặc đã vô trùng ra chỗ không khí định nghiêncứu Mở nắp hộp trong thời gian xác đinh (thường là 5 phút) rồi đậy nắp hộp và để vào tủ ấm Sau 24 – 48 giờ đem ra, đếm số khuẩn lạc

- Tính toán: Đo đường kính hộp petri (d cm) để tính diện tích, rồi suy ra lượng vi sinh vật trong 1 lít hay 1m3 không khí theo ước tính của

Omelianxki

Ngoài ra còn có thể ước tính như sau: Hộp petri có diện tích 60 cm2 Sau 1h sẽ

có một lượng vi sinh vật lắng xuống bằng lượng vi sinh vật có trong 6 lít không khí

è Nuôi vi sinh vật ở điều kiện thích hợp trong khoảng 36- 48 tiếng Theo nguyên tắc mỗi tế bào riêng biệt sẽ phát triển thành 1 khuẩn lạc riêng rẽ Đếm khuẩn lạc, tính toán ta sẽ xác định được lượng vi sinh vật có trong mẫu thí nghiệm

IV Kết quả thí nghiệm, tính toán và nhận xét

Đối với 2 mẫu pha loãng ( mẫu đất và mẫu nước ) tiêu chuẩn kết quả: đĩa thạch

có chứa từ 30-300 khuẩn lạc (khoảng có ý nghĩa)

Nếu có 2-3 đĩa cho kết quả có nghĩa thì ta vẫn tính lượng vi sinh vật trong mẫu theo từng đĩa và lấy kết quả trung bình.

-mẫu 10 -6 : : mẫu này không có khuẩn lạc

-mẫu 10 -5 : : mẫu này không có khuẩn lạc

-mẫu 10 -4 : mẫu này có 6 khuẩn lạc

Trong mẫu pha loãng10-4 có 6 khuẩn lạc

2 khuẩn lạc 2µl

à trong 1ml có 1000.22 =1000 k huẩ nl ạc 1000 tế bào vi sinh vật Mẫu pha loãng 10-3 à lượng vi sinh vật trong mẫu = 100010−4 = 107 (CFU/ml)

2 Mẫu nước

Đối với mẫu 10 -5 :

Mẫu này không quan sát thấy khuẩn lạc

- Mẫu 10-4: mẫu này có 2 khuẩn lạc

- Mẫu 10-3: mẫu này có 2 khuẩn lạc

Trong mẫu pha loãng10-3 có 2 khuẩn lạc

2 khuẩn lạc 2µl

à trong 1ml có 1000.22 =1000 k huẩ nl ạc 1000 tế bào vi sinh vật Mẫu pha loãng 10-5 à lượng vi sinh vật trong mẫu = 100010−3 = 106 (CFU/ml)

è Nhận xét chung: các khuẩn lạc phát triển có hình dạng, màu sắc và kích thước khác nhau do trong mẫu đất có chứa nhiều hơn 1 loại vi sinh vật Theo hình ảnh ta thấy:

+ có loại có kích thước nhỏ khoảng 1-2mm, màu trắng đục, giống như những chấm nhỏ li ti, bề mặt bằng phẳng

+ có loại có kích thước 0,5-1cm, màu trắng sữa, viền đều và nhạt màu dần từ tâm ra viền, bề mặt phát triển bằng phẳng, hơi nhô phần tâm

è Theo như quan sát, các khuẩn lạc tách nhau riêng rẽ Tuy nhiên trên cả 2 mẫu đất và nước, số lượng khuẩn lạc trong đĩa đều < 30 à chưa đạt yêu cầu Mặt khác, kết quả này thuận lợi cho việc phân lập vi sinh vật

è Nguyên nhân:

- Lượng vi sinh vật trong mẫu nhỏ, độ pha loãng lớn

- Lượng mẫu nuôi cấy vào môi trường nhỏ

- Thao tác cấy trang không tách được riêng biệt các tế bào vi sinh vật à các khuẩn lạc phát triển không tách rời nhau

- Do thao tác thí nghiệm: que trang sau khí khử trùng bằng ngọn lửa đền cồn chưa được làm nguội đến nhiệt độ mà một số vi sinh vật chịu được à

3 Mẫu không khí

- Vị trí lấy mẫu: trên bàn sau cửa ra vào của phòng thí nghiệm (C4-401)

- Nhận xét: có nhiều hơn 1 loại vi sinh vật trong canh trường tập trung thu được Đặc điểm của khuẩn lạc khác nhau: màu sắc, kích thước, hình thái khuẩn lạc,…

Ước tính: hộp petri có diện tích 60cm2, sau 1 giờ sẽ có một lượng vi sinh vật lắng xuống bằng lượng vi sinh vật có trong 6 lít không khí

Trong thí nghiệm lần này, ta để thời gian vi sinh vật lắng xuống trong 5 phút

lượng vi sinh vật trong 0,5 lít không khí = 500ml không khí

 Vi sinh vật trong không khí vô cùng đa dạng Có cả vi khuẩn và nấm

 Ở đây 2 trong3 mẫu đất, nước và không khí đều không đạt yêu cầu thí nghiệm do số khuẩn lạc không nằm trong khoảng từ 30 đến 300, chỉ có 1trong 3 mẫu thí nghiệm đạt yêu cầu

 Khuẩn lạc ít có thể do trong quá trình lắc bình tam giác và ống eppendorf không đều nên vi khuẩn phân bố trong ống không đều

 Để cải thiện kết quả có thể sử dụng môi trường có độ pha loãng thấp hơn

Bài 4:Thí nghiệm Định lượng vi sinh vật – Phương pháp nhiều ống (số

xử lý, sẽ trở nên đặc biệt nguy hiểm nếu được sử dụng làm nước sinh hoạt hoặc dành cho các hoạt động thể dục thể thao

- Để đánh giá sự ô nhiễm phân của nước tự nhiên, việc xác định sự có mặt của

vi sinh vật chỉ thị được tiến hành Coliform được xem là vi sinh vật chỉ thị ô nhiễm phân do:

(1) chúng thường không có mặt trong môi trường nước tự nhiên, môi trường sống tự nhiên của chúng là hệ đường ruột của động vật máu nóng, trong đó có con người, (2) Chúng có khả năng sống lâu trong môi trường nước tự nhiên hơncác loài vi sinh vật khác có nguồn gốc từ đường ruột,

(3) đa số các chủng coliform không phải là vi sinh vật gây bệnh, và

(4) việc phát hiện chúng bằng kỹ thuật nuôi cấy khá đơn giản Coliform là nhómcác vi khuẩn hiếu khí tùy tiện, Gram âm, hình que, không sinh bào tử, và có khảnăng lên men lactose sinh ra acid và giải phóng khí ở 35°C sau 48h

Việc xác định sự có mặt của coliform trong mẫu nước phải trải qua ba xét

nghiệm: (1) thí nghiệm giả định, (2) thí nghiệm xác nhận, và (3) thí nghiệm hoàn thành

+ Thí nghiệm giả định (presumed test): cấy mẫu nước vào môi trường lactose để xác định sự có mặt của vi khuẩn coliform có khả năng lên men

lactose sinh acid và khí sau 48h ở nhiệt độ 35°C

+ Thí nghiệm xác nhận (confirmed test): canh trường trong ống dương tính

ở thí nghiệm giả định được cấy chuyển sang môi trường chọn lọc đặc hiệu cho

vi khuẩn Gram âm (ví dụ: môi trường thạch Eosin Methylene Blue - EMB) để

xác nhận việc lên men sinh khí không phải do vi khuẩn Gram dương (những loài cũng có khả năng lên men sinh khí như Clostridium và Bacillus).

+ Thí nghiệm hoàn thành (completed test): Các khuẩn lạc phát triển trên môi trường ở thí nghiệm xác nhận sẽ được kiểm tra đặc tính hình thái kỹ hơn đểxác định chúng có phải vi khuẩn Gram âm, hình que, và không sinh bào tử (đặc điểm của vi khuẩn coliform)

- Trong bài thí nghiệm này, thí nghiệm lactose sinh khí bằng phương pháp số

giả định được tiến hành để định lượng vi khuẩn lên men có xác suất lớn nhất (MPN-Most Probable Number)

- Phương pháp MPN xác định sự có mặt của vi khuẩn lên men lactose sinh khí dựa vào việc cấy mẫu nước với thể tích giảm dần theo hệ số 10 vào tổ hợp 3-5 ống chứa môi trường dinh dưỡng chứa lactose, số lượng ống cho kết quả dương tính được xác định và đối chiếu với bảng tính thống kê tiêu chuẩn MPN cũng

có thể được sử dụng để định lượng các loại vi sinh vật khác trong các mẫu môi trường khác nhau, phương pháp này có ưu điểm so với phương pháp đếm trực tiếp hoặc phương pháp đo quang là các thành phần rắn lơ lửng không ảnh hưởngđến kết quả định lượng

1 Mục đích

 Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp MPN

 Định lượng sự có mặt của nhóm vi khuẩn sinh khí và acid trong mẫu nước

2 Vật liệu và Phương pháp

 Nguyên liệu và dụng cụ

 Mẫu: nước hồ Tiền

 Môi trường lỏng Lactose nồng độ kép: 30mL

 Môi trường lỏng Lactose nồng độ đơn: 60mL

 Môi trường được chứa trong các ống nghiệm có sẵn ống Durham úp ngược để thu khí sinh ra trong quá trình lên men Lactose

 Chuẩn bị môi trường

Môi trường lỏng lactose: môi trường được chuẩn bị ở nồng độ đơn và nồng độ kép theo công thức sau:

Thành phần Nồng độ kép Nồng độ đơn Peptone 4g 2g

Lactose 4g 2g

 Mẫu: nước hồ Tiền

 Mẫu nước được chuẩn bị sẵn, chứa trong các bình được khử trùng trước,

 Nuôi các ống đã cấy mẫu nước trong tủ ấm 35°C trong 48h

3 Kết quả thấy được sau 48h

 Sau 48h, kiểm tra số lượng các ống dương tính trong mỗi tổ hợp ống nhận được Ống dương tính là ống có khí được thu trong ống durham rồi xem lượng khí có khoảng 10% chiều cao(3mm) của ống nhỏ hay không

 Ưu điểm: Cho kết quả nhanh chóng.

 Số ống dương tính trong hộp F1 là 3 (1 ống sinh 2/3 ống và1 ống gần ½ ống và 1 ống gần 1/3 ống )

è lượng sinh khí khác nhau

 số ống dương tính trong hộp F2 là 3 (3 ống đều sinh 1 lượng ít khí lớn hơn 10%≈ 3mm) ; số ống dương tính trong hộp F3 là 2 (trong đó 2 ống dương tính thì 1 ống lớn hơn 10% và 1 ống≈ 1/3 ống nhỏ; và 1 ống sinh 1lượng rất nhỏ nhỏ hơn 10%)

 Ta có bộ ba số 3-3-2

 Đối chiếu bộ số này với bảng thống kê MPN tiêu chuẩn nhận được kết quả là: 1100 MPN/100ml

 mật độ vi sinh vật Coliform trong mẫu nước ban đầu: 11000

MPN/100ml (do mẫu nước đã pha loãng 10 lần)

 Giới hạn MPN của mẫu nước đã pha loãng 10 lần ở độ tin cậy 95% là:150-4800 MPN/100ml

 Giới hạn MPN của mẫu nước ban đầu ở độ tin cậy 95% là: 1500-48000 MPN/100ml

4 Phạm vi áp dụng

 Sử dụng xác định mật độ vi sinh vật sống, cấy 10ml, 1ml, 0,1 ml từ 1 độ pha loãng ban đầu

 Cho phép đếm số vi sinh vật chính xác, mẫu không cản trở đếm số lượng

vi sinh vật, áp dụng với nhiều loại mẫu khác nhau: rắn, lỏng với lượng visinh vật trong nhiều mẫu khác nhau

 Nhược điểm:

 Cho phép ước tính số lượng vi sinh vật không thật sự chuẩn xác

5 Thảo luận và đánh giá

 Sử dụng làm vi sinh vật chỉ thị vì việc nuôi cấy rất đơn giản

 Bài này xác định bằng cách lên men lactose sinh axit và khí

 Môi trường chỉ thị: yếu tố lên men lactose kết hợp với ống Durham

 Phương pháp này có thể áp dụng cho mẫu có mật độ vi sinh vật thấp

 Áp dụng định lượng vi sinh vật không có khả năng phát triển tốt trong môi trường thạch, tuy nhiên tốn nhiều thời gian

Bài 5 + 6: Quan sát nấm men Định lượng nấm men trong canh trường sử dụng buồng đếm hồng cầu.

I Mục đích thí nghiệm

- Thao tác sử dụng kính hiển vi, quan sát vi sinh vật

- Đánh giá chất lượng canh trường (độ thuần khiết, tỷ lệ tế bào sống/chết,

tỷ lệ nảy chồi, mật độ tế bào,…)

- Định lượng vi sinh vật sử dụng phương pháp buồng đếm hồng cầu

II Cơ sở lý thuyết

 Cấu tạo kính hiển vi

Cấu tạo kính hiển vi bao gồm 2 bộ phận chính: bộ phận cơ học và bộ phận quang học

Bộ phận cơ học: gồm giá kính, ống kính và khay kính

Bộ phận quang học là bộ phận quan trọng nhất của kính hiển vi gồm: vật kính, thị kính, kính tụ quang và gương phản chiếu.

 Cách sử dụng

- Điều chỉnh ánh sáng: điều chỉnh gương, kính tụ quang

- Quan sát tiêu bản: điều chỉnh khoảng cách giữa vật kính và khay kính, vị trí quan sát tiêu bản,…sao cho ảnh nhìn thấy rõ nét

2 Các tiêu bản quan sát vi sinh vật sống.

Có 3 loại tiêu bản chính: tiêu bản giọt ép, tiêu bản giọt treo, tiêu bản vết Trong bài thí nghiệm này ta làm tiêu bản ép để quan sát vi sinh vật

 Tiêu bản giọt ép

Phạm vi sử dụng: tiêu bản giọt ép cho phép quan sát hình dạng, xác định kích thước và hả năng di động của tế bào vi sinh vật

 Tiêu bản giọt treo

- Phạm vi sử dụng: loại tiêu bản này dùng để theo dõi sự sinh sản, sự hình

thành bào tử, khả năng di động và phản ứng của tế bào vi sinh vật với cácchất kích thích hóa học

- Ưu điểm của loại tiêu bản này so với tiêu bản giọt ép là giúp ta quan sát

tế bào vi sinh vật dễ dàng hơn, tiêu bản giữ được lâu hơn và nhờ đó ta có thể quan sát phương thức chuyển động và sinh sản của vi sinh vật

 Tiêu bản vết