Enzyme Protease bộ môn vi sinh vật đại cương

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ TÀI NGUYÊN TIỂU LUẬN TÊN ĐỀ TÀI ENZYME PROTEASE Môn học Vi sinh vật đại cương Mã môn học EN1015 Giảng viên PGS TS Đặng Vũ Bích Hạnh ThS Trịnh Thị Bích Huyền Họ và tên LÊ BÙI ANH MSSV 2010110 Tp Hồ Chí Minh, Tháng 10 năm 2021 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1 KHÁI NIỆM VÀ NGUỒN GỐC 2 I Khái niệm 2 II Nguồn gốc 2 1 Thực vật 2 2 Động vật 3 3 Vi sinh vật 3 CHƯƠNG 2 PHÂN LOẠI 5 I Khái niệm EC 5 II Phân loại Protease 5 CHƯƠNG 3 CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG 7 CHƯƠNG 4 CHỨC NĂNG.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ TÀI NGUYÊN

TIỂU LUẬN

TÊN ĐỀ TÀI:

ENZYME PROTEASE

Môn học : Vi sinh vật đại cương

Mã môn học : EN1015

Giảng viên : PGS TS Đặng Vũ Bích Hạnh

ThS Trịnh Thị Bích Huyền

Họ và tên : …LÊ BÙI ANH…

Tp Hồ Chí Minh, Tháng 10 năm 2021

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: KHÁI NIỆM VÀ NGUỒN GỐC 2

I Khái niệm: 2

II Nguồn gốc: 2

1 Thực vật: 2

2 Động vật: 3

3 Vi sinh vật 3

CHƯƠNG 2: PHÂN LOẠI 5

I Khái niệm EC: 5

II Phân loại Protease: 5

CHƯƠNG 3: CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG 7

CHƯƠNG 4: CHỨC NĂNG VÀ ỨNG DỤNG 10

I Trong y sinh: 10

II Trong công nghiệp: 10

1 Chế biến thủy sản 10

2 Công nghiệp sữa và bánh 11

3 Sản xuất bia 11

4 Công nghiệp da và dệt 11

CHƯƠNG 5: QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT ENZYME 12

I Phương pháp thu nhận Ficin thô từ cây sung và sơ chế thành chế phẩm Enzyme Ficin 12

1 Thu nhận Ficin thô: 12

2 Sơ chế dịch nhựa tươi thành chế phẩm Enzyme Ficin: 12

II Phương pháp tinh sạch: 13

KẾT LUẬN 15

MỞ ĐẦU

Thế giới xung quanh ta tồn tại vô vàn những điều kì diệu mà loài người đã dành nhiều thế hệ để nghiên cứu chúng và enzyme cũng là 1 trong số đó Enzyme, như chúng ta đã biết, đóng vai trò rất quan trọng trong cơ thể của mọi sinh vật sống trên Trái Đất này.Trên thực tế, khi con người còn chưa có khái niệm về enzyme, họ đã biết

sử dụng nó trong chế biến bảo quản thực phẩm lên men cổ truyền Khoảng 5000 năm trước công nguyên ở Jerico, người ta đã biết đến kỹ thuật làm bánh mì, nấu rượu vang, sản xuất dấm, tương chao,… ở các mức độ khác nhau Và Protease là 1 trong những enzyme vô cùng thú vị: Các nghiên cứu gần đây cho thấy khoảng 2% của toàn bộ sản

enzyme này Lịch sử nghiên cứu của protease đã được ghi nhận từ những năm cuối của thế kỉ XVIII, nhưng tới gần đây mới thật sự nhận được sự quan tâm bởi các ứng dụng rộng rãi của chúng: chúng không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh sản, sinh trưởng của mọi sinh vật mà còn đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ chế biến thực phẩm, trong y học, trong công nghệ gene và bảo vệ môi trường Đây cũng là lí do vì sao đây

là đề tài được chọn cho bài tiểu luận này và sau đây chúng ta sẽ lần lượt tìm hiểu về khái niệm, phân loại, cơ chế hoạt động cũng như ứng dụng và quy trình tách chiết của loại enzyme đặc biệt này

CHƯƠNG 1: KHÁI NIỆM VÀ NGUỒN GỐC

I Khái niệm:

Enzyme là nhóm protein chuyên biệt hóa cao có vai trò và chức năng sinh học quan trọng bậc nhất đối với tế bào cơ thể sống Enzyme có khả năng xúc tác với tốc độ đặc hiệu cơ chất vô cùng hoàn hảo, xúc tác đặc biệt các phản ứng hóa học mà ở điều kiện bình thường các chất xúc tác hóa học khác không thể thực hiện nổi Các quá trình sinh học xảy ra trong cơ thể của mọi sinh vật sống là các phản ứng hóa học và hầu hết đều chịu tác động của enzyme Nếu không có enzyme, phần lớn các phản ứng đó có thể sẽ không thể xảy ra Enzyme xúc tác tất cả các quá trình trao đổi chất của tế bào, bao gồm tiêu hóa thức ăn mà ở đó các phân tử chất dinh dưỡng lớn như protein,

Điển hình trong quá trình tiêu hóa thức ăn chính là enzyme protease Protease ( hay còn được gọi là Peptidase hoặc Proteinase) là enzyme xúc tác cho quá trình phân giải protein thành những chuỗi polypeptide ngắn hơn hay nhiều phân tử amino acid

Để làm được điều này, trong quá trình thủy phân, chúng cắt đứt các liên kết peptide ( -CO-NH-) của phân tử protein, ngoài ra nhiều protease còn có khả năng thủy phân liên kết ester và vận chuyển amino acid Chúng không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh sản, sinh trưởng của mọi sinh vật mà còn đóng vai trò rất quan trọng trong công

II Nguồn gốc4:

Protease có 3 nguồn thu chính tới từ động vật, thực vật và vi sinh vật

1 Thực vật:

Bromelin, một glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3 maltose, 2 glucosamine, 2 xylose và 1 fructose được tìm thấy trong quả và thân cây dứa Loại protease này có biên độ pH từ 3-10, pH tối thiểu 5-8 tùy thuộc cơ chất và khi nhiệt độ thay đổi sẽ gây ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme này

Papain, một protease-thiol với trung tâm hoạt động có nhóm –SH quyết định hoạt tính của nó, có trong nhựa đu đủ Loại protease này có thể chịu được nhiệt độ cao

và ở dạng ổn định (hay cấu trúc không gian ổn định) có thể chịu được pH trong khoảng 1.5-8.5

2 https://www.britannica.com/science/enzyme

3 https://en.wikipedia.org/wiki/Protease ; https://sciencevietnam.com/enzyme-protease

4 Protease- Nhóm 1, Trường Đại học An Giang Khoa Nông nghiệp - Tài nguyên Thiên nhiên

Ficin có trong nhựa lá và thân cây quả sung lại có thể thủy phân các liên kết peptide của nhiều loại protein tự nhiên như protein sữa, đậu nành Hoạt động được trong phạm vi nhiệt độ từ 30-500C với pH thuộc khoảng 4-9.5 và hoạt động tốt tại

2 Động vật:

Pepsin, 1 polypeptide cấu tạo bởi 329 amino acid, đầu C là alanin và đầu N là isoleucine với pH tối hảo (pH phù hợp nhất) = 1.5-2.4, được tìm thấy trong dịch vị của động vật có vú, chim…

Rennin, hay còn được gọi là Chymosin được hình thành trong dạ dày con non của các loại nhai lại (như bê) có khả năng đông tụ sữa giúp những con non này hấp thụ chất dinh dưỡng từ sữa tốt hơn ,và hoạt động ở pH= 2.3-6.8

Trypsin là một loại enzyme tiêu hóa quan trọng, được tìm thấy trong hệ tiêu hóa của rất nhiều loài động vật có xương sống, cũng là nơi enzyme trypsin thực hiện vai trò thủy phân protein

3 Vi sinh vật 5

Vi sinh vật là nguồn thu nhận enzyme khổng lồ do protease chúng sản xuất có tính đặc hiệu cơ chất cao, protease phân bố chủ yếu ở vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn

5 Enzyme Protease_Trần Anh Đào_48K_Hóa Thực Phẩm_Đại học Vinh

Subtilisin là một protease ban đầu thu được từ Bacillus subtilis, vi khuẩn có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiếm yếu (5-8) và có khả năng chịu nhiệt thấp

Bacillus

Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH = 2.5-3 Một số nấm mốc như A.candidatus,P camemberti, cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa

Nấm mốc

CHƯƠNG 2: PHÂN LOẠI

I Khái niệm EC:

Để phân loại đầu tiên ta phải tìm hiểu về Enzyme Commission number (tạm dịch số EC) Đây là 1 cách phân loại enzyme bằng phương pháp đánh số dựa trên các phản ứng hóa học mà chúng tham gia xúc tác Mọi mã Enzyme (Enzyme code) đều chứa cụm “ EC” và 4 số ngăn cách nhau bởi dấu chấm Những con số này đại diện cho

II Phân loại Protease:

7Protease thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 ( EC.3.4) : chỉ những enzyme thủy phân ( Hydrolases) tác động lên liên kết peptide Protease được chia thành 2 loại dựa vào vị trí cắt mạch peptide: Endopeptidase và Exopeptidase Endopeptidase cắt liên kết peptide ở ngay trong phân tử protein, kết quả tạo ra nhiều mạch peptide còn Exopeptidase lại cắt ở cuối mạch của phân tử protein dẫn đến việc tách ra các amino acid

Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, Exopeptidase được phân thành 2 loại:

- Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của

chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc tripeptide

- Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của

chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide

Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, Endopeptidase được chia thành 4 nhóm:

-Serine Protease: là những protease chứa nhóm -OH của gốc serine

trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme Nhóm này bao gồm 2 nhóm nhỏ: Chymotrypsin và Subtilisin Chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như Chymotrypsin, Elastase; còn Subtilisin bao gồm 2 loại enzyme vi khuẩn như Subtilisin Carlsberg, Subtilisin BPN Các Serine protease thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm và thể hiến tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng

-Cysteine Protease: các Protease chứa nhóm -SH trong trung tâm hoạt

động; bao gồm các Protease thực vật như Papain, Bromelin, một vài Protease

6 https://en.wikipedia.org/wiki/Enzyme_Commission_number

7 https://sciencevietnam.com/enzyme-protease#Phan_loai

động vật và Protease kí sinh trùng Các Cysteine Protease thường hoạt động ở vùng pH trung tính và có tính đặc hiệu cơ chất rộng

-Aspartic Protease: hầu hết các Aspartic Protease đều thuộc nhóm

Pepsin, bao gồm các enzyme tiêu hóa như: Pepsin, Chymosin, Cathepsin, Renin Các Aspartic Protease có chứa nhóm Carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính

-Metallo proteinase: là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm

mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các Metallo Proteinase thường hoạt động ở vùng PH trung tính và giảm hoạt động mạnh dưới tác dụng của EDTA

Ngoài ra, Protease có thể được phân loại theo vùng pH tối ưu tương ứng:

Protease acid: Pepsin, Renin, … vùng pH acid 2-4

Protease base: Trypsin, Chymotrypsin, … vùng pH kiềm 9-11

Protease trung tính: như Papain từ quả đu đủ, Bromelin từ quả dứa, …

hoạt động ở vùng pH trung tính 7-8

CHƯƠNG 3: CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG

phân chính là sử dụng nước để phá vỡ liên kết cộng hóa trị Trong trường hợp này, liên kết cộng hóa trị mà ta muốn phá chính là liên kết amide ở trong protein Hình dưới đây

mô ta phân tử nước ( màu đỏ) và liên kết peptide (màu xanh) và bảng màu này sẽ được

sử dụng xuyên suốt chương này nhằm giải thích cơ chế hoạt động của Protease

Sau khi nước phản ứng với liên kết amide, ta được kết quả là một amine và một acid carboxylic

Tác dụng của Enzyme Protease là giúp phản ứng này xảy ra nhanh hơn nhiều

do bản chất nước không phải là một nucleophile đủ tốt để quá trình này diễn ra nhanh chóng Và ta nên nhớ rằng ta cần một nucleophile để bắt đầu loại phản ứng trên Và Protease có thể biến nước thành một nucleophile tốt hơn bằng cách như sau:

ở trong các hình sau Trung tâm hoạt động của enzyme sẽ được vẽ bằng màu trắng và dòng electron màu vàng để ta có thể dễ dàng theo dõi

8 https://www.youtube.com/watch?v=A_Krlxg6lz8

Bước đầu tiên trong phản ứng này là biến nước thành một nucleophile tốt hơn

và enzyme làm điều đó bằng cách lấy prtoton của nước và tạo ra anion hydroxide Enzyme có thể lấy cặp electron tự do trên aspartic acid của Trung tâm hoạt động để lấy

đi proton từ nước, tạo ra Hydroxide

Sau đó nước đã trở thành 1 nucleophile đủ mạnh để tác dụng với electrophile (tạo ra Oxyanion) Và khi điều này xảy ra đã tạo điều kiện cho nguyên tử N ở trong liên kết peptide có thể lấy proton của nguyên tử H (của nhóm -OH) Chính vì vậy khiến cho N trở thành điện tích dương (positive charge) nên khi nhóm carbonyl hình thành thì các electron sẽ hấp dẫn bởi nguyên tử N trong liên kết peptide chứ không phải liên kết CO vừa được tạo ra

Khi hoàn thành giai đoạn này cũng là lúc ta đã cắt được liên kết peptide và về

cơ bản thì quá trinh thủy phân đã kết thúc nhưng ta vẫn còn giai đoạn hồi phục Trung tâm hoạt đông của Enzyme bằng cách lấy đi proton của Aspartic acid

Và ta có thể làm điều này bằng cách dùng cặp electron tự do trên amine hoặc trên Carboxylate và tùy vào điều kiện pH thích hợp mà phân tử nào sẽ nhường cặp electron tự do của mình Và cụ thể trong điều kiện sinh học, amine thường lấy proton (protonated)

Vậy là ta đã khôi phục được Trung tâm hoạt động của enzyme để có thể tiếp tục xúc tác cho các phản ứng tiếp theo

CHƯƠNG 4: CHỨC NĂNG VÀ ỨNG DỤNG

I 9Trong y sinh:

Protease gắn liền với nhiều khía cạnh của sinh học con người Ví dụ, trong ruột non, Protease giúp tiêu hóa các protein và giúp ta hấp thụ các amino acid Các quá trình cần có Protease làm trung gian như sự đông tụ của máu, giúp phát hệ miễn dịch hoạt động, sự phát triển của các prohormone, sự hình thành của xương, sự chết theo chương trình của tế bào ( Programmed cell death) Protease không nhất thiết phải gắn liền tới chức năng tiêu hóa và tái tạo chất nền và mô ngoại bào, mà còn là yếu tố chính

để “hướng dẫn” (induction) các phản ứng miễn dịch sinh lý (Physiological immune responses) Sự hướng dẫn này có thể là trực tiếp, thông qua sự phân hủy của mầm bệnh bên trong Phagolysosomes hoặc gián tiếp,thông qua sự kích hoạt của các PRRs (Pattern recognition receptors) chủ chốt như TLRs (toll-like receptors) Nhưng thật đáng tiếc rằng sự sản xuất dư thừa của Protease có thể dẫn đến phản ứng có hại cho vật chủ và gây viêm và tổn thương cho các mô dư thừa

Protease còn đóng vai trò quan trọng trong nhiều cơ sở để điều trị bệnh như bệnh Alzheimer’s, ung thư và nhiễm trùng do vi rút (viral infection) MMP-9, một ma trận metallopeptidase, đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành các mạch máu (angiogenesis) và là một mục tiêu để chữa trị cho ung thư (therapeutic target for cancer) Chính vì tầm quan trọng của chúng trong bệnh lý học (pathology of disease)

mà Protease là một nhóm thuốc mục tiêu hướng tới ( drug target class)

II 10Trong công nghiệp:

1 Chế biến thủy sản

Nước mắm truyền thống là kết quả của quá trình thủy phân protein thịt cá dưới

sự tác động của hệ protease nội tại trong cá với điều kiện có muối Khi sản xuất nước mắm thì thời gian chế biến thường là dài nhất, hiệu suất thủy phân (độ đạm) lại phụ thuộc rất nhiều vào địa phương, phương pháp gài nén ( một phương pháp để sản xuất nước mắm), nguyên liệu cá Nên việc sử dụng chế phẩm Enzyme Protease trong quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày đã dần được hoàn thiện Phương pháp sử dụng Protease trong sản xuất nước mắm:

Trong 24 tiếng đầu tiên, dưới tác động của hệ Protease nội tại của cá, một phần protein thịt cá bị phân hủy thành peptide, polypeptide hòa tan trong nước bồi Sau đó, protein thịt cá, peptide và các polypeptide được tạo thành này

9 https://www.sinobiological.com/research/enzymes/proteases-function

10 Enzyme Protease_Trần Anh Đào_48K_Hóa Thực Phẩm_Đại học Vinh

tiếp tục bị thủy phân bởi các Protease tạo thành các amino acid tự do, peptide ngắn và sự hình thành hương vị của nước mắm

2 Công nghiệp sữa và bánh

Protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng và đó là các Protease từ các sinh vật như A Candidus, P.Roquerti, B mesentericus Trong công nghiệp sản xuất bánh mỳ, bánh quy,… Protease làm giảm thời gian trộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp, giúp bánh có độ nở tốt hơn

3 Sản xuất bia

Chế phẩm Protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc Protease của Aps.oryzae có thể tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn bằng cách thủy phân Protein trong hạt ngũ cốc ( hạt này sau khi lên men để nấu bia thì được gọi là bã bia)

Ứng dụng Protease để làm trong và ổn định nước quả và rượu vang do tác nhân gây đục và gây khó khăn cho việc này chính là protein

4 Công nghiệp da và dệt

Trong công nghiệp da, Protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự thủy phân một phần protein của da, chủ yếu là collagel, thành phần chính khiến cho da bị cứng Kết quả cho việc này là loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo nhất định, tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi thuộc da Trước đây, để làm mềm

da người ta dùng Protease được phân lập từ cơ quan tiêu hóa của động vật Ngày nay, việc đưa các Protease tách từ vi khuẩn (B.mesentericus, B.subtilis), nấm mốc (A.Oryzae, A.flavus) vào công nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả quan trọng

Protease vi sinh vật được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo để được sợi bóng, dễ nhuộm do Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serisin đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm để từ đó giảm lượng hóa chất cần để tẩy trắng