Bộ môn vi sinh vật học – khoa sinh học đại học khoa học tự nhiên – đại học quốc gia hà nội

MỞ ĐẦUProbiotic là các vi sinh vật sống khi được sử dụng với số lượng thích hợpmang lại lợi ích cho sức khoẻ, đã được nghiên cứu rộng rãi và sản xuất thương mạithành nhiều sản phẩm khác

-NGUYỄN HOÀNG TUẤN

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN BIFIDOBACTERIA ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT

CHẾ PHẨM PROBIOTICS

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2017

-NGUYỄN HOÀNG TUẤN

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN BIFIDOBACTERIA ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT

CHẾ PHẨM PROBIOTICS

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :

1 TS Đào Thị Lương

2 PGS.TS Bùi Thị Việt Hà

Hà Nội - 2017

Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến TS Đào Thị Lương Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc Gia Hà Nội, người đã trựctiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trongsuốt thời gian thực tập vừa qua.

-Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Bùi Thị Việt Hà - Chủ nhiệm bộmôn Vi sinh - Khoa Sinh học - Trường ĐH Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc Gia

Hà Nội, người đã chỉ bảo và góp ý nhiệt tình giúp tôi hoàn thành luận văn thạc sĩnày

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS TS Dương Văn Hợp, cùng các cô chúanh chị, đặc biệt là Ths Trần Thị Lệ Quyên và KS Hà Thị Hằng, thuộc Bảo tànggiống chuẩn Vi sinh vật (VTCC) - Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học (IMBT)

- Đại học Quốc Gia Hà Nội, đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt cho tôi trong quá trìnhthực tập

Tôi cũng xin tỏ lòng biết ơn các thầy cô giáo trong bộ môn Vi sinh, khoaSinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc Gia Hà Nội đã cung cấp chotôi những kiến thức quý báu, tạo nền tảng giúp tôi hoàn thành luận văn thạc sĩ này

Cuối cùng, cho phép tôi gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đãluôn bên cạnh động viên, ủng hộ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập vừaqua

Xin chân thành cảm ơn !!!

Hà Nội, ngày 20 tháng 11 năm 2017

Học viên

Nguyễn Hoàng Tuấn

VTCC Vietnam Type Culture Collection

(Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Việt Nam)

GRAS Generally Recognized as Safe

( Một loại chứng nhận an toàn của FDA)

FAO Food and Agriculture Organization

(Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc)

(Tổ chức Y tế Thế giới)

FISH Fluorescence In situ Hydridization

(Lai tại chỗ phát huỳnh quang)

F-6-PPK Fructose-6-Phosphate Phosphoketolase

GI Tract Gastrointestinal Tract

(Đường tiêu hóa)

(Bệnh viêm ruột)

(Mật độ quang học)

(Số lượng tế bào vi khuẩn)

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Định nghĩa probiotic 3

1.2 Tiêu chí lựa chọn các chủng probiotic 3

1.3 Lợi ích của probiotic 4

1.4 Bifidobacteria 5

1.4.1 Giới thiệu 5

1.4.2 Phân loại 5

1.4.2.1 Hình thái 5

1.4.2.2 Sinh học phân tử 6

1.4.3 Môi trường sống 9

1.4.4 Đặc điểm sinh lý sinh hóa 11

1.4.4.1 Sự trao đổi carbohydrate 11

1.4.4.2 Nhiệt độ và pH sinh trưởng tối ưu 15

1.4.4.3 Độ nhạy cảm oxy 15

1.4.5 Bifidobacteria mang đặc tính probiotic 16

1.4.5.1 Giảm tiêu chảy 16

1.4.5.2 Làm giảm sự không dung nạp lactose 16

1.4.5.3 Ức chế Helicobacter pylori 17

1.4.5.4 Phòng ngừa bệnh viêm ruột 17

1.4.5.5 Giảm táo bón 17

1.4.5.6 Phòng ung thư đại trực tràng 17

1.4.6.2 Bifidobacterium animalis 18

1.4.6.3 Bifidobacterium bifidium 19

1.4.6.4 Bifidobacterium breve 20

1.4.6.5 Bifidobacterium longum 21

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 22

2.1 Nguyên liệu 22

2.1.1 Chủng vi khuẩn 22

2.1.2 Hóa chất 22

2.2 Thiết bị 22

2.3 Môi trường 23

2.4 Phương pháp nghiên cứu 24

2.4.1 Phân lập 24

2.4.2 Phân loại bằng sinh học phân tử 24

2.4.3 Nghiên cứu đặc tính probiotic và tuyển chọn chủng 29

2.4.3.1 Khả năng sinh enzyme ngoại bào 29

2.4.3.2 Khả năng sinh trưởng 30

2.4.3.3 Khả năng sinh axít hữu cơ 30

2.4.3.4 Khả năng chịu muối mật 31

2.4.3.5 Khả năng kháng các vi khuẩn gây bệnh đường ruột 31

2.4.3.6 Khả năng tồn tại trong điều kiện đường tiêu hóa của dịch dạ dày và ruột mô phỏng 31

2.4.3.7 Khả năng chịu kháng sinh 32

2.4.4.1 Lựa chọn môi trường nuôi thích hợp 32

2.4.4.2 Lựa chọn nhiệt độ nuôi thích hợp 32

2.4.4.3 Lựa chọn pH nuôi thích hợp 33

2.4.4.4 Lựa chọn nguồn cacbon nuôi thích hợp 33

2.4.4.5 Lựa chọn nguồn Nitơ nuôi thích hợp 33

2.4.4.6 Lựa chọn thời gian nuôi thích hợp 33

2.4.5 Lựa chọn điều kiện lên men thích hợp cho hai chủng Bifidobacterium trên thiết bị lên men 5 lít 36

2.4.5.1 Chế độ khuấy đảo 36

2.4.5.2 Tỷ lệ giống cấy 36

2.4.5.3 Lựa chọn thời gian nuôi thích hợp 36

2.4.6 Bước đầu nghiên cứu một số loại chất mang thích hợp cho quá trình đông khô các chủng Bifidobacterium 36

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Phân lập và phân loại 37

3.1.1 Phân lập và quan sát hình thái 37

3.1.2 Tách DNA genome và xác định gen F-6-PPK 38

3.1.3 Phân loại dưa vào trinh tư rDNA 16S 39

3.2 Nghiên cứu các đặc tính probiotic và lựa chọn chủng Bifidobacterium 42

3.2.1 Khả năng sinh enzyme ngoại bào 42

3.2.2 Khả năng sinh trưởng và sinh axít hữu cơ 44

3.2.3 Khả năng chịu muối mật 46

và ruột 49

3.2.6 Khả năng chịu kháng sinh 51

3.3 Lựa chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả năng sinh trưởng của hai chủng Bifidobacterium 53

3.3.1 Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp 53

3.3.2 Lựa chọn nhiệt độ nuôi thích hợp 54

3.3.3 Lựa chọn pH nuôi thích hợp 55

3.3.4 Lựa chọn nguồn cacbon thích hợp 56

3.3.5 Lựa chọn nguồn nitơ thích hợp 57

3.3.6 Lựa chọn thời gian nuôi thích hợp 58

3.4 Lựa chọn điều kiện lên men thích hợp cho hai chủng Bifidobacterium trên thiết bị lên men 5 lít 59

3.4.1 Lựa chọn tốc độ khuấy thích hợp 59

3.4.2 Lựa chọn tỷ lệ giống cấy thích hợp 61

3.4.3 Lựa chọn thời gian nuôi thích hợp 62

3.5 Lựa chọn chất mang thích hợp cho hai chủng Bifidobacterium 63

KẾT LUẬN 64

KIẾN NGHỊ 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

PHỤ LỤC 75

Bảng 1.2: Khả năng sinh trưởng của B longum NCC2705 trên 23 loại

carbohydrate 14

Bảng 3.1: Danh sach cac chung phân lâp nghi ngờ thuôc chi Bifidobacterium 37

Bảng 3.2: Độ tương đồng về trình tự rDNA 16S của các chủng vi khuẩn phân lập với các chủng chuẩn trên GenBank 41

Bảng 3.3: Khả năng sinh enzyme của 20 chủng vi khuẩn Bifidobacterium 43

Bảng 3.4: Khả năng sinh trưởng và sinh axit hữu cơ của 20 chủng vi khuẩn 45

Bảng 3.5: Khả năng chịu muối mật của 20 chủng vi khuẩn 46

Bảng 3.6: Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của 20 chủng vi khuẩn 48

Bảng 3.7: Khả năng tồn tại của các chủng vi khuẩn trong điều kiện đường tiêu hóa của dịch dạ dày và ruột mô phỏng 50

Bảng 3.8: Khả năng chịu kháng sinh của các chủng vi khuẩn Bifidobacterium 52

Bảng 3.9: Khả năng tồn tại của 2 chủng nghiên cứu trên 4 loại chất mang 63

Hình 1.1: Các con đường chuyển hóa Fructose 6-Phosphat 12

Hình 1.2: Sơ đồ khác quá trình sự chuyển hóa đường của bifidobacteria theo Meulen và cộng sự 13

Hình 1.3: Hình dạng tế bào đặc trưng của Bifidobacterium 6

Hình 1.4: Cây phát sinh các loài thuộc chi Bifidobacterium dựa trên trình tự rDNA 16S 8

Hình 1.5: Bifidobacterium adolescentis 18

Hình 1.6: Bifidobacterium animalis 19

Hình 1.7: Bifidobacterium bifidium 20

Hình 1.8: Bifidobacterium breve 20

Hình 1.9: Bifidobacterium longum 21

Hình 3.1: Đoan gen F-6-PPK (591 bp) ơ cac chung vi khuân phân lâp đươc khuyếch đai vơi căp môi đăc hiêu UR1 va UL2 39

Hình 3.2: Vị trí phân loại của các chủng Bifidobacterium phân lập và các loài có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự rDNA 16S 40

Hình 3.3: Lựa chọn môi trường nuôi thích hợp cho các chủng Bifidobacterium 54

Hình 3.4: Lựa chọn nhiệt độ nuôi thích hợp cho các chủng Bifidobacterium 54

Hình 3.5: Lựa chọn pH nuôi thích hợp cho các chủng Bifidobacterium 55

Hình 3.6: Lựa chọn nguồn cacbon thích hợp cho các chủng Bifidobacterium 56

Hình 3.7: Lựa chọn nguồn nitơ thích hợp cho các chủng Bifidobacterium 57

Hình 3.8: Lựa chọn thời gian nuôi thích hợp cho chủng Bf 3.1 58

Hình 3.9: Lựa chọn thời gian nuôi thích hợp cho chủng Bf 9.2 58

Hình 3.10: Lựa chọn tốc độ khuấy thích hợp cho chủng Bf 3.1 60

Hình 3.11: Lựa chọn tốc độ khuấy thích hợp cho chủng Bf 9.2 60

Hình 3.12: Lựa chọn tỷ lệ giống cấy thích hợp cho các chủng Bifidobacterium 61

Hình 3.13: Lựa chọn thời gian nuôi thích hợp cho chủng Bf 3.1 quy mô 5 lít 62

Hình 3.14: Lựa chọn thời gian nuôi thích hợp cho chủng Bf 9.2 quy mô 5 lít 62

MỞ ĐẦU

Probiotic là các vi sinh vật sống khi được sử dụng với số lượng thích hợpmang lại lợi ích cho sức khoẻ, đã được nghiên cứu rộng rãi và sản xuất thương mạithành nhiều sản phẩm khác nhau trên thế giới Lợi ích của chúng đối với sức khoẻcon người và động vật đã được chứng minh trong hàng trăm nghiên cứu khoa học.Ruột con người có một hệ sinh thái vi sinh vật rất lớn và đa dạng Có hàng trăm loài

vi khuẩn thường gặp và tổng khối lượng hệ vi sinh vật sống trong đại tràng ước tínhkhoảng vài trăm gram Mật độ vi khuẩn trong đường ruột của con người ước tính lênđến 1013-1014, nghĩa là gấp khoảng 10 đến 20 lần tổng số các tế bào trong toàn bộ cơthể Hầu hết là các loại vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, bao gồm Clostridia, Eubacteria,

nhóm Bacteroides và các chi Bifidobacterium: như Bifidobacterium bifidum,

Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve,

bifidobacteria có tự nhiên trong hệ vi sinh vật đường ruột, chiếm đến 25% số lượng

vi khuẩn ở người lớn và 80% ở trẻ em, cho thấy sự phân bố của các loàibifidobacteria trong hệ vi sinh vật đường ruột của người lớn như thế nào

Bifidobacterium đã được chứng minh có các đặc tính probiotic, sử dụng chúng hiệu

quả trong việc phòng ngừa và điều trị các tiệu chứng rối loạn tiêu hóa ở con người vàđộng vật như: táo bón, nhiễm trùng đường ruột, u đại tràng và ung thư Ngoài ra,bifidobacteria đã được cấp chứng chỉ GRAS (Generally Recognised As Safe) để

chứng minh tính an toàn của chúng Nhờ đó, Bifidobacterium được sử dụng phổ biến

trong các sản phẩm sữa lên men, thực phẩm chức năng và dược phẩm dùng cho cảcon người cũng như động vật

Hiện nay, đã có mặt nhiều chế phẩm chứa Bifidobacterium trên thị trường Việt

Nam, nhưng đa số là nhập khẩu, hoặc đóng gói tại Việt Nam nhưng nguyên liệu nhập

khẩu từ nước ngoài Mặc dù đã có những chế phẩm chứa Bifidobacterium xuất xứ từ

Việt Nam, tuy nhiên các nghiên cứu về nguồn gốc, đặc tính probiotic, quy trình sảnxuất chủng vẫn còn chưa nhiều

Từ những đặc điểm trên, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này với mục tiêu:

 Phân lập và tuyển chọn được các chủng Bifidobacterium có các đặc tính

probiotic tốt, từ những nguồn gốc khác nhau ở Việt Nam

 Phân loại và lựa chọn các chủng vi khuẩn Bifidobacterium có đặc tính sinh

học an toàn

 Nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy cho sinh khối cao, qua đó ứngdụng trong sản xuất các chế phẩm probiotic cho động vật cũng như con người

Ngoài ra việc phân lập được các chủng Bifidobacterium cũng giúp phong phú

thêm bộ sưu tập nguồn gen Quốc Gia ở Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật (VTCC) –Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học – Đại học Quốc gia Hà Nội còn hạn chế về

số lượng

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Định nghĩa probiotic

Probiotic xuất phát từ tiếng Hy Lạp và có nghĩa là "cho cuộc sống", ban đầuđược nó được sử dụng với ý nghĩa trái ngược với từ "kháng sinh" Tuy nhiên, địnhnghĩa này đã được cải tiến trong những năm qua Ban đầu, probiotic được mô tả làchất tăng cường sức khoẻ của bệnh nhân suy dinh dưỡng, kích thích sự phát triểncủa các vi sinh vật khác, hoặc góp phần vào cân bằng vi khuẩn đường ruột Cácđịnh nghĩa gần đây cho thấy rằng probiotic bao gồm các vi sinh vật sống [62].

Trong đó, định nghĩa của Fuller (1992) được sử dụng rộng rãi: “Probiotic như làmột chất bổ sung vi sinh vật sống, tác động có lợi đến vật chủ bằng cách cải thiện

sự cân bằng vi khuẩn đường ruột” Theo khuyến cáo của một nhóm làm việc choFAO / WHO về việc đánh giá probiotic trong thực phẩm, probiotic được định nghĩa

là "các vi sinh vật sống khi được sử dụng với số lượng thích hợp mang lại lợi íchcho sức khoẻ"[23].

1.2 Tiêu chí lựa chọn các chủng probiotic [62]

Tiêu chuẩn an toàn

 Có nguồn gốc rõ ràng

 Xác định chính xác về phân loại

 Không độc hại, không gây bệnh, đạt tiêu chuẩn GRAS

 Đặc tính chủng: Chịu kháng sinh ở nồng độ thấp và có hoạt động trao đổi chấttrong cơ thể vật chủ

Tính phù hợp về công nghệ

 Có khả năng sản xuất và bảo quản số lượng lớn

 Mật độ cao (ưu tiên 106-108 CFU/ml,g)

 Mang lại các tính chất cảm quan mong muốn (hoặc không có những phẩmchất không mong muốn)

 Ổn định di truyền

 Kháng Phage

Tiêu chuẩn chức năng

 Kháng với muối mật và axit

 Bám dính được vào bề mặt niêm mạc

 Có khả năng sống sót, tăng sinh và hoạt động trao đổi chất ở vị trí mục tiêutrong cơ thể sống

 Có khả năng sinh bacteriocin, axit hữu cơ và một số các chất kháng khuẩn đểcạnh tranh với các vi khuẩn khác

 Có khả năng mang lại một hoặc nhiều lợi ích về sức khoẻ được kiểm chứnglâm sàng

Tiêu chuẩn sinh lý và ảnh hưởng đến sức khỏe mong muốn

 Phản ứng đối với vi khuẩn gây bệnh / ung thư

 Sản sinh các chất chống vi khuẩn (bacteriocin, hydrogen peroxide, axit hữu cơhoặc hợp chất ức chế khác)

 Sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học (enzyme, vắc-xin, peptide)

 Cải thiện các phản ứng miễn dịch

 Giảm dị ứng lactose

 Giảm cholesterol huyết thanh

 Phòng ngừa một số loại bệnh tiêu chảy

1.3 Lợi ích của probiotic

Các tác động có lợi cho sức khoẻ của probiotic, được ghi nhận đối với một sốchủng nhất định, bao gồm ngăn ngừa một số loại bệnh tiêu chảy, đặc biệt dorotavirus, giảm các triệu chứng liên quan đến việc sử dụng kháng sinh quá nhiều,giảm tỷ lệ dị ứng ở người dễ bị dị ứng, cải thiện đáp ứng miễn dịch, giảm hiệntượng không dung nạp lactose và giảm các chất chuyển hóa không có lợi Một sốảnh hưởng có lợi khác liên quan đến sức khoẻ, thông qua việc sử dụng probioticnhư sau: phòng ngừa hoặc giảm triệu chứng viêm ruột mạn tính, giảm nguy cơ tiêu

chảy cấp ở trẻ em, giảm nguy cơ nhiễm trùng đường hô hấp, ức chế Helicobacter

pylori và giảm cholesterol huyết thanh[45].

Hơn nữa, probiotic có thể ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật đường ruột và các cơquan khác bằng cách điều biến các thông số miễn dịch, tính thấm qua ruột hoặcbằng cách cung cấp các chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học Các cơ chế đượcnghiên cứu bởi De Vrese và Schrezenmeir (2008) bao gồm: Giảm pH ruột; Sản xuấtcác chất diệt khuẩn (ví dụ axit hữu cơ, H2O2 và bacteriocin); Sự kết tụ các vi sinhvật gây bệnh; Tăng cường sự vững chắc cho các chất nền lên men hoặc thụ thể trên

bề mặt tế bào niêm mạc ruột; Hấp thu và chuyển hóa các chất có khả năng gây bệnh,độc hại hoặc ung thư; Điều biến các cơ chế miễn dịch; Kích thích nhu động ruột vàsản xuất chất nhầy[16].

1.4 Bifidobacteria

1.4.1 Giới thiệu

Năm 1899, Tissier quan sát và phân lập vi khuẩn hình chữ Y trong phân của

trẻ sơ sinh bú mẹ và gọi nó là "Bacillus bifidus communis" (Lat Bifidus: đứt đoạn,

phân nhánh) Tuy nhiên, do sự tương đồng với lactobacilli, bifidobacteria đã được

đưa vào chi Lactobacillus Và mãi cho đến khi đến khi hệ thống phân loại vi khuẩn

mới của Bergey ra đời trong ấn bản cùng tên tái bản lần thứ VIII, chúng mới được

phân loại lại và công nhận là một chi riêng Khác với Lactobacillus, bifidobacteria có

fructose-6-phosphate phosphoketolase, không có aldolase hoặc glucose-6-phosphatedehydrogenase và có hàm lượng G+C trong DNA cao nằm trong khoảng từ 55 đến

67% Bifidobacteria catalase âm tính, ngoại trừ B indicum và B asteroids [6;11].

Chi Bifidobacterium, gồm 42 loài, thuộc Họ Bifidobacteriaceae, Bộ

Bifidobacteriales, Phân lớp Actinobacteridae, Lớp Actinobacteria, Ngành Firmicutes,

Hình 1.1: Hình dạng tế bào đặc trưng của Bifidobacterium [71]

1.4.2.2 Sinh học phân tử

Phân loại đến chi

Bifidobacteria có enzyme fructose-6-phosphate phosphoketolase (F-6-PPK)(EC 4.1.2.22), tham gia vào quá trình phân huỷ glucose qua con đườngphosphoketolase hay còn gọi là "bifid shunt" thông qua erythrose-4-phosphate vàacetyl-phosphate, đây là điểm khác biệt với vi khuẩn đường ruột khác Do đó enzymenày cũng như gen mã hóa cho nó được dùng để làm phân tử chỉ thị cho nhóm này [5].

Phân loại đến loài

Sự khác biệt của các loài trong chi thường dựa vào sự đồng nhất DNA-DNAhoặc các đặc tính hình thái khác nhau Trong những năm gần đây, sự chú ý của nhiềunhà khoa học về mặt phân loại đã được thu hút vào các đầu dò DNA và gen rRNA.Các chuỗi DNA được sử dụng phổ biến nhất để nhận diện bifidobacteria ở chi vàmức độ loài là gen 16S rRNA và 23S rRNA, cũng như vùng gen internal transcribedspacer (ITS) nằm giữa các gen rRNA 16S và 23S Đặc biệt, trình tự rDNA 16S có 9vùng biến đổi, đặc biệt thích hợp để thiết kế oligonucleotides dùng để định danh đếnloài nhóm bifidobacteria Ngoài ra, ưu điểm của việc sử dụng các gen rRNA là sốlượng bản sao của chúng trong một tế bào vi khuẩn khá cao Roy và cộng sự (1996)

đã nghiên cứu thiết kế được các oligonucleotides dựa trên chuỗi 16S rDNA sử dụng

cho B breve, B infantis, và B longum Sau đó, Matsuki và cộng sự (1998, 1999) đã

thiết kế được các cặp primer đặc hiệu cho hầu hết các loài Bifidobacterium sống ở đường ruột của con người như: B adolescentis, B angulatum, B bifidum, B breve, B.

catenulatum, B longum, B infantis, B dentium và B gallicum [10] (Hình 1.4).

Ngoài phân tích trình tự rDNA 16S, SR 23S và 16S-23S, hiện nay để phân

biệt các loài có mối quan hệ gần gũi cùng thuộc chi Bifidobacterium, trình tự gen của

protein ưa nhiệt 60 kDa (HSP60) được sử dụng HSP60 là một protein thuộc họchaperonin, thành viên họ này có trong tất cả các vi khuẩn và tế bào eukaryote ở các

cơ quan như ty thể và lục lạp, gen HSP60 không dễ dàng chuyển từ một vi khuẩn nàysang vi khuẩn khác, tính bảo thủ cao và có một bản sao trong gần như tất cả các loài

vi khuẩn, do đó rất đặc trưng cho từng loài vi khuẩn Những đặc điểm trên cho thấyHSP60 một đại phân tử thích hợp cho nghiên cứu phát sinh loài của các loài vi khuẩn

có mối quan hệ gần gũi với nhau

Hình 1.2: Cây phát sinh các loài thuộc chi Bifidobacterium dựa trên trình tự rDNA

16S[24]

1.4.3 Môi trường sống

Môi trường sống của bifidobacteria chủ yếu là trong đường ruột của động vậtmáu nóng Đôi khi chúng là tác nhân gây bệnh ở con người (chủ yếu là sâu răng)nhưng thường chúng được coi là không gây bệnh Thông thường, các loài

Bifidobacterium là đặc trưng đối với người và động vật; Ngoài ra, đã có nghiên cứu

chứng minh rằng bifidobacteria có trong nước thải và trong các sản phẩm sữa lênmen [6].

Ruột của trẻ sơ sinh bị xâm chiếm bởi vi sinh vật từ hệ sinh dục của người mẹ

và môi trường bên ngoài Ngoài ra, các nghiên cứu mới cho thấy việc di chuyển vikhuẩn từ tuyến ruột sang tuyến vú của người mẹ có thể là nguồn lây nhiễm cho sữa

mẹ và dẫn đến sự lây lan sang ruột của trẻ sơ sinh [47] Các nghiên cứu sử dụng công

nghệ lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) cho thấy bifidobacteria chiếm tới 75% tổng số

vi khuẩn trong phân của trẻ sơ sinh bú sữa mẹ và đến 91% trẻ bú sữa mẹ [28] Theo

thời gian số lượng bifidobacteria trong đường tiêu hoá của con người giảm dần, các

vi sinh vật trong phân của trẻ em tương tự như người lớn sau hai năm đầu đời Ở

người cao tuổi, số lượng bifidobacteria thấp hơn, trong khi số lượng Clostridium

trong phân tăng lên[51].

Bảng 1.1: Môi trường sống của các loài thuộc chi Bifidobacterium

Phân trẻ sơ sinh và phân, âm đạongười trưởng thành

B longum bv infantis ATCC 15697 Phân và âm đạo trẻ sơ sinh

B breve UCC2003 Phân và âm đạo trẻ sơ sinh

B catenulatum Phân người trưởng thành

Phân lập từ động vật

B.animalis ssp animalis Phân, ruột chuột, gà, thỏ và phân bê

B longum bv suis Phân lợn con

B animalis ssp lactis Sữa lên men

Nguồn: [9; 63; 36; 33]

1.4.4 Đặc điểm sinh lý sinh hóa

1.4.4.1 Sự trao đổi carbohydrate

Bifidobacteria thuộc nhóm chemoorganotrophs (là những sinh vật làm oxyhóa các liên kết hóa học trong các hợp chất hữu cơ làm nguồn năng lượng) Chúngsinh axit từ nhiều loại carbohydrate, chủ yếu là acid acetic và axit lactic, và không tạo

khí Sự phân giải hoá học các hexoses trong các loài Bifidobacterium liên quan đến

một con đường đặc trưng được gọi là con đường fructose 6-phosphate (F-6-P) [19].

Enzyme chính của con đường này là fructose-6-phosphate phosphoketolase (F-6-PPK)(EC 4.1.2.2) xúc tác sự phân hủy của phosphat pentose, acetyl phosphate vàglyceraldehyde-3-phosphate[9].

Fructose-6-phosphate phosphoketolase được mã hoá bởi gen xfp [43] Hexose

trải qua một loạt các phản ứng phân tách và phản ứng đồng phân hóa học để tạo raphosphat pentose Acetyl phosphate được chuyển thành axetat, sản sinh ra một ATP,trong khi glyceraldehyde-3-phosphate được chuyển thành pyruvate và tiếp tục tạo ralactate để tái tạo NAD [17] Tỷ lệ lý thuyết tính toán của con đường F-6-P là 3:2

(acetate/lactate) (Hình 1.1) Tuy nhiên, pyruvate cũng có thể được chuyển đổi thành

formate và acetyl-CoA sau đó được tạo ra ethanol bằng cách oxy hóa một NADH sảnsinh ra trong quá trình trao đổi chất (Hình 1.2) [19].

Hình 1.3: Các con đường chuyển hóa Fructose 6-Phosphat [6]

Hình 1.4: Sơ đồ sự chuyển hóa đường của bifidobacteria được điều chỉnh theo Van

sự (2006) chỉ ra rằng khi mức tiêu thụ đường tăng lên, nhiều axit lactic và ít axitacetic hơn, axit formic và ethanol được ưu tiên sản xuất và ngược lại[60].

Bifidobacteria có thể phát triển trên nhiều nguồn carbon bao gồm cảsaccharide mono-, di-, tri- và oligo Điều này cho bifidobacteria một lợi thế sinh thái

trong môi trường ruột, nơi có nguồn carbohydrate phức tạp B longum thích ứng với

nhiều nguồn carbohydrate phức tạp bởi trong bộ gen của chúng mã hóa trên 40glycosylhydrolases có liên quan đến sự biến đổi của các oligosaccharide bậc cao hơn

Bảng 1.2: Khả năng sinh trưởng của B longum NCC2705 trên 23 loại carbohydrate

+++

+ ++

-Di / trisaccharides

-Khả năng sinh trưởng: sinh trưởng chậm (+), sinh trưởng vừa phải (++) và sinh trưởng nhanh (+++)

* Thành phần của raftilose là 93,2% oligofructose và tới 6,8% glucose, fructose và sucrose[44].

1.4.4.2 Nhiệt độ và pH sinh trưởng tối ưu

Bifidobacteria là vi khuẩn đường ruột của các động vật máu nóng, nhiệt độsinh trưởng tối ưu của chúng dao động từ 37 đến 41°C và pH tối ưu cho sự sinhtrưởng là giữa 6,5 và 7,0 [6] Hầu hết các loài không phát triển dưới 20°C và trên

46°C và pH thấp hơn 4,5 hoặc cao hơn 8,5, ngoại trừ B thermacidophilum, có thể

phát triển ở pH 4,0 và ở 49°C[20].

1.4.4.3 Độ nhạy cảm oxy

Bifidobacteria là các vi sinh vật kỵ khí nghiêm ngặt và nhạy cảm với oxy Tuynhiên, độ nhạy cảm với oxy khác nhau giữa các loài và chủng [6] Một số chủng

Bifidobacterium có thể phát triển trong môi trường dịch thể có sự hiện diện của oxy.

Ví dụ, B lactis dung nạp 10% oxy trong lớp khí quyển ở trên môi trường lỏng [42] B.

thermophilum ít nhạy cảm tiếp xúc với không khí và có thể phát triển trong điều kiện

nồng độ oxy thấp [3;64] Tuy nhiên gần đây, B psychraerophilum được phát hiện là

vi khuẩn kỵ khí chịu khí, loài này thậm chí còn có thể phát triển trên đĩa thạch dướiđiều kiện hiếu khí[56] Bifidobacteria nhạy cảm với oxy có thể do một số lý do: một

số chủng cần khả năng oxy hóa cao hoặc do enzyme harbor (ví dụ phosphoketolase)nhạy cảm với hydrogen peroxide[6] Hydrogen peroxide là một loại oxy hoạt tính và

nó tích tụ trong bifidobacteria khi chúng tiếp xúc với oxy [30], bifidobacteria catalase

âm tính khi nuôi cấy trong điều kiện kỵ khí

1.4.5 Bifidobacteria mang đặc tính probiotic

Việc sử dụng bifidobacteria như probiotic cho thấy hệ tiêu hóa vật chủ là môitrường sống tự nhiên trong suốt chu trình phát triển của chúng Sự có mặt của chúngtrong đường tiêu hóa (GI Tract) đã được công nhận mang lại hiệu ứng sức khoẻ cólợi như: giảm bệnh tiêu chảy, giảm sự không dung nạp lactose, chống nhiễm vi khuẩn,phòng ung thư, điều trị bệnh viêm ruột, giảm táo bón, tăng chức năng miễn dịch vàgiảm cholesterol huyết thanh Tuy nhiên, cơ chế hoạt động cho phần lớn các tác độngnày vẫn chưa được làm sáng tỏ[36].

1.4.5.1 Giảm tiêu chảy

Bifidobacteria giúp giảm tần suất nhiễm trùng do Escherichia coli, Salmonella,

Campylobacter, Shigella cũng như rotavirus Một số nghiên cứu in vitro và trên động

vật đã khẳng định rằng một số chủng probiotic ức chế sự tăng trưởng và hoạt độngtrao đổi chất cũng như sự kết dính vào các tế bào ruột của vi khuẩn gây bệnh như

Salmonella, Shigella hoặc Vibrio cholerae Tần suất, thời gian của các đợt tiêu chảy

liên quan đến kháng sinh và mức độ nghiêm trọng của các triệu chứng có thể giảm

bằng cách dùng probiotic (trong đó có Bifidobacterium), trước và trong khi điều trị

bằng kháng sinh[16].

1.4.5.2 Làm giảm sự không dung nạp lactose

Bifidobacteria giúp giảm sự không dung nạp lactose, một cơ chế có thể giảithích cho điều này là do chúng giải phóng lactase (β –galactosidase) khi bị phân giảibởi muối mật trong đường tiêu hóa Ngoài ra, bifidobacteria cũng làm giảm bớt đaubụng, đầy hơi và buồn nôn ở những bệnh nhân không dung nạp lactose bằng việc

cung cấp lactase đến ruột qua việc sử dụng các probiotic sản xuất lactase Đây thực

sự là một cách tiếp cận thực tế để điều trị sự không dung nạp lactose [36].

1.4.5.3 Ức chế Helicobacter pylori

Việc kết hợp điều trị thuốc kháng sinh với sử dụng probiotic (trong đó có

bifidobacteria) trong điều trị H pylori giúp quyết các vấn đề liên quan đến các tác

dụng phụ của kháng sinh [62] Một số cơ chế liên quan đến hiệu quả của probiotic

trong hỗ trợ điều trị H pylori bao gồm: sản xuất axit hữu cơ, hydrogen peroxide,

bacteriocins, tăng cường chức năng rào cản của ruột và cạnh tranh với các vị trí bámdính Tuy nhiên, tầm quan trọng của các cơ chế này vẫn còn chưa rõ ràng [36].

1.4.5.4 Phòng ngừa bệnh viêm ruột

Triệu chứng của bệnh viêm ruột (IBD) bao gồm: viêm, loét và hẹp đường tiêuhóa gây ra đau bụng, tiêu chảy và xuất huyết đường tiêu hóa Các probiotic, trong đó

có vi khuẩn bifidobacteria, có tính chống viêm, và một tác động tích cực đã chứngminh đối với hệ tiêu hóa đã cho thấy những hiệu quả hứa hẹn đối với IBD trong cácnghiên cứu với động vật thực nghiệm [62].

1.4.5.5 Giảm táo bón

Các nghiên cứu lâm sàng cho thấy dùng probiotic, trong đó có bifidobacterialàm tăng nhu động của đường tiêu hóa Tuy nhiên, cần có thêm các nghiên cứu lâmsàng có kiểm soát với đủ số người tham gia để xác nhận những kết quả này và cầnphải làm rõ các cơ chế hoạt động của chúng[16].

1.4.5.6 Phòng ung thư đại trực tràng

Dữ liệu về hiệu quả của probiotic chống lại ung thư đại trực tràng được lấy từ

việc sử dụng mô hình động vật Probiotic, bao gồm một số chủng Bifidobacterium đã

gián tiếp làm giảm khả năng gây ung thư bằng cách giảm các enzyme vi khuẩn kíchhoạt sự sinh ung thư và sản xuất các axit béo mạch ngắn, làm giảm các hoạt động củaenzym tham gia vào việc tạo ra các sản phẩm gây ung thư[62].

1.4.6 Một số loài bifidobacteria đã được thương mại hóa

1.4.6.1 Bifidobacterium adolescentis

Bifidobacterium adolescentis thường sống trong ruột người và động vật khỏe

mạnh B adolescentis là vi khuẩn gram dương, chứa một màng tế bào, không di

động (Hình 1.5) Thành tế bào của B adolescentis cấu tạo chủ yếu từ murein, chứa

Lys- hoặc Orn-D-Asp trong chuỗi peptide của nó Các thành phần polysaccharide của

nó bao gồm glucose và galactose Myristic, palmitic, và oleic là các axit béo chủ yếutrong thành tế bào Các axit leipoteichoic trên bề mặt thành thành tế bào giúp chúng

liên kết với thành ruột B adolescentis, giống như tất cả các loài bifidobacteria, có

thể lên men lactose và sinh trưởng tốt trong sữa, cũng như sử dụng nhiều

carbohydrate B adolescentis tổng hợp cyanocobalamin và nicotine, cũng như thiamin, folic acid, và pyridoxine, nhờ đó khi bổ sung B adolescentis vào các sản

phẩm sữa lên men giúp nâng cao chất lượng dinh dưỡng của các sản phẩm này[2].

B adolescentis có khả năng sản xuất folate trong đại tràng, cung cấp các yếu

tố dinh dưỡng hỗ trợ điều trị bệnh viêm loét dạ dày[55] Ngoài ra chúng còn được sử

dụng như một transporter mang gen kháng ung thư vào các khối u[38].

Hình 1.5: Bifidobacterium adolescentis [72]

1.4.6.2 Bifidobacterium animalis

Bifidobacterium animalis là một vi khuẩn gram dương , sống kỵ khí, hình que

có thể tìm thấy trong ruột già của hầu hết các động vật có vú , bao gồm cả con người

(Hình 1.6) Bifidobacterium animalis và Bifidobacterium lactis trước đây được mô tả

là hai loài riêng biệt Hiện nay, cả hai đều được coi là B animalis với phân loài

Bifidobacterium animalis subsp animalis và Bifidobacterium animalis subsp lactis.

[39]

Một số công ty đã thương mại hóa Bifidobacterium animalis với các thương hiệu khác nhau như: Chr Hansen A/S (Đan Mạch) Bifidobacterium animalis subsp.

lactis BB-12 [70] Lidl Sử dụng "Bifidobacterium BB-12" trong sữa chua "Proviact".

Bifidobacterium lactis Bl-04 và Bi-07 là các chủng từ dòng Danora FloraFIT của

DuPont, chúng được sử dụng trong sản phẩm probiotic bổ sung chế độ ăn uống

Therelac sử dụng các chủng "Bifidobacterium lactis BI-07" và "Bifidobacterium

lactis BL-34" (còn gọi là BI-04) trong viên nang probiotic Bifidobacterium lactis

HN019 là một chủng từ Fonterra, sau khi được cấp phép sử dụng, DuPont đã thươngmại chủng này với tên sản phẩm là HOWARU Bifido[79;80;74;78] Một nghiên cứu

gần đây cho thấy, Bifidobacterium animalis subsp lactis BB-12 kết hợp với một số

dạng probiotic khác giúp giảm viêm loét đại tràng ở 32 bệnh nhân[26].

Hình 1.6: Bifidobacterium animalis [76]

1.4.6.3 Bifidobacterium bifidium

Bifidobacterium bifidum là một loại vi khuẩn thuộc chi Bifidobacterium B bifidum là một trong những loại vi khuẩn probiotic phổ biến nhất có thể tìm thấy

trong cơ thể của động vật có vú, bao gồm cả người (Hình 1.7) B bifidum là một vi

khuẩn Gram dương mà không di động, sống kỵ khí, không hình thành bào tử, hình

que và có thể hình thành các cụm, các cặp hoặc thậm chí là độc lập Phần lớn B.

bifidum được tìm thấy trong đại tràng , ruột non, sữa mẹ và âm đạo Việc sử dụng B.

bifidum trong các chế phẩm probiotic có thể làm giảm nguy cơ bị tiêu chảy cấp và

nguy cơ nhiễm khuẩn E coli, góp phần duy trì sự cân bằng môi trường âm đạo, giảm

triệu chứng tiêu chảy và nhiễm trùng bởi các vi sinh vật gây bệnh[35].

Hình 1.7: Bifidobacterium bifidium [77]

1.4.6.4 Bifidobacterium breve

Bifidobacterium breve là vi khuẩn, hình que, sống kỵ khí, Gram dương không

có khả năng di chuyển tế bào, không tạo bào tử[50] (Hình 1.8) B breve đã được tìm

thấy nhiều trong ruột non và lần đầu tiên được phân lập từ phân trẻ sơ sinh bú sữa mẹ

vào năm 1990 B breve là một loài vi khuẩn sống hội sinh chiếm ưu thế trong ruột

[21] Đặc biệt, B breve đóng một vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa sữa

mẹ ở trẻ sơ sinh, trong đó chứa human milk oligosaccharides (HMOs) là một loại

đường trẻ em không thể tiêu hóa được B breve đã được chứng minh hiệu quả của nó trong điều trị táo bón ở trẻ em khi kết hợp với Bifidobacterium bifidum và

Lactobacillus acidophilus[58].

Hình 1.8: Bifidobacterium breve [75]

1.4.6.5 Bifidobacterium longum

Hình 1.9: Bifidobacterium longum [73]

Bifidobacterium longum là một vi khuẩn Gram dương , catalase âm tính , hình

que có trong đường tiêu hóa của người (Hình 1.9) Đây là một trong những loài vi

sinh vật xuất hiện sớm nhất trong hệ tiêu hóa của trẻ sơ sinh Khi được nuôi cấy trên

môi trường kị khí nói chung, B longum hình thành các khuẩn lạc trắng, bóng với hình dạng lồi B longum được coi là một phần của hệ vi sinh đường ruột và sản sinh axit lactic, có tác dụng ngăn ngừa sự phát triển của sinh vật gây bệnh B longum

không gây bệnh và thường được bổ xung vào các sản phẩm thực phẩm mang lại lợiích sức khỏe cho người cũng như động vật [54] Bifidobacterium longum subsp.

longum 35624, trước đây được phân loại là Bifidobacterium longum subsp infantis

35624, nó được bán dưới nhãn hiệu Align ở Mỹ, Alflorex ở Anh và đã được cấp bằngsáng chế Dòng này được phân lập trực tiếp từ biểu mô của hồi tràng sau của mộtngười khỏe mạnh và là một trong những dòng probiotic được nghiên cứu nhiều nhất

[69].

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Chủng vi khuẩn

 5 chủng Bifidobacterium đang lưu giữ tại Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật

(VTCC) - Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội,bao gồm:

tủ sấy (Carbolite, Anh), máy đo quang phổ (Beckman Coulter, Mỹ), kính hiển viquang học (Olympus, Nhật), tủ lạnh (Hitachi, Thái Lan), tủ lạnh -80oC (Nuaire, Mỹ),máy ly tâm lạnh (C30P Sartorius Group, Đức), Máy PCR (PE-9700, ABI, Mỹ), Máy

đọc trình tự tự động (ABI 3100 Avant, Mỹ), thiết bị cô mẫu (Mỹ), máy ly tâm lạnh

(Beckman Coulter, Mỹ),

2.3 Môi trường

 MT1 (MRSc): De Man Rogosa Sharpe (LabM, UK) (g/l)

Glucose: 20; Peptone: 10; Cao thịt: 10; Cao men: 5; K 2 HPO 4 : 2;

CH 3 COONa.3H 2 O: 5; (NH 4 ) 3 C 6 H 5 O 7 : 2; MgSO 4 7H 2 O: 0,2; MnSO 4 5H 2 O: 0,05; Tween 80: 1,08; L-cysteine HCl: 0,5; pH 6,5

 MT2: (g/l)

Glucose: 20; Cao men: 6; CH 3 COONa.3H 2 O: 5; KH 2 PO 4 : 0,25;

(NH 4 ) 3 C 6 H 5 O 7 : 2; MnSO 4 5H 2 O: 0,05; MgSO 4 7H 2 O: 0,2; L-cysteine HCl: 0,5;

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phân lập

Các mẫu phân lập được thu thập từ các nguồn gốc khác nhau tại Việt Nam(phân trẻ em bú sữa mẹ, động vật, sữa lên men, nước thải, ) Mỗi mẫu được làm giàutrên môi trường MRS broth (LabM, UK) bổ sung thêm 0,05% L-cysteine (Sigma, St.Louis, Mo, USA)-(Ký hiệu MRSc) [13] Các mẫu sau đó đã được đồng nhất và pha

loãng trong nước muối sinh lý (0,85 %) Mỗi mẫu phân lập được cấy trải ở các nồng

độ pha loãng khác nhau trên môi trường MRSc agar và ủ ở 37oC trong 48 giờ tronghộp yếm khí (AnaeroPack Rectangular Jar, Mitsubishi Gas Chemical Company).Nhặt các khuẩn lạc tách rời có hình thái khác nhau cấy vào các đĩa môi trường MRScagar và ủ ở 37oC trong 48 giờ trong hộp yếm khí Các chủng được quan sát bằng kínhhiển vi (1000 x) sau khi nhuộm Gram, những mẫu có dạng hình thái "Y" hoặc “V”bắt màu tím được chọn để phân tích tiếp bằng sinh học phân tử

2.4.2 Phân loại bằng sinh học phân tử

Tách chiết DNA

DNA của các chủng vi khuẩn nghi ngờ bifidobacteria được tách chiết theophương pháp của Gabor và cộng sự (2003) [25] với một số bước cải biến để phù hợp

với điều kiện phòng thí nghiệm

- Chủng vi khuẩn nghi ngờ bifidobacteria được nuôi kỵ khí trong ống môi trường MRSc dịch thể trong 24 – 48 giờ.

-Ly tâm 1,5ml dịch nuôi vi khuẩn lấy sinh khối tế bào

- Hoà sinh khối tế bào trong 100 l TE

- Thêm 0,4 mg lysozyme Trộn đều, ủ 370C trong 1 giờ Trộn đều 3 phút

- Thêm 100 l SDS 10% (w/v), trộn đều 2-3 phút trộn thật kỹ, ủ 37oC/30 phút

- Thêm một thể tích tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol (PCI),trộn đều Ly tâm 15.000v/p, 15phút Chuyển lớp dịch phía trên sang ống Eppendoftkhác.

- Thêm 8 l RNAse 3 mg/ml, trộn đều, ủ ở 37oC trong 30 phút

- Thêm 12 l proteinase K (5 mg/ml), trộn đều, ủ 15 phút ở 56oC

- Thêm một thể tích tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol (PCI),trộn đều Ly tâm 15.000v/p, 15 phút Chuyển lớp dịch phía trên sang ống Eppendoftkhác

- Thêm 1 thể tích tương chloroform: isoamyl alcohol, trộn đều, ly tâm15.000v/p, 15 phút Chuyển lớp dịch phía trên sang ống Eppendoft khác

- Thêm 1/10 V Natri acetat 3M và 1ml Ethanol 100%, đảo trộn Đặt trong đá

30 phút

- Ly tâm 15.000v/p trong 15 phút Bỏ lớp dịch trên

- Rửa tủa bằng ethanol 70%

- Làm khô DNA bằng máy cô quay chân không

- Hoà tan DNA trong 50-100l nước hoặc TE

- Kiểm tra sản phẩm DNA bằng điện di

Đun tan agarose 1% (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agarose: 1g)

để ấm, bổ sung Redsafe theo tỷ lệ 1µl/15 ml gel, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặttấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml dung dịch 1 X TAE Trộn 1 l dungdịch 6X loading buffer với 5 l mẫu trộn đều, nhỏ vào giếng Chạy điện di bằng dòngđiện một chiều với điện thế 100V, cưòng độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, Quansát trên máy soi gel

Mồi :

Mồi xuôi U1R: 5’- ACC TGC CCG AAG TAC ATC GAC -3’

Mồi ngược U2L: 5’- GAG CTC CAG ATG CCG TGA CG -3’[67]

Phân loại dựa trên trình tự gen 16S rRNA

Phản ứng PCR được sử dụng để khuếch đại đoạn gen ADNr 16S với cặp mồi(27F: (5'- AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG -3') và 1525R (5'-

 Sử dụng bộ kit QIAgen theo chỉ dẫn của nhà sản xuất

- Thêm dung dịch PBI vào mẫu theo thể tích 5:1 Trộn đều

- Cho hỗn hợp mẫu vào cột, ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút

- Đổ bỏ dịch phía dưới cột

- Bổ sung 750 l PE buffer lên cột Ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút

- Đổ bỏ dịch dưới cột

- Ly tâm tiếp 10.000 v/p trong 1 phút

- Chuyển cột sang ống Eppendoft mới

- Thêm 30l nước Để ở nhiệt độ phòng 5 phút

- Ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút

- Lấy dịch phía dưới

 Kiểm tra độ tinh sạch của mẫu:

Mẫu được kiểm tra trên máy quang phổ ở các bước sóng 260 và 280 Tính tỷ

lệ tinh sạch : OD 260/OD 280 > 1,7

Phản ứng khuếch đại DNA cho đọc trình tự

-Terminator Ready Reaction Mix (Termix):

- Chuyển 20l sản phẩm sang ống Eppendoft sạch

- Thêm 5  l EDTA 125mM và 60  l ethanol 100% Đểkhoảng 15 phút ở nhiệt độ phòng

- Ly tâm 15.000v/p, 15phút

- Bỏ dịch, thêm 60l ethanol 70% để rửa, ly tâm 15.000v/p, 10 phút

- Làm khô.

- Thêm 10l HiDi Formamide

- Để ở 960C trong 2 phút

- Cho ngay mẫu vào nước đá lạnh

- Chuyển toàn bộ mẫu vào giếng trong khay dùng cho đọc trình tự

- Vận hành máy xác định trình tự gen ABI 3100 Avant

Giải trình tự gen 16S rRNA và xây dựng cây phát sinh chủng loại

Trình tự của ADNr 16S được phân tích sử dụng phần mềm CLUSTAL W ver1.83 của Thompson và cộng sự (1997) [59] Các trình tự tham khảo dùng trong

nghiên cứu cây phát sinh chủng loại được lấy từ dữ liệu của DDBJ, EMBL, GenBank.Cây phát sinh được xây dựng theo Kimura (1980) [32] sử dụng phương pháp của

Saitou và Nei (1987) [53] Phân tích bootstrap được thực hiện từ 1000 lần lặp lại

ngẫu nhiên, chỉ có những giá trị trên 50% được thể hiện

2.4.3 Nghiên cứu đặc tính probiotic và tuyển chọn chủng

2.4.3.1 Khả năng sinh enzyme ngoại bào

Phương pháp đặt thỏi thạch

Cấy các chủng vi khuẩn Bifidobacterium trên môi trường thạch MRSc, ở 37oCsau 3 ngày Dùng ống hút có đường kính 5mm khoan các thỏi thạch chứa khuẩn lạcđặt lên các bản thạch chứa các cơ chất (Casein, CMC, tinh bột, tributyrin) Quan sátvòng trong xung quanh các thỏi thạch trên các đĩa chứa casein và tributyrin TrángLugol vào các đĩa chứa CMC và tinh bột Đo vòng phân giải

Phương pháp nhỏ dịch

Cấy các chủng vi khuẩn Bifidobacterium trên môi trường dịch thể MRSc, ở

37oC sau 3 ngày, sau đó ly tâm 1 ml dịch nuôi của từng chủng (10.000 v/p, 10 phúttrong ống eppendorf 1,5 ml) Đổ các bản thạch chứa các cơ chất 0,1% (Casein, CMC,Tinh bôt, Tributyrin) Dùng ống hút có đường kính 5mm khoan các lỗ giếng, nhỏphần dịch trong sau ly tâm vào các lỗ tương ứng của mỗi chủng trên đĩa môi trường

chứa cơ chất Ủ 37oC sau 1 ngày, quan sát vòng trong xung quanh các lỗ giếng trêncác đĩa chứa casein và tributyrin Tráng Lugol vào các đĩa chứa CMC và tinh bột Đovòng phân giải.

2.4.3.2 Khả năng sinh trưởng

 Khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn được xác định bằng mật độ tếbào trong dịch nuôi (OD ở bước sóng 600nm)

 Xác định số lượng tế bào (CFU/ml,g): Lấy 10 ml (g) mẫu cần xác định sốlượng tế bào pha vào 90 ml nước muối sinh lý (NaCl 0,85%) Pha loãng tớinồng độ thích hợp theo hệ số 10 Sau đó, nhỏ vào các đĩa môi trường thíchhợp cho mỗi loại (mỗi đĩa nhỏ 100l, mỗi nồng độ pha loãng làm 3 đĩa), dùngque gạt trải đều cho đến khi khô mặt thạch; Các đĩa Petri sau đó được nuôi

37oC trong bình kín ở điều kiện kỵ khí sử dụng túi tạo kỵ khí (Sachet gaspak

EZ anaerobe, Becton Diskinson) Sau 2 ngày nuôi ở 37oC, tiến hành đếm sốlượng khuẩn lạc tại nồng độ pha loãng thích hợp (>30 khuẩn lạc/ đĩa Petri)

Số lượng tế bào/g được tính theo công thức = a x b x cTrong đó: a-số lượng khuẩn lạc trên đĩa; b- nồng độ pha loãng; c- lượngmẫu cấy

2.4.3.3 Khả năng sinh axít hữu cơ

Định lượng axit theo Therner [22]

Các chủng Bifidobacterium được nhân khởi động 24 giờ trên môi trường MRS

dịch thể, 10% giống khởi động được cấy truyền sang môi trường MRSc dịch thể, ủ

24 giờ Lấy 10ml dịch nuôi vi khuẩn đã li tâm 12.000 v/p, 10 phút, bỏ sinh khối,thêm 1 giọt phenolphtalein (nồng độ 1% trong cồn 900) Sau đó chuẩn độ bằng NaOH0,1N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 30 giây thì dừng lại Ghi lại thể tíchNaOH (ml) đã dùng Độ axit được tính như sau:

Hàm lượng axit (mg/ml) = VNaOHtiêu tốn x 10 x 0,009008