E e e 1 e c a 1 e d 0 1 e d a 1 e f 0 1

Cấu tạo kính hiển vi quang học Kính hiển vi quang học là một dụng cụ quang học hỗ trợ cho mắt gồm có nhiều lăng kínhvới các độ phóng đại khác nhau, có tác dụng làm tăng góc trông ảnh của

NHỮNG QUI ĐỊNH CHUNG ĐỐI VỚI THỰC HÀNH SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG

1 Nội qui:

-Khi làm việc trong phòng thí nghiệm phải giữ vệ sinh sạch sẽ, tôn trọng tính tính

ngăn nắp và trật tự của phòng thí nghiệm

-Mỗi cá nhân hoăc nhóm sẽ làm việc riêng, chỉ được sử dụng các dụng cụ và trang

thiết bị của mình Nếu thiếu phải hỏi cán bộ phụ trách phòng thí nghiệm hoặc giáo viênhướng dẫn, không tự ý sử dụng của người khác

-Sinh viên phải mặc áo bluse Trong một số trường hợp cần thiết phải sử dụng các

dụng cụ bảo hộ cá nhân phù hợp như khẩu trang y tế, găng tay

-Không nói chuyên riêng, không ăn uống, không hút thuốc lá và không đi lại mất

trật tự trong phòng thí nghiệm

-Mỗi buổi thực hành, nhóm trưởng bố trí một nhóm trực dụng cụ, một nhóm trực

hoá chất và một nhóm trực vệ sinh

-Trước mỗi buổi thực hành, sinh viên phải nắm vững nội dung thực hành và kiến

thức lý thuyết liên quan tới nội dung thực hành Nếu sinh viên không nắm vững lý thuyết thì không được thực hành và xem như vắng thực hành không lý do

-Sau khi làm thí nghiệm xong, sinh viên phải vệ sinh nơi làm việc của mình và vệ

sinh các dụng cụ, trang thiết bị đã sử dụng

-Sinh viên phải tham dự đủ 100% các buổi thực hành, nếu vắng một buổi thực hành

vì bất cứ lý do gì thì phải học bù

2 Qui định về viết tường trình

- Sinh viên phải vừa tiến hành thí nghiệm vừa viết tường trình và nộp bài vào cuối

mỗi buổi thực hành

- Nội dung tường trình ở từng thí nghiệm theo yêu cầu của giáo viên.

3 Tiêu chuẩn đánh giá một bài thực hành

Một bài thực hành sẽ được đánh giá theo các tiêu chuẩn sau:

THÍ NGHIỆM SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG

Tiêu chuẩn đánh giá Điểm

THÍ NGHIỆM SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG

BÀI 1: CÁCH SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI –QUAN SÁT TIÊU

BẢN MẪU 4

1.4 Cách sử dụng kính hiển vi 5 1.5 Cách làm tiêu bản mẫu8 1.6 Quan sát một số tiêu bản mẫu 10 BÀI 2: HÌNH THÁI TẾ BÀO11

2.3.1 Nghiên cứu tế bào thực vật12

2.3.2 Khảo sát hình thái-hóa tính của lạp màu13

2.3.3 Khảo sát hình thái hóa tính của lục lạp ,lạp không màu13

2.3.4 Quan sát hình thái hạt tinh bột ở thực vật14

2.3.5 Quan sát tinh thể canxi oxalat ở tế bào thực vật15 BÀI 3: SỰ VẬN CHUYỂN NƯỚC QUA MÀNG TẾ BÀO.15

2.2.1 Thí nghiệm 1: Hiện tượng co nguyên sinh và phản co nguyên sinh 16

2.2.2 Thí nghiệm 2: Xác định nồng độ dung dịch đẳng trương dựa vào sự biến đổi kích thước của mô 17

BÀI 4: HÔ HẤP19

4.3.1 Thí nghiệm 1: So sánh hô hấp hiếu khí và yếm khí ở nấm men Saccharomyces cerevisiae 20

4.3.2 Thí nghiệm 2: Định tính CO2 trong hô hấp thực vật.22

4.3.3 Thí nghiệm 3: Xác định cường độ hô hấp theo phương pháp Boysen – Jensen 23

BÀI 5: KHẢO SÁT MỘT SỐ TÍNH CHẤT HÓA LÝ CỦA SẮC TỐ QUANG HỢP 24

5.3.1 Thí nghiệm 1: Rút sắc tố lá và khảo sát tính chất hóa học của diệp lục 25

5.3.2 Thí nghiệm 2: Tính huỳnh quang của diệp lục25

5.3.3 Thí nghiệm 3: Tính chất cảm quang của diệp lục28

BÀI 6: QUANG HỢP (tiếp theo) 29

THÍ NGHIỆM SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG

6.3.1 Thí nghiệm 1 Tách các sắc tố bằng phương pháp sắc kí trên

giấy 30 6.3.2 Thí nghiệm 2 Sự thải oxy ngoài ánh sáng của cây thủy sinh31

BÀI 1: CÁCH SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI –QUAN SÁT TIÊU BẢN MẪU

1.1 MỤC ĐÍCH YÊU CẦU

Sinh viên ở bài thực hành này phải;

THÍ NGHIỆM SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG

-Hiểu rõ cấu tạo, biết sử dụng kính và bảo trì kính một cách thành thạo.

-Biết cách làm tiên bản tạm thời, tiêu bản mẫu.

-Tập quan sát một số tiêu bản mẫu bằng kính hiển vi

1.2 BẢNG KÊ CHI TIẾT THIẾT BỊ - HÓA CHẤT - DỤNG CỤ

1.3 NỘI DUNG THÍ NGHIỆM

Chuẩn bị mẫu vật thí nghiệm:

-Cây rau dền (có cả thân và rễ)

THÍ NGHIỆM SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG

-Cành hoa huệ

1.3.1 SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI

1.3.1.1 Cấu tạo kính hiển vi quang học

THÍ NGHIỆM SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG

Thị kính

Hình 1.1 Cấu tạo kính hiển vi quang học Kính hiển vi quang học là một dụng cụ quang học hỗ trợ cho mắt gồm có nhiều lăng kính

với các độ phóng đại khác nhau, có tác dụng làm tăng góc trông ảnh của những vật rất nhỏ

mà ta không thể nhìn thấy được bằng mắt thường

THÍ NGHIỆM SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG

Ốc vĩ cấp

Ốc vi cấp

Ống kính

Ốc chỉnh ống kính

        Hệ thống chiếu sáng gồm:

      -     Nguồn sáng (gương hoặc đèn)

      -     Màn chắn, được đặt vào trong tụ quang dùng để điều chỉnh lượng ánh sáng đi qua

tụ quang

      -     Tụ quang, dùng để tập trung những tia ánh sáng và hướng luồng ánh sáng vào tiêu bản cần quan sát Vị trí của tụ quang nằm ở giữa gương và bàn để tiêu bản Di chuyển tụ quang lên xuống để điều chỉnh độ chiếu sáng

        Hệ thống điều chỉnh gồm:

-      Ốc vĩ cấp

-      Ốc vi cấp

-      Ốc điều chỉnh tụ quang lên xuống

-      Ốc điều chỉnh độ tập trung ánh sáng của tụ quang

-      Núm điều chỉnh màn chắn

THÍ NGHIỆM SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG

-      Ốc di chuyển phiến kính mang tiêu bản (trước, sau, trái, phải)

-     Điều chỉnh cỡ màn chắn tương ứng với vật kính

-      Hạ vật kính sát vào tiêu bản (mắt nhìn tiêu bản)

-      Mắt nhìn thị kính, tay vặn ốc vĩ cấp để đưa vật kính lên cho đến khi nhìn thấyhình ảnh mờ của vi trường

-      Điều chỉnh ốc vi cấp để được hình ảnh rõ nét

1.3.1.3 Bảo quản kính hiển vi

      -      Sử dụng và bảo quản kính hiển vi một cách thận trọng

      -      Đặt kính ở nơi khô thoáng, vào cuối ngày làm việc đặt kính hiển vi vào hộp có góihút ẩm silicagel để trách bị mốc

      -      Lau hệ thống giá đỡ hàng ngày bằng khăn lau sạch, lau vật kính dầu bằng giấy mềm chuyên dụng có tẩm xylen hoặc cồn

      -      Bảo dưỡng, mở kính lau hệ thống chiếu sáng phía trong định kỳ

1.3.2 CÁCH LÀM TIÊU BẢN MẪU

Khái niệm: Tiêu bản là mẫu vật, nhuộm hay không nhuộm dùng xem qua kính hiển

vi, mẫu vật được đặt trên lam kính, đậy lại bằng lamen (kính lam nhỏ) trong một dung dịch (môi trường) đặc biệt và qua đó có thể bảo quản và lưu giữ trong thời gian dài. 

Một mẫu tiêu bản làm tốt có thể giữ được hàng chục năm, đôi khi cả trăm năm Vì vậy mẫu tiêu bản nên ghi chú đầy đủ và chính xác.Tiêu bản mẫu có thể được làm từ các mẫu vật đã được xử lý trước hoặc đã làm khô Các mẫu vật tươi có khả năng bị vi khuẩn phá hủy cao nên khi làm tiêu bản mẫu bảo quản bằng nhựa nhân tạo phải chiết hết nước ra

THÍ NGHIỆM SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG

trước khi đổ nhựa bảo quản Mặt khác, tiêu bản mẫu thường được nhuộm để làm nổi các cấu trúc của mẫu vật vừa dễ phân biệt vừa làm rõ các chi tiết của các mẫu vật đã được cắt quá mỏng Thông thường có 2 loại tiêu bản là tiêu bản tạm thời và tiêu bản cố định hay còn gọi là tiêu bản mẫu.

1.3.2.1 Cách làm tiêu bản tạm thời

a Cắt mẫu:

Muốn quan sát dễ dàng cấu tạo ta phải cắt các cơ quan thực vật (rễ, thân, lá ) thành các lát mỏng gọi là thiết vật Để tạo thành các thiết vật ta đặt các cơ quan thực vật lên tấm thớt bằng củ khoai lang hay cục gôm rồi dùng dao lam thật bén để cắt, các lát cắt phải thật mỏng và thẳng góc với trục của cơ quan thực vật Sau khi cắt xong, ta dùng kim mũi mác vớt thiết vật nhúng vào nước hay hóa chất nhuộm thích hợp

Lưu ý: Nên tiến hành nhuộm nhiều mẫu thiết vật trong cùng một đĩa đồng hồ và dùng

một ống nhỏ giọt để tiến hành thay hóa chất hay nước trong đĩa và không được dùng kim nhọn để vớt thiết vật vì sẽ làm vỡ thiết vật rất khó quan sát

1.3.2.2 Làm tiêu bản mẫu

Để có thể lưu giữ các tiêu bản mẫu trong thời gian lâu (tiêu bản mẫu) ta có thể làm các tiêu bản cố định bảo quản trong glycerin hoặc bảo quản bằng nhựa nhân tạo Với các tiêu bản mẫu được bảo quản bằng nhựa nhân tạo thì sau khi khô có thể cất giữ trong hộp gỗ

THÍ NGHIỆM SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG

bằng cách dựng đứng hay để nằm điều thích hợp Còn các tiêu bản mẫu được bảo quản bằng glycerin, nên để nằm trong quá trình cất giữ, vì nếu không mẫu vật có thể bị xê dịch

và hư hỏng

a Cách làm tiêu bản mẫu bảo quản bằng glycerin

Glycerin là tên thường gọi cho lọai propantriol và là lọai cồn có 3 nhóm OH Glycerin được dùng nhiều làm chất giữ ẩm trong lãnh vực mỹ phẩm và trong công nghiệp, cũng như làm phụ gia thực phẩm Glycerin không độc hại, có tác dụng bảo quản và làm trắng nên rất thích hợp trong bảo quản các mẫu vật Nhưng cần phải nhuộm mẫu vật trước khi bảo quan do trong quá trình bảo quản bằng glycerin thì mẫu vật sẽ trở nên trắng và trong hơn Nhưng glycerin hòa tan trong nước nên không cần phải chiết nước ra khỏi mẫu vật trước khi nhuộm Thông thường, qui trình làm tiêu bản mẫu bằng glycerin sẽ theo các bước sau:

 Chuẩn bị một lam kính sách: rửa sạch bằng cồn

 Nhỏ một giọt glycerin hòa với nước (tỉ lệ 1:1) vào giữa lam kính, tránh tạo bong bóng khí Sau đó, dùng kim di chuyển mẫu vật (khô, ráo nước) vào trong phạm vi giọt glycerin sau đó ấn mẫu vật chìm vào trong đó

 Dùng lamen (lá kính) đặt nghiêng lên trên, dùng kim di chuyển kính lamen trượt trên glycerin sao cho không tạo bọt khí bên dưới Quan trọng là sao cho glycerin không trào ra ngoài phạm vi kính lam nhỏ, hoặc dính lên kính lam nhỏ, nếu không khi dán sẽ không được kín

 Sau cùng, dùng sơn móng tay (sơn trong suốt) dán lại: trước tiên dùng một giọt sơn dán các góc lại, sau đó dùng sơn quét đều một đường lên các cạnh Khi quét sơn xong, để cho khô Trong quá trình sử dụng tiêu bản mẫu nên cẩn thạn tránh hư hỏng lớp sơn đã dán

b Cách làm tiêu bản mẫu bảo quản bằng nhựa nhân tạo

THÍ NGHIỆM SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG

Tiêu bản mẫu bảo quản bằng nhựa nhân tạo giữ được lâu và tốt hơn bằng glycerin Nhưng nhựa nhân tạo không hòa tan trong nước nên cần phải chiết hết nước ra trước khi bảo quản Để chiết hết nước ta lần lượt ngâm các mẫu vật vào các dung dịch sau: cồn 30% -> cồn 60% -> cồn 95%  -> Terpeniol (mỗi bước ngâm khoảng 3 phút) Sau đó, thực hiện quy trình nhuộm tương tự như làm tiêu bản mẫu bằng glycerin, chỉ khác là không cầnthực hiện bước dán bằng sơn móng tay Quy trình cụ thể như sau:

 Chuẩn bị một lam kính sạch và khô

 Nhỏ một giọt nhựa nhân tạo lên vật kính, dùng kim đưa vật mẫu đã chiết hết nước lên trên, tránh các bong bóng khí, nếu có dùng kim đâm cho xì hết ra

 Sau đó đưa kính lamen theo thế nghiêng lên trên Khi nhựa nhân tạo đã dính hơn một nửa kính lamen rồi thì chúng ta không được nhấc kính lên nữa Khi kính lamen

đã vào vị trí chính xác, chúng ta lấy kim ra, nhựa sẽ tự động phân tán đều hết diện tích của kính lamem bởi trọng lượng của kính ấn xuống

 Để khô trong vòng 24 tiếng đồng hồ hoặc hơn nữa

Hiện nay, trên thị trường có những loại nhựa bảo quản sau:: Malinol, Euparal,DepeX

NeoClear (công ty Merck cung cấp)

1.3.3 QUAN SÁT TIÊU BẢN MẪU

-Tiêu bản thực vật

-Tiêu bản động vật

THÍ NGHIỆM SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG

-Rèn luyện kỹ năng sử dụng kính hiển vi và kỹ năng quan sát

Yêu cầu: Sinh viên ở bài thực hành này phải;

- Làm tiêu bản tế bào thực vật tạm thời

- Khảo sát những cấu trúc cơ bản của tế bào thực vật

- Phân biệt các bào quan trong tế bào

- Nghiên cứu hình thái và hóa tính cơ bản của lạp màu ở thực vật

- Khảo sát hình thái của lục lạp ở các loài thực vật bậc cao.

THÍ NGHIỆM SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG

- Hình thái hạt tinh bột ở thực vật

- Quan sát các hình dạng hạt tinh bột

- Nhận biết các tinh thể caxi oxalat trong lá cây

2.2 BẢNG KÊ CHI TIẾT THIẾT BỊ - HÓA CHẤT - DỤNG CỤ TRONG THỰC HÀNH

C THIẾT BỊ

 Lá cây khoai lang (Ipomoea batatas L), lá thài lài tía

 Củ khoai tây (Solanum tuberosum L), quả đậu cove (Phaseolus vulagris )

THÍ NGHIỆM SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG

 Lá trúc đào (Nerium oleander L), lá rau sam

2.3.1 Nghiên cứu tế bào thực vật

b Tiến hành thí nghiệm: quan sát tế bào dính liền ở biểu bì lá hành

 Lau sạch lam và nhỏ một giọt Glyxerin vào giữa phiến kính Bóc bỏ lớp vẩykhô bên ngoài củ hành Dùng kim mũi mác bóc một miếng nhỏ biểu bì trên lớp vẩy bêntrong còn tươi rồi đặt lên lam chỗ có giọt dung dịch glyxerin đã nhỏ sẵn trên phiến kính.Đậy lá kính lại quan sát dưới kính hiển vi

 Dịch chuyển tiêu bản chọn điểm nào sáng và rõ rất quan sát dưới vật kính lớn.Trước khi quan sát, nhuộm mẫu với dung dịch KI

 Cách làm: tay trái cầm mảnh giấy thấm đặt mép giấy thấm vào cạnh lá kính đểthấm glyxerin, dùng ống hút để nhỏ giọt KI vào đầu đối diện Xoay cạnh của mảnh giấythấm để giấy thấm hút KI qua mẫu vật Quan sát vật kính X40

c Tường trình

- Tiến hành quan sát tiêu bản ở vật kính X10, X40

- Tế bào có hình gì? Sắp xếp như thế nào?

- Vẽ hình và ghi cấu trúc quan sát được ở vât kính X40

2.3.2 Khảo sát hình thái-hóa tính của lạp màu

a Nguyên tắc

- Ở các trái cây chín trong tế bào có nhiều sắc tố tạo nên màu đỏ ,vàng của trái

cây là carotenoit (quả ớt, cà chua, dưa hấu)

- Khi caroteinoid với acid sulfuric sẽ làm chuyển màu tử đỏ sang xanh sẫm

b Tiến hành thí nghiệm

 Dùng kim mũi mác gợt nhẹ ở phần thịt quả, đặt mẫu lên lam kính, nhỏ vào một giọtsaccharose 5% Tiến hành quan sát tiêu bản ở vật kính X10, X40

THÍ NGHIỆM SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG

 Khảo sát hóa tính của Carotenoid:

Tiến hành các bước thí nghiệm giống như trên chỉ thay giọt saccharose 5% bằng giọt

H2SO4 đặc Dưới tác dụng của acid H2SO4, Carotenoid sẽ chuyển từ màu đỏ cam sangmàu xanh sẫm Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi

c Tường trình

 Vẽ tiêu bản quan sát được, nhận xét và giải thích

 Quan sát sự tác dụng của Carotenoid và acid H2SO4 Giải thích?

2.3.3 Khảo sát hình thái hóa tính của lục lạp, lạp không màu

a Nguyên tắc

Ở các phần xanh của cây nhất là lá trong tế bào có lục lạp ,lục lạp có chức diệp lục đó

là sắc tố quang hợp chủ yếu của thực vật Lục lạp có nhiều hình dạng như hình chén, hìnhđĩa, hình bầu dục Ở thực vật bậc cao, lục lạp thường có hình bầu dục, hình thấu kính rấtthích hợp cho việc hấp thu ánh sáng ở các điều kiện khác nhau

Tế bào biểu bì của lá, tế bào khí khổng hay còn gọi là lỗ khí lục lạp ít hơn dễ quan sáthơn Khi quan sát dưới vật kính nhỏ ta thấy các tế bào lỗ khí, trong đó có những hạt nhỏmàu lục là lục lạp

Lạp không màu là những thể nhỏ thường hình cầu, không màu, có chỉ số khúc xạ sấp

xỉ tế bào Khi quan sát dưới vật kính lớn ta thấy ở mỗi tế bào có những hạt cầu nhỏ, sáng,không màu, nằm tập trung ở quanh nhân tế bào Đó là những lạp không màu, các lạp nàythường nhìn rõ hơn ở các tế bào quanh lỗ khí

THÍ NGHIỆM SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG

b Tiến hành thí nghiệm

 Dùng kim mũi mác bóc một lớp tế bào biểu bì ở mặt dưới của lá khoailang, đặt miếng biểu bì lên lam kính, nhỏ lên 1 giọt dung dịch saccharose 5% Đậy la menlại và tiến hành quan sát ở vật kính X10, X40

c Tường trình

Quan sát, vẽ hình tiêu bản, chú thích các cấu trúc quan sát được

2.3.4 Quan sát hình thái hạt tinh bột ở thực vật

a Nguyên tắc: Tinh bột ở khoai tây : hạt thường có hình trứng, một số hạt nhỏ có

hình bầu dục hoặc tròn Kích thước trung bình từ 65-100µm Ở hạt có những đường vântăng trưởng và rốn khá to, ta thường thấy những dạng hạt sau

 Hạt đơn: Thường có hình trứng, có một rốn ở đầu nhỏ và đường vân rất nhỏ (phổbiến)

 Hạt kép: nhỏ hơn hạt đơn và ít hơn nhiều do 2-3 hạt đơn dính vào với nhau Mỗi hạttrong hạt kép cũng có một rốn và đường vân riêng biệt Các rốn này nằm đối diệnnhau qua đường nối giữa các hạt

 Hạt nửa kép: rất hiếm có, do 2-3 hạt đơn dính lại liền nhau Ngoài những vân riêngcủa từng hạt còn có lớp vân chung bao bọc xung quanh

b Tiến hành thí nghiệm

 Cắt ngang củ khoai tây (là những bộ phận chứa tinh bột) của những nguyênliệu trên Dùng kim mũi mác cạo ít bột trên mặt cắt đó rồi lên kính trong một giọt nước.Quan sát và vẽ hình ở các vật kính X10, X40

THÍ NGHIỆM SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG

Chú ý: không nên lấy nhiều tinh bột vì các hạt tinh bột xếp chồng lên nhau làm ta khóquan sát.

 Phản ứng xác định tinh bột

Sau khi quan sát tinh bột xong chuyển sang vật kính 10 rồi cho một giọt dung dịch

KI 0,1%loãng vào mép lá kính của một tiêu bản Ở mép đối diện dùng giấy thấm hút nướcdưới lá kính đi (không cho quá nhiều làm dây bẩn lá kính) Nhìn vào kính hiểm vi thấy cáchạt tinh bột bắt màu xanh đen hoặc xanh lam

c Tường trình

 Tiến hành làm tiêu bản thực hiện các yêu cầu của thí nghiệm

 Viết phương trình phản ứng bắt màu của tinh bột

 Quan sát hình thái các hạt tinh bột ,phân biệt hạt đơn hạt kép

2.3.5 Quan sát tinh thể canxi oxalat ở tế bào thực vật

a Nguyên tắc: Cấu trúc mô thực vật, có các hạt tinh thể có vai trò gia tăng độ cứng

cho tế bào

Tinh thể cầu gai có ở lá cây trúc đào hoặc rau sam, với vật kính nhỏ quan sát thấytrong mô mềm của phiến lá cũng như gân lá trúc đào hoặc thân cây rau sam có những tếbào chứa tinh thể canxi olaxat hình cầu gai, màu hơi xám

b Tiến hành thí nghiệm

 Cắt ngang qua gân lá trúc đào, chọn những lát cắt mỏng ngâm vào nướcjaven 15 phút Sau đó rửa sạch lên kính trong một giọt nước Quan sát

c Tường trình

THÍ NGHIỆM SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG