TÓM TẮT Nhiều protein chủ chốt như LC3, PARKIN, PINK, DJ-1 tham gia vào quá trình mitophagy trong quá trình suy thoái ti thể của tế bào trước các tín hiêu oxy hoá stress.Tuy nhiên cơ chế
Trang 1KHẢO SÁT VAI TRÒ CỦA PROTEIN P62 TRONG QUÁ TRÌNH HÌNH THÀNH
MITOPHAGY
Nguyễn Kiều Linh, Hồ Nguyễn Anh Minh, Bùi Chí Bảo
Trung tâm Y Sinh học Phân Tử, Đại học Y Dược, 217 Hồng Bàng quận 5, Tp Hồ Chí Minh
TÓM TẮT
Nhiều protein chủ chốt như LC3, PARKIN, PINK, DJ-1 tham gia vào quá trình mitophagy trong quá trình suy thoái ti thể của tế bào trước các tín hiêu oxy hoá stress.Tuy nhiên cơ chế tương tác của protein p62 mã hóa từ gene SQSTM1 với LC3 trong quá trình mitophagy vẫn chưa được hiểu rõ Nghiên cứu này được tiến hành trên dòng tế bào HeLa được giảm biểu hiện gen P62 bằng một trình tự can thiệp shRNA thông qua hệ thống T-RExTM system Kết quả biểu hiện được kiểm tra bằng phương pháp RT-PCR và nhuộm ti thể nhằm xác định rõ vai trò của P62 trong quá trình mitophagy Đề tài đã chứng minh được protein P62 giúp bảo vệ tế bào chống lại các điều kiện stress nhờ vào cơ chế hình thành mitophagy thông khả năng tương tác với các phân tử bị ubiquitin hóa trên màng ti thể như PINK1 Từ đó, mở ra nhiều hướng nghiên cứu mới cho những nghiên cứu chuyên sâu hơn nữa về quá trình mitophagy
Từ khóa: autophagy, mitophagy, ROS, P62, palmitate, tetracycline, ti thể
MỞ ĐẦU
Autophagy (hoặc autophagocytosis) là cơ
chế dị hóa cơ bản làm phân hủy các
protein sai hỏng của tế bào, các bào quan,
ngăn ngừa sự tích tụ của protein bất
thường thông qua túi lysosome
Auto-phagy có khả năng phá hủy một số lượng
lớn các thành phần của tế bào chất nhờ vào
lysosome Quá trình này còn cho phép tế
bào tái sử dụng các thành phần trong tế
bào cũng như cung cấp các acid amin trong điều kiện tế bào bị thiếu nguồn dinh
dưỡng [1]
Autophagy có thể được chia thành ba hình thức chính: macroautophagy, micro-autophagy và micro-autophagy có liên quan đến chaperone (Chaperone mediated auto-phagy - CMA) Quá trình macroautoauto-phagy liên quan đến sự hình thành một lớp màng đôi autophagosome nhờ vào sự phối hợp hoạt động của các protein liên quan đến
Trang 2autophagy (Atg), giúp bao quanh các bào
quan và các phần của tế bào chất Sau đó
trong tế bào chất, autophagosome sẽ dung
hợp với lysosome thông qua cơ chế nội
nhập bào (endocytosis) Trong lysosome,
các thành của autophagosome sẽ bị phân
Micro-autophagy lại liên quan trực tiếp đến việc
nuốt các vật liệu của tế bào chất vào
lysosome Theo con đường CMA, trên bề
mặt của màng lysosome có thụ thể
LAMP-2A (lysosome associated membrane
protein) chúng sẽ gắn được với các protein
cần được phân hủy để chuyển vào màng
Con đường này có tính chọn lọc cao vì nó
chỉ phân hủy những protein chứa một
motif liên quan đến KFERQ pentapeptide
Ngoài ra, autophagy còn có thể được phân
loại đưa vào các vật liệu mà nó phân hủy
Nếu đó là quá trình phân hủy ribosome thì
được gọi là ribophagy, nếu phân hủy ti thể
thì gọi là mitophagy [2]
Trong tế bào, ti thể (mitochrondria) đóng
vai trò rất quan trọng, chúng được xem là
“nhà máy năng lượng” của tế bào nhờ vào
việc tạo ra nhiều ATP thông qua quá trình
hô hấp Tuy nhiên, trong quá trình vận
chuyển điện tử trên màng ti thể, điện tử
được chuyển từ oxy đến phân tử nước
cũng làm sản sinh ra một phần các gốc oxy
tự do ROS (reactive oxygen species) như
là H2O2 Tuy nhiên, khi tế bào ở điều kiện stress oxy hóa, lượng ROS tăng cao làm tổn thương nhân cũng như các bào quan khác trong đó có ti thể Các ti thể bị hư hỏng sẽ được thủy phân trong tui lysosome thông qua hình thức mitophagy Đến nay
đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về mitophagy Ở nấm men, protein Atg32 có vai trò quan trọng trong định hướng quá trình mitophagy [3] Ở tế bào động vật có
vú, có protein NIX tham gia quá trình loại
bỏ các ti thể của tế bào hồng cầu đã biệt hoá [4] Các gen liên quan đến bệnh Parkinson mã hoá cho các protein như α- NUCLEIN, PARKIN, PINK1, và DJ-1 đều tham gia quá trình mitophagy [5] Các nghiên cứu cũng cho thấy rằng việc giảm điện thế trên màng làm ti thể bị phân mảnh
“fission”, đồng thời sự tăng biểu hiện PINK1 tạo điều kiện thuận lợi cho PARKIN hướng bám vào ti thể dẫn tới hình thành autophagosome để phân hủy ti
thể
Gần đây, các nghiên cứu ức chế quá trình autophagy và mitophagy khiến hàm lượng P62 tích tụ khá cao trong tế bào Những nghiên cứu khác cho thấy cấu trúc của P62
Trang 3có khá nhiều các domain đặc biệt như
domain KIR (keap 1 interacting region)
giúp cho P62 có thể tương tác với phân tử
KEAP1 UBA (Ubiquitin associated
domain) giúp P62 gắn với các phân tử bị
Ubiquitin hóa Vùng LRS (LC3
recognition sequence) giúp nhận biết chuỗi
LC3 và vùng LIR (LC3 interacting region)
giúp P62 phản ứng LC3 một gen chỉ thị
của quá trình autophagy[6] Kết hợp với
những nghiên cứu trước đó, một giả thuyết
rằng P62 có thể liên quan đến tính ổn định
tế bào khi bị stress bằng quá trình
mitophagy có chọn lọc Như vậy để có thể
nghiên cứu rõ hơn về vai trò của P62 trong
quá trình mitophagy, nghiên cứu knock
down gen P62 rồi nuôi cấy tế bào trong
điều kiện stress và khảo sát quá trình hình
thành mitophagy
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Nguyên liệu
Dòng tế bào HeLa (ATCC- CCL 2TM) đã
knock down gen P62 bằng cách sử dụng hệ
thống T-RExTM system từ trường đại học
Sung Kuyn Kwan, Hàn Quốc Dựa vào hệ
thống biểu hiện T-REx system TM
(Invitrogen, Cat, No K1020-01), tế bào
HeLa được chuyển một đoạn RNA can
thiệp có cấu trúc kẹp tóc “short hairpin RNA” (shRNA) để làm giảm biểu hiện gen mục tiêu P62 Khi có tetracycline (Invitrogen), tetracycline sẽ kích hoạt gen mục tiêu là shRNA thông qua đó sẽ làm giảm biểu hiện của protein P62
Phương pháp
Nuôi cấy tế bào: Tế bào HeLa P62 được nuôi cấy trong môi trường DMEM (Welgen, Hàn Quốc) (có sẵn10% huyết thanh nhau thai bò, 1% kháng sinh peniciline và streptomycin) để tăng sinh
Để cảm ứng giảm biểu hiện gen HeLa P62 được nuôi trong môi trường DMEM có chứa tetracycline 100 ng/ml Tế bào HeLa P62 sẽ nuôi trong môi trường DMEM có chứa tetracycline 100ng/ml và 1mM palmitate (Sigma) để cảm ứng quá trình mitophagy cũng như giảm biểu hiện gen P62 Tế bào được nuôi cấy trong môi trường cảm ứng mitophagy bằng các hóa chất như palmitate, rapamycin (Sigma) hay môi trường thiếu serum
RT-PCR: Tế bào HeLa P62 sau khi nuôi cấy và đạt khoảng 80% diện tích đĩa nuôi cấy sẽ được tách chiết RNA bằng RNeasy Mini kit (QIAGEN) RNA sau khi tách chiết sẽ làm khuôn và dựa vào đặc tính của Enzyme Reverse Transcriptase, tổng hợp
Trang 4mạch mới là cDNA Sau đó, cDNA sẽ
được nhân số lượng thông qua phản ứng
khuếch đại (PCR) với mồi đặc hiệu P62 và
GAPDH để kiểm tra sự biểu hiện gen
Phương pháp nhuộm ti thể: tế bào được
nuôi cấy trong môi trường cảm ứng sẽ
nhuộm với DAPI (Sigma) và MitoTracker
(Invitrogen) để quan sát sự hình thành
mitophagy Bên cạnh đó, tế bào HeLa P62 được nuôi cấy cảm ứng quá trình mitophagy cũng như giảm biểu hiện gen P62 sẽ được nhuộm trực tiếp với thuốc nhuộm MiTo Tracker để quan sát ti thể
Quy trình thực hiện đƣợc tóm tắt theo
hình 1
Hình 1: Quy trình tiến hành
Trang 5KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1 Kết quả khảo sát nồng độ
tetracycline
Khi xét phản ứng RT-PCR với mồi
chứng nội GAPDH, ta thấy các giếng
5,6,7,8 đều có các vạch sản phẩm Có sự
khác biệt ở giếng 1,2,3,4 khi điện di với
sản phẩm đặc hiệu của mồi P62 là do khi
ta xử lí tế bào với nồng độ tetracycline
khác nhau thì quá trình biểu hiện gen P62
bị ảnh hưởng Khi nồng độ tetracycline
càng tăng thì sự biểu hiện gen P62 càng
giảm, ở mẫu 3 và 4 nồng độ tetracycline là
tương ứng là 150 ng/ml và 200 ng/ml thì
hầu như không có vạch sản phẩm Như vậy, ở nồng độ tetracycline 150 và 200 ng/ml thì quá trình biểu hiện gen bị ức chế hoàn toàn Tuy nhiên, gen P62 là một gen khá cần thiết cho tế bào vì nó là một thành phần trong con đường truyền tín hiệu Nrf2 giúp phiên mã ra các sản phẩm chống oxy hóa [7] Nên khi ta ức chế mạnh sự biểu hiện của gen P62 có thể ảnh hưởng mạnh đến sức sống của tế bào, do đó nồng độ tetracycline được chọn để cảm ứng giảm biểu hiện gen P62 cho các thí nghiệm sau
là 100 ng/ml(hình 2)
Hình 2: Kết quả RT-PCR với mồi đặc hiệu (P62 giếng 1,2,3,4; GAPDH giếng 5,6,7,8,9) trong đó giếng 1 và 5 tế bào không xử lí hóa chất, giếng 2 và 6 tế bào xử lí tetracycline 100 ng/ml, giếng 3 và 7 tế bào xử lí tetracycline nồng độ 150 ng/ml, giếng
4 và 8 tế bào xử lí tetracycline 200 ng/ml Trong đó, giếng 9 là chứng âm không có cDNA.
Trang 62 Kết quả khảo sát môi trường cảm
ứng mitophagy
Theo kết quả hình 3 khi xử lí tế bào HeLa
với các hóa chất rapamycin, palmitate và
môi trường không có serum thì ti thể bị
tích tụ nhiều so với mẫu đối chứng
Hình 3: Kết quả nhuộm tế bào với DAPI
(xanh dương) và Mito Tracker (màu đỏ)
trong môi trường cảm ứng Mitophagy A
là môi trường đối chứng không xử lí hóa
chất, B là môi trường không có serum, C
là môi trường có rapamycin 100 ng/ml, D
là môi trường có palmitate 1mM
Nguyên nhân của hiện tượng này là do
các chất này làm tăng tín hiệu stress của ti
thể, khiến ti thể bị hư hại và phải tăng mạnh quá trình dung hợp và phân tách Tuy nhiên, trong điều kiện stress ti thể hình thành bởi quá trình phân tách không bền vững nên thường bị phân hủy theo con đường mitophagy [8] Như vậy, sự tích tụ của ti thể có thể được xem là dấu hiệu của quá trình mitophagy Mặc dù rapamycin thường được dùng như đối chứng dương trong quá trình hình thành autophagy Nhưng quan sát trên kết quả nhuộm, ta có thể thấy rapamycin không cảm ứng quá trình mitophagy tốt bằng palmitate Do đó, môi trường có chứa palmitate là thích hợp nhất để cảm ứng quá trình mitophagy cho những thí nghiệm về sau
3 Kết quả khảo sát vai trò P62 trong môi trường cảm ứng mitophagy
Theo như kết quả hình 4, ti thể bị tích tụ nhiều ở môi trường có xử lí palmitate (mẫu
C và D) còn ở mẫu A và B ti thể không có
sự khác biệt rõ Ở mẫu B, khi có tetracycline trong môi trường sẽ làm giảm
sự biểu hiện của gen P62 tuy nhiên do môi trường không có những chất cảm ứng gây stress cho tế bào nên ti thể vẫn ở trạng thái bình thường Riêng ở mẫu C và D có xử lí với palmitate để cảm ứng quá trình mitophagy ti thể đã xuất hiện sự tích tụ
Trang 7nhưng với mẫu D khi đồng thời giảm biểu
hiện P62 thì sự tích tụ biểu hiện mạnh hơn
rất nhiều Điều này có thể được giải thích
là khi xử lí tế bào palmitate có sự tích tụ
của ti thể nhưng quá trình mitophagy vẫn
xảy ra để phân hủy một lượng ti thể hư hại
Với mẫu D ti thể cũng tích tụ khá nhiều
nhưng cơ chế mitophagy bị ảnh hưởng có
thể là do P62 nên không có khả năng phân
hủy ti thể Ti thể bị hư hại vẫn tích tụ trong
tế bào, bên cạch đó quá trình phân tách vẫn
diễn ra làm cho lượng tín hiệu huỳnh
quang tăng lên đột ngột Như vậy có khả
năng protein P62 tham gia vào quá trình
hình thành mitophagy
Thảo luận
Một nghiên cứu gần đây khi phân tích
các protein tương tác với PARKIN trong
quá trình ubiquitin hóa đã chỉ ra một tập
hợp các protein trên màng ti thể bị
ubiquitin hóa như PINK1, MFN2, P62 [9]
Theo các nghiên cứu trước đó đã khẳng
định PINK1 và PARKIN có vai trò quan
trọng trong quá trình mitophagy giúp ti thể
hình thành màng autophagosome [5] Bên
cạnh đó, ở bệnh nhân bị Parkinson do đột
biến gene PARKIN hàm lượng P62 bị tích
tụ khá nhiều trong tế bào, quá trình
mitophagy cũng bị ức chế [10]
Hình 4: Kết quả nhuộm tế bào với Mito Tracker (màu đỏ) trong môi trường cảm ứng Mitophagy A là môi trường đối chứng không xử lí hóa chất, B là môi trường có tetracycline 100 ng/ml, C là môi trường có palmitate 1mM, D là môi trường có palmitate 1mM và tetracycline
100 ng/ml
Trong khi đó cấu trúc của protein P62 lại
có domain tương tác với các phân tử bị ubiquitin hóa cũng như protein LC3 một marker cho quá trình autophagy Điều này cho thấy rất có khả năng vai trò của protein P62 trong quá trình mitophagy thông khả năng tương tác với các phân tử
bị ubiquitin hóa trên màng ti thể như PINK1 và LC3 nhờ vào domain LIR trong
Trang 8điều kiện stress để hình thành
auto-phagosome để phân hủy ti thể
Protein P62 có khá nhiều domain do dó
có khả năng tương tác với rất nhiều loại
protein khác Nhiều nghiên cứu đã cho
thấy P62 có tham gia vào các con đường
tín hiệu như mTOR, NFκB của quá trình
hình thành khối u [11] Mặt khác, theo kết
quả của nghiên cứu cho thấy P62 cũng
tham gia vào quá trình mitophgagy giúp
thải loại các ti thể hư hỏng Hơn nữa
mitophagy còn giúp tế bào tránh khỏi quá
trình apoptosis nhờ vào khả năng phân hủy
ti thể hư hỏng trước khi chúng thải ra
cyctochrome c kích hoạt apoptosis Ở các
dòng tế bào ung thư quá trình này lại ảnh
hưởng đến khả năng điều trị của các thuốc
Giúp cho các tế bào ung thư có thể tồn tại
trước điều kiện stress do thuốc gây ra và
tránh quá trình apoptosis Chính vì thế mà
vai trò hình thành hay ức chế khối u của
p62 còn cần phải nghiên cứu thêm
KẾT LUẬN
Dựa vào những kết quả thu được, nghiên
cứu đã tìm ra được môi trường cảm ứng
mitophagy tốt nhất là 1mM palmitate
Nghiên cứu cũng chứng minh được vai trò
protein P62 có liên quan đến quá trình
mitophagy Điều này, giúp hiểu biết thêm những thông tin cơ bản về quá trình mitophagy cũng như vai trò của P62 đồng thời giúp xây dựng mô hình tế bào bị cảm ứng mitophagy một cách hiệu quả tạo tiền
đề, định hướng cho những nghiên cứu chuyên sâu về sau, như là cần tiến hành thêm các thí nghiệm kiểm tra vai trò của palmiate lên quá trình mitophagy, kiểm tra
vai trò của mitophagy trong tế bào
Lời cảm ơn: Chúng tôi gửi lời cảm ơn
đến dự án TRIG của Đại học Y Dược tp HCM đã hỗ trợ trang thiết bị Cảm ơn Viện
Y Sinh Samsung trường Y Sung Kyunkwan đã cung cấp nguồn tế bào HeLa knock down P62 Đồng thời cũng gửi lời cảm ơn đến Dr Lee Chang Woo và Dr Shin Jaekyoon
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 de Duve, C., Walttiaux, R "Functions
of lysosome." Annual Review Physiology
(1966): 435-492
2 Mizhusima, N., Nonoru, M
"Autophagy prosess and function." Genes
& Develpoment (2007): 9-14
3.Kanki, T., Tomotake, K "Nix: A receptor protein for mitophagy in mammals." Autophagy (2010): 433-435
Trang 94.Richard, J., Youle & Derek, P
"Mechanism of mitophagy." Nature
Reviews Molecular Cell Biology (2011):
9-14
5.Tomotake, K., Ke, W., Yang, C.,
Misuzu, B "Atg32 is a mitochondrial
protein that confers selectivity during
mitophagy."Developmental cell (2010):
89-109
6.Shin, I., Daichi, M., Kyohei, A., Satoru,
U., Takeshi, T., Jun, H., Yu-shin, S.,
Komatsu, M., Keiji, T., Masahiro, S., and
Hidehito, T "Crystal Structure of the
Ubiquitin-associated (UBA) Domain of
P62 and Its Interaction with Ubiquitin." J
Biol Chem (2011): 31864-31874
7 Kwon, J., Han, E., Bui, C.B., Shin, W.,
Lee, J., Lee, S., Choi, Y.B., Lee, A.H.,
Lee, K.H., Park, C., Obin, M.S., Park,
S.K., Seo, Y.J., Oh, G.T., Lee, H.W., Shin,
J "Assurance of mitochondrial integrity
and mammalian longevity by the P62-Keap1-Nrf2-Nqo1 cascade." Embo reports (2012): 150-156
8 Dieter, A K., Asa, B "Mitochondria and Mitophagy: The Yin and Yang of Cell
Death Control" Circulation Research
(2012) , 1208-1221
9 Shireen, A.S., Malavika, R., Virginia, G.P., Mathew, E.S Edward, L.H., Steven,
P.G., Wade, H "Landscape of the PARKIN-dependent ubiquitylome in response to mitochondrial depolarization."
Nature (2013): 372-376
10 Thangiah, G., Nilmini, V., Marina,
S., and Jeganathan, R.B “Sequestosome 1/p62: across disease” Biomarkers (2012),
1–5
11 Alexandre, P., Mina, F., Patrick, A
"When autophagy memts cancer through p62/SQSTM1." America Journal Cancer
Research (2012): 397-413
Trang 10THE ROLE OF PROTEIN P62 IN MITOPHAGY
Nguyen Kieu Linh, Ho Nguyen Anh Minh, Bui Chi Bao
University of medicine and pharmacy Hochiminh city
SUMARY
Mitophagy has been increasingly implicated in diseases including neurodegenerative disease, diabetes, and cancer Several proteins such as Nix, Parkin, Pink1…show that they involve in regulation of mitophagy More recently, the
Sequestosome 1 (P62) together with LC3 have formed a special sequestration that
scavengers damaged organelles and proteins However, the sequestration of mitochondria after damage is poorly understood Therefore, we studied on the role of P62 role in mitophagy targeting damaged mitochondria We performed a T-RexTM system to control the expression of P62 in the HeLa cell lines This system was used to examine the molecular mechanism whether the mitophagy would be required P62 or not In this results, we found the accumulation of damaged mitochondria in absence of P62 More experiences with mitophagy are needed to carry out the role of P62 to remove damaged mitochondria These results would be useful for more insights of mechanism of mitophagy that related to aging disease such as Parkinson, Alzheimer and cancer
Họ và tên: CN NGUYỄN KIỀU LINH, CN HỒ NGUYỄN ANH MINH, TS
BÙI CHÍ BẢO
Cơ quan: Trung tâm Y Sinh học phân tử, đại học Y Dược tp, Hồ Chí Minh
Địa chỉ liên hệ: Đại học Y dược tp Hồ Chí Minh, 217 Hồng Bàng, Quận 5, Tp Hồ Chí Minh
- Tel: 0838535159 Email:bcbao@ump.edu.vn
