BÁO cáo THÍ NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM

Trường hợp nước mặt, mẫu nước được thu vào bình thủy tinh dung tích 100 - 1000ml đã khử trùng, cần chú ý không để mẫu nước bị nhiễm bởi tay hay bởi dây sử dụng khi thu mầu.. Trường hợp n

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HÓA

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM

SVTH : Lê Văn Phú

NHÓM : 19H2CLC1

MSSV : 107190035

Huế, Tháng 07 năm 2021

CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT TRONG NƯỚC

Nước được dùng cho sản xuất, sinh hoạt và thực phẩm Tùy theo mục đích sử dụng các chỉ tiêu vi sinh vật cần kiểm soát sẽ thay đổi

Đối với nước tự nhiên, nước sản xuất, nông ngư nghiệp và nước sinh hoạt, cần phải đảm bảo không bị nhiễm phân, không mang mầm bệnh bằng cách kiểm nghiệm vi sinh vật chỉ thị ô nhiễm phân ví dụ như

coliform, coliform phân

1 Nước dùng cho mục đích sản xuất, sinh hoạt

Các loại nước dùng cho mục đích này được gọi chung là nước mặt, tiêu chuẩn quốc gia Việt Nam ( TCVN 5942-1995)

2 Nước uống

TCNV 6096 – 1995, TCVN 5042 – 1994

CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM

Các chỉ tiêu vi sinh vật trong thực phẩm được quy định bởi tiêu chuẩn của Bộ Y tế bao gồm các chỉ tiêu sau: tổng vi khuẩn hiếu khí, Coliforms,

E coli, Staphylococcus aureus, Salmonella, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus, Streptococcus -faecalis, Pseudomonas aeruginosa,

Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, tổng số' nấm men, nấm mốc

Quy định về giới hạn cho phép của các chỉ tiêu thay đổi theo nhóm và chủng loại thực phẩm Các mặt hàng thủy sản chế biến xuất khẩu được quy định bởi tiêu chuẩn quốc gia (TCVN) và tiêu chuẩn của ngành và của thị trường xuất khẩu

Các chỉ tiêu thường được quan tâm là: tổng vi khuẩn hiếu khí,

Conforms,Coliforms phân, E coli, Staphylococcus aureus, Salmonella spp., Shigella spp.,Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, tổng số" nấm men, nấm mốc, Clostridia, Listeria monocytogenes

 Quy định về giới hạn cho phép của các chỉ tiêu thay đổi theo nhóm, chủng loại thực phẩm

PHƯƠNG PHÁP THU, BẢO QUẢN VÀ CHUẨN BỊ MẪU

1 Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu nước

Về nguyên tắc cần thu mẫu sao cho mẫu thu được có tính đại diện cho khối nước cần kiểm nghiệm Khi thu mẫu nước cần lưu ý :

- Sử dụng bình thu mẫu loại dùng một lần hoặc có thể dùng nhiều lần Trường hợp dùng bình chứa dùng nhiều lần, chất liệu của bình phải cho phép khử trùng lặp lại nhiều lần mà không tạo ra các tạp chất ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của vi sinh vật

- Khi cần thiết phải bổ sung tác chất vô trùng để trung hòa các dư lượng chất diệt khuẩn hiện diện trong mẫu nước Tác chất trung hòa này phải không ảnh hưởng đến sức sống hoặc sự tăng trưởng của vi sinh vật

Ví dụ đối với các mẫu nước có chứa dư lượng chlor như nước máy, cần

bổ sung 0,1ml dung dịch 1,8% sodium thiosulfate vào bình thu mẫu có dung tích 100ml trước khi khử trùng bình này

- Lưu ý tránh gây tạp nhiễm mẫu trong lúc thu mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu

Trường hợp nước mặt, mẫu nước được thu vào bình thủy tinh dung tích

100 - 1000ml đã khử trùng, cần chú ý không để mẫu nước bị nhiễm bởi tay hay bởi dây sử dụng khi thu mầu Để thu các mẫu nước ở độ sâu nhất

định người ta dùng bình thu mẫu chuyên dụng Trường hợp này người ta thả bình thu mẫu xuống độ sâu cần thiết, dùng dây mở nắp bình rồi thu mẫu Trường hợp nước ngầm, dùng bơm để thu mẫu Đối với hầu hết các mẫu nước, cần chừa một khoảng không khí đủ lớn giữa mặt nước và nắp bình Do chủng loại và mật độ vi sinh vật trong nước thay đổi rất nhiều theo bề mặt, độ sâu và chất lượng nước nên cần đánh giá chất lượng Khi thu mẫu nước cần chọn nhiều vị trí thu mẫu khác nhau | Trường hợp nước mặt, vi sinh vật trong nước mặt có dòng chảy như nước sông có mật độ thay đổi rất nhiều theo lưu tốc, độ sâu Do vậy để

có được mẫu có tính đại diện cần chọn nơi nước chảy (giữa dòng) và độ sâu 20 - 30cm đế thu mẫu Thông thường cần thu mẫu tại nhiều điểm từ thượng lún xuống cửa sông Trường hợp nước ao hồ, để có số liệu về sự phân bộ bề mặt của vi sinh vật, tùy kích thước của ao hồ, cần chọn từ 5 đến 10 điểm cách nhau những khoảng thích hợp Để có số liệu phân bộ theo chiều sâu, thông thường người ta lấy một mẫu ở đáy ao hồ và sau

đó thu các | mẫu theo một khoảng cách nhất định từ điểm đáy Trường hợp nước ngầm, cần chọn | 5 đến 10 địa điểm trở lên Trường hợp này cần lưu ý đến các yếu tố như độ sâu, thành phần đất, khoảng cách từ

nguồn ô nhiễm.Trên mỗi bình chứa mẫu cần ghi chú rõ ràng, đầy đủ các thông tin cần thiết liên quan đến mẫu (địa điểm, thời gian, mục đích, người thu )

Mẫu nên được phân tích trong vòng 6 giờ sau khi thu mẫu Do việc phân tích thường được tiến hành ở tại phòng thí nghiệm nên cần vận chuyển mẫu từ nơi thu mẫu về phòng thí nghiệm Trường hợp này cán báo quán mẫu ở nhiệt độ dưới 10°c bằng nước đá hoặc đá khô trong khi vận chuyển Trường hợp không thực hiện được việc phân tích ngay thì cần bao quán mẫu ở 0 - 5°c trong tủ lạnh và liên phân tích trong vòng từ 6-12 giờ

2 Chuẩn bị mẫu

Trong đa số các trường hợp, mẫu nước không cần được xử lý gì đặc biệt trước khi phân tích vi sinh vật Khi cần thiết, mẫu cần được pha loãng thập phân để được các độ pha loãng cần thiết bằng nước cất, nước muối sinh lý hay môi trường lỏng vô trùng

PHÂN TÍCH CHỈ TIÊU TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ

1 Định nghĩa và nguyên tắc

Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuân lạc trong điều kiện có sự hiện diện của ôxi phân tử

Tổng số vi khuẩn hiếu khí được xác định bằng phương pháp đêm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem 1khuẩn lạc là sinh khôi phát triển từ 1 tế bào hiện diện trong mẫu và được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming unit, CFU) trong một đơn vị khối lượng thực phẩm Quy trình phân tích bao gồm các bước:

- Cân mẫu,

- Đồng nhất mẫu,

- Pha loãng thành dãy các nồng độ thập phân,

- Chuyên và phân phối đều một thể tích xác định mẫu lên bề mặt môi trường rắn trong đĩa petri bằng phương pháp hộp trải (spread plate) hay hộp đổ (pour plate)

- Ủ ở điều kiện nhiệt độ và thời gian quy định

Chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí được dùng để đánh giá chất lượng của mẫu về vi sinh vật, nguy cơ hư hỏng, thời hạn bảo quản của sản phẩm, mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản sản phẩm

2 Môi trường và hóa chất

- Môi trường sử dụng là Plate Count Agar (PCA) có pH 7,0 + 0,2 Ngoài môi trường trên, còn có thể sử dụng các môi trường khác như Tryptose Glucose Agar, Nutrient Agar

Môi trường được phân phối vào trong các bình thủy tinh hay trong các ống nghiệm và hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút

- Dung dịch nước muối pepton SPW (Saline Pepton Water) dùng để pha loãng chứa 8,5g NaCl và 1g pepton trong 1000ml nước Dung dịch này được hấp khử trùng và được phân phối thành các thể tích chính xác 9ml vào trong các ống nghiệm vô trùng

3 Quy trình phân tích

3.1 Chuẩn bị mẫu trước khi phân tích

- Đồng nhất mẫu: Đối với mẫu dạng rắn, dùng các dụng cụ đã được khử trùng cân chính xác 10g (hay 25g) mẫu vào trong bao PE Tất cả thao tác tiếp theo cần phải tiến hành trong điều kiện vô trùng Thêm vào lượng mẫu này 90ml (hay 225ml) dung dịch pha loãng SPW Thực hiện đồng

nhất mẫu bằng máy dập mẫu (stomacher) Thời gian dập mẫu phụ thuộc vào tính chất cơ lý của mẫu, nhưng không quá 2,5 phút

- Dịch mẫu đồng nhất được pha loãng vào ống nghiệm chứa 9mL dung dịch pha loãng đến độ pha loãng cần thiết Trộn mẫu trong ống nghiệm cho đồng nhất bằng máy rung (vortex) hoặc dùng pipet hút đảo dịch mẫu lên xuống 5 - 10 lần

Lưu ý: nếu pipet hoặc đầu tip pipetman nguy cơ bị nhiễm trong quá trình thao tác (chạm tay, chạm mặt ngoài ống nghiệm, mặt ngoài bình

chứa ), cần phải thay pipet hoặc đầu tip vô trùng khác

3.2 Cấy mẫu

Chọn 2 hay 3 độ pha loãng liên tiếp dự kiến chứa 25 - 250 tế bào vi sinh vật trong ImL để cây lên đĩa petri Dùng pipet vô trùng hoặc pipet man chuyến 1mL dịch mẫu pha loãng đã chọn vào giữa đĩa petri vô trùng Tương ứng với mỗi độ pha loãng cấy ít nhất 2 - 3 đĩa (tức là thực hiện

2-3 lần lặp lại) Sau khi cấy, đổ vào mỗi đĩa 10+ 15mL môi trường PCA đã được đun chảy và ổn định ở 45°C Trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi

chiều 3 - 5 lần ngay sau khi đổ môi trường Đặt các đĩa trên mặt phẳng ngang cho thạch đông đặc Lật ngược và ủ các đĩa trong tủ ấm ở nhiệt độ 30+1°C trong 72 giờ

3.3 Tính kết quả

Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ Chọn các đĩa

có số đếm từ 25 + 250 để tính kết quả Mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí trong lg hay 1mL mẫu được tính như sau:

Trong đó:

A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc vi khuẩn trong lg hay 1mL mẫu

N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn

n: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i

V: thể tích dịch mẫu (mL) cấy vào trong mỗi đĩa

f: độ pha loãng tương ứng

3.4 Kết quả

Đếm tất cả khuẩn lạc xuất hiện ở các đĩa sau khi ủ

Nồng độ

pha loãng

 Kết luận: Không có đĩa nào đếm được vì

- Trong quá trình cấy bị nhiễm vi sinh vật lạ không đảm bảo quy trình

- Mẫu vật có thể có nhiều vi sinh vật hiếu khí không đảm bảo vệ sinh an toàn cho phép

- Thao tác cấy sai sót dẫn đến mẫu vật bị hư

Hình ảnh kết quả thí nghiệm

ĐỊNH LƯỢNG COLIFOMRS BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM

KHUẨN LẠC

1 Nguyên tắc

Mẫu đã được đồng nhất hóa được cấy một lượng nhất định lên môi

trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose Đếm số khuẩn lạc lên men lactose và sinh acid sau khi ủ ở 37+1°C trong 24 - 48 giờ

Ngoài lactose, môi trường chọn lọc cho Coliforms còn chứa muối mật

ức chế vi khuẩn gram dương và chất chỉ thị pH như neutral red, crystal violet Trên môi trường này khuấn lạc Coliforms có màu đỏ đến màu đỏ

đậm, đường kính > 0,5 mm, xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa của muối mật

Mật độ Coliforms được tính dựa trên số lượng khuẩn lạc điển hình đêm được, tỉ lệ khẳng định và độ pha loãng mẫu trước khi cấy vào đĩa

2 Môi trường và hoá chất

- Môi trường Tryptone Soya Agar (TSA) được chuẩn bị trong các bình hay chai thủy tinh, hấp khử trùng và bảo quản ở 4 - 8°C Trước khi sử dụng, môi trường được đun chảy và làm nguội ở 45°c trong bế điều nhiệt

- Môi trường canh Brilliant Green Bile Lactose Broth (BGBL) được phân phối 10ml vào mỗi ống nghiệm vô trùng chứa một ống Durham úp ngược Hấp khử trùng Sau khi hấp kiểm tra các ông để đảm bảo không

có bọt khí trong ống Durham

3 Dụng cụ

- 4 đĩa petri

- 4 ống nghiệm chứa 9ml nước cất  Hấp khử trùng tất cả

- 5 ống nghiệm + 5 ống durham

4 Quy trình phân tích

- Mẫu phân tích: Sữa

- Đồng nhất mẫu và pha loang tương tự như phần định lượng vi khuẩn hiếu khí sao cho chứa <100 tế bào coliforms trong 1ml dung dịch pha loãng

- Độ pha loãng từ 10-1 đến 10-4

- Chuyển 1ml dung dịch pha loãng mẫu đã chọn vào đĩa petri Bổ sung vào mỗi đĩa đã cấy khoảng 5ml môi trường TSA đã được đun chảy và ổn định trong bể điều nhiệt 45 độ Thử nghiệm lặp lại ở mỗi nồng độ

* Thử nghiệm khẳng định coliforms

Trong trường hợp mẫu có chứa các nguồn carbon khác không phải

lactose, để tránh các trường hợp vi sinh vật sử dụng các nguồn carbon trong mẫu để lên men và tạo khuẩn lạc có hình dạng tương tự Coliforms cần thực hiện thêm bước khẳng định như sau : Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ, dùng que cấy vòng cây chuyển sang các ông nghiệm chứa môi

trường BGBL (trường hợp khẳng định Coliforms tổng số) hoặc môi trường EC (trường hợp khẳng định Coliforms phân), ủ các ông BGBL ở 37+1°c và các ống EC ở 44°C trong 24 - 48 giờ Kết quả khẳng định là (+) khi vi khuẩn tăng trưởng làm đục môi trường và sinh hơi trong ống Durham Tính tỉ lệ khẳng định là tỉ số giữa số khuẩn lạc cho kết quả (+) với số khuẩn lạc được dùng trong thử nghiệm khẳng định

4 Cách tính kết quả

Dựa vào số khuẩn lạc đếm được và tỉ lệ khẳng định, tính mật độ của Coliforms theo công thức sau:

N: tổng số khuẩn lạc đếm được

n: số đĩa có số' khuẩn lạc được chọn tại mỗi độ pha loãng

v: dung tích mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩa

f: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đệm

R: tỉ lệ khẳng định

5 Kết quả và khẳng định Đĩa có nồng độ pha loãng 10 -3

Tổng 424 khuẩn lạc

Vàng to: 35 khuẩn lạc

Vàng nhỏ 389 khuẩn lạc

Đĩa có nồng độ pha loãng 10 -4

Tổng 208 khuẩn lạc

Vàng to 23

Vàng nhỏ 185

*Ống durham: Tất cả các ống đều xuất hiện bọt khí

Kết luận: 5 trên 5 ống có thể khẳng định có coliforms  R= 5/5=1 Tính toán: A = 1.1⋅10208+ 424−3 +1.1⋅10−4 = 574545.4545 ( CFU/ml )