Thẩm định phương pháp phân tích hplc định lượng cao bạch quả

- Dung dịch chuẩn Quercetin:+ Cân 27,40 mg Quercetin chuẩn hoà tan vừa đủ 25ml bằng methanol.. - Dung dịch chuẩn thêm Quercetin ASQ: - Dung dịch chuẩn thêm ASQ 1: Cân 83,4 mg quercetin n

Trang 1

1 Mục đích

- Phơng pháp xác định hàm lợng flavonoid toàn phần trong tiêu chuẩn chất lợng thành phẩm viên nén bao phim éloge ginkgo đợc xây dựng theo USP30 chuyên luận viên nén, để thẩm định phơng pháp trên Chúng tôi tiến hành xác định: Độ đúng, độ lặp lại, tính tơng thích của hệ thống, tính đặc hiệu của phơng pháp

2 Đối tợng và phơng pháp

2.1 Đối tợng:

- Chuẩn Quercetin: ĐCVKN TPHCM, hàm lợng 91,34% (nguyên trạng), SKS: QT104050609, N-ớc: 8,51%

- Chuẩn Kaempferol làm việc, hàm lợng 95,9% (nguyên trạng), SKS: 110861 - 200808

- Chuẩn Isorhamnetin làm việc, hàm lợng 100,0% (nguyên trạng), SKS: 110860 - 200806

- Viên nén bao phim éloge ginkgo Số lô: 3001201, HD: 19/03/2014

- Viên nén bao phim éloge ginkgo Placebo có công thức tá dợc nh sau: (công thức tá dợc cho 1 viên nén 40mg):

2.2.Phơng pháp: Định lợng bằng phơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đã mô tả trong tiêu chuẩn

cơ sở viên nén bao phim éloge ginkgo

- Cột : C18, 2504,6 mn; 20m

- Detector : 270 nm

- Tốc độ dòng : 1,5 ml/phút

- Thể tích tiêm : 20l

- Pha động : Dung dịch acid phosphoric 0,5% : Methanol (50:50)

3 Tiến hành và kết quả

3.1 Độ đúng

- Nguyên lý: Độ đúng đợc xác định theo phơng pháp thêm, bằng cách thêm đồng thời những

l-ợng chất chuẩn Quercetin, Kaempferol, Isorhamnetin đã biết vào mẫu viên nén bao phim éloge ginkgo placepo tại 80% ( khoảng 0,16mg/ml, 0,16mg/ml, 0,04mg/ml), 100% (khoảng khoảng 0,2mg/ml, 0,2mg/ml, 0,05mg/ml) và 120% ( khoảng khoảng 0,24mg/ml, 0,24mg/ml, 0,06mg/ml) nồng độ định lợng bằng phơng pháp đã nêu trên Độ đúng là tỉ lệ (%) giữa lợng tìm thấy và lợng thêm vào

3.1.1 Chuẩn bị các dung dịch:

Trang 2

- Dung dịch chuẩn Quercetin:

+ Cân 27,40 mg Quercetin chuẩn hoà tan vừa đủ 25ml bằng methanol

- Dung dịch chuẩn thêm Quercetin (ASQ):

- Dung dịch chuẩn thêm ASQ 1: Cân 83,4 mg quercetin n chuẩn hoà tan vừa đủ 50ml bằng methanol

- Dung dịch chuẩn thêm ASQ 2: Cân 110,5 mg quercetin chuẩn hoà tan vừa đủ 50ml bằng methanol

- Dung dịch chuẩn thêm ASQ 3: Cân 144,5 mg quercetin chuẩn hoà tan vừa đủ 50ml bằng methnol

- Dung dịch chuẩn Kaempferol:

+ Cân 16,50 mg kaempferol chuẩn hoà tan vừa đủ 25ml bằng methanol

- Dung dịch chuẩn thêm Kaempferol (ASK):

- Dung dịch chuẩn thêm ASK 1: Cân 83,4 mg kaempferol chuẩn hoà tan vừa đủ 50ml bằng methanol

- Dung dịch chuẩn Isorhamnetin:

+ Cân 15,70 mg Isorhamnetin chuẩn hoà tan vừa đủ 100ml bằng methanol

- Dung dịch chuẩn thêm Isorhamnetin (ASI):

- Dung dịch chuẩn thêm ASI 1: Cân 40,90 mg Isorhamnetin chuẩn hoà tan vừa đủ 100ml bằng methanol

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp: Hút 2,0 ml chuẩn quercetin, hút 3,0 ml kaempferol, hút 3,0 ml

isorhamnetin vào bình định mức 10ml thêm methanol đến vạch, lắc đều

- Dung dịch mẫu éloge ginkgo Placebo: Cân 1 lợng hỗn hợp tá dợc khoảng 500,0mg vào

bình định mức 100ml

Dung dịch Khối lợng hỗn hợp tá dợc (mg)

Thêm 40ml methanol, lắc siêu âm 3 phút, thêm 40ml acid hydrocloric 1,5N, lắc siêu âm 10 phút, để nguội thêm methanol vừa đủ 100ml, lắc đều

Trang 3

- Dung dịch thử 01: Lần lợt hút 10,0 ml chuẩn ASQ1, ASK1, ASI1, vào bình định mức 100ml, thêm dung dịch éloge ginkgo Placebo tơng ứng tới vạch, lắc đều

- Dung dịch trắng: Hút 10,0ml dung dịch éloge ginkgo Placebo, pha loãng thành 100,0ml

với methanol

- Lọc các dung dịch trên qua màng lọc 0,45m Lần lợt tiêm các dung dịch: chuẩn hỗn hợp, trắng và thử 01, thử 02, thử 03 vào hệ thống sắc ký lỏng, ghi sắc đồ

3.1.2 Kết quả:

- Quercetin

Diện tích peak Lợng thêm vào

100ml (B, mg)

Lợng tìm thấy trong 100ml (A, mg)

Lợng tìm thấy

X (%)

Chuẩn 5417249 - -

-Thử 01.01 4090810

15,24

Thử 02.01 5396833

20,19

Thử 03.01 7084151

26,39

Khoảng tin cậy với độ chính xác 95% 98,8 – 99,2

o Công thức:

+ Lợng quercetin tìm thấy trong 100ml dung dịch: Amg   22510010

C

C C

T

S

HL m

S

+ Phần trăm thu hồi: X %   100

B A

- Kaempferol.

100ml (B, mg)

Lợng tìm thấy X (%)

Trang 4

Chuẩn 5367828 - -

-Thử 01.01 4480510

16,00

Thử 02.01 5355434

19,00

Thử 03.01 6308520

22,67

Khoảng tin cậy với độ chính xác 95% 98,8 – 99,8 + Lợng kaempferol tìm thấy trong 100ml dung dịch: Amg   32510010

C

C C

T

S

HL m

S

B A

- Isorhamnetin.

100ml (B, mg)

Lợng tìm thấy

X (%)

Chuẩn 601062 - -

-Thử 01.01 519320

4,09

Thử 02.01 602252

4,72

Thử 03.01 706414

5,59

Khoảng tin cậy với độ chính xác 95% 98,9 – 99,9

+ Lợng isorhamnetin tìm thấy trong 100ml dung dịch:

mg

A   310010010

C

C C

T

S

HL m

S

B A

Trang 5

3.2 Độ lặp lại

- Nguyên lý: Định lợng flavonoid toàn trong viên nén bao phim eloge ginkgo 6 lần, với

nồng độ nh đã mô tả trong TCCS, tính độ chính xác của phơng pháp thông qua giá trị trung bình và độ lệch chuẩn tơng đối

- Thực hiện và kết quả:

+ Cân 20 viên nén, xác định khối lợng trung bình Nghiền thành bột min

+ mtb= 270,5mg

Chuẩn hỗn hợp - Xem phần độ đúng mục 3.1.1

Thử 01 311,2 Vào bình định mức 50ml , thêm 20ml MeOH, lắc siêu âm 3

phút, thêm 20ml HCl 1,5N lắc siêu âm 10 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, thêm methanol đến vach, lắc đều Lọc qua giấy lọc thờng, lọc qua màng lọc 0,45m vào vial, đun trong cách thủy 1h, làm nguội trong nớc đá, để nguội đến nhiệt độ phòng Tiêm sắc ký, tính tổng diện tích pic của 3 flavonoid chính (quercetin, kaempferol, và isorhamnetin) Hàm lợng flavonoid toànphần tính theo quercetin trong mỗi viên

- Kết quả

Tổng diện tích peak Hàm lợng X (mg/Viên)

Khoảng tin cậy với xác suất 95% 10,78 - 10,94

- Công thức tính: Xmg/Vien  25 102,51 2 50





T C

tb C C

T

xm S

m HL m

S

3.3 Tính đặc hiệu

- Trên sắc ký đồ các dung dịch: Trắng, chuẩn hỗn hợp và dung dịch thử éloge ginkgo mục

độ đúng 3.1 cho thấy:

+ Trên sắc đồ của dung dịch trắng không xuất hiện các peak tại các thời diểm rửa giải của quercetin, kaempferol, isorhamnetin, cũng nh các thời điểm khác

Trang 6

+ Peak chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử có thời gian lu và phổ tử ngoại trùng với peak chính trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn hỗn hợp ( quercetin, kaempferol, isorhamnetin)

+ Nh vậy công thức bào chế cũng nh các điều kiện phân tích của Công ty LD dợc phẩm Eloge France Việt Nam không ảnh hởng tới sự rửa giải cũng nh thứ tự rửa giải của các thành phần chính (Flavonoid) trong viên nén bao phim Eloge Ginko

3.4 Tính thích hợp hệ thống

- Tiêm 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp phần độ đúng mục 3.1 vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu

nâng cao, ghi lại sắc đồ

- Kết quả:

Diện tích peak (quercetin )

Thời gian lu quercetin (phút)

Diện tích peak (kaempfero l)

Thời gian lu kaempferol (phút)

Diện tích peak (isorhamnetin)

Thời gian lu isorhamnetin (phút)

- Kết luận:

+ Phơng pháp xác định hàm lợng flavonoid toàn phần trong tiêu chuẩn chất lợng thành phẩm viên nén bao phim éloge ginkgo có tính đặc hiệu cao

+ Phơng pháp có độ chính xác cao, với hàm lợng trung bình 10,87mg/viên và độ lệch

chuẩn tơng đối 0,67%

+ Độ đúng của phơng pháp là 99,02% và độ lệch chuẩn tơng đối 0,28% của quercetin, 99,27%; 0,63% của kaempferol, 99,37%; 0,65% của isorhamnetin

+ Tính thích hợp hệ thống đạt yêu cầu so với USP30

TP Kiểm tra chất lợng

Ds Lê Văn Tú

Định dạng
Số trang	6
Dung lượng	200 KB