Bài giảng HÓA SINH ENZYME VA VITAMIN 1 enzyme

Trung tâm hoạt động của enzyme hexokinasetrúc bậc II là sự xoắn, gấp lại ở những phần nhất định tạo thành cấu trúc bậc II.Chuỗi polypeptide có cấu trúc bậc II cuộn lại trong không gian t

Chương 3 ENZYME VÀ VITAMIN

1.2 Bản chất và thành phần cấu tạo của enzyme

Bản chất hoá học của enzyme là protein, do đó enzyme cũng có đầy đủ các đặc tính của protein.

- Phần lớn enzyme đều có dạng hình hạt như các protein hình hạt Các enzymecũng có khối lượng phân tử lớn, enzyme có khối lượng phân tử bé nhất làribonuclease (12.700 dalton)

- Các enzyme có thể hoà tan trong nước, trong dung dịch muối loãng Khi hoàtan trong nước, dung dịch enzyme có tính chất của keo ưa nước

- Enzyme trong dung dịch dễ dàng bị kết tủa dưới tác dụng của các yếu tố vật

lý và hoá học Dưới tác dụng của các yếu tố gây biến tính protein, phần lớn cácenzyme bị mất hoạt tính xúc tác

- Enzyme được cấu tạo từ các L -  - axit amin kết hợp với nhau qua liên kếtpeptide Khi enzyme bị thuỷ phân hoàn toàn tạo thành L -  - axit amin, trong nhiềutrường hợp ngoài axit amin còn nhận được các chất khác

Hầu hết các enzyme đều có bản chất protein Tuy nhiên, cũng có một sốenzyme lại có bản chất khác Ví dụ: Ribozyme là RNA có hoạt tính enzyme, có khảnăng tự cắt chọn lọc các đoạn không mang thông tin trên mRNA (intron) và nốinhững đoạn mang thông tin (exon) để hình thành mRNA thành thục Điều nàychứng tỏ rằng RNA có hoạt tính enzyme, nhưng không giống enzyme protein, bởi vìribozyme tự nó cũng là cơ chất Ribozyme tự cắt và tự nối những đoạn exon lại vớinhau Những đoạn intron tự hình thành những vòng (loop), các vòng này hình thànhnhờ những liên kết hydro giữa các cặp base A=U, G=C Giống như enzyme, cấuhình của ribozyme quy định hoạt tính của chúng Sự cuộn lại của Ribozyme sẽ bẻgẫy chuỗi RNA ở hai điểm và nối chúng lại với nhau để tạo mRNA với các chuỗiexon lại với nhau Như vậy ngoài hoạt tính ribonuclease, ribozyme còn có hoạt tínhnối hai đầu chuỗi lại với nhau, đây là hoạt tính RNA-polymerase Khám phá này có

ý nghĩa rất lớn trong nghiên cứu enzyme và khoa học tiến hoá

28

Exon1 Intron Exon 2 Intron Exon 3

DNAPromoter

Phiên mã

mRNA Cuộn intron Cuộn intron

Exon 1 Exon 2 Exon 3

Splicing (cắt nối)

Exon1 Exon2 Exon3

TỔNG HỢP PROTEIN

Tuỳ theo thành phần cấu tạo enzyme, người ta chia enzyme làm hai nhĩm:

Enzyme một thành phần là enzyme mà trong thành phần cấu tạo chỉ là protein

đơn giản Đây là các enzyme thuộc nhĩm enzyme thuỷ phân (hydrolase) Tuy nhiên,các enzyme trong nhĩm này thường cĩ các ion kim loại như Cu2+, Fe2+, Zn2+, … làmchất đồng yếu tố (cofacter)

Enzyme hai thành phần là protein phức tạp, phần protein được gọi là

apoenzyme, thành phần thứ hai khơng phải là protein gọi là nhĩm ngoại (prosthetic)hay coenzyme Coenzyme là các phức hữu cơ, thơng thường là dẫn xuất của cácvitamin Khi hai thành phần kết hợp với nhau thì được gọi là enzyme hồn chỉnh(holoenzyme) Thành phần apoenzyme cĩ vai trị quyết định tính đặc hiệu củaenzyme, làm tăng hoạt tính xúc tác Coenzyme trực tiếp tham gia xúc tác và tăng độbền của apoenzyme với các tác nhân gây biến tính

1.3 Cấu trúc của enzyme

Enzyme là một phân tử protein, do đĩ nĩ cũng cĩ 4 bậc cấu trúc Cấu trúc bậc

nhất là số lượng và trình tự sắp xếp của các axit amin trong chuỗi polypeptide Cấu

Hình 3.1 Trung tâm hoạt động của enzyme hexokinase

trúc bậc II là sự xoắn, gấp lại ở những phần nhất định tạo thành cấu trúc bậc II.Chuỗi polypeptide có cấu trúc bậc II cuộn lại trong không gian thành một cấu trúcgọn, chặt hơn gọi là cấu trúc bậc III Những enzyme có khối lượng phân tử lớn(>100.000) thường cấu tạo từ nhiều chuỗi polypeptide, các chuỗi này có cấu trúcbậc III, kết hợp lại với nhau hình thành nên cấu trúc bậc IV Trong tế bào còn hìnhthành những hệ thống nhiều enzyme (multienzyme) bao gồm những enzyme xúc táccho một dây truyền phản ứng Ví dụ: hệ thống enzyme xúc tác cho quá trình đườngphân, chu trình Krebs, β-oxy hoá, …

Trung tâm hoạt động (TTHĐ) của enzyme: Hoạt động xúc tác của enzyme liên

quan đến một phần xác định trong phân tử enzyme gọi là trung tâm hoạt động (activesite) TTHĐ là phần của phân tử enzyme trực tiếp kết hợp với cơ chất, tạo thành vàchuyển hoá phức chất trung gian giữa enzyme và cơ chất để cho ra sản phẩm

TTHĐ có những đặc điểm cơ bản sau:

- TTHĐ bao gồm nhiều nhóm chức năng của axit amin, coenzyme, ion kimloại, phân tử nước liên kết Các nhóm chức năng của axit amin thường gặp trongTTHĐ là –SH của Cysteine, -NH2 của lysine, -COOH của aspartic acid, glutamicacid, nhóm –OH của Serine, threonine, vòng imidazol của histidine, … Trong TTHĐcủa enzyme thường có từ 3-7 nhóm chức năng

- Các nhóm chức năng của trung tâm hoạt động có thể ở xa nhau về thứ tựtrong chuỗi polypeptide nhưng trong cấu trúc không gian thường gần nhau, đảm bảocho chúng có thể tương tác với nhau khi tham gia xúc tác

- TTHĐ của enzyme chiếm một tỷ lệ thể tích tương đối bé so với toàn bộ phân

tử enzyme

Các nhóm chức năng của trung tâm hoạt động có vai trò như sau:

- Nhóm xúc tác: là nhóm trực tiếp tham gia phản ứng kết hợp với cơ chất bịchuyển hoá

- Nhóm tiếp xúc: Kết hợp với phần cơ chất không bị chuyển hoá, có tác dụng

cố định cơ chất

30

acid bao quanh thuộc trung tâm hoạt động của

- Nhĩm bổ trợ: là nhĩm tương tác với nhĩm tiếp xúc và xúc tác, cố dịnh cácnhĩm này ở vị trí nhất định để thực hiện chức năng xúc tác

1.4 Enzyme điều hồ (allosteric enzyme)

Các quá trình trao đổi chất trong cơ thể sống thường diễn ra những chu trình(cycle), đường hướng (path way) Các chu trình hay đường hướng trao đổi chất baogồm một chuỗi các phản ứng, diễn ra theo một trình tự nhất định Để điều hồ quátrình trao đổi chất, thơng thường mỗi chu trình, đường hướng cĩ một enzyme điềuhồ xúc tác, gọi là enzyme điều hồ Enzyme điều hồ cĩ vai trị điều hồ hoạt độngcủa cả chu trình trao đổi chất Cĩ nhiều kiểu enzyme điều hồ, nhưng phổ biến nhất

là enzyme dị lập thể

Trong enzyme điều hồ dị lập thể (allosteric enzyme), ngồi trung tâm hoạtđộng cịn cĩ một trung tâm khác là trung tâm dị lập thể Trung tâm dị lập thể khigắn với chất điều hồ đặc hiệu sẽ làm thay đổi cấu hình khơng gian của enzyme Sựthay đổi này sẽ làm giảm hoạt tính xúc tác của enzyme Các chất điều hồ thường làsản phẩm cuối cùng của chu trình, hoặc chuỗi phản ứng Khi sản phẩm cuối cùng cĩ

xu hướng dư thừa sẽ trở lại kết hợp vào trung tâm dị khơng gian để làm giảm hoạttính enzyme này và kết quả là tồn bộ chu trình, chuỗi phản ứng sẽ bị giảm Vì vậy,

cơ chế điều hồ này cịn gọi là điều hồ ức chế ngược (feedback inhibition)

Ví dụ: Điều hồ tổng hợp isoleucine từ threonine

Thơng thường thì enzyme điều hồ là enzyme xúc tác cho phản ứng đầu chuỗi

- E: enzyme

- S: Cơ chất

- P: Sản phẩm

- ES: Phức chất enzyme-cơ chất

- ES* Phức chất enzyme-cơ chất hoạt hoá

E + S ES ES* EP E + P

1.5 Cơ chế hoạt động của enzyme

Vai trị xúc tác của enzyme là làm giảm năng lượng hoạt hố của phản ứng, do

đĩ phản ứng do enzyme xúc tác cĩ thể xảy ra ở nhiệt độ, pH sinh lý của cơ thể Khi

cơ chất nằm trong trung tâm hoạt động, tương tác với các nhĩm chức năng củatrung tâm hoạt động, với coenzyme, và sự thay đổi cấu hình khơng gian của trungtâm hoạt động, cĩ tác dụng kéo căng, làm giảm năng lượng tự do của liên kết trong

cơ chất cần chuyển hố Ngồi ra để làm giảm năng lượng hoạt hố, enzyme sẽ hìnhthành các phản ứng trung gian, các phản ứng này địi hỏi năng lượng tự do thấp hơn

do đĩ phản ứng dễ dàng xảy ra hơn

Cơ chế xúc tác của enzyme cĩ thể chia làm bốn giai đoạn:

- Giai đoạn 1: Cơ chất sẽ kết hợp vào TTHĐ của enzyme, tạo thành phức chất

enzyme - cơ chất

- Giai đoạn 2: Khi gắn vào TTHĐ, cơ chất sẽ hình thành các liên kết với các

nhĩm chức năng, các liên kết này sẽ kéo căng liên kết cần chuyển hố của cơ chất,khi đĩ cơ chất trở thành dạng hoạt hố (S*)

- Giai đoạn 3: Khi trở thành dạng hoạt hố, cùng với sự biến đổi cấu trúc

khơng gian của phần apoenzyme làm đứt liên kết cần chuyển hố của cơ chất để tạothành sản phẩm (P) Với enzyme hai thành phần thì thành phần coenzyme cĩ vai trịchủ đạo trong chuyển hố S* thành sản phẩm P

- Giai đoạn 4: Sản phẩm (P) sẽ giải phĩng khỏi TTHĐ của enzyme Enzyme

trở thành trạng thái tự do và tiếp tục gắn với một cơ chất mới để chuyển hố

32

Hình 3.3 Cơ chế xúc tác của

enzyme

- Thuyết ổ khoá và chìa khoá của Fisher (1894): Theo Fisher thì giữa TTHĐ

của enzyme và cơ chất có cấu trúc tương đồng như ổ khoá và chìa khoá Nghĩa làTTHĐ của enzyme có sự tương đồng từ trước khi cơ chất gắn vào, cấu trúc này làcứng nhắc, bất biến và một ổ khoá (enzyme) chỉ tương ứng với một chìa khoá (cơchất) Thuyết này giải thích tính chất đặc hiệu của enzyme

- Thuyết tương ứng cảm ứng của Koshland (1958): Koshland cho rằng

enzyme cũng như trung tâm hoạt động của enzyme có cấu hình biến động, mềmdẻo, nghĩa là cấu hình của enzyme và trung tâm hoạt động có thể thay đổi khi tiếpxúc với enzyme Như vậy sự tương đồng giữa trung tâm hoạt động của enzyme và

cơ chất chỉ xảy ra khi cơ chất kết hợp với enzyme

1.6 Tính chất của enzyme

1.6.1 Hoạt tính xúc tác của enzyme

Hầu hết enzyme là protein có hoạt tính xúc tác Các enzyme xúc tác cho hầuhết các phản ứng hoá học xảy ra trong cơ thể sống, đảm bảo cho các quá trìnhchuyển hoá các chất diễn ra một cách nhịp nhàng, cân đối và theo những chiềuhướng nhất định

Enzyme có đầy đủ những tính chất cơ bản của một chất xúc tác là:

- Làm giảm năng lượng hoạt hoá của phản ứng, nhưng so với các chất xúctác vô cơ thì enzyme có tác dụng lớn hơn nhiều Ví dụ: nếu dùng acid xúc tác chophản ứng thuỷ phân saccharose thì năng lượng hoạt hoá (Ea) là 25,6 Kcal/mol, cònnếu dùng enzyme invectase thì Ea là 8 Kcal/mol

- Enzyme không tham gia vào phản ứng, không thay đổi chiều phản ứng và

có tác dụng làm tăng tốc độ của phản ứng Tốc độ phản ứng invectase xúc tác nhanhgấp 2 x 1012 so với xúc tác acid

- Với một lượng nhỏ nhưng có tác dụng chuyển hoá một lượng lớn cơ chất

Ở enzyme hiệu quả xúc tác cao hơn nhiều so với chất xúc tác vô cơ Ví dụ: 1gamylase trong 1 giờ có thể chuyển hoá 100 kg tinh bột

Enzyme có tính chất đặc thù riêng so với các chất xúc tác vô cơ và hữu cơkhác là:

- A: là trạng thái khởi

A năng Ea

- Enzyme hoạt động trong cơ thể sống nên xúc tác trong điều kiện sinh lý của

cơ thể, như nhiệt độ, áp suất, pH mơi trường nhẹ nhàng

- Do cĩ bản chất là protein nên enzyme dễ biến tính dưới các tác nhân hố lý

như nhiệt độ, hố chất, tia bức xạ

- Enzyme cĩ tính đặc hiệu cao, enzyme chỉ xúc tác cho những cơ chất nhất

định, những kiểu phản ứng nhất định

Hình 3.6 Sơ đồ mơ tả tác dụng của chất xúc tác.

1.6.2 Tính đặc hiệu của enzyme

Mỗi enzyme chỉ cĩ khả năng xúc tác cho sự chuyển hố một hay một số chất

nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định Đặc tính tác dụng lựa chọn cao này gọi

là tính đặc hiệu hoặc là tính chuyên hố của enzyme

Đây là một trong những đặc tính cơ bản quan trọng nhất của enzyme, và là

một trong những sai khác chủ chủ yếu giữa enzym và các chất xúc tác khác

- Đặc hiệu kiểu phản ứng

Đặc hiệu này thể hiện ở chỗ mỗi enzyme chỉ cĩ thể xúc tác trong một kiểu

phản ứng chuyển hố một chất nhất định Ví dụ: phản ứng oxy hố khử, phản ứng

chuyển vị, phản ứng thuỷ phân…

- Đặc hiệu cơ chất

34

a Đặc hiệu tuyệt đối

Enzym chỉ tác dụng trên một chất nhất định và hầu như không tác dụng vớichất nào khác Ví dụ: Urease hầu như chỉ xúc tác thuỷ phân ure thành CO2 và NH3

Tuy nhiên, sau này người ta tìm thấy rằng urease cũng tác dụng được với cácchất khác có cấu trúc gần giống ure như hydroxyure nhưng với vận tốc bé hơn 120 lần

Các enzyme khác như arginase, glucooxydase cũng thuộc loại có tính đặchiệu tuyệt đối

Những enzyme đặc hiệu tuyệt đối được dùng để định lượng chính xác cơchất của nó

b Đặc hiệu nhóm

Đặc hiệu nhóm được chia thành hai loại sau:

+ Đặc hiệu nhóm tuyệt đối: Các enzyme chỉ tác dụng lên những chất có cùng

một kiểu cấu trúc phân tử, một kiểu liên kết và có những yêu cầu xác định đối vớinhóm nguyên tử ở gần liên kết chịu tác dụng

Ví dụ: carboxylpeptidase có khả năng phân cắt liên kết peptit gần nhóm

carboxyl tự do

+ Đặc hiệu nhóm tương đối: Mức đặc hiệu kém hơn nhóm trên ở chổ enzyme

không đòi hỏi nghiêm ngặt đối với nhóm nguyên tử ở gần liên kết bị phân giải

Ví dụ: Lipase có khả năng thuỷ phân được tất cả các mối liên kết este.Aminopeptidase có thể xúc tác thuỷ phân nhiều peptide

c Đặc hiệu quang học (đặc hiệu lập thể)

Phần lớn các enzyme đều có tính đặc hiệu lập thể, nghĩa là enzyme chỉ tácdụng với một trong hai dạng đồng phân quang học của các chất

Ví dụ: Fumarathydratase chỉ tác dụng đối với axit L – malic mà không tácdụng lên axit D – malic

Theo thuyết đa ái lực của Berman và Fruton (1941) trong cơ chế đặc hiệuquang học, cơ chất phải kết hợp với enzyme ít nhất ở ba điểm Điều đó cho phépgiải thích rõ vì sao enzyme chỉ tác dụng lên một dạng đồng phân quang học

Enzyme cũng thể hiện tính đặc hiệu lên một dạng đồng phân hình học cishoặc trans Ví dụ: Fumarathydratase chỉ tác dụng lên dạng trans của axit fumaric màkhông tác dụng lên dạng cis

H2N – CO – NH2 + H2O CO2 + NH3

Trong điều kiện thừa cơ chất, vận tốc

phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ

(Vmax) Đồ thị có dạng hyperbol như hình 3.8

Quan sát đồ thị, ta thấy V không tăng theo

đường thẳng khi nồng độ cơ chất tăng dần lên

Khi mà nồng độ cơ chất đủ lớn, tất cả các phân tử

enzyme có trong phản ứng đều tham gia tạo phức

ES, vận tốc phản ứng sẽ là cực đại Nếu tiếp tiếp

tục tăng nồng độ cơ chất lên thì V cũng sẽ không

thể tăng được nữa

Tuy nhiên sau thời gian phản ứng, nồng độ cơ chất sẽ giảm, nồng độ sảnphẩm tăng lên, pH và nhiệt độ của môi trường cũng có thể thay đổi, các yếu tố này

có thể ảnh hưởng đến V, làm V phản ứng giảm Do đó, khi nghiên cứu, người tathường xác định V trong thời gian mở đầu, khi các yếu tố kể trên chưa ảnh hưởngđáng kể đến V

S V V

m

 max

1

3 2

k

k k

- Nếu [S] << Km

Như vậy, ở [S] cơ chất thấp, V phụ thuộc tuyến tính vào [S]

- Nếu [S] >> Km V=Vmax, vận tốc phản ứng đạt vận tốc cực đại, khôngphụ thuộc vào [S] Như vậy [S] đã đủ lớn đến mức nào đó nếu tiếp tực tăng [S], Vcũng không tăng theo

- Nếu [S] = Km V = Vmax/2, vận tốc phản ứng bằng một nửa vận tốc cực

đại Như vậy, K m bằng nồng độ cơ chất mà ở đó vận tốc ban đầu của phản ứng bằng một nửa vận tốc cực đại Do đó, trị số của Km cũng được biểu diễn bằng đơn

vị đo nồng độ cơ chất: mol, gam hoặc phần trăm

Với những phản ứng enzyme có hai hay nhiều cơ chất thì các phương trìnhđộng học còn phức tạp hơn nhiều

1.7.3 Ảnh hương của pH

pH ảnh hưởng đến mức độ ion hoá của enzyme, của trung tâm hoạt động và cơchất, do đó ảnh hưởng đến sự kết hợp của enzyme và cơ chất Ngoài ra, pH còn ảnhhưởng đến mức độ hoà tan, kết tủa của enzyme do đó ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác.Mỗi một enzyme có một pH tối thích riêng Ví dụ: pepsin là enzyme thuỷ phânprotein của dạ dày có pH tối thích là 1.5 Trypsin là enzyme thuỷ phân protein tuyếntuỵ có pH tối thích kiềm là 7.7 Phần lớn enzyme khác có pH tối thích trung tính, vì

pH của các dịch sinh lý của cơ thể sinh vật nằm trong khoảng này

Hình 3.9 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme

 

m K

S V