Công nghệ sinh học dược

Kỹ thuật được sử dụng bao gồm đột biến và chọn lọc chủng vi sinh vật và phương pháp lên men, nuôi cấy để sinh sản phẩm tối ưu..  Công nghệ sinh học trắng White Biotechnology: Sử dụng x

Công nghệ sinh học dược

 Hiện đại: Nửa sau thế kỷ 20, dựa trên sinh học phân tử, sinh học tế bào, hóa sinh, …

Các giai đoạn phát triển

 Thế hệ một: sản xuất các sản phẩm thực

phẩm và nước uống lên men Kỹ thuật được sử dụng bao gồm lên men, nuôi trồng và nuôi cấy

mô thực vật

 Thế hệ hai: sử dụng nuôi cấy tế bào hay nuôi

cấy mô để sản xuất Sản phẩm của thế hệ này gồm kháng sinh, enzym, vitamin, acid amin Kỹ thuật được sử dụng bao gồm đột biến và chọn lọc chủng vi sinh vật và phương pháp lên men, nuôi cấy để sinh sản phẩm tối ưu

 Thế hệ ba chính là CNSH hiện đại Nó bao

gồm các kỹ thuật tái tổ hợp di truyền Ứng

dụng công nghiệp của nó bao gồm dược phẩm, nông nghiệp, hóa chất, y học Các sản phẩm

hiện nay đang là các protein trị liệu, chẩn

đoán, vaccin và cải tạo giống nông nghiệp

Sự mở rộng nguồn gen

 Công nghệ cổ điển tạo giống hay tính trạng mới dựa vào lai tạo, đột biến-sàng lọc:

 Công nghệ hiện đại thao tác trên gen:

Phạm vi ứng dụng

 Công nghệ sinh học xanh (Green

Biotechnology): CNSH áp dụng trong nông

nghiệp và xử lý môi trường

 Công nghệ sinh học trắng (White

Biotechnology): Sử dụng xúc tác sinh học và

công nghệ lên men để tạo ra các sản phẩm

công nghiệp như hóa chất hay enzym

 Công nghệ sinh học đỏ (Red Biotechnology):

CNSH ứng dụng trong y tế Chẩn đoán và điều trị bệnh Sản xuất dược phẩm

Đặc điểm của CNSHYD

 Đòi hỏi mức độ đầu tư cho nghiên cứu cao

 Qui mô vừa và nhỏ

 Tỷ lệ đầu tư nghiên cứu cao hơn sản xuất

 Có tính phối hợp cao

Sản phẩm của CNSHYD

 Chẩn đoán y học

 Sản xuất sinh phẩm chẩn đoán

 Kỹ thuật chẩn đoán mới

 Thuốc có nguồn gốc sinh vật

 Sản xuất thuốc bằng xúc tác sinh học

 Nuôi cấy mô, tế bào

Các vấn đề của CNSH trong nước

 Thiếu qui hoạch Qui hoạch sai

 Đầu tư thấp

 Yếu kém trong phát triển nguồn nhân lực

 Bất hợp lý trong quản trị nhân lực

 Thiếu sự liên kết giữa cơ sở nghiên cứu và sản

xuất

 Chưa có cơ sở hạ tầng công nghiệp thích hợp

Công nghệ lên men

Công nghệ lên men

 Định nghĩa: quá trình biến đổi do vi sinh vật

thực hiện trong điều kiện yếm khí hay hiếu khí

 Sản phẩm

 Sinh khối vi sinh vật

 Enzym – protein vi sinh vật

 Sản phẩm trao đổi chất: sơ cấp + thứ cấp

 Các biopolymer và biosurfactant

 Sản phẩm tái tổ hợp gen

Chủng vi sinh vật

1: Không gây bệnh cho người, động vật và môi

trường (GRAS - Generally Recognized As Safe)2: Có thể gây khó chịu cho người, động vật và

môi trường

3: Gây bệnh, truyền bệnh nhưng có cách chữa trị4: Gây bệnh, truyền bệnh rất nhanh nhưng chưa

có cách chữa trị

Yêu cầu của chủng công nghệ

1. Ổn định di truyền

2. Sản xuất hiệu quả sản phẩm mong muốn, và

con đường sinh tổng hợp sản phẩm đã được khảo sát kỹ

3. Không cần hay ít cần các bổ sung vitamin và

yếu tố tăng trưởng

4. Sử dụng được các cơ chất phổ biến và rẻ tiền

5. Có thể biến đổi di truyền được

6. An toàn, không gây bệnh, và không sản xuất

chất độc, trừ khi đó chính là sản phẩm

7. Dễ dàng thu hoạch từ quá trình lên men

8. Dễ dàng phá vỡ tế bào nếu sản phẩm là nội

bào

9. Ít tạo ra sản phẩm phụ để thuận tiện cho việc

tinh chế sản phẩm

Cải tạo chủng

 Tái tổ hợp tự nhiên

 Gây đột biến

 Đột biến ngẫu nhiên

 Đột biến nhân tạo - cảm ứng

 Sử dụng base tương đồng

 Thay đổi về hóa học của các base

 Chiếu xạ

 Gây đột biến bằng transposon

 Lai ghép tế bào trần và biến nạp gen

 Thao tác di truyền trên vi sinh vật

Chiến lược thao tác di truyền

 Sàng lọc gen từ tế bào nguồn

 Cô lập gen quan tâm: tạo dòng

 Thực hiện các biến đổi cần thiết

 Đưa gen trở lại tế bào đích

 Kiểm tra và sàng lọc chủng mới

Sàng lọc thể đột biến

 Kiểu hình quan sát được

 Khuyết dưỡng: cấy trên môi trường tối thiểu

Làm giàu thể khuyết dưỡng bằng penicillin

Bảo quản giống vi sinh vật

 Ngân hàng tế bào

 Cấy chuyền

 Làm khô

 Đông khô

 Đông lạnh

Môi trường lên men

 Cung cấp chất dinh dưỡng để tế bào phát triển

 Cung cấp các chất cần thiết để thu sản phẩm

Các loại môi trường lên men

 Môi trường tổng hợp: đó là môi trường có

thành phần hóa học chính xác về mặt định tính

và định lượng

 Môi trường phức hoặc bán tổng hợp: người

ta chỉ biết thành phần chính xác của một vài hợp chất (về mặt định lượng đối với các chất

cần quan tâm như yếu tố tăng trưởng, các

thành phần khác dựa theo kinh nghiệm)

 Môi trường công nghiệp: nguyên liệu phức

ban đầu chủ yếu bắt nguồn từ các sản phẩm nông nghiệp hoặc từ sữa vì chúng rẻ và tương đối dồi dào

Tiêu chí chọn thành phần môi

trường

 Giá thành và khả năng cung cấp.

 Dễ xử lý, vận chuyển, và bảo quản với chi phí thấp.

 Không gây khó khăn cho quá trình tiệt trùng và không

bị biến chất.

 Có các thuộc tính vật lý như độ nhớt, khả năng trộn

lẫn, … không ảnh hưởng đến công thức chung, việc vận hành nồi cũng như xứ lý sau lên men.

 Giúp đạt được nồng độ sản phẩm đích với tốc độ hình

thành và năng suất sản phẩm trên gam cơ chất cao.

 Nồng độ và loại tạp chất cũng như khả năng tạo sản

phẩm phụ thấp không làm ảnh hưởng đến quá trình tách sản phẩm chính sau đó

 Có tính an toàn tốt

Biện pháp kiểm soát bọt

 Thay đổi công thức môi trường

Các thiết bị nuôi cấy khác

Các phương thức lên men

 Kiểu vận hành

 Lên men gián đoạn

 Lên men bổ sung dinh dưỡng gián đoạn

 Lên men liên tục

Lên men bề mặt

7

6 6

1 2

3 4

5

1-Giá đựng khay ; 2-Khay ; 3-Cử a cho không khí sạch vào buồng ; 4-Cử a cho không khí

ra ; 5-Quạt ; 6-Chỗ phun nướ c ; 7-Bộ phận xả hơi nó ng để điều chỉ nh nhiệt độ củ a buồng.

Giám sát quá trình lên men

 Các cảm biến in situ

 Các bộ phân tích trực tuyến

Sản xuất Kháng sinh

Sản xuất penicillin

 Giống

 Penicillium notatum: do Fleming phân lập 1928,

Florey và Chain xác định cấu trúc 1940

 Penicillium chrysogenum: hiệu suất cao hơn, được

cải tiến thành chủng công nghiệp ngày nay

 Tốc độ tạo sản phẩm và hiệu suất cao

 Nuôi cấy chìm

 Sử dụng được cơ chất phức tạp và tiêu thụ tốt phenylacetat.

 Không tạo sắc tố gây khó khăn cho việc tinh chế.

 Có hệ sợi sinh trưởng rắn chắc.

Nhân giống

 Thu lượng giống tinh khiết cần thiết ở pha tăng trưởng lũy thừa (logarit) cho giai đoạn lên men

 Tiêu chuẩn

Môi trường lên men

 Nguồn nitơ: nước thải ngâm bắp

 Nguồn carbon: glucose, sucrose và các dịch

đường thô,

10–12% cho sản xuất penicillin

 Canxi, magiê, phosphat, và các kim loại vi lượng

 Tiền chất:

 Gián đoạn bổ sung dinh dưỡng, thu hoạch từng phần

Lên men

Đường

Penicillin

Hậu lên men

 Loại tế bào: lọc/ly tâm

 Chiết penicillin

và methyl isobutyl ketone

 Kết tinh

khiết

 Hiệu suất thu hồi: >90%

 Giá thành: ~10 USD/kg

Tóm tắt qui trình

Lên men cephalosporin C

 Lên men bổ sung dinh dưỡng gián đoạn A chrysogenum

 Galactose và sucrose: tăng trưởng chậm, năng suất cao hơn

 Thay dần đường bằng dầu đậu nành hay đậu phọng: giảm glucose, giúp hình thành bào tử đốt và cephalosporin C Dầu có tác dụng chống bọt

 Nguồn nitơ: bột đậu nành, hạt bông có bổ sung amonium sulfate Ammoniac có thể dùng để kiểm soát pH

 Nước ngâm bắp hay dùng làm nguồn nitơ và khoáng chất, vitamin

 DL-Methionine: cảm ứng hình thành bào tử đốt

 Thông khí:

 Cyclase và expandase cần oxi để xúc tác: nếu oxi hòa tan giảm

<20% penicillin N sẽ tích tụ và hiệu suất cephalosporin C sẽ giảm

 Thêm acetyl esterase (Rhodosporidium toruloides): tích tụ

deacetylcephalosporin C (bền)  tăng năng suất

Thu hồi cephalosporin C

 Dùng cột than hoạt / cột nhựa không ion

penicillin N, deacetylcephalosporin C, and

deacetoxycephalosporin C

 Tạo dẫn xuất tetrabromocarboxybenzoyl

cephalosporin C

cơ+chiết tách bằng dung môi

Sản xuất các beta-lactam khác

 Cephalosporin C, cephamycin C và penicillin

được dùng để sản xuất các khung cho việc bán tổng hợp các beta-lactam khác

6-APA

Sản xuất các khung để bán tổng hợp

 Hóa học: chiếm ưu thế từ 1970, nhưng hiện gặp nhiều vấn

đề về môi trường, dung môi và tốn năng lượng

 Enzym: được sử dụng từ 1960, nhưng ngưng do giá thành

và vấn đề tái sử dụng Đến 1990 enzym cố định giải quyết được vấn đề

 E coli tái tổ hợp để sản xuất penicillin G acylase và

Fusarium oxysporum tái tổ hợp sản xuất penicillin V acylase

 7-ADCA được sản xuất từ penicillin G bằng phản ứng mở

rộng vòng

 Merck và Panlabs: dùng P chrysogenum mang gen cefE

(expandase) của S clavuligerus Khi cung cấp disodium

adipate, nó sản xuất adipoyl 6-APA, rồi được chuyển thành adipoyl 7-ADCA nhờ expandase tái tổ hợp Mạch adipoyl

được cắt nhờ adipoyl acylase của Pseudomonas thành

7-ADCA

 được sản xuất từ cephalosporin C bằng phản ứng deacyl

hóa nhờ enzym hay hóa học

Các thế hệ Cephalosporin

 I (cephalothin, cephaloridine, and cefazoline): biến đổi vị trí C-3 và C-7 của 7-ACA

 II: kháng β-lactamase

7-methoxy  kháng β-lactamase: cefoxitin and moxalactam

 III: kháng β-lactamase + phổ rộng:

oximinocephalosporin (thế hệ II): cefotaxime, ceftizoxime, và ceftazidime

 IV (cefepime và cefpirome): có vòng

aminothiazole ở C-7 cùng với nhóm thế

oxyimino và nitơ bậc IV ở C-3

Sản xuất erythromycin

 Chủng: Saccharopolyspora erythraea (Streptomyces erythreus )

Sản xuất acid amin

Phương pháp sản xuất acid amin

 Phương pháp trích ly các acid amin từ dịch

thủy phân protein Phương pháp này dùng để thu nhận L-cystein, L-cystin, L-leucin, L-

asparagin, L-tyrosin

 Phương pháp tổng hợp hóa học Phương pháp

này dùng để sản xuất glycin, alanin,

methionin, tryptophan

 Phương pháp lên men vi sinh vật

Phương pháp lên men vi sinh vật

 Phương pháp sử dụng các chủng vi khuẩn hoang dại glutamic acid, L-alanine, L-valine)

(L- Phương pháp sử dụng vi khuẩn đột biến (L–lysine, L–

threonine, L–arginine, L– citrulline, L–ornithine, L–

homoserine, L-tryptophan, L-phenylalanine, L-tyrosine, L-histidine, …)

 Phương pháp thêm các tiền chất ( throenine,

L-isoleucine, L-tryptophan…)

 Phương pháp enzym (aspartic acid, alanine,

L-cyteine, L-dihydroxyphenylalanine, glycine…)

D-p-hydroxyphenyl- Phương pháp sử dụng các dòng vi khuần được tạo ra bằng các kỹ thuật biến đổi gene, protein và chất

chuyển hóa hoặc sự kết hợp của các kỹ thuật trên

(hydroxy-L-proline)

L-Glutamic acid - điều kiện sản xuất

 Vi khuẩn Corynebacterium glutamicum

 Môi trường có nồng độ đường và các ion

aminonium cao, nồng độ khoáng chất thích

hợp

 Nồng độ biotin giới hạn hoặc bổ sung penicllin hoặc xà phòng

 Điều kiện hiếu khí

 Năng suất L-glutamate: khoảng 100 g/L /2-3 ngày

L-Glutamic acid - điều kiện sản

xuất

 Chủng vi khuẩn: Corynebacterium , cần biotin

 Nguồn carbon: glucose, thủy phân tinh bột

 Nguồn nitơ: cao, ammoniac

 Cơ chế: glutamate dehydrogenase amin hóa oxo-glutarate (Chu trình Krebs) thành

2-glutamate

 Vai trò biotin (hoặc penicillin, xà phòng): làm rò rỉ

 Công nghệ gen:

dehydrogenase  sản xuất glutamate

năng tế bào: cùng với hormon tăng trưởng để điều trị bệnh ruột ngắn (short bowel syndrome)

Hoa”

L-Lysine - Chủng

 Đột biến tự dưỡng homoserine (hoặc threonine cộng với methionine), thiếu enzym homoserine

dehydrogenase

 Kiểu hình nhạy cảm với threonin hay methionin

 Đột biến đề kháng chất tương tự lysine

 Aspartokinase không nhạy cảm với ức chế ngược

 Đột biến cần leucine

 Công nghệ gen: tạo dòng và giải trình tự các gen liên quan

 Gen ldc (mã hóa lysine decarboxylase - phá hủy lysine)

 Gen cadA (mã hóa chất cảm ứng ldc)

 Gen lysE (mã hóa chất vận chuyển lysine ra khỏi tế bào)

L-Lysine - Ứng dụng

 Lysine được dùng làm chất bổ sung cho thức

ăn gia cầm, heo vì các thức ăn thường dùng

như ngũ cốc, đậu nành không béo chứa ít

lysine, là một acid amin thiết yếu cho vật nuôi

 Lượng L-lysine được sản xuất trên thế giới

hàng năm khoảng 400.000 tấn

 Dược lý:

L-Threonine

 Chủng:

 đột biến dị dưỡng lysin, diaminopimelate, hay methionin

L- và/hay đột biến đề kháng chất tương tự threonin

 các chủng được tạo ra bằng công nghệ gen

L-Threonin - Công nghệ gen

 S marcescen đột biến bằng giới nạp với phage

dehydrogenase làm mất nhạy cảm với quá trình

ức chế ngược của L-threonin

làm cho chúng không bị ức chế bởi L-threonin

với sự ức chế ngược bởi L-lysin

dehydrogenase làm cho chúng không bị ức chế bởi L-methionine

Sản lượng L-threonin của các chủng

 E coli sinh aspartase được cố định trong

polyacrylamid hay K-carageenan

 E coli sinh aspartase được cố định trong

polyurethane và polyazetidine

 Công nghệ gen: chủng coryneform có hoạt tính maleate isomerase và aspartase, nồi phản ứng màng

L-Aspartic Acid

Maleaic acid Fumaric acid

L-Aspartic Acid - ứng dụng

 dịch truyền dinh dưỡng, phụ gia thực phẩm,

 nguyên liệu sản xuất aspartame,

aspartyl-phenylalanine methyl ester

 sản xuất polymer có thể phân hủy sinh học

 dùng như xà phòng, tác nhân chelat hóa hay

xử lý nước

L-Alanine

 Công nghệ enzym với aspartate β-decarboxylase

 Pseudomonas dacunhae cố định trên

polyacrilamide, κ-carageenan, nhồi cột

L-aspartate Aspartate β-decarboxylase L-alanine + CO2 Fumarate + NH3 aspartase

Thực phẩm chức năng

Một số định nghĩa

 Thực phẩm chức năng (functional food)

 Thực phẩm tăng cường (fortified food)

Prebiotic - yêu cầu

 Không được thủy phân hay hấp thu ở đoạn

trên của ống tiêu hóa

 Là cơ chất chọn lọc của một hay một số giới

hạn vi khuẩn có lợi sống hội sinh trong ruột

già, do đó các vi khuẩn này sẽ được kích thích tăng trưởng hay chuyển hóa

 Có khả năng thay đổi thành phần hệ vi khuẩn

ruột già theo hướng có lợi

 Tạo ra các hiệu ứng có lợi tại chổ hay toàn

thân đối với người sử dụng

 carbohydrate không tiêu hóa được: các oligo

fructose, glucose, xylose và galactose

Prebiotic - chức năng

 kiểm soát thời gian lưu chuyển thức ăn qua

ruột

 cải thiện hấp thu glucose,

 giảm hấp thu chất béo và cholesterol,

 tăng thể tích và khả năng giữ nước của thức ăn trong ruột non,

 điều hòa sự lên men vi sinh vật để làm tăng

sản xuất các acid béo chuỗi ngắn,

Probiotic - các yêu cầu chung

 Chủng vi sinh vật phải có những đặc điểm

phù hợp với công nghệ để có thể đưa vào sản xuất

 Có khả năng sống và không bị biến đổi chức

năng khi đưa vào vào sản phẩm

 Không gây các mùi vị khó chịu cho sản phẩm

 Có khả năng sống sót khi đi qua đường tiêu

hóa (dạ dày-ruột non) nếu được sử dụng qua đường này

 Các vi khuẩn sống phải đi đến được nơi tác

động của chúng

 Có khả năng thực hiện chức năng trong môi

trường nơi chúng được định hướng

Probiotic - yêu cầu an toàn

 Không liên quan tới bệnh tật, ví dụ như nhiễm

trùng nội mạc cơ tim, hay gây rối loạn tiêu

Probiotic - yêu cầu chức năng

 Có khả năng dung nạp với acid và dịch vị của người.

 Có khả năng dung nạp với muối mật (là đặc tính rất

quan trọng để probiotic có thể sống sót được khi đi qua ruột non).

 Có khả năng bám dính vào bề mặt niêm mạc ruột và

tồn tại lâu dài trong đường tiêu hóa.

 Có khả năng kích thích miễn dịch nhưng không có tác

động gây viêm.

 Có khả năng cạnh tranh với hệ vi sinh vật tự nhiên.

 Sản xuất các chất kháng sinh vi sinh vật (ví dụ

bacteriocin, hydrogen peroxide, acid hữu cơ)

 Có hoạt tính đối kháng với tác nhân gây bệnh như

Helicobacter pylori, Samonella sp., Listeria

monocytogenes và Clostridium difficile

 Có khả năng chống đột biến và các yếu tố gây ung

thư

 Các lợi ích khác được chứng minh trên lâm sàng.