Định lượng Bacillus cereus

Tình hình ô nhiễm Bacillus cereus Bacillus cereus có mặt khắp nơi trong tự nhiên và có thể được tìm thấy trong nhiều loại đất, trầm tích, bụi và thực vật. Bào tử có thể lây lan một cách thụ động và do đó cũng được tìm thấy bên ngoài môi trường sống tự nhiên. B.cereus có thể nảy mầm, phát triển và tạo bào tử trong đất, do đó thể hiện vòng đời hoại sinh. Ruột của côn trùng có thể làm môi trường sống cho B. cereus khi vi khuẩn tạo bào tử, được phân lập từ ruột của các loài chân đốt sống trong đất, nơi vi khuẩn dường như tồn tại cộng sinh với vật chủ là động vật không xương sống của chúng Tính toán • Đối với mỗi độ pha loãng môi trường tăng sinh lỏng chọn lọc đã được cấy, ghi lại số lượng ống nghiệm có mặt Bacillus cereus giả định đã được khẳng định. • Chỉ rõ các ống này là các ống dương tinh. • Chọn những đĩa có từ 15 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc của 2 đậm độ pha loãng liên tiếp để tinh kết quả. Nếu chênh lệch các giá trị ở 2 đậm độ nhỏ hơn hoặc bằng 2 lần.

ĐỊNH LƯỢNG BACILLUS CEREUS

NHÓM 7

An toàn trong phân tich 7

1 Tình hình ô nhiễm Bacillus cereus

Bacillus cereus có mặt khắp nơi trong tựnhiên và có thể được tìm thấy trong nhiều loạiđất, trầm tích, bụi và thực vật Bào tử cóthể lây lan một cách thụ động và do đó cũngđược tìm thấy bên ngoài môi trường sống

tự nhiên B.cereus có thể nảy mầm, pháttriển và tạo bào tử trong đất, do đó thể hiệnvòng đời hoại sinh Ruột của côn trùng cóthể làm môi trường sống cho B cereus khi

vi khuẩn tạo bào tử, được phân lập từ ruộtcủa các loài chân đốt sống trong đất, nơi vikhuẩn dường như tồn tại cộng sinh với vật chủ

là động vật không xương sống của chúng

1 Tình hình ô nhiễm Bacillus cereus

Ngoài vòng đời đầy đủ trong đất, B cereus cũng thích nghi với lối sống trongvật chủ, như một mầm bệnh hoặc có thể là một phần của hệ thực vật đường ruột,cũng như để phát triển trong các loại thực phẩm Khả năng thích nghi của B.cereus với môi trường ruột động vật có thể là cơ sở cho tác dụng lợi khuẩnđược đề xuất của chúng Việc sử dụng như vậy không thể được coi là an toàn đốivới con người vì tất cả các chủng B cereus đều có thể tạo ra ít nhất mộttrong các độc tố liên quan đến bệnh tiêu chảy Tuy nhiên, một số chủng tạo ramột lượng độc tố không đáng kể ở 37 C đã được Cơ quan An toàn Thực phẩmChâu Âu (EFSA) cho phép sử dụng chế phẩm sinh học

1 Tình hình ô nhiễm Bacillus cereus

• Bacillus cereus có thể được phân lập từ nhiều loại thực phẩm và thànhphần thực phẩm khác nhau, bao gồm gạo, các sản phẩm từ sữa,gia vị, thực phẩm khô và rau

• Khi thu hoạch, tế bào hoặc bào tử B cereus có thể đi cùng nguyên liệuthực

vật vào các khu vực sản xuất thực phẩm và hình thành trên thiết bị chếbiến thực phẩm

• Bacillus cereus là chất gây ô nhiễm phổ biến trong sữa, và nó có thểgây ra

một khuyết tật được gọi là sữa đông ngọt trong các sản phẩm sữa Bào tử hoặc

tế bào của B cereus có thể gây ô nhiễm bầu vú của bò trong quá trìnhchăn thả, hoặc xâm nhập vào trang trại bò sữa qua vật liệu lót chuồnghoặc thức ăn

1 Tình hình ô nhiễm Bacillus cereus

Xét đến sự hiện diện phổ biến của

B.cereus, không loại thực phẩm nào

có độ pH> 4,8 có thể bị loại trừ

như một phương tiện có thể xảy ra hoặc

là một nguy cơ hư hỏng thực phẩm hoặc

bệnh do thực phẩm Người tiêu dùng

không tuân thủ các quy tắc chuẩn bị

thực phẩm cơ bản, tức là làm lạnh chậm

hoặc không đủ, bảo quản ở nhiệt độ môi

trường xung quanh hoặc giữ nhiệt kéo dài

ở <60 C, có thể cho phép B cereus

phát triển

2 Đặc điểm sinh học

Hiếu khí và khị khí tùy ý Nhiệt độ 5-50, tối ưu 35-40 pH 4,5-9,3 thích hợp 7-7,2

Trên môi trường NA hay TSA sau 24 giờ tạo nhóm lớn, nhăn nheo, xù xì

Trên môi trường MYP: khóm hồng xung quanh có vòng sáng

Trên môi trường Mossel: khóm to hồng chung quanh có vòng sáng

Trên môi trường canh NB, TSB: đục tạo váng, sau cặn lợn cợn

Đặc điểm nuôi cấy:

2 Đặc điểm sinh học

Trên môi trường đường: lên men glucose trong điều kiện hiếu khí và khị khí, không lên men mannitol

Phản ứng khử VP (+) Phân giải Tyroxin Khử nitrat bằng nitrit

Catalase (+), Citrate (+)

Mọc trên NB + 0,001% lyzozym

Tính chất sinh hóa

Đặc điểm sinh học

• Độc tố gây tiêu chảy

• Vi khuẩn sản sinh độc tố trên thịt, rau quả, gia vị Bản chất là một loại protein gây phân hủy hoại biểu

bì và niêm mạc ruột gây tiêu chảy có thể nguy hiểm đến tinh mạng.

Emetic

Emetic Toxin

• Độc tố gây nôn mữa

• Vi khuẩn nhiễm trong gạo, cơm nguội, đậu các loại Bản chất độc tố là phospholipit có tinh ổn định cao không bị phân hủy ở nhiệt độ cao và dịch

dạ dày.

Đặc điểm sinh học

2 Đặc điểm sinh học

Đặc điểm gây bệnh - độc tố - triệu chứng:

• Ngoài ra vi khuẩn còn có enzyme hemolyzin là một loại protein gây độc mạnh

có thể gây chết người Độc tố này có thể bị trung hòa bởi cholesterol trong huyết thanh nhưng nó có thể góp phần cho sự phát triển của vi khuẩn.

• Bacillus Cereus có thể gây nhiễm trùng và nhiễm độc khác nhau như: nhiễm trùng máu, viêm màng não và nhiễm trùng mắt.

2 Đặc điểm sinh học

Thực ăn chứa mật độ vi khuẩn: 105 vi khuẩn/g thực phẩm đủ gây độcBiểu hiện: đau bụng, buồn nôn, nôn sau 1-5 giờ ăn phải thực phẩm nhiễm vi khuẩn Bệnh có thể kéo dài 24 giờ

Biện pháp phòng ngừa: không ăn thức ăn để nguội qua đêm, thức ăn luôn hâm nóng trên 80 trước khi ăn

Đặc điểm gây bệnh - độc tố - triệu chứng:

- triệu chứng gây độc

3 Cơ sở phân tich

• TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 4992 : 2005 (ISO 7932 : 2004): VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN

NUÔI – PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BACILLUS CEREUS GIẢ ĐỊNH TRÊN ĐĨA THẠCH – KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC Ở 30OC.

• TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 6404:2016 (ISO 7218:2007 WITH AMENDMENT 1:2013): VI SINH VẬT TRONG

THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - YÊU CẦU CHUNG VÀ HƯỚNG DẪN KIỂM TRA VI SINH VẬT.

3 Cơ sở phân tich

Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp định lượng Bacillus cereus giả định

có khả năng mọc được trên đĩa thạch bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở

30oC Tiêu chuẩn này có thể áp dụng cho:

• Các sản phẩm dùng cho con người và thức ăn chăn nuôi

• Các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất và xử lý thực phẩm

3 Cơ sở phân tich

Thuật ngữ - định nghĩa

Bacillus cereus giả định (presumptive Bacillus cereus)

Để cho phương pháp thử mang tinh thực tiễn thì giai đoạn khẳng định đã giớihạn về thử điển hình trên thạch MYP và thử hồng cầu Do đó, thuật ngữ "giảđịnh" đã được đưa vào để công nhận thực tế là giai đoạn khẳng định không thể

phân biệt được B.cereus với các loài Bacillus khác có liên quan mật thiết.

3 Cơ sở phân tich

Nguyên tắc

• Cấy một lượng mȁu thử qui định nếu sản phẩm ban đầu ở dạng lỏng, hoặcmột lượng huyền phù ban đầu qui định nếu các sản phẩm ở dạng khác, lên bề mặtmôi trường cấy đặc chọn lọc đựng trong các đĩa Petri

• Chuẩn bị các đĩa khác trong cùng một điều kiện, sử dụng các dungdịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu

• Ủ trong các điều kiện hiếu khí các đĩa ở 30oC từ 18 h đến 48 h

• Tính số lượng B.cereus trong một mililit hoặc trong một gam mȁu từ số lượng

khuẩn lạc khẳng định thu được trên các đĩa ở các độ pha loãng đã chọn sao cho kếtquả có ý nghĩa và được khẳng định theo phép thử qui định

3 Cơ sở phân tich

Phép thử Kết quả khẳng định Bacillus cereus giả định

Thạch MYP Hình thành khuẩn lạc màu hồng được bao quanhbởi một vùng kết tủa.

Thử hồng cầu trên thạch huyết cừu Phản ứng dương tinh, độ rộng của vùng hồng cầu có thể thay đổi

3 Cơ sở phân tich

Quyết định 46/2007/QĐ-BYT

Sản phẩm

GIỚI HẠN B cereus (Trong 1g hoặc 1ml sản phẩm)

Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, khoai củ, đậu đỗ: bột, miến,

mỳ sợi (có xử lý nhiệt trước khi sử dụng) 10

2

Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, khoai củ, đậu, đỗ: bánh,

bột (dùng trực tiếp, không qua xử lý nhiệt trước khi sử dụng) 10

Thức ăn khô và thức ăn dinh dưỡng cho trẻ em, thức ăn thay

thế đặc biệt (phải xử lý nhiệt trước khi sử dụng) 10

2

Thức ăn khô và thức ăn dinh dưỡng cho trẻ em, thức ăn thay

thế đặc biệt (dùng trực tiếp, không qua xử lý nhiệt trước khi

sử dụng)

10

3 Cơ sở phân tich

4 Quy trình phân tich

4 Quy trình phân tich

4 Quy trình phân tich

Bảng dụng cụ

1 Bình tam giác Chứa dung dịch hóa chất, chứa mȁu

2 Pipet Vận chuyển một lượng thể tich (huyền phù hoặc dung

dịch pha loãng) xác định

3 Đĩa petri Nuôi cấy vi sinh vật

4 Que cấy trải Trải đều dịch mȁu lên khắp bề mặt đĩa

5 Quy trải Trải mȁu vật, làm mịn bề mặt thạch

4 Quy trình phân tich

Bảng môi trường và hóa chất

Môi trường và hóa chất Mục đích

SPW (Saline Peptone Water) Pha loãng mȁu

MYP agar base (Mannitol

-Egg Yolk - Polymixin)

Polymixin B Nuôi cấy B.cereus

Egg Yolk

Blood agar base Khẳng định B.cereus giả định

Sheep blood Được bổ sung vào môi trường nhằm tăng khả năng

phát triển cho các loài vi sinh vật khó mọc

HCl và NaOH 10% Điều chỉnh pH

4 Quy trình phân tich

Bảng thiết bị

1 Cân Cân lượng mȁu rắn

2 Máy lắc vortex Trộn mȁu

3 Máy dập Stomacher Đồng nhất mȁu và dịch pha loãng

4 Máy đếm khuẩn lạc Nhìn thấy độ khuếch đại của khuẩn lạc để dễ dàng đếm

5 Nồi hấp tiệt trùng Tiệt trùng vi khuẩn cho các thiết bị, dụng cụ và hóa chất

Cân Máy lắc vortex Máy dập

Stomacher

Máy đếm khuẩn lạc Nồi hấp

tiệt

trùng

6 Giải thích quy trình

Cách tiến hành Bước 1 Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu

mȁu rắn hoặc đong 10ml

đối với mȁu lỏng, sai số cho

phép ± 5%, cho vào túi nhựa

vô trùng (bình tam giác).

SPW 90ml (sai số cho phép

± 5% ) vô trùng vào túi nhựa

(bình tam giác) chứa mȁu.

trong máy dập mȁu hoặc lắc đều bình tam giác.

pipet, nên để pipet ở tư thế nằm ngang khi được làm đầy với một thể tich của huyền phù Lắc huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng bằng máy vortex để tránh các phần tử có vi sinh vật lắng xuống.

6 Giải thích quy trình

Bước 2 Pha loãng mẫu

• Hút 1ml huyền phù ban đầu cho vào một ống nghiệm chứa 9 ml dịchpha loãng SPW vô trùng ở nhiệt độ thích hợp

• Trộn kỹ bằng máy vortex trong 5 – 10s để thu được dung dịch pha loãng

10

-2 Nếu cần, có thể lặp lại thao tác trên để có được dung dịch pha loãng

10-3 , 10-4, cho đến khi thu được lượng vi khuẩn thích hợp

• Để định lượng các bào tử Baclillus cereus giả định, cần làm nóng dung

dịch pha loãng ban đầu ở 80C trong 10 phút trên nồi cách thủy sau đótiến hành cấy và ủ

6 Giải thích quy trình

Bước 3: Cấy và ủ mẫu

• Dùng pipet vô trùng chuyển 0,1ml mȁu thửdạng lỏng hoặc 0,1ml huyền phù ban đầuđối với sản phẩm ở dạng khác cho vào giữađĩa petri Lặp lại qui trình với các dung dịchpha loãng thập phân tiếp theo, nếu cần

• Sử dụng 2 nồng độ pha loãng liên tiếp, mỗinồng độ 2 đĩa petri Dùng que cấy trải trảiđều dịch mȁu lên khắp bề mặt đĩa petri, sửdụng một que trải vô trùng cho mỗi đĩa

• Để các đĩa khoảng 15 phút ở nhiệt độphòng để chất cấy bám vào thạch Lật úpđĩa và ủ ở 30C trong 24 giờ

6 Giải thích quy trình

Bước 4: Đếm và chọn khuẩn lạc để khẳng định

Đếm các đĩa có số khuẩn lạc dưới 150 sau 24 giờ

nuôi cấy Khuẩn lạc B cereus giả định là các

khuẩn lạc lớn, màu hồng, được bao quanh bởi

một vòng kết tủa Đếm các khuẩn lạc B cereus

giả định trên những đĩa có số đếm phù hợp.

Lấy 5 khuẩn lạc giả định, nếu trên đĩa có ít hơn 5 khuẩn lạc thì lấy tất cả các khuẩn lạc giả định có mặt Cấy ria, cấy đâm sâu hoặc chấm các khuẩn lạc đã chọn lên mặt thạch máu cừu, ủ ở 30C trong 24 giờ Đọc kết quả.

Khuẩn lạc của B Cereus môi trường thạch

MYP: dẹt, đường kính 2-3 mm, bờ hình răng

cưa, màu đỏ hồng, xung quanh có vùng

đục, tan máu

B Cereus làm tan máu mạnh và tạo vùng tan máu hoàn toàn (,xung quanh vùng phát triển.

6 Giải thích quy trình

Tính toán

• Đối với mỗi độ pha loãng môi trường tăng sinh lỏng chọn lọc đã

được cấy, ghi lại số lượng ống nghiệm có mặt Bacillus cereus giả

định đã được khẳng định.

• Chỉ rõ các ống này là các ống dương tinh.

• Chọn những đĩa có từ 15 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc của 2 đậm

độ pha loãng liên tiếp để tinh kết quả Nếu chênh lệch các giá trị

ở 2 đậm độ nhỏ hơn hoặc bằng 2 lần.

V: là thể tích mẫu cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit

(ml) n1: là số đĩa có đậm độ pha loãng thứ nhất được

giữ lại n2: là số đĩa có đậm độ pha loãng thứ hai được

giữ lại

d: là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhấtLàm tròn số kết quả có được, chỉ giữ lại 2 số có nghĩa.

6 Giải thích quy trình

Biểu thị kết quả

Biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa số 1.0 và 9.9 nhân với (n là số mũ thích hợp của 10)

Nếu chênh lệch các giá

có ít hơn 15 khuẩn lạc tinh kết quả là trung bình cộng của các khuẩn lạc đếm được ở cả 4 đĩa tinh

ra cho 1g hoặc 1ml sản phẩm.

Nếu tất cả các đĩa không có khuẩn lạc nào mọc, đánh giá kết quả như sau:

Ít hơn 1 khuẩn lạc Bacillus

trong 1ml sản phẩm.

Ít hơn 1/d khuẩn lạc Bacillus

trong 1g sản phẩm

Yêu cầu đối với Rác thải hoặc mẫu

Các yêu cầu đối với phòng vi sinh

• Hạn chế tiếp cận khu vực phòng

thí nghiệm vi sinh

• Các bề mặt bàn làm việc

trong

phòng thí nghiệm phải được vê ̣sinh

ky bằng cồn 70% trước và sau khi

làm việc

• Khi chuẩn bị hóa chất môi trường

có

cảnh báo nguy hiểm, cần đọc ky và

tuân theo hướng dȁn pha chế

• Khi vận hành các thiết bị có liên

quan đến tinh an toàn (nồi hấp, đèn

Bunsen), cần đọc ky và tuân thủ hướng dȁn sử dụng thiết bị

• Rác thải nhiễm và mȁu thực

phẩm nhiễm vi sinh phải được hấp

tiệt trùng 1210C, 30 phút trước khi

• Găng tay, khẩu trang, bông gòn vêsinh

mặt bàn thao tác với mȁu nhiễm

KẾT LUẬN

Trong môi trường chọn lọc, B.Cereus tạo khuẩn lạc rất to, mọc lăn,rìa nhăn Vi khuẩn này hiện diện trong các loại thực phẩm (Sữa,thịt, rau quả, hỗn hợp gia vị, sản phẩm khô…)

Hình thành 2 loại độc tố chính

1.Diarrhoeal toxin gây tiêu chảy

2.Dmetic toxin gây nôn mửa

B.Cereus được phát hiện và định lượng bằng môi trườngthạch chọn lọc Mannitol – Egg Yolk – Polymein (MYP) hoặc CereusSelective Agar (MOSSEL), Polymycin Elgelb MannitolBromothymol Blue Agar (PEMBA) Ngoài ra B.cereus cũngđược định lượng bằng phương pháp MPN