Kỹ thuật vi nhân giống cây trồng - Nuôi cấy mô là quá trình nuôi cấy vô trùng invitro các bộ phận tách rời của thực vật nhằm: nhân giống và cải thiện di truyền, sản xuất sinh khối ch
Trang 1ĐỀ CƯƠNG ÔN TẬP MÔN CÔNG NGHỆ
SINH HỌC THỰC VẬT
1 Kỹ thuật vi nhân giống cây trồng
- Nuôi cấy mô là quá trình nuôi cấy vô trùng invitro các bộ phận tách rời của thực vật nhằm: nhân giống và cải thiện di truyền, sản xuất sinh khối cho các sản phẩm hóa sinh, bệnh học thực vật, duy trì và bảo vệ những nguồn gen quý…
- Nhân giống invitro còn gọi là vi nhân giống là kỹ thuật được sử dụng trong quá trình nuôi cấy các bộ phận của thực vật trong điều kiện vô trùng ở ống nghiệm hoặc bình chứa
- Vi nhân giống có điều kiện:
+ Có mảnh cắt nhỏ của thực vật
+ Sạch vi sinh vật
+ Được nuôi cấy vô trùng
1 Các phương pháp nuôi cấy mô thực vật.
+ Nuôi cấy đỉnh phân sinh
+ Phát sinh phôi vô tính
+ Tạo mô sẹo (callus)
+ Nuôi cấy lát mỏng
+ Vi ghép trong nhân giống
+ Nuôi cấy túi phấn
+ Nuôi cấy và dung hợp protoplast ở thực vật
+ Chuyển nạp gen thực vật
Trang 2a Nuôi cấy đỉnh phân sinh.
Quá trình sinh trưởng gồm 3 giai đoạn:
1 Giai đoạn phôi sinh: trong các mô phân sinh đỉnh hình thành mầm cơ quan và sự phân chia đầu tiên để tạo nên mô riêng biệt
2 Giai đoạn sinh trưởng: do quá trình sinh trưởng nhanh chóng nên mầm cơ quan đạt đến kích thước tối đa và trở nên hình dạng xác định
3 Giai đoạn phân hóa tế bào: hóa gỗ vách tế bào Các u lá xuất hiện, sau đó phát triển thành mầm lá,
Ở mỗi nách lá đều có chồi nách Chồi nách thực chất có cấu tạo không khác đỉnh sinh trưởng của thân
Quá trình tổng hợp DNA của virus thực vật không xảy ra trong đỉnh sinh trưởng do một số cơ chế không rõ Nên mô đỉnh sinh trưởng là mô duy nhất sạch virus trong một cây nhiễm virus Do vậy, kỹ thuật này giúp cây con sạch virus
Do vùng mô phân sinh quá nhỏ, kỹ thuật tách đỉnh sinh trưởng được thực hiện dưới kính lúp Các đỉnh sinh trưởng kích thước 0,1 đến 0,15mm sẽ tạo ra được 100% số cây con sạch bệnh và tỷ lệ này giảm dần đến kích thước 1 mm
Mẫu càng nhỏ thì càng khó tái sinh cây con và khả năng sống sót cũng giảm
Kích thước thường được sử dụng là 0.2 đến 1mm
Ngoài ra, xử lý nhiệt cũng giúp loại bỏ virus ở đỉnh phân sinh Hoặc một số hóa chất diệt virus trong môi trường nuôi cấy như ribavirein
Trang 3Khi tạo đủ rễ, cây con có thể dùng làm nguyên liệu để tạo dòng sạch bệnh phục vụ cho sản xuất
Môi trường nuôi cây: Cytokinin 0.05 – 0.5 mg/l, Auxin: 0.01 – 0.1mg/l
b Nuôi cấy mô thực vật bằng cách phát sinh phôi vô tính.
- Phát sinh phôi vô tính là quá trình tạo phôi từ tế bào và mô soma trong các hệ thống nuôi cấy Invitro
- Giai đoạn 1: chọn cây giống có vật liệu nuôi cấy thích hợp: tạo callus, tạo huyền phù tế bào hoặc tạo protoplast
- Giai đoạn 2: Cảm ứng khả năng tạo phôi trong các tế bào nuôi cấy
+ Chuyển tế bào cần cảm ứng vào môi trường nuôi cấy có nồng độ auxin cao Loại Auxin thường dùng là 2,4-D hoặc hỗn hợp sữa dừa với nồng độ thấp NAA + Sau 1, 2 tuần tế bào tiền phôi xuất hiện Sau đó khối tế bào lớn lên, tiền phôi lớn
có thể chuyển sang môi trường phân hóa Các tế bào nhỏ hơn có thể cấy chuyền để tiếp tục sản xuất phôi vô tính
- Giai đoạn 3: Phân hóa và sự thành thục của phôi vô tính
Sau khi tạo phôi vô tính trong môi trường auxin cao thì chuyển qua môi trường phân hóa có Nito cao và không chứa auxin Phôi vô tính xuất hiện từ các tế bào đơn trong khối tế bào nuôi cấy, phát triển tính phân cực và tiếp theo là giống như quá trình tạo phôi bình thường Ta có thể bổ sung acid abscisic vào môi trường sẽ làm tăng tính đồng nhất và đẩy mạnh sự phát triển bình thường của phôi
- Giai đoạn 4: Tạo cây con: Các phôi vô tính thành thục sẽ được đưa lên thạch không có chứa auxin nhưng có chứa cytokinin nồng độ thấp để tái sinh cây con hoàn chỉnh
- Giai đoạn 5: Đưa cây con ra vừa ươm Sau khi có đầy đủ bộ phận: lá, rễ Cần đưa cây ra vườn ươm và chăm sóc như những cây con khác
c Nuôi cây mô thực vật bằng phương pháp tạo mô sẹo (callus).
- Mô sẹo: là khối tái sinh vô tổ chức từ mẫu
2,4-D để trong tối dễ hình thành mô sẹo
- Khối Callus:
Trang 4+ Tốc độ phân chia của tế bào lúc đầu là rất chậm, phải cần sự hỗ trợ của auxin (tạo rễ)
+ Phase phân chia tế bào lại rất nhanh cùng với sinh tổng hợp nhanh chóng DNA, RNA, Protein
+ Tiếp theo ngừng từ từ tốc độ phân chia tế bào
+ Phase phân hóa thành tế bào nhu mô và tế bào mô dẫn
- Tỷ lệ Cytokinin/Auxin biễn diễn cho quá trình tạo chồi/rễ của mô sẹo Nếu tỷ lệ bằng nhau thì vừa tạo chồi và vừa tạo rễ
d Nuôi cấy mô thực vật bằng nuôi cấy lát mỏng.
e Nuôi cấy mô thực vật bằng phương pháp vi ghép.
f Nuôi cấy mô thực vật bằng phương pháp nuôi túi phấn.
g Nuôi cấy và dung hợp protoplast ở tế bào thực vật.
Protoplast là tế bào mất đi lớp vỏ cellulose bằng cách xử lý dưới enzyme
cellulase Nó chỉ còn màng sinh chất bao quanh chất nguyên sinh
Lai vô tính là quá trình lai hai protoplast thành 1 nhờ PEG hoặc dung hợp nhờ xung điện Quá trình này có thể hấp thu đại phân tử DNA, RNA, Protein, virus, vi khuẩn, các cơ quan tử
h Chuyển gen ở Thực vật
- Nhờ VK Agrobacterium
- Đặc điểm: vi khuẩn hình que, gram âm, có nhiều trong đất
+ Họ Rhizobiaceae: tạo khối u ở thực vật
+ Họ A Rhizogenes: gây bệnh rễ tóc
- Sinh học phân tử:
+ Có Plasmid Ti ở họ Rhizobiaceae có chiều dài từ 120 – 150 kb Quyết định đặc tính gây u Trong khi đặc tính tương tự có ở Plasmid Ri ở họ A Rhizogenes gây rễ tóc
+ Một phần DNA của Plasmid Ti và Ri được gọi là DNA T hay gọi là DNA vận chuyển Nó sẽ được gắn vào bộ gen của bộ gen thực vật sẽ làm xuất hiện khối u
Trang 5hoặc rễ tóc Nhờ đặc tính này mà chúng ta có thể ứng dụng plasmid Ti và Ri làm vector chuyển gen để thay đổi tính trạng di truyền của thực vật mà chúng ta muốn
3 Các phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật
- Nuôi cấy mô tế bào là tách rời tế bào thực vật trong môi trường dinh dưỡng tựa như cơ thể sống, giúp tế bào phân chia, biệt hóa thành mô, cơ quan, tăng trưởng thành cây hoàn thiện Những kỹ thuật này dùng để nuôi cấy những tế bào, mô hay những cơ quan thực vật trong điều kiện vô trùng
- Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật hay nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là các thuật ngữ miêu tả những cách thức nuôi cấy những bộ phận thực vật trong ống nghiệm cùng môi trường và điều kiện vô trùng Môi trường trong ống nghiệm có chứa những thành phần dinh dưỡng như muối khoáng, vitamin, những hormone sinh trưởng và đường
Công cụ dùng trong quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật
Để nuôi được mô tế bào thực vật thì đòi hỏi phải có phòng nuôi cấy với điều kiện môi trường vô trùng và một vài điều kiện thiết yếu theo mỗi giống cây giống khác nhau
Phòng nuôi cấy mô cần có tủ cấy và một vài dụng cụ thủy tinh như: Ống đong, pipet, bình tam giác, cốc thí nghiệm, ống nghiệm, lọ thủy tinh, phễu, bình đun môi trường
Công cụ sử dụng trong nuôi cấy gồm có: Dao, kéo, phanh, đĩa cấy, … Hết thảy đều làm từ thép không gỉ, chiều dài tùy vào độ dài của bình và ống nghiệm nuôi cấy Những công cụ được khử trùng bằng nồi hấp tiệt trùng hay đốt nóng kỹ trước lúc
sử dụng
Mọi công cụ dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật phải đảm bảo đạt tiêu chuẩn,
có nguồn gốc, xuất xứ rõ ràng
Những bước, quy trình nuôi cấy mô tế bào thực vật
Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy
Trang 6Chọn cây mẹ đạt chuẩn cây giống để làm nguyên liệu nhân giống Chú ý chọn cây
mẹ có các phẩm chất vượt trội, sạch bệnh và hơn hết nên chọn cây trồng trong nhà kính hay cây được trồng theo tiêu chuẩn đặc biệt
Thời điểm chọn mẫu cấy: Lấy vào giai đoạn tăng trưởng mạnh nhất của cây mẹ
Tạo thể nhân giống in vitro
Mẫu nuôi được cấy trong môi trường đặc biệt để tạo thể nhân giống in vitro Gồm hai thể nhân giống in vitro: Thể chồi, thể cắt đốt Tạo thể nhân giống in vitro căn
cứ theo đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng
Nhân giống in vitro
Nhân giống mẫu cấy từ các thể chồi Môi trường nuôi cấy thông thường giống với môi trường tạo thể chồi, thỉnh thoảng nồng độ chất tăng trưởng giảm thấp để phù hợp cho quá trình nhân giống kéo dài Cây nhân giống in vitro có tình trạng sinh lý trẻ và được duy trì trong thời gian vô hạn
Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro
Cây giống cấy mô được nuôi dưỡng và tăng trưởng trong ống nghiệm cho đến lúc
đủ tiêu chuẩn về kích thước và đặc tính để có thể tăng trưởng tốt trong điều kiện tự nhiên
Chuyển cây con in vitro sang vườn ươm
Cây con cấy mô đạt yêu cầu về chiều cao, rễ lá phát triển hoàn chỉnh sẽ được đưa
đi thuần dưỡng trong nhà lưới nhằm thích nghi với môi trường tự nhiên