Ứng dụng vi sinh vật trong CNTP

Bản chất của quá trình tổng hợp acid amin bằng phương pháp vi sinh vật• Các phương pháp sản xuất acid amin ▫ Phương pháp thủy phân ▫ Phương pháp tổng hợp hóa học ▫ Phương pháp kết hợp ▫

Chương 3: Ứng dụng vi sinh vật trong CNTP

3.3 Tổng hợp acid amin bằng phương pháp vi sinh vật

3.3.1 Bản chất của quá trình

3.3.2 Sản xuất acid glutamic và bột ngọt

3.3.3 Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh

3.3.1 Bản chất của quá trình tổng hợp acid amin bằng phương pháp vi sinh vật

▫ amino axit mang cả tính bazơ lẫn tính axit (lưỡng tính)

▫ Amino axit ở trạng thái tinh thể rắn, không màu hầu hết hòa tan dễ trong nước

3.3.1 Bản chất của quá trình tổng hợp acid amin bằng phương pháp vi sinh vật

• Các phương pháp sản xuất acid amin

▫ Phương pháp thủy phân

▫ Phương pháp tổng hợp hóa học

▫ Phương pháp kết hợp

▫ Phương pháp tổng hợp acid amin bằng công nghệ vi sinh vật

3.3.1 Bản chất của quá trình tổng hợp acid amin bằng phương pháp vi sinh vật

• Các phương pháp sản xuất acid amin

▫ Phương pháp thủy phân:

 Người ta dùng acid hoặc kiềm để thủy phân các nguyên liệu chứa nhiều protein

 Phương pháp này có nhược điểm là cần thiết bị chịu acid hoặc chịu kiềm

 Trong trường hợp sử dụng kiềm để thủy phân sẽ tạo ra nhiều acid amin dạng D

 Trong trường hợp sử sụng acid để thủy phân sẽ tạo ra ô nhiễm môi trường

không khí do lượng acid dư bay hơi trong quá trình thủy phân

 Giá thành thường cao

3.3.1 Bản chất của quá trình tổng hợp acid amin bằng phương pháp vi sinh vật

• Các phương pháp sản xuất acid amin

▫ Phương pháp tổng hợp hóa học:

 Đây cũng là phương pháp được áp dụng nhiều trong thực tế Tuy nhiên, phương pháp này cũng lại cho ra những acid amin raxemic ( hỗn hợp acid amin dạng D và dạng L )

 Việc tách 2 loại acid amin này ra rất tốn kém

3.3.1 Bản chất của quá trình tổng hợp acid amin bằng phương pháp vi sinh vật

• Các phương pháp sản xuất acid amin

3.3.1 Bản chất của quá trình tổng hợp acid amin bằng phương pháp vi sinh vật

• Các phương pháp sản xuất acid amin

▫ Phương pháp tổng hợp acid amin bằng công nghệ vi sinh vật :

 Phương pháp này lợi dụng khả năng sinh tổng hợp thừa một số loại acid amin của một số vi sinh vật, người ta nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận các acid amin

 Phương pháp này cho phép ta thu nhận acid amin dạng L

 Nguyên liệu sản xuất rẻ, dễ kiếm

 Tốc độ trao đổi chất, tốc độ sinh sản và phát triển mạnh của vi sinh vật cho phép ta được năng suất cao

 Giá thành sản phẩm thấp hơn giá thành sản phẩm từ những

phương pháp khác

3.3.1 Bản chất của quá trình tổng hợp acid amin

bằng phương pháp vi sinh vật

• Cơ chất cho pp vi sinh vật:

▫ Nguồn Cacbon: hydrohydrate (glucose , fructose, sucrose,

maltose, lactose, dịch thủy phân tinh bột , cellulose, mật

rỉ…), các acid hữu cơ, rượu…

▫ Nguồn nitơ:

 N vô cơ: anoniac lỏng hay khí, amoni sulfate, amoni

nitrate, amoni phosphate, amoni clorua, amoni

carbonate…

 N hữu cơ: amoni acetate, nước chiết nấm men, nước chiết thịt , nước chiết malt,ure, peptone và các amino acid

▫ Nguồn khoáng và các nguyên tố vết: KH2PO4

▫ Nguồn Vitamin: vitamin H và vitamin B1

3.3.2 Sản xuất acid glutamic và bột ngọt

• Axit glutamic: C5H9NO4

▫ Axit glutamic (Glu) là một loại axit amin có trong protein thiên nhiên, thường thấy trong cơ thể động vật và thực vật dưới nhiều dạng khác nhau

▫ Glutamine(Gln) là một axit amin rất quan trọng trong cơ thể người

• Bột ngọt: C5H8NO4Na

▫ Bột ngọt (hay mì chính) là tên thường gọi của

Monosodium Glutamate (viết tắt là MSG),

▫ Là muối của axit glutamic, một trong hơn 20 loại axit amin để kiến tạo nên protein cơ thể

▫ Tên thường gọi: Natri glutamat

▫ Mã quốc tế và cộng đồng châu Âu: INS 621, EEC 621

3.3.2 Sản xuất acid glutamic và bột ngọt

• Vai trò axit glutamic và bột ngọt

▫ Axit glutamic

 Trao đổi chất của người và động vật

 Xây dựng protit, cấu tử tế bào, tổng hợp các aa khác

 Tham gia vào phản ứng chuyển amin, giúp cho cơ thể

chuyển hóa nhóm amin và tách NH3 ra khỏi cơ thể

 Tổng hợp chất hoạt động bề mặt N-acetylglutamat

 Acetylglutamat dùng trong xử lý ô nhiễm nước biển do

dầu hỏa và dầu thực vật

 Làm thuốc chữa bệnh thần kinh và tâm thần, hôn mê gan, bại liệt

▫ Bột ngọt

 Chất điều vị: giống với vị của thịt

 Chuyển hóa chất bổ dưỡng trong cơ thể con người

3.3.2 Sản xuất acid glutamic và bột ngọt

• Các phương pháp sản xuất axit glutamic

▫ Phương pháp tổng hợp hóa học

▫ Phương pháp thủy phân protit

▫ Phương pháp lên men

▫ Phương pháp kết hợp

3.3.2 Sản xuất acid glutamic và bột ngọt

• Các phương pháp sản xuất axit glutamic

▫ Phương pháp tổng hợp hóa học

 Ứng dụng các phản ứng tổng hợp hóa học để tổng hợp nên các axit glutamic và các aminoaxit khác từ các khí thải của công nghiệp dầu hỏa và các ngành công nghiệp khác

 Ưu điểm: có thể sử dụng các nguồn nguyên liệu không

phải là thực phẩm, tận dụng được phế liệu CN dầu hỏa

 Nhược điểm: thực hiện ở các nước có CN dầu hỏa phát

triển và yêu cầu kỹ thuật cao Tạo ra hỗn hợp không quay cực D, L – axit glutamic, việc tách L- axit glutamic ra lại khó khăn làm tăng giá thành sản phẩm

3.3.2 Sản xuất acid glutamic và bột ngọt

• Các phương pháp sản xuất axit glutamic

▫ Phương pháp thủy phân protit

 Sử dụng các tác nhân xúc tác là các hóa chất hoặc fecmen

để thủy phân protit thành hỗn hợp amino axit, từ đó tách các axit glutamic ra và sản xuất bột ngọt

 Ưu điểm: dễ khống chế quy trình sản xuất và được ứng

dụng vào các cơ sở sản xuất thủ công, bán cơ giới và cơ

giới dễ dàng

 Nhược điểm: cần sử dụng nguyên liệu giàu protit hiếm và đắt, cần nhiều hóa chất và các thiết bị chống ăn mòn, hiệu suất thấp nên giá thành cao

3.3.2 Sản xuất acid glutamic và bột ngọt

• Các phương pháp sản xuất axit glutamic

▫ Phương pháp lên men

 Lợi dụng một số VSV (Micrococcus glutamicus, Brevi

bacterium) có khả năng tổng hợp ra các axit amin từ các

nguồn gluxit và đạm vô cơ

 Ưu điểm : không sử dụng nguyên liệu protit, không cần dùng nhiều hóa chất và các thiết bị chống ăn mòn , hiệu suất cao, hạ giá thành, tạo ra L- axit glutamic có hoạt tính sinh học cao

3.3.2 Sản xuất acid glutamic và bột ngọt

• Các phương pháp sản xuất axit glutamic

▫ Phương pháp kết hợp

 Là phương pháp tổng hợp hóa học và vi sinh vật học

 Phương pháp vi sinh vật học tổng hợp nên các axit amin

từ các nguồn đạm vô cơ và gluxit mất nhiều thời gian, do

đó người ta lợi dụng các phản ứng tổng hợp tạo nên

những chất có cấu tạo gần giống axit amin ,từ đó lợi dụng

vi sinh vật tạo ra axit amin

 Phương pháp này tuy nhanh nhưng yêu cầu kỹ thuật cao, chỉ áp dụng vào nghiên cứu, ít áp dụng vào công nghiệp sản xuất

3.3.2 Sản xuất acid glutamic và bột ngọt

• Các chủng vi sinh tham gia vào quá trình tổng hợp

axit glutamic

▫ VSV thường sử dụng: Corynebacterium Glutanicum,

Brevibacterium Lactofermentus, Micrococus Glutamicus; chủ

yếu là Corynebacterium Glutamicum (do Kinosita phát hiện từ

1956)

▫ Giống vi khuẩn thuần khiết này được lấy từ ống thạch nghiêng tại các cơ sở giữ giống, sau đó được cấy truyền, nhân sinh khối trong môi trường lỏng, nhân lên đến yêu cầu sản xuất đại trà

▫ Chủng vi khuẩn giống phải có khả năng tạo ra nhiều axit

glutamic, tốc độ sinh trưởng phát triển nhanh, có tính ổn định cao trong thời gian dài, chịu được nồng độ axit cao, môi trường nuôi cấy đơn giản, dễ áp dụng trong thực tế sản xuất

3.3.2 Sản xuất acid glutamic và bột ngọt

• QTCN theo pp lên men

Xử lí Lọc dịch xử lí

Pha loãng

Thủy phân Trung hòa Lọc

Thanh trùng Pha chế dịch lên men

Làm nguội

Nhân giống cấp II Nhân giống cấp I

Rỉ đường

Tinh bột

Ống gốc

3.3.2 Sản xuất acid glutamic và bột ngọt

• QTCN theo pp lên men

Pha loãng Trao đổi ion

Bao gói Bảo quản

3.3.2 Sản xuất acid glutamic và bột ngọt

• Các sản phẩm của quá trình lên men

▫ Sản phẩm chính: L-Glu và CO2 (hiệu suất lý thuyết: 81,66% , thực tế SX: 45 - 50%)

 Acid Succinic: cũng tạo ra khi thừa biotin hay thiếu O2

 Acid -xetoglutaric: khi thiếu NH4+ và pH acid

 Sp khác: glutamin, L-acetylglutamin, alanin và aspartic…

3.3.2 Sản xuất acid glutamic và bột ngọt

• Công đoạn trao đổi ion: Tách lấy acid Glutamic khỏi dịch lên men

bằng hạt nhựa Polyetylen sunfuric (Rezin) Quá trình trao đổi nhựa ion gồm các quá trình sau:

▫ Quá trình hấp phụ : R’-SO3H + + NH3ROO -  R’SO3NH3RCOOH

▫ Quá trình tách: R’SO3NH3RCOOH +NaOH  R’SO3Na + NH2RCOOH + H2O

Dịch lên men Pha chế dịch lên men

Xử lý nhựa Rafin Trao đổi ion

Acid glutamic và dịch thải

Dịch thải/nước

Acid HCl

Nước

Dịch rửa

3.3.2 Sản xuất acid glutamic và bột ngọt

• Chỉ tiêu chất lượng sản phẩm (TCVN 1459-1996, QĐ 867/98 QĐ-BYT)

STT Chỉ tiêu thử nghiệm Phương pháp Yêu cầu

7 Hàm lượng Asen As (mg/kg) AOAC 96 (993.14) <5.00

8 Tổng lượng vi khuẩn hiếu khí/g TCVN 5667-92 10 4

9 Coliform/g TCVN 4882-01 10 2

10 E.coli/g TCVN 5155-90 3

3.3.3 Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh

• Giới thiệu:

▫ Là aa “ không thay thế”

▫ Giúp chuyển hóa protein, tổng hợp

hemoglobin, điều hòa hệ thần kinh, sinh dục nam, chuyển hóa axit nucleic, chuyển hóa

canxi, dự trữ N…

▫ Giảm độc tính của gossypol trong khô dầu bóng

▫ Tăng cường tiết dịch tiêu hóa

▫ Trộn 0.1-0.4% lysine vào thức ăn, sẽ làm tăng hiệu quả sử dụng thức ăn, giảm chi phí thức ăn, tăng trọng, tăng khả năng chống đỡ bệnh tật

3.3.3 Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh

• Các phương pháp sản xuất lysine

▫ Phương pháp thủy phân

▫ Phương pháp tổng hợp hóa học

▫ Phương pháp lên men

▫ Phương pháp chuyển hóa sinh học

3.3.3 Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh

• Các phương pháp sản xuất lysine

▫ Phương pháp thủy phân

 Người ta dùng acid hoặc kiềm để thủy phân các nguyên liệu chứa nhiều protein Cơ chất là bột mì, bột đậu nành, Protein từ máu, keratin…

 Phương pháp này đơn giản dễ thực hiện nên được sử dụng rộng rãi

 Hiệu suất rất thấp, khó thực hiện, và khó điều khiển các thông số

 Vấn đề tinh sạch rất khó khăn nên dạng sản phẩm tạo ra sẽ nằm dưới dạng tổ hợp và ứng dụng làm thức ăn cho gia súc, gia cầm

 Cần thiết bị chịu acid hoặc chịu kiềm

 Giá thành sản phẩm cao

3.3.3 Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh

• Các phương pháp sản xuất lysine

▫ Phương pháp tổng hợp hóa học

 Ưu điểm là sản xuất ổn định, có thể chuẩn hóa điều kiện sản xuất và hiệu suất

 Nhược điểm là tạo ra các đồng phân dạng D mà cơ thểkhông thể sử dụng được nên vấn đề tách ra khó khăn

 Ứng dụng trong công nghệ hóa học hay là làm thức ăn cho 1 số loài gia cầm

3.3.3 Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh

• Các phương pháp sản xuất lysine

 Nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường thức ăn để lấy acid amine

 Đây là phương pháp thông dụng nhất, sản lượng và sản phẩm tạo ra có chất lượng cao hơn, giá thành sản phẩm rẻhơn

 Tận dụng được những nguồn cơ chất rẻ tiền , đơn giản

 Phương pháp tiến hành và điều khiển thông số dễ dàng

3.3.3 Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh

• Các phương pháp sản xuất lysine

 Dùng những sinh khối của vi sinh vật để chuyển hóa 1 cơ chất thành sản phẩm thông qua 1 hay 2 phản ứng

 Vấn đề tinh sạch và điều khiển thông số khó hơn phương pháp lên men

 Khó thực hiện vì phản ứng có thể là nội bào hay ngoại bào nên không

có cơ chế điều hòa của vi sinh vật

 Cơ chất tham gia phải có cấu tạo tương tự như sản phẩm Nên phạm

vi ứng dụng bị hạn chế

 Để khắc phục người ta kết hợp với phương pháp hóa học: tổng hợp ra các tiền thân của các acid amine sau đó dùng vi sinh vật để chuyển thành L- lysine

3.3.3 Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh

• Các VSV tổng hợp lysine :

▫ Có nhiều loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp được Lysine:

Corynebacterium acetophilum, Micrococcus glutamicum,

Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Bacillus methanolicus, Ustilago maydis, Torulopsis utilis, Bacillus

megaterium, Aerobacter derogences, Escherichia coli, Streptomyces coloniformis, Mycobacterium tuberculosis,, Pseudomonas

Brevibacterium lactofermentum

3.3.3 Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh

• Con đường sinh tổng hợp lysine của vi khuẩn

Corynebacterium glutamicum :

3.3.3 Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh

• Quy trình công nghệ:

3.3.3 Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh

• Hệ thống lên men:

3.3.3 Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh

• Hệ thống lọc:

3.3.3 Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh

• Sấy phun:

3.3.3 Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh

• Sản phẩm:

▫ Sản phẩm lysine dưới dạng bột

L - Lysine – HCl L- lysine sulphate

▫ Sản phẩm lysine dưới dạng thuốc bổ

Chương 3: Ứng dụng vi sinh vật trong CNTP

3.4 Tổng hợp enzyme bằng phương pháp vi sinh

3.4.1 Phương pháp tổng hợp enzyme từ vi sinh 3.4.2 Tổng hợp enzyme amylase

3.4.3 Tổng hợp enzyme protease

3.4.4 Tổng hợp pectinase

3.4.5 Tổng hợp cellulase

3.4.1 Phương pháp tổng hợp enzyme từ vi sinh

• Nguyên tắc:

▫ Nuôi cấy tăng sinh khối chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp nhiều enzyme mong muốn trong môi trường dinh dưỡng thích hợp

▫ Tách chiết, tinh sạch enzyme từ sinh khối vi sinh vật

3.4.2 Tổng hợp enzyme amylase

• Giới thiệu

▫ QT thủy phân Tinh bột thành đường glucose dùng trong

SX rượu, bia, giấy, thuộc da

▫ Có thể dùng acid để thủy phân tinh bột, nhưng rất khó kiểm soát và tạo SP không mong muốn, không ATTP, giá thành lại cao

▫ Dùng amylase có nhiều ưu điểm: năng lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao về thiết bị, giảm chi phí tinh sạch

▫ Amylase có ở TV, ĐV và VSV  VSV thích hợp nhất

3.4.2 Tổng hợp enzyme amylase

• PHÂN LOẠI

▫ Hiện nay có 6 loại Enzyme Amylase được xếp làm 2 nhóm:

 Endoamylase (Enzyme nội phân)

 Exoamylase (Enzyme ngoại phân)

3.4.2 Tổng hợp enzyme amylase

• Enzyme β-amylase (EC 3.2.1.2)

▫ Phổ biến ở thực vật, đặc biệt là hạt nảy mầm

▫ Thủy phân các liên kết 1,4 α-glucoside từng nhóm maltose

từ đầu không khử của mạch tinh bột

▫ M ~ 64.000 Dal

3.4.2 Tổng hợp enzyme amylase

• Enzyme γ-amylase (Glucoamylase)

▫ Thủy phân được 2 kiểu lk 1,4 và 1,6

▫ Chủ yếu được tạo ra bởi các vi sinh vật.

▫ M = 27.000 – 112.000 Dal

▫ Chứa các gốc methioni, tritophan và cystein

3.4.2 Tổng hợp enzyme amylase

• Enzyme pullulanase (EC 3.2.1.41)

▫ Thủy phân được liên kết α-1,6 của tinh bột, glucogen, pullulan và các dextrin tới hạn

▫ Nhiều loại nấm sợi sản sinh ra loại enzyme này

3.4.2 Tổng hợp enzyme amylase

• NGUỒN THU NHẬN ENZYME AMYLASE

▫ Enzyme có ở hầu hết mọi thực vật, động vật và vi sinh vật nhưng chỉ một số có khả năng tích lũy một lượng lớn các enzyme này trong những điều kiện xác định.

▫ Nguồn enzyme ở VSV phong phú nhất:

 VSV có khả năng chuyển hóa một khối lượng cơ chất lớn hơn khối lượng cơ thể hàng chục ngàn lần sau một ngày đêm

 Enzyme thu nhận từ VSV có hoạt tính cao hơn

 Tốc độ sinh sản của vi sinh vật mạnh

 VSV có cơ thể nhỏ bé nên vận hành SX đơn giản

 VSV thích hợp cho sản xuất quy mô công nghiệp

 VSV không đòi hỏi quá khắc khe về dinh dưỡng  rẻ tiền

 VSV có thể sinh tổng hợp cùng lúc nhiều loại enzyme khác nhau

3.4.2 Tổng hợp enzyme amylase

• NGUỒN THU NHẬN ENZYME AMYLASE

▫ Nguồn động vật:

 Enzyme amylase có trong tụy tạng của động vật

 Tụy tạng là ống dạng chùm, dài, lớn, nằm ngang phía sau

dạ dày, giữa lá lách và tá tràng

 Tụy tạng vừa có chức năng nội tiết vừa có chức năng ngoại tiết

 Thu nhận amylase từ động vật phần lớn là từ dịch tụy tạng

 98% tụy tạng được cấu tạo từ các tế bào ngoại tiết hoặc là tếbào tuyến

 Các tế bào này tiết enzyme tiêu hoá vào trong tá tràng

3.4.2 Tổng hợp enzyme amylase

• NGUỒN THU NHẬN ENZYME AMYLASE

▫ Nguồn thực vật:

 Đại mạch (Hordeum sativum): có giống hai hàng và giống nhiều hàng

(4,6 hàng), trong đó người ta sử dụng loại hai hàng để sản xuất malt làm bia, những loại còn lại để làm thức ăn cho gia súc

 Lúa (Oryse sativa L): Chủ yếu ở vùng Đông Nam Á

 Ngô (Zea mays): có nhiều loại ngô: ngô đá, ngô bột, ngô răng ngựa

Hạt ngô có màu trắng,màu vàng hay màu hồng Ngô màu vàng do có

sự hiện diện của carotenoid và zeaxanthine ở trong nội nhũ, ngô màu hồng là do trong nội nhũ của ngô có anthocyanin