CHƯƠNG 4 CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT

NỘI DUNG 1. Nuôi cấy tế bào động vật 2. Động vật chuyển gen 3. Công nghệ tế bào gốc 4. Nhân bản vô tính động vật 5. Liệu pháp gen 1. Nuôi cấy tế bào động vật 1.1. Sơ lược lịch sử phát triển Từ năm 1907, nuôi cấy tế bào động vật in vitro lần đầu tiên được chứng minh có khả năng thực hiện 1949, J F Enders nuôi mô động vật thành công để nuôi các chủng virus gây bệnh bại liệt (Poliovirus) 1950, tế bào động vật có vú được nuôi với số lượng lớn để nuôi nhiều virus gây bệnh bại liệt dùng để chế tạo vacxin phòng bệnh bại liệt. Nuôi tế bào động vật được ứng dụng vào các lĩnh vực sau: sản xuất protein, hormon trị liệu, kháng thể đơn dòng, y học tái sinh

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

KHOA NÔNG HỌC

Bộ môn Công nghệ Sinh học

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

KHOA NÔNG HỌC

Bộ môn Công nghệ Sinh học

Bài giảng Nhập mônCÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHƯƠNG 4CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT

1 Nuôi cấy tế bào động vật

1.1 Sơ lược lịch sử phát triển

Từ năm 1907, nuôi cấy tế bào động vật in vitro lần đầu

tiên được chứng minh có khả năng thực hiện

1949, J F Enders nuôi mô động vật thành công để nuôi các chủng virus gây bệnh bại liệt (Poliovirus)

1950, tế bào động vật có vú được nuôi với số lượng lớn để nuôi nhiều virus gây bệnh bại liệt dùng để chế tạo

vacxin phòng bệnh bại liệt

Nuôi tế bào động vật được ứng dụng vào các lĩnh vực sau: sản xuất protein, hormon trị liệu, kháng thể đơn dòng, y học tái sinh

1.2 Những ưu điểm và hạn chế của nuôi cấy tế bào động vật

Ưu điểm:

- Hệ thống tế bào động vật là các nhà máy tế bào thích hợp cho việc sản xuất các dược chất và các kháng thể dùng trong phòng bệnh, điều trị và chẩn đoán

- Tế bào động vật là tế bào eukaryote, có quá trình biến đổi sau dịch mã

- Sản xuất các viral vector dùng trong liệu pháp gen

- Ứng dụng trong y học tái sinh/phục hồi (regenerative medicine) ví dụ da nhân tạo để chữa bỏng, mô gan để chữa viêm gan,

Hạn chê:

- Tế bào động vật có kích thước lớn, chuyên hóa cao

và cấu trúc phức tạp hơn tế bào vi sinh vật Trong quá trình nuôi tế bào động vật có thể tạo ra các mức độ bội thể khác nhau và tế bào nuôi không thể kéo dài mãi được, chúng sẽ chết theo chương trình đã được định sẵn

- Sinh sản chậm Tế bào động vật có vú cần 15 – 20h để tăng gấp đôi số lượng

- Rất nhạy cảm với các yếu tố của môi trường nuôi cấy như nhiệt độ, pH, dinh dưỡng

- Hầu hết các tế bào động vật chỉ sinh trưởng khi được gắn trên bề mặt

- Mô liên kết (connective tissue)

- Mô cơ (muscle)

- Mô thần kinh (nerve)

1.4 Môi trường nuôi cấy

1.4.1 Môi trường tự nhiên

Ví dụ: Cục máu đông, dịch huyết tương, nước ối bào thai, dịch ối bào thai,

1.4.2 Môi trường nuôi tổng hợp

Môi trường gồm các thành phần chủ yếu sau: axit amin, vitamin, hormon, nhân tố sinh trưởng, muối khoáng, glucose, huyết tương

1.5 Chuẩn bị tế bào để nuôi cấy

Mảnh mô tế bào được tách ra trong điều kiện vô trùng, sau đó được xử lý với trypsin để tạo huyền phù tế

bào

- Loại bỏ trypsin, dịch huyền phù được cho vào bình nuôi cấy chuyên dụng Gọi là quá trình nuôi sơ cấp (primary cultures)

- Các tế bào của quá trình nuôi sơ cấp sẽ được tách

ra và dùng làm nguyên liệu khởi đầu cho quá trình nuôi thứ cấp (secondary cultures)

- Các tế bào được nhân lên qua nhiều lần cấy chuyển liên tiếp Các tế bào không tăng vô hạn mà chúng chỉ có khả năng phân chia nhất định rồi chết (ví dụ tế bào người chỉ

phân chia tối đa 100 lần rồi chết)

Tuy nhiên, có một số dòng tế bào được biến đổi do

đó chúng có khả năng phân chia lâu dài, gọi là các dòng tế bào liên tục (cell lines)

Do các dòng tế bào này có xu hướng biến đổi liên tục qua nhiều lần nuôi cấy nên chúng được giữ ở trạng thái đông lạnh

1.7 Ứng dụng của nuôi cấy tế bào động vật

1.7.1 Sản xuất vacxin virus

- Virus là vi sinh vật kí sinh nội bào, đặc hiệu từng loại

tế bào chủ Do đó muốn nhân với số lượng nhiều để làm

vacxin cần phải nuôi virus trong các tế bào động vật có vú

- Một số vacxin được sản xuất như vacxin bại liệt, viêm gan B, quai bị, sởi, dại, lở mồm long móng

1.7.2 Sản xuất các protein, protein tái tổ hợp

Interferon, kháng thể, hormon trị liệu, chế phẩm miễn dịch

1.7.3 Trong y học phục hồi

- Cấy ghép tế bào, sản xuất các cơ quan nhân tạo

1.8 Tế bào lai và kháng thể đơn dòng

Kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibodies – Mab) là

sản phẩm của là sản phẩm của một dòng tế bào bạch cầu, bắt nguồn từ một dòng tế bào được kích thích

G Milistein và C Koehler đã sử dụng tế bào lai giữa một dòng tế bào lympho B tạo kháng thể đặc hiệu với tế bào mylolema (tế bào bạch cầu ung thư) có khả năng sinh sản vô hạn và tiết ra kháng thể đặc hiệu

Sản xuất Mab gồm hai công đoạn chính:

Tiªm kh¸ng nguyªn

TÕ bµo lai (hybridoma) sinh tr ëng, ph¸t triÓn trong m«i tr êng HAT vµ s¶n xuÊt kh¸ng thÓ

T¸ch vµ thu tÕ bµo lympho B tõ l¸ch

иp øng miÔn dÞch s¬ cÊp vµ thø cÊp

Tóm tắt quy trình sản xuất Mab

2 Động vật chuyển gen

Động vật chuyển gen (transgenic animal) là động vật

có gen chuyển (ngoại lai) trong hệ gen của chúng Gen ngoại lai phải được truyền lại cho tất cả các tế bào kể cả tế bào

mầm (gốc)

Các bước chính:

- Phân lập gen mong muốn

- Tạo vật liệu để biến nạp gen, thu nhận phôi

- Biến nạp gen vào phôi động vật

- Nuôi cấy phôi hoặc cấy truyền hợp tử (động vật bậc cao)

- Đánh giá tính ổn định và sự biểu hiện của gen lạ

2.1 Các phương pháp chuyển gen

2.1.1 Phương pháp chuyển nhiễm (transfection)

Dùng hóa chất như calcium phosphate, Diethyaminoehtyl – dextran (DEAE – dextran) mở các lỗ trên màng để ADN xâm nhập

DEAE – dextran là polycation kết hợp với DNA (tích điện âm) dẫn đến quá trình nhập bào với màng tế bào (tích điện âm)

2.1.2 Chuyển gen nhờ liposome

Liposome là các màng lipid bao gói DNA ở bên trong, sau đó màng liposome sẽ hợp nhất với màng tế bào chất và đưa ADN vào tế bào chất

2.1.3 Phương pháp dùng xung điện (electroporation)

Dùng dòng điện để mở các lỗ trên màng cho ADN xâm nhập

2.1.4 Chuyển gen bằng vi tiêm (microinjection)

Dùng thiết bị vi thao tác có gắn kim thủy tinh cực nhỏ

để tiêm ADN ngoại lai vào tế bào phôi ở giai đoạn 2 – 4 tế bào

2.1.5 Dùng súng bắn gen (gene gun)

Sử dụng các vi đạn là các hạt tungsten hoặc vàng Vi

đạn mang phân tử ADN và

được đưa vào tế bào đích

2.1.6 Chuyển gen nhờ viral vector

Là phương pháp đưa gen ngoại

lai chèn vào hệ gen

virus, sau đó cho

virus lây nhiễm vào

tế bào chủ để

chuyển gen vào tế

bào chủ

2.2 Những hướng nghiên cứu và kết quả đạt được trong lĩnh vực động vật chuyển gen

2.2.1 Hướng nghiên cứu chính

a) Tạo động vật có tốc độ lớn nhanh và hiệu quả sử dụng

thức ăn cao

Thành công chuyển gen hormon sinh trưởng trên cừu, lợn, thỏ, bò

b) Tạo động vật chuyên sản xuất protein dùng trong y – dược

c) Tạo động vật chống chịu bệnh tật và những thay đổi của môi trường

d) Tạo động vật chuyển gen sản xuất nội tạng thay thế

Thỏ chuyển gen

Lợn chuyển gen

Bò chuyển gen

Cá trê châu Phi chuyển gen hormon sinh trưởng