bài giảng công nghệ tế bào chương 4 công nghệ sinh học tế bào người và động vât

 Sau khi chọn lọc, các tế bào sống sót được chuyển vào bìnhnuôi cấy, và được phát triển để sản xuất các quần thể vô tínhclonal populations.chọn ra dòng có khả năng sản xuất cao nhất.. 

BÀI GIẢNG: CÔNG NGHỆ TẾ BÀO

Khoa: Công nghệ sinh học – môi trường Th.s Vưu Ngọc Dung

CHƯƠNG 4 CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TẾ BÀO NGƯỜI VÀ ĐỘNG VẬT

Công nghệ tế bào động vật có vú

Môi trường nuôi cấy

C ÔNG NGHỆ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT CÓ VÚ

Các ưu điểm của nuôi cấy tế bào động vật

Một số hạn chế của nuôi cấy tế bào động vật

C ÁC ƯU ĐIỂM CỦA NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

phòng bệnh, điều trị hoặc chẩn đoán

phẩm protein sinh-dược (biopharmaceutical)

thư, hội chứng suy giảm miễn dịch (HIV), chứng viêm khớp, cácbệnh tim mạch và xơ hóa u nang

độc chất học và dược học

cơ quan thay thế nhân tạo-sinh học/các dụng cụ trợ giúp: Da nhântạo (bỏng), Mô gan (viêm gan), Đảo Langerhans (tiểu đường)

M ỘT SỐ HẠN CHẾ CỦA NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

phải bổ sung huyết thanh máu

một bề mặt

TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Các tế bào dịch huyền phù

hình, dạng thể lỏng

phù (suspension cells), hoặc không dính bám khi chúng sinh

trưởng trong nuôi cấy in vitro.

Các tế bào dính bám

vì thế chúng cần có bề mặt để gắn vào và sinh trưởng

(fibroblast)

(a) (b)

(c)

Hình : Các tế bào động vật thường được sử dụng trong nuôi cấy.

(a) tế bào bạch huyết, (b) tế bào biểu mô, (c) nguyên bào sợi

M ÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

amino acid và vitamin vào môi trường

tố sinh trưởng, muối khoáng và glucose và bổ sung 2-20% huyếttương của động vật có vú (bò con trong bụng mẹ)

trường không có huyết thanh, hormone và các nhân tố sinhtrưởng được tinh sạch để thay thế cho huyết thanh

Choline Folic acid Inositiol Nicotinamide Pantothenate Pyridoxal Riboflavin Thiamine

4 Muối

NaCl KCl CaCl2 MgCl2.6H2O NaH2PO4.2H2O NaHCO3

1 1 2 1 1 1 0,1 1 6800 400 200 200 150 2000

K Ỹ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

trong hệ lên men

không tạo bọt khí và tốc độ truyền oxygen là thỏa đáng

hiện tượng tạo bọt nên cần khuấy chậm và nhẹ

microcarrier

1 C Ơ CHẾ CHUYỂN GEN

(promoter) cần thiết trong plasmid vector để chuyển vào tế bào

cũng được chuyển cho tế bào nhận để phân biệt tế bào được biếnnạp và không biến nạp, dihydrofolate reductase (DHFR)và

glutamine synthetase (GS)

cho phép phân lập các tế bào tái tổ hợp sống sót

trường (hypoxantine và thymidine: DHFR hoặc glutamine: GS), ngăn cản sự sinh trưởng của các tế bào không biến nạp

 Sau khi chọn lọc, các tế bào sống sót được chuyển vào bìnhnuôi cấy, và được phát triển để sản xuất các quần thể vô tính(clonal populations).

chọn ra dòng có khả năng sản xuất cao nhất

thích hợp và các sản lượng cao được sử dụng để sản xuấtprotein tái tổ hợp

sản xuất

Hình 6.2 Sinh sản và phát triển dòng tế bào cho các quá trình nuôi

cấy để sản xuất protein tái tổ hợp mong muốn (protein o.i.)

Chuyển nhiễm

Các dòng tế bào vô tính Chọn lọc

2 C ÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN

PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN NHIỄM (TRANSFECTION)

để DNA xâm nhập

thể hội nhập mang nhiều bản sao DNA trong tế bào

sulfoxide (DMSO) hoặc glycerol sau khi chuyển nhiễm

cấy dịch huyền phù và các tế bào phân hóa ở giai đoạn cuối

nhiễm DNA có thể ít độc hơn với mọi xử lý sốc sau chuyển nhiễm

ở tế bào nuôi cấy dịch huyền phù và tế bào phân hóa

PHƯƠNG PHÁP LIPOFECTION

dính bám vào trong phần bào tan (cytosol)

DEAE-dextran hoặc calcium phostphate

gen in vitro với hiệu suất trên 90% ở một số loại tế bào nuôi cấy.

protein virus trong lớp lipid cải thiện hiệu quả gắn của vector vớicác tế bào đặc biệt như tế bào ung thư gan (liver hepatocytes)

người tới tế bào đích thích hợp

PHƯƠNG PHÁP XUNG ĐIỆN (ELECTROPORATION)

theo gradient mật độ chui vào trong phần bào tan

lymphocyte (lympho bào)

PHƯƠNG PHÁP VI TIÊM (MICROINJECTION)

không gây nguy hiểm màng tế bào

tương đồng giữa DNA ngoại lai và DNA nội sinh

của biện pháp thay thế gen

quy trình chuyển nạp gen in vivo, cho dù bệnh học của động vật

hiếm khi tương tự như ở người

PHƯƠNG PHÁP DÙNG SÚNG BẮN GEN (GENE GUN)

vi đạn

xâm nhập vào tế bào đích

chế đối với tim và các tế bào cơ xương của động vật

vaccine, một lượng nhỏ protein là đủ để tạo ra một phản ứngmiễn dịch

PHƯƠNG PHÁP DÙNG CÁC VIRAL VECTOR

virus được thay thế bởi DNA tạo dòng

và phân phối tải trọng di truyền vào trong chúng

enhancer của virus

retrovirus như là một bản sao đơn trong nhiễm sắc thể vật chủ

lai vào trong các tế bào phân hóa, các tế bào mầm phôi, cáclymphocyte

 Chọn lựa một phương pháp chuyển gen thích hợp phụ thuộc vàomục đích thí nghiệm và loại tế bào đích (dính bám hay dịch huyềnphù).

đến 10 µg cho 105-106 tế bào nhận

tỷ lệ với kích thước của vector, đoạn chèn và nồng độ DNA

khoảng 10 lần các cấu trúc mạch vòng

CÁC ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

sởi, dại (người); lở mồm, long móng (gia súc)…

hợp): interferon, kháng thể và các hocmone trị liệu…

đưa tế bào bình thường thay thế tế bào bệnh

C ÁC KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG

dịch

thể (antibody) gọi là immunoglobulin khi một chất ngoại lai đi

vào cơ thể

trên bề mặt của chất ngoại lai gọi là kháng nguyên (antigent)

đào thải các chất ngoại lai

và các kháng thể khác trong máu

 Có nhiều dòng B-lymphocyte và mỗi dòng sản xuất ra các khángthể khác nhau.

ứng bằng cách sản xuất ra một hỗn hợp kháng thể đa dạng hầunhư không thể phân chia được

dòng) chỉ nhận ra một cấu trúc hóa học, phải cho sinh trưởng

được một dòng tế bào đặc biệt của B-lymphocyte

a Cấu trúc cơ bản của kháng thể b Vị trí liên kết kháng nguyên cókháng thể liên kết

Chuỗi nặng

Chuỗi nhẹ

Vị trí liên kết kháng nguyên Vùng có thể thay đổi

Vùng không thể thay đổi

Vùng liên kết kháng nguyên

Kháng nguyên

Yếu tố quyết định kháng nguyên

1 DUNG HỢP TẾ BÀO

thống miễn dịch

của lá lách với tế bào myeloma của chuột để lai hai loại tế bàonày với nhau

hai dòng tế bào: đó là sản xuất các kháng thể đặc hiệu và bất tử

xuất một loại kháng thể gọi là kháng thể đơn dòng

Hình 6.4. Phương thức dung hợp các tế bào B-lymphocyte

Phương thức đặc trưng để dung hợp tế bào như sau:

cách sản xuất các tế bào B-lymphocyte để tiết ra kháng thể

guanine phosphoribosyl transferase), đột biến HPGRT-, mộtmarker di truyền để chọn các tế bào lai sau khi dung hợp

cách trộn chúng trong môi trường chứa 40-50% polyethylene

glycol (PEG)

 Các B-lymphocyte và các hybridoma chứa HPGRT Vì thế, các

tế bào myeloma được coi như là HPGRT-, trong khi các tế bàoB-lymphocyte và hybridoma là HPGRT+

môi trường chứa HAT (hypoxanthine, aminopterin và

thymidine) là chất ức chế sinh trưởng các tế bào HPGRT-

các tế bào hybridoma sẽ phân chia Các B- lymphocyte khôngdung hợp sẽ chết do khoảng thời gian sống bị hạn chế của

chúng

2 THỬ NGHIỆM KHÁNG THỂ

enzyme (enzyme linked immunosorbent assays-ELISA)

assays-RIA)

 Interferon là một loại cytokine (protein) do tế bào động vật sinh

ra mỗi khi chúng bị virus xâm nhập

dạng ung thư (do ức chế sự sinh trưởng và phát triển)

(IFN-β), chống lại sự sinh sản của tế bào, IFN-α điều trị ung thư(ung thư máu ác tính, ung thư biểu mô tế bào thận), viêm gan B

và C mạn tính (40-50%) Interferon-γ (IFN-γ) làm thúc đẩy sựbiệt hóa các tế bào mono thành các đại thực bào

1 INTERFERON

 Các interferon riêng biệt có các phạm vi hoạt động khác nhau

trong các loài khác nhau

định cho interferon của lymphoid người bằng kỹ thuật nuôicấy dịch huyền phù, sản phẩm cuối cùng chưa tinh sạch

thuận lợi hơn nhiều nhờ công nghệ DNA tái tổ hợp

Gen mã hóa interferon được biến nạp vào tế bào nấm men S

cerevisiae có khả năng sản xuất interferon với sản lượng rất cao

2 HOẠT TỐ PLASMINOGEN MÔ

được tổng hợp trong nuôi cấy tế bào động vật có vú chuyển gen

fibrin (cục máu đông) được sử dụng để chữa bệnh nghẽn mạchmáu

phá tan những cục máu nhỏ có khả năng làm tắc mạch

hợp, sau đó phôi chuột được cấy vào chuột cái tạo thành chuộtchuyển gen có khả năng tiết t-PA người qua sữa

3 DNA VACCINE

vaccine

đặc hiệu được tiêm vào vật chủ (tế bào động vật hoặc vi sinh vật)

để sản xuất các kháng nguyên này và khởi động một phản ứngmiễn dịch

sản xuất từ nuôi cấy tế bào động vật mà không phải là tế bào vi sinh vật

Gen sản xuất kháng nguyên

Nguyên liệu di truyền Tác nhân gây bệnh

Plasmid đã được sửa đổi

từ tác nhân gây bệnh (pathogen), đưa các gen này vào trong vòng DNA của plasmid và đóng lại (a).

- Các vòng DNA sau đó được đưa vào trong các nhóm tế bào nhỏ, thường bằng cách tiêm vào

tế bào cơ (b)

- Hoặc đẩy vào da nhờ súng bắn gen (c).

Các tế bào nuôi

Pha loãng trong môi

trường và acid butyric

Lấy môi trường kiệt

Lấy môi trường cạn dung dịch ra

Thêm môi trường

K Ỹ THUẬT TẾ BÀO MẦM PHÔI , CHUYỂN GEN

VÀ TÁI TỔ HỢP TƯƠNG ĐỒNG

còn gọi là tế bào gốc

sau: xung điện, chuyển nhiễm hoặc vi tiêm

vào trong con cái mang thai giả cho phép phát triển tới kỳ hạnsinh đẻ

dòng tế bào mầm (germline), sau đó một phương thức chọn giốngthích hợp sẽ cho phép thiết lập một dòng chuyển gen

1 NUÔI CẤY TẾ BÀO MẦM ĐỂ SẢN XUẤT CƠ QUAN NGƯỜI

 “Y học tái tạo” bắt nguồn từ tính đa năng của của ES

 Do chúng có khả năng tự phân chia và đổi mới vô hạn, hoặc phân hóa thành nhiều loại tế bào

 Năm 1981, Martin và Evans cùng lúc phát hiện các tế bào ES của

chuột được nuôi cấy trong các điều kiện đặc biệt, bắt đầu phân chia và

có thể nhân lên vô hạn mà không phân hóa, cố định ở giai đoạn phát triển phôi sớm này

 Năm 1998, Thomson và cộng sự đã phân lập được tế bào ES từ phôi người và nhận thấy chúng khác với tế bào gốc của chuột ở nhiều điểm, chẳng hạn như khó duy trì và nhân lên trong nuôi cấy

 Năm 2000, Pera và cộng sự đã chứng minh các tế bào ES người cũng

có thể phân hóa trong điều kiện in vitro thành các loại tế bào trưởng

thành khác nhau Chẳng hạn, họ đã phân lập được một quần thể tiền tế bào thần kinh thuần khiết, và trong một số điều kiện chúng có thể phân hóa thành các tế bào thần kinh thành thục.

Hình: Nuôi cấy tế bào mầm để sản xuất cơ quan người

Tế bào mầm phôi

Tế bào mầm trưởng thành

Nuôi cấy tế bào mầm

Các điều kiện nuôi cấy khác nhau Cáctế bào biệt hóa

Tế bào cơ tim

Tế bào thần kinh

Tế bào gan

2 ỨNG DỤNG TẾ BÀO MẦM PHÔI

Trong nghiên cứu cơ bản

dạng khác nhau có thể làm rối loạn sự phát triển này

hóa đặc thù, cũng như các nhân tố điều khiển chúng

thận, bắt nguồn từ các quần thể tế bào phôi

ung thư

trong trường hợp ghép tủy, nuôi cấy tế bào ES có thể có ứngdụng trong việc tái tạo các mô khác

 Xét nghiệm nhanh trong

ống nghiệm để xác định

chức năng của các gen

thể dễ xử lý di truyền, chịu

những biến đổi định vị tại

các vị trí nhiễm sắc thể đặc

thù nhờ cách tái tổ hợp

cùng nguồn, mới hoặc đã

biết, trong các tế bào phôi

hoặc ở các tế bào trưởng

thành đã phân hóa

một nguồn in vitro đối với bất

kỳ loại tế bào nào của cơ thể

nghiệm và có thể biến đổi ditruyền

tế bào ES được biến đổi ditruyền sẽ là nguyên liệu lýtưởng để chọn lọc các phân tửđiều trị

Nghiên cứu chức năng gen Nghiên cứu các mô hình bệnh lý

N HÂN BẢN VÔ TÍNH ĐỘNG VẬT CÓ VÚ

tập hợp các cá thể giống hệt nhau về mặt di truyền và giống bố(hoặc mẹ) ban đầu bằng phương thức sinh sản vô tính

phát từ một tế bào hợp tử ban đầu qua phân bào nguyên nhiễm nhân hoàn toàn giống hệt nhau về mặt di truyền

1 NHÂN BẢN VÔ TÍNH CỪU DOLLY

cái Finn Dorset, sáu năm tuổi, lông trắng

đã được phân hóa cao độ và phát triển

cấy rất nghèo huyết thanh (5 ngày), mục đích làm cho chu kỳ tếbào giảm từ từ cho tới khi ngừng hoàn toàn, giai đoạn này đượcgọi là G0

thụ tinh, đã rút nhân của một cừu cái khác, đầu đen

thành phôi

 Cừu Dolly sinh ngày 5/7/1996, có trọng lượng bình thườngkhông có biểu hiện dị dạng như các thí nghiệm trước đó

Dolly vẫn có lông trắng

sao của cừu Finn Dorset, cừu đã cung cấp tế bào tuyến vú

Cừu cho tế bào trứng Cừu cho tế bào tuyến vú

Dung hợp tế bào

Nhân của tế bào tuyến vú

Nuôi cấy tế bào tuyến vú Chu kỳ tế

bào được ngừng lại ở (phage G0)

Tế bào trứng từ noãn Loại bỏ nhân

Tế bào sinh trưởng trong nuôi cấy

Phôi sớm

Cừu mẹ thay thế

Cừu non (Dolly) giống hệt nhiễm sắc thể với cừu cho tế bào tuyến vú

2 C ÔNG NGHỆ SINH SẢN NHÂN TẠO

 Can thiệp vào sinh sản ở người

 Các biện pháp sinh sản nhân tạo động vật nuôi

CAN THIỆP VÀO SINH SẢN Ở NGƯỜI

- Ở nam giới: tinh trùng ít, yếu, dị dạng, bị tắc, yếu tố ditruyền hay miễn dịch

trùng hay do hệ thống tử cung

 Bơm tinh nhân tạo:

pháp này trở nên phổ biến

mỗi năm nhờ phương pháp này

trùng trong ống nghiêm hoặc đĩa petri

năm 1978

 Từ năm 1995, một kỹ thuật mới là tiêm tinh trùng vào bào tươngtrứng - ICSI (Intracytoplasmic Sperm Injection) ra đời

bất thường về thụ tinh, dẫn đến không có phôi để chuyển vào

buồng tử cung

2 phương pháp mới có hiệu quả với chi phí thấp hơn IVF là:

trứng to nhất được lấy ra

nhau để thụ tinh

dẫn trứng là biến dạng của GIFT khi hợp tử IVF được đưa vàoống dẫn trứng với kết quả tương đương GIFT

CÁC BIỆN PHÁP SINH SẢN NHÂN TẠO ĐỘNG VẬT NUÔI

Thụ tinh nhân tạo

nước phát triển (vấn đề quan trọng là chọn lọc con giống)

Cấy chuyển phôi (Embryo transplantation)

trứng chín in-vitro, tạo hàng loạt phôi từ động vật năng suất cao, cắt phôi,…

cấy chuyển phôi bằng cách sử dụng mồi đặc hiệu nhiễm sắc thể

Y khuếch đại gen bằng PCR

vật khảm

Chó Ruppy dưới ánh sáng ban ngày

Phát sáng trong phòng tối có tia cực tím