SINH HÓA RỐI LOẠN CHUYỂN HÓA GLUCID Rối loạn trong hấp thu, rối loạn trong vận chuyển, ở đây chỉ nghiên cứu một bệnh điển hình là bệnh đái đường tụy. 1 - Hệ thống điều hòa đường máu Bình thường: glucose trong máu từ 0,8 - 1,2 g/l. Sự ổn định đó là do có hệ thống điều hòa đường máu (gan, các hormon) 1.1 - Gan Gan giữ vai trò trong việc điều hòa đường máu. Khi glucose < 0,8 g/l, gan sẽ tăng thoái hóa glycogen tạo glucose để đưa vào máu. Ngược lại khi glucose >1,2 g/l, gan sẽ tăng tổng hợp glycogen để giữ lại glucose 1.2- Hormon: * Hormon làm tăng đường máu gồm: - Adrenalin và glucagon, hai hormon này tham gia vào giai đoạn phosphoryl hóa glycogen để tạo glucose. Ngoài ra còn có các hormon khác: - Thyroxin kích thích chuyển hóa cơ bản. - Corticoid chuyển hóa đường: kích thích tạo glucid và protid. - GH: ức chế enzym hexokinase làm glucose không phosphoryl hóa được gây tăng đường máu * Hormon làm giảm đường máu: - Insulin làm tăng hoạt động của enzym hexokinase (giải thoát ức chế của GH) làm tăng sự phosphoryl hóa glucose gây giảm glucose máu. 2 - Hệ thống điều hòa đường máu Do thiếu Insulin (mắc bệnh về tụy) glucose chậm phosphoryl hóa dẫn đến glucose máu tăng lên, khi quá ngưỡng thận (1,7 g/l) sẽ xuất hiện glucose trong nước tiểu. Có những trường hợp glucose máu tăng từ 3-6 g/l và đường niệu rất cao. 2.1 - Cơ chế sinh bệnh: Thể cetonic gồm 3 chất: - Aceton: CH 3 - CO - CH 3 - Acetoacetic acid: CH 3 - CO - CH 2 - COOH - β hydroxybutyric acid: CH 3 - CH - CH 2 - COOH OH Khi insulin bị giảm hoặc không có, GH sẽ phát huy tác dụng, nó ức chế hexokinase, khi đó glucose không thoái hóa được sẽ tăng trong máu. Khi glucose quá ngưỡng thận (1,7 g/l) sẽ xuất hiện glucose niệu. Vì chu trình pentose không có nên không cung cấp được NADPH 2 cho việc tổng hợp acid béo từ acetyl CoA, acetyl CoA bị ứ đọng sẽ tạo thể cetonic, giai đoạn cuối của bệnh sẽ xuất hiện thể cetonic niệu, hơi thở có mùi aceton. Sự rối loạn chuyển hóa glucid, lipid gây rối loạn chức năng, thoái hóa các tổ chức biểu hiện bằng đục thủy tinh thể, tổn thương hệ mạch máu, xương, răng, nhiễm khuẩn da … gây trạng thái toan chuyển hóa, toan hô hấp. 2.2 - Lâm sàng: Ăn nhiều, uống nhiều, tiểu nhiều, gầy nhiều, giai đoạn cuối hôn mê do toan chuyển hóa 2.3 - Xét nghiệm: - Giai đoạn 1: Glucose máu tăng - Giai đoạn 2: Glucose niệu (+) - Giai đoạn 3: Cetonic niệu, pH máu giảm, dự trữ kiềm giảm, dự trữ kiềm giảm; bicarbonat chuẩn (SB), kiềm đệm (BB): giảm nhiều; kiềm dư (BE): rất âm. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NIỆU (Kỹ thuật so độ đục bằng bộ gam mẫu MESTREZAT) 1 - Nguyên tắc Protein niệu tác dụng với acid tricloacetic cho tủa trắng, đem so độ đục với bộ gam mẫu có nồng độ biết trước và cùng làm trong điều kiện tương tự như vậy. 2 - Chuẩn bị 2.1 Dụng cụ: - Cốc có chân 250ml - Pipet bầu 10ml (2) - Đĩa thủy tinh - Pipet bầu 5ml (2) - Phễu lọc - Pipet bầu 2ml (2) - Giấy lọc - Ồng nghiệm cùng cỡ (9) - Ồng đong 100ml (1) - Parafin (nến) - Bình định mức 500ml (1) - Bông mỡ - Bình cầu >100ml (9) - Pipet 1ml (1) - Pipet bầu 25ml (2) - Giá đựng ống nghiệm. 2.2 Thuốc thử - Acid tricloacetic 30% - Natriclorua 0,9% - 3 lòng trắng trứng gà tươi. 2.3 Bệnh phẩm: nước tiểu buổi sáng sớm, nước tiểu trong (nếu không trong phải lọc) 3 - Thao tác kỹ thuật 1 - Chuẩn bị đủ dụng cụ, thuốc thử, bệnh phẩm. 2 - Hút chính xác 2 ml nước tiểu trong 3 - Hút chính xác 0,2 ml acid tricloacetic 30% 4 - Lắc đều để 10 phút, so độ đục với bộ gam mẫu Mestrezat (nếu đục quá bộ gam mẫu, phải pha loãng nước tiểu bằng NaCl 0,9%). Khi tính kết quả phải nhân với độ pha loãng. 5 - Đọc kết quả trước một thang đen (quay lưng ra ánh sáng) 6 - Tác phong: sạch, gọn, đúng kỹ thuật, đúng thời gian (20-25 phút) 4 - Cách làm bộ gam mẫu Lấy 3 lòng trắng trứng gà tươi không lẫn lòng đỏ, đong thể tích của 3 lòng trắng trứng, thêm vào cùng thể tích bằng NaCl 0,9% đánh kỹ nổi bông. Thêm ba thể tích nữa (NaCl 0,9%) trộn đều, lọc lấy 23ml dịch trong, pha vừa đủ 500ml bằng NaCl 0,9%; dung dịch này chứa 1g/l albumin (pha trong bình định mức 500ml) dùng dung dịch này pha gam mẫu, chọn 9 bình cầu giống nhau, hút vào bình theo bảng sau: STT Các chất 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 Dung dịch albumin 1g/l (ml) NaCl 0,9% (ml) Nồng độ albumin (g/l) 5 95 0,05 10 90 0,1 13 87 0,13 17 83 0,17 22 78 0,22 28 72 0,28 36 64 0,36 46 54 0,46 60 40 0,6 Chọn 9 ống nghiệm cùng cỡ, cùng độ dày, không màu, trong suốt, cho vào mỗi ống 2ml dung dịch trên theo thứ tự từ 1 đến 9, thêm vào cả 9 ống mỗi ống 0,2ml acid tricloacetic 30%, hàn kín bằng bông mỡ có gắn parafin hoặc hàn kín như ống thuốc tiêm (có thể dùng ống nghiệm to nút lọ penicelin rồi hàn kín bằng parafin) dán nhãn, đánh số, ghi rõ nồng độ albumin trên mỗi ống, bảo quản trong tối, sau 3 ngày có thể dùng được. Khi bộ gam mẫu ngả màu vàng phải bỏ đi, mực nước ít đi cũng không dùng được (làm cho sai số tăng). 5 - Nhận định kết quả: Bình thường lượng protein quá thấp không phát hiện được bằng phương pháp thông thường (lượng protein niệu khoảng 30mg/l) Bệnh lý: protein niệu có thể tới 3g/l hoặc hơn gặp trong thận hư nhiễm mỡ, viêm thận, u thận, lao thận, sỏi thận. - Protein niệu không do thận: gặp trong sốt cao, nhiễm khuẩn, rối loạn tuần hoàn, bệnh cấp tính, thần kinh kịch phát, bệnh tim. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN TOÀN PHẦN TRONG HUYẾT THANH (Phản ứng Biuret - kỹ thuật wendell caraway) I - NGUYÊN TẮC Protein tác dụng với đồng sunfat trong môi trường kiềm, cho phức chất màu tím bền vững. Trong điều kiện xác định, đậm độ màu của phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ protein. II - CHUẨN BỊ 1 - Dụng cụ - Dụng cụ lấy máu tĩnh mạch - Giá ống nghiệm - Ống nghiệm to, nhỏ - Quả bóp to nhỏ - Pipet nhỏ giọt - Máy quang kế (bước sóng 530 - 560nm) cóng 1cm - Pipet 10ml (1) - Máy li tâm - Micropipet 0,1ml (1) 2 - Thuốc thử 2.1. Dung dịch Natrihydroxit bão hòa: (khoảng 18N) không lẫn carbonat: - Natrihydroxit viên: 200g - Nước cất: 200ml Hòa tan, nút kín để lắng nhiều ngày, gạn lấy phần dung dịch trong, bảo quản trong lọ nút kín (lọ polyetilen) 2.2. Dung dịch Natrihydroxit 10% (theo thể tích) không lẫn carbonat. - Dung dịch Natrihydroxit bão hòa: 42ml - Nước cất đun sôi, để nguội (vừa đủ): 300ml Lắc đều, bảo quản trong lọ polyetylen nút kín. 2.3. Thuốc thử Biuret (Biure) theo Gornall: - Đồng sulfat (CuSO 4 .5H 2 O): 1,5g - Natri Kalitactrat: muối seignette (NaKC 4 H 4 O 6 .4H 2 O): 6g - Nước cất 500ml Hòa tan rồi thêm: - Kali Iodua: 1g - Dung dịch NaOH 10%: 300ml Vừa cho vừ lắc rồi hoàn thành vừa đủ 1000ml bằng nước cất, lắc kỹ bảo quản trong lọ màu, nút kín để trong tối, bỏ đi khi có cặn. Tốt nhất là chỉ pha ít một để dùng. Nghĩa là để riêng dung dịch đồng sulfat và dung dịch NaOH 10% khi cần mới trộn lẫn theo như công thức qui định. 3 - Bệnh phẩm: Xét nghiệm trên huyết thanh không tan máu. Khi lấy máu bệnh nhân trước hết phải nằm nghĩ ít nhất 30 phút trước đó. Không được dùng dây garo vì máu ứ lại làm cho nồng độ protein tăng lên nhiều. III - THAO TÁC KỸ THUẬT 1 - Tiến hành: 1 - Chuẩn bị đủ dụng cụ, thuốc thử. 2 - Lấy máu đúng kỹ thuật 3 - Lấy huyết thanh không vỡ hồng cầu, dùng 2 ống nghiệm to: ống thử (T), ống trắng (Tr) 4 - Mao dẫn chính xác 0,1 ml huyết thanh vào ống thử (T) (hoặc 0,05ml huyết thanh) 5 - Hút chính xác 8ml thuốc thử Biuret vào ống thử, ống trắng (hoặc 4ml thuốc thử) 6 - Hút tráng micropipet vào ống thử (lấy hết lượng huyết thanh) 7 - Lắc thật đều, để tiếp xúc 30 phút 8 - Đo máy quang kế (bước sóng 560nm) cóng 1cm, đối chiếu nước cất. 9 - Tính kết quả dựa vào biểu đồ mẫu, hệ số protein, hoặc ống mẫu 10 - Tác phong: vô khuẩn, gọn, đúng kỹ thuật, đúng thời gian (70-80 phút) 2 - Vẽ biểu đồ mẫu 3 - Tính kết quả: có 3 cách - Tra trên biểu đồ mẫu: E thử thật (E TT ) tra trên biểu đồ mẫu - Dựa vào hệ số: C T = (E T - E Tr ) x hệ số protein (thay đổi tùy máy) - Dựa vào ống mẫu: ta có công thức: C T = E T (đậm độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ protein) C M E M Suy ra: Nếu dùng mẫu 1 ta có: Dựa vào ống mẫu là khách quan, chính xác nhất vì trong cùng điều kiện, so sánh giữa ống thử, ống mẫu là tốt nhất (phải có mẫu chuẩn) IV - NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ 1. Trị số bình thường Người lớn: 66 - 87 g/l 2. Bênh lý: - Tăng: trong bệnh u tủy, mất nước liên tục (nôn nhiều, ỉa chảy…), thiểu năng vỏ thượng thận (bệnh Addison) - Giảm: Thận nhiễm mỡ, suy dinh dưỡng, thoái hóa thận dạng tinh bột, viêm gan, xơ gan sau chọc tháo nước nhiều lần, bệnh tao keo… - Đề phòng tăng protein “giả” do cô đặc máu (nhiễm độc, say nắng…), giảm protein “giả” do hòa loãng máu (truyền nước quá nhiều). Kiểm tra bằng cách xác định thể tích máu hoặc hematocrit. ĐỊNH LƯỢNG CHOLESTEROL TOÀN PHẦN TRONG HT I - NGUYÊN TẮC Acidsulfosalicylic phá hủy protein của huyết thanh và các sợi dây nối lipid-protid đồng thời giải phóng cholesterol, chất này được định lượng trực tiếp bằng thuốc thử của phản ứng Liebermann-Burchard II - CHUẨN BỊ 1- Dụng cụ: - Dụng cụ lấy máu tĩnh mạch - Quả bóp to, nhỏ - Ống nghiệm (khô) (3) - Máy ly tâm - Pipet 2ml (3) - Máy quang kế (bước sóng 600nm) cóng 1cm - Micropipet (3) - Giá ống nghiệm - Pipet nhỏ giọt (1) 2- Thuốc thử: - Acid acetic (hóa nghiệm) - Alhydric acetic (hóa nghiệm) - Acidsulfuric hóa nghiệm (d=1,84) - Acid sulfosalicylic 12% (trong acid acetic hóa nghiệm): + Acid sulfosalicylic 12g + Acid acetic hóa nghiệm (vđ) 100ml - Cholesterol mẫu 0,2% trong acid acetic + Cholesterol mẫu 0,2g (cân thật chính xác) + Acid acetic hóa nghiệm (vđ): 100ml Pha trong bình định mức 100ml, lắc kỹ cho tan hết, để bảo quản trong tủ lạnh. Khi dung dịch có màu vàng không được dùng (thường dùng cholesterol chuẩn đã pha sẵn) III - THAO TÁC KỸ THUẬT: 1- Chuẩn bị đủ dụng cụ, thuốc thử. 2- Lấy máu đúng kỹ thuật, huyết thanh không vỡ hồng cầu. 3- Hút vào 3 ống nghiệm: trắng (Tr), thử (T), chuẩn (C) mỗi ống 0,6ml acid sulfosalicylic 12% 4- Hút chính xác 0,1ml cholesterol mẫu vào ống chuẩn (C) 5- Hút chính xác 0,1ml nước cất vào ống trắng (Tr) 6- Mao dẫn chính xác 0,1ml huyết thanh vào ống thử 7- Hút chính xác 1,5ml alhydrid acetic vào 3 ống 8- Lắc kỹ để nguội ở nhiệt độ phòng 9- Hút chính xác 0,2ml acidsulfuric vào 3 ống 10- Lắc đều, để 10 phút trong bóng tối sẽ xuất hiện màu xanh lá 11- Lắc đều, đo máy quang kế bước sóng 600nm (đối chiếu ống trắng) 12- Tính kết quả dựa vào ống mẫu 13- Tác phong: vô khuẩn, gọn, đúng kỹ thuật, đúng thời gian (80-90 phút) IV - TÍNH KẾT QUẢ E T - E Tr C cholesterol (g/l) = x 2 E C - E Tr V - NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ 1. Bình thường Cholesterol toàn phần thay đổi theo lứa tuổi, bình thường 150 - 260 mg/dl (4-6,7 mmol/l) 2. Bệnh lý: Cholesterol tăng, giảm trong các bệnh sau: Tăng: trong xơ vữa động mạch, cao huyết áp, xơ gan, vàng da tắc mật, đái đường, thận nhiễm mỡ, viêm thận mạn tính. Giảm: trong lao tiến triển, nhiễm khuẩn nặng kéo dài, thiểu năng thượng thận, viêm gan nặng, cường giáp, tan máu. ĐỊNH LƯỢNG CREATININ TRONG HUYẾT THANH VÀ NƯỚC TIỂU I - NGUYÊN TẮC Creatinin phản ứng với acid picric trong môi trường kiềm tạo hợp chất Picrat - Creatinin có màu vàng da cam (phản ứng jaffe’), đậm độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ Creatinin. II - CHUẨN BỊ 1- Dụng cụ: - Dụng cụ lấy máu tĩnh mạch - Ống nghiệm to nhỏ - Quả bóp to, nhỏ - Pipet 5ml (2) - Que thủy tinh nhỏ - Pipet 1ml (4) - Máy ly tâm - Pipet nhỏ giọt (1) - Nồi cách thủy (100 0 C) - Giá ống nghiệm (1) - Máy quang kế (bước sóng 530nm) cóng 1cm 2- Thuốc thử 2.1. NaOH 10% 2.2. Dung dịch acid picric bão hòa: Hòa tan 2g acid picric trong 100ml nước bằng cách đun cách thủy. Để 24h thỉnh thoảng lại khuấy lọc, dung dịch này bền vững (acid picric thường chứa 15 -> 20% nước, không được sấy khô vì có thể nổ). 2.3. Dung dịch acid clohydric (HCl) 0,1N 2.4. Dung dịch mẫu creatinin: - Mẫu gốc (mẫu mẹ): 100mg% Hòa tan 100mg creatinin vừa đủ 100ml (HCl 0,1N), để tủ lạnh. - Mẫu loãng (mẫu con): pha khi vẽ biểu đồ mẫu. + Lấy 0,5 -> 1 -> 1,2 -> 2 ml dung dịch creatinin mẫu mẹ cho vào 4 bình ngấn 100ml. + Thêm nước vào các bình, các dung dịch sẽ có nồng độ creatinin tương ứng với 0,5% -> 1% -> 1,2% -> 2%, dùng các dung dịch này để vẽ biểu đồ mẫu 3- Lấy bệnh phẩm: Huyết thanh, nước tiểu 24h (hoặc từng phần trong ngày) III - THAO TÁC KỸ THUẬT 1- Chuẩn bị đủ dụng cụ, thuốc thử, bệnh phẩm 2- Lấy máu đúng kỹ thuật, huyết thanh không vỡ hồng cầu 3- Nước tiểu pha loãng 1/100 4- Mao dẫn chính xác 0,5ml huyết thanh vào ống thử (1) 5- Hút chính xác 1ml nước tiểu vào ống thử (2) 6- Hút chính xác 3ml acid picric vào ống (1), (2) 7- Hút chính xác 1,5ml acid picric vào ống trắng (3) 8- Hút chính xác 0,5ml nước cất vào ống thử (1), 1,5ml nước cất vào ống (3) 9- Khuấy đều sau 5 phút, đặt cả 3 ống vào nồi cách thủy sôi 15 giây đến 20 giây 10- Ly tâm 2 ống thử (1) (2) 4000 -> 5000 vòng/phút trong 10 phút 11- Hút dịch trong của 3 ống ra 3 ống nghiệm khác (2ml mỗi ống) 12- Hút chính xác: 0,1ml NaOH vào mỗi ống 13- Để 20 phút sau, đem đo máy quang kế bước sóng 530nm, cóng 1cm (đọc đối chiếu ống trắng) 14- Tính kết quả dựa vào ống mẫu, hoặc biểu đồ mẫu 15- Tác phong: vô khuẩn, gọn, đúng kỹ thuật, đúng thời gian (120-130 phút) IV - TÍNH KẾT QUẢ 1 - Vẽ biểu đồ mẫu: Cho vào 4 ống nghiệm mỗi ống 0,5ml dung dịch creatinin loãng của các dung dịch có nồng độ creatinin tương ứng 0,5 -> 1 -> 1,2 -> 2 mg% 1 (ml) 2 (ml) 3 (ml) 4 (ml) Tr (ml) Creatinin loãng Acid picric (bão hòa) NaOH 10% Nước cất 0,5 1,5 0,1 0 0,5 1,5 0,1 0 0,5 1,5 0,1 0 0,5 1,5 0,1 0 0 1,5 0,1 0,5 Sau 20 phút, so màu như huyết thanh, đọc các ống 1,2,3,4 đối chiếu với ống trắng trong điều kiện trên, mật độ quang của các ống trong gam mẫu sẽ tương ứng với nồng độ creatinin 1, 2, 3, 4 mg creatinin/100ml huyết thanh hay 50, 100, 150, 200 mg creatinin/100ml nước tiểu 2- Tính kết quả - Tra kết quả đo được trên biểu đồ mẫu: - Dùng ống mẫu: Ví dụ: Ta dùng ống mẫu 2 của biểu đồ mẫu (ống này tương ứng với nồng độ creatinin 2mg% huyết thanh hoặc 100mg% trong nước tiểu Creatinin huyết thanh (mg/100ml) = Creatinin nước tiểu (mg/100ml) = E T : Mật độ quang của ống thử của huyết thanh hoặc nước tiểu - mật độ quang của ống trắng E M : Mật độ quang ống mẫu - mật độ quang ống trắng V - NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ 1- Bình thường: - Creatinin huyết thanh: Nữ: 0,6 - 1,1 mg/100ml = 53 - 97 μmol/l Nam: 0,5 - 0,9 mg/100ml = 44 - 80 μmol/l Trẻ em: 0,4 - 0,8 mg/100 ml - Creatinin nước tiểu Nam 1000 -> 1800 mg/24h Nữ 790 -> 1400 mg/24h Lượng creatinin trong nước tiểu thay đổi tùy người, nhưng rất ít thay đổi ở một số người có chức năng thận bình thường. 2- Bệnh lý: Tăng trong suy thận, viêm thận cấp, mạn, ure huyết cao; creatinin huyết thanh và nước tiểu có giá trị trong việc đánh giá chức năng thận qua độ thanh lọc của creatinin - độ thanh lọc giảm là suy thận nặng. . - Acid acetic (hóa nghiệm) - Alhydric acetic (hóa nghiệm) - Acidsulfuric hóa nghiệm (d=1,84) - Acid sulfosalicylic 12% (trong acid acetic hóa nghiệm): +. đoạn phosphoryl hóa glycogen để tạo glucose. Ngoài ra còn có các hormon khác: - Thyroxin kích thích chuyển hóa cơ bản. - Corticoid chuyển hóa đường: kích