Tìm hiểu về vi khuẩn Salmonella

MỤC LỤC TRANG Nhiệm vụ đồ án Lời cảm ơn i Mục lục ii Danh mục các hình v Danh mục các bảng vi Danh mục các từ viết tắt vii Chương I: Giới thiệu 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục đích 1 1.3 Nội dung nghiên cứu 1 Chương II: Tổng quan 2 2.1 Tổng quan về một số vi sinh vật nhiễm trong thực phẩm 2 2.1.1 Escherichia Coli 2 2.1.1.1 Giới thiệu 2 2.1.1.2 Phân loại 2 2.1.1.3 Đặc điểm 2 2.1.1.4 Yếu tố độc lực 3 2.1.1.5 Khả năng gây bệnh 9 2.1.1.6 Các thực phẩm liên quan 9 2.1.1.7 Biện pháp phòng ngừa và kiểm soát 9 2.1.2 Listeria monocytogenes 9 2.1.2.1Giới thiệu 9 2.1.2.2 Phân loại 10 2.1.2.3 Đặc điểm 10 2.1.2.4 Yếu tố độc lực 10 2.1.2.5 Khả năng gây bệnh 12 2.1.2.6 Các thực phẩm liên quan 12 2.1.2.7 Biện pháp phòng ngừa và kiểm soát 12 2.2 Tổng quan về Salmonella sp. 13 2.2.1 Lịch sử phát hiện 13 2.2.2 Phân loại 13 2.2.3 Đặc điểm 14 2.2.3.1 Đặc điểm chung và đặc điểm nuôi cấy 14 2.2.3.2 Tính chất hóa sinh 15 2.2.4 Cấu trúc của Salmonella 15 2.2.5 Yếu tố độc lực 17 2.2.5.1 Nội độc tố - Endotoxin 17 2.2.5.2 Độc tố đường ruột 18 2.2.5.3 Độc tố tế bào 19 2.2.6 Cơ chế gây bệnh 19 2.2.6.1 Cơ chế gây bệnh thương hàn 20 2.2.6.2 Cơ chế gây nhiễm khuẩn và nhiễm độc thức ăn 21 2.2.7 Nguồn gốc lây nhiễm 21 2.2.8 Tình hình nhiễm Salmonella ở Việt Nam và trên thế giới 22 2.2.8.1 Trên thế giới 22 2.2.8.2 Trong nước 23 2.3 Các phương pháp phát hiện Salmonella 24 2.3.1 Phương pháp truyền thống 24 2.3.1.1 Nguyên tắc 24 2.3.1.2 Phương pháp thực hiện 25 2.3.2 Phương pháp hiện đại 29 2.3.2.1 Phương pháp PCR 30 2.3.2.2 Phương pháp ELISA 34 2.4 Các biện pháp kiểm soát Salmonella trong thực phẩm 34 Chương III: Nội dung và phương pháp nghiên cứu 36 3.1 Địa điểm và thời gian 36 3.2 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 36 3.3 Vật liệu tiến hành thí nghiệm 36 3.3.1 Các dụng cụ và hóa chất thí nghiệm 36 3.3.2 Các môi trường sử dụng 36 3.4 Nội dung thực hiện 37 3.5 Phương pháp nghiên cứu 38 3.5.1 Quy trình phân tích 38 3.5.2 Thuyết minh quy trình 39 3.6 Kết quả 45 3.6.1 Kết quả cảm quan 45 3.6.2 Kết quả đánh giá mức độ nhiễm Salmonella 46 Chương IV: Kết luận và kiến nghị 47 4.1 Kết luận 47 4.2 Kiến nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

Chương I: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Trong những năm gần đây, vấn đề ngộ độc thực phẩm ngày càng trở nên cấpthiết, các báo cáo cho thấy phần lớn các vụ ngộ độc thực phẩm là do vi sinh vật Đã cónhiều cảnh báo, nhưng tình trạng ngộ độc thực phẩm vẫn đang leo thang và ngày càngnghiêm trọng

Có rất nhiều vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm, ví dụ như Clostridium butolinum, Escherichia Coli, Listeria monocytogenes… trong đó, Salmonella là loài vi sinh vật gây ngộ độc rất nguy hiểm Salmonella thuộc họ Enterobactriaceae, gây ra

bệnh thương hàn, nhiễm trùng huyết và nhiều bệnh nghiêm trọng khác

Xuất phát từ nhu cầu tìm hiểu về độc tố, khả năng gây bệnh và cách phát hiện

cũng như cách phòng phòng chống bệnh vi khuẩn Salmonella,tôi thực hiện nghiên cứu

đề tài “tìm hiểu về vi khuẩn Salmonella” để có cái nhìn tổng quan hơn về vi khuẩn Salmonella và một số chủng vi sinh vật khác.

1.2 Mục đích

- Tổng quan về một số loại vi sinh vật thường lây nhiễm vào thực phẩm

và tìm hiểu về Salmonella với độc tố của nó.

1.3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu về đặc điểm sinh hóa, sinh lý, kháng nguyên, độc tố và cơchế gây độc của một số chủng vi sinh vật

- Nghiên cứu về cách phát hiện Salmonella và đề xuất biện pháp phòng

ngừa

Chương II: TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan về một số vi sinh vật nhiễm trong thực phẩm

2.1.1 Escherichia Coli

2.1.1.1 Giới thiệu

- Escherichia Coli do Theodore Escherich (1857 – 1911), một bác sĩ nhi

khoa người Áo phát hiện năm 1885

- E.Coli là một trong những thành viên chính của hệ vi khuẩn bình thường

ở đường ruột, nhưng cũng là căn nguyên của nhiều bệnh nhiễm trùng

- E.Coli đã được sử dụng làm mô hình nghiên cứu về sinh học phân tử trong lĩnh vực vi sinh học nói riêng và sinh học nói chung Trong đó, chủng E.coli K12

là mô hình được nghiên cứu nhiều nhất Nhiều thành tựu về di truyền học, hóa sinh học

đã thu được dựa trên cơ sở nghiên cứu vi khuẩn này

- E.Coli là trực khuẩn, Gram âm, kích thước trung bình từ 2 – 3 µm × 0,5

µm Một số ít chủng E.Coli có vỏ, nhưng hầu hết đều có lông và có khả năng di động.

- E.Coli có khả năng lên men nhiều loại đường và có khả năng sinh hơi E.Coli có khả năng sinh Indol, không sinh H2S, không sử dụng được nguồn carbon của

citrat trong môi trường Simmons, có deoxycarboxylase nên có khả năng phân giảicarborxyl của lysin, ornithin, arginin và acid glutamic Thử nghiệm VP (Voges –Proskauer) sau 24h âm tính, sau 48h có thể dương tính

Hình 2.1 : Vi khuẩn Escherichia Coli

2.1.1.4 Yếu tố độc lực

- Người ta chia E.coli thành nhiều nhóm, mỗi nhóm sinh ra các loại độc tố

khác nhau, hiện có 5 nhóm chính : STEC (Shiga toxin-producing E.Coli) hoặc VTEC

(Verotoxigenic E.Coli) và EHEC (Enterohaemorrhagic E.Coli), EPEC (Enteropathogenic E.Coli), ETEC (Enterotoxigenic E.Coli), EAEC (Enteroaggregative E.Coli) và EIEC (Enteroinvasive E.Coli).

a) Nhóm STEC

- Hiện nay có khá nhiều thuật ngữ khác nhau để gọi tên cho nhóm E.Coli này Tên gọi Verotoxigenic E.Coli (VTEC) được Konowalchuk và cộng tác viên (1977)

đặt cho nhóm này khi phát hiện việc sản xuất độc tố gây độc cho dòng tế bào Vero Tên

gọi Enterohaemorrhagic E.Coli (EHEC) là do dòng này gây viêm kết tràng xuất huyết

và hội chứng huyết niệu (Nataro và Kaper, 1989) Và thuật ngữ Shiga toxin-producing

E.Coli (STEC) (trước đây gọi là Shiga-like toxin producing E.Coli - SLTEC) chỉ rõ khả

năng sản sinh độc tố gây độc tế bào giống như độc tố Shiga

- STEC sản xuất độc tố Shiga-like toxin (Slt), còn gọi là Shiga toxin (Stx)hay Verotoxin (VT) Họ độc tố Stx gồm hai nhóm chính không phản ứng chéo với nhau

là Stx1 và Stx2 Trong khi Stx1 có tính bảo tồn cao thì Stx2 rất thay đổi về trình tự, tạo

ra nhiều subtype như Stx2c, Stx2hb, Stx2e, Stx2g Một dòng STEC có thể sản sinh Stx1,Stx2 hoặc cả Stx1 và Stx2, và thậm chí nhiều dạng của Stx2

- Hai độc tố Stx1 và Stx2 đều được cấu tạo từ 5 tiểu đơn vị B có khốilượng phân tử 7,7 kDa và 1 tiểu đơn vị A có khối lượng phân tử 32 kDa Tiểu đơn vị Agồm peptide A1 28 kDa và peptide A2 4 kDa nối với nhau bằng cầu nối disulfur.Peptide A1 có hoạt tính enzyme và peptide A2 có nhiệm vụ gắn kết tiểu đơn vị A vàonhững tiểu đơn vị B Những tiểu đơn vị B giúp độc tố kết hợp với receptor đặc hiệu Gb3(globotriaosylceramide) hiện diện trên bề mặt của những tế bào eukaryote (Stx2e córeceptor là Gb4) Sau khi được chuyển vào bên trong tế bào, tiểu đơn vị A đến tế bàochất và tác động lên tiểu phần 60S của ribosome Peptide A1 có hoạt tính enzyme hoạtđộng như một N-glycosidase cắt một gốc adenin khỏi rRNA 28S của ribosome, do đógây trở ngại cho sự tổng hợp protein Do không tổng hợp được protein, những tế bào bịStx tác động (tế bào nội mô của thận, tế bào biểu mô ruột, tế bào Vero, tế bào Hela hay

bất cứ tế bào nào có receptor là Gb3, receptor Gb4 đối với Stx2e) sẽ chết Hậu quả gâyđộc cho tế bào ruột do Stx và các yếu tố độc lực khác của STEC là gây sự hư hại những

tế bào nhung mao ruột, gây tiêu chảy và viêm kết tràng xuất huyết (Haemorrhagic colitis– HC) Sự hư hại những tế bào thành mạch máu do Stx2e sẽ gây nên hiện tượng phùthủng ở heo

- Yếu tố bám dính của STEC/EHEC đã được chứng minh là đóng vai tròquan trọng trong sự định vị vi khuẩn ở ruột Đó chính là intimin, một protein màng

ngoài có trọng lượng phân tử 94 – 97 kDa Intimin được mã hóa bởi gen eae (E.Coli attaching and effacing) Intimin gây tổn thương dạng bám dính và phá hủy (attaching-

and-effacing, A/E) ở ruột già do vi khuẩn bám chặt vào tế bào biểu mô (Donnerberg và

ctv, 1993) Gen eae này cũng được tìm thấy ở nhóm EPEC Gen eae gây tổn thương

kiểu A/E là một trong số các gen nằm trên vùng gây bệnh 35,5 kb (gọi là vùng gây hưhại tế bào ruột – locus of enterocyte effacement, LEE) Vùng LEE của STEC/EHECchứa những gen mã hóa cho intimin, mã hóa receptor của intimin Tir (translocatedintimin receptor) và một số gen khác Vùng LEE không chỉ là điều kiện cần mà còn làđiều kiện đủ cho việc hình thành tổn thương A/E Tuy nhiên không phải tất cả STEC

đều có gen eae, nhưng tất cả EHEC đều có gen eae.

- Yếu tố khác có liên quan đến độc lực của STEC là việc tạo raenterohaemolysin (EHEC-Hly) và có thể cả độc tố ruột chịu nhiệt EAST1

(enteroaggregative heat – stabe toxin – 1) EHEC-Hly được mã hóa bởi gen trên plasmid

60 MDa (pO157) mà plasmid này được tìm thấy ở gần như tất cả các dòng O157:H7 và cũng khá phổ biến cả những dòng STEC non-O157 nữa (Nataro và Kaper, 1998) Trên plasmid này có sự hiện diện của một operon gồm 4 khung đọc mở (open reading frame ORF) là hlyCABD Trong đó hlyA là gen cấu trúc khởi đầu cho haemolysin Độc tố ruột chịu nhiệt EAST1 (đầu tiên được mô tả ở nhóm EAEC là EAEC heat-stable enterotoxin 1), cũng được tìm thấy ở nhiều dòng STEC Tầm quan trọng của EAST1 đối với khả năng gây bệnh của STEC vẫn chưa được biết, nhưng có ở một vài trường hợp tiêu chảy không có máu mà thường thấy ở những người nhiễm STEC.

b) Nhóm EPEC

- Các yếu tố độc lực chính bao gồm gen eae mã hóa protein itimin cần

thiết cho việc tạo ra tổn thương dạng A/E, plasmid 50 – 70 Mda ( EAF ) : mã hóa BFP

(bundle – forming pilus), PER (plasmid – encoded regulator) và Ler (LEE – encordedregulator) Các protein tiết : Tir, EspA, EspB, EspD, EspF, EspG và MAP( mitochondria – associated protein), EAST – 1 có khả năng phá hủy tế bào biểu mô vàCDT (Cytolethan distending toxin)

c) Nhóm ETEC

- Nhóm ETEC có hai nhóm quyết định độc lực chính là độc tố ruột(enterotoxin) và yếu tố định vị (colonization factor – CF)

- Độc tố ruột enterotoxin

+ Nhóm ETEC gồm những E.Coli tạo ra ít nhất một trong hai loại

độc tố đường ruột là ST và LT ETEC gây bệnh bằng cách vi khuẩn bám vào bề mặtmàng nhầy ruột non và tiết ra độc tố ruột, làm gia tăng tình trạng tiết dịch Nhóm ETEC

gây tiêu chảy thông qua sự tiết độc tố đường ruột LT và ST E.Coli nhóm này có thể chỉ

tiết độc tố LT, hoặc chỉ tiết ST, hoặc có thể tiết cả LT và ST

 Độc tố không chịu nhiệt (Heat-labile toxin - LT): Độc tố

LT của E.Coli là oligopeptide có liên hệ gần gũi về mặt cấu trúc và chức năng với độc

tố tả (cholera toxin – CT) do Vibrio cholerae tiết ra LT và CT giống nhau nhiều đặc tính như cấu trúc, trình tự acid amin (giống nhau khoảng 80%), tương đồng về receptor,

hoạt tính enzym, và tác động của nó trên thú hay nuôi cấy tế bào

 LT có 2 serogroup chính là LT-I và LT-II LT-I và LT-II

không có phản ứng chéo về mặt miễn dịch LT-I được tiết bởi những dòng E coli gây bệnh trên người và thú Còn LTII được tìm thấy chủ yếu ở E coli trên thú và hiếm khi ở người LT-I là một oligopeptide khoảng 86 kDa, được cấu tạo bởi 1 tiểu đơn vị A 28 kDa và 5 tiểu đơn vị B 11,5 kDa Tiểu đơn vị A chịu trách nhiệm trong hoạt tính enzyme của độc tố gồm peptide A1 và peptide A2 liên kết nhau bởi cầu nối disulfur Những tiểu đơn vị B sắp xếp thành vòng, liên kết chắc chắn với ganglioside GM1 và liên kết lỏng lẻo với GD1b và vài glycoprotein ruột – chúng là các receptor của LT Hai loại LT-I có liên hệ gần nhau và có thể phản ứng chéo một phần với nhau là LTp (LTp- I) đầu tiên được phân lập từ heo và LTh (LTh-I) được phân lập từ người Gen mã hóa cho LT là elt hay lt-I nằm trên plasmid mà plasmid này có thể chứa cả gen mã hóa ST và/hoặc gen mã hóa những kháng nguyên của yếu tố định vị (colonization factor antigen

- CFA)

 Sau khi độc tố đi vào nội bào, chúng di chuyển trong tế

bào nhờ hệ thống vận chuyển của Golgi Đích đến của LT trong tế bào là enzym adenylate cyclase nằm ở lớp màng ngoài của tế bào biểu mô ruột Peptide A1 có hoạt tính ADP-ribosyltransferase chuyển phần ADP-ribosyl từ NAD đến của protein liên kết GTP (GTP-binding protein) là GS, gây hoạt hóa enzyme adenylate cyclase, làm gia tăng AMP vòng (cAMP) trong tế bào Vì vậy enzyme cAMP-dependent protein kinase (A kinase) được họat hóa dẫn đến sự phosphoryl hóa kênh chloride (Cl-) ở màng tế bào

biểu mô vượt quá mức bình thường Kết quả dây chuyền là kích thích tế bào bên dưới tiết Cl- và ngăn cản sự hấp thụ NaCl bởi những tế bào có lông nhung Hàm lượng ion trong lòng ruột gia tăng kéo theo sự di chuyển thụ động của nước từ tế bào vào lòng ruột, gây tiêu chảy (Nataro và Kaper, 1998) Mặc dù sự kích thích của Cl- do sự gia tăng

lượng cAMP trong tế bào là cách giải thích cổ điển về cơ chế gây tiêu chảy của LT và

CT, ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy rằng đáp ứng tăng tiết đối với những độc

tố này có cơ chế phức tạp hơn Một cơ chế tác động khác của độc tố có liên quan đến những prostaglandin E (PGE1 và PGE2) và yếu tố hoạt hóa tiểu cầu Sự tổng hợp và

phóng thích những chất chuyển hóa của acid arachidonic như prostaglandin vàleukotriene có thể kích thích sự vận chuyển các chất điện giải và kích thích nhu độngruột Cơ chế tác động khác thứ hai có liên quan đến hệ thần kinh ruột (enteric nervoussystem – ENS) điều hòa nhu động và sự tiết ion ở ruột Cơ chế thứ ba là CT và LT gâyđáp ứng viêm ruột dạng nhẹ

 Nhóm LT-II giống với LT-I và CT khoảng 55 - 57% ởtiểu đơn vị A, nhưng không giống với LT-I và CT ở tiểu đơn vị B LT-II làm gia tăngcAMP trong tế bào qua cơ chế tương tự như LT-I, nhưng LT-II sử dụng GD1 làm

receptor thay vì GM1 Như đã nói ở trên, LT-II không có liên quan đến bệnh trên người

và thú

 Độc tố chịu nhiệt (Heat-stable toxin - ST): Ngược với

LT, ST có trọng lượng phân tử nhỏ và những cầu nối disulfur của nó giải thích cho khảnăng chịu nhiệt của độc tố này ST được chia thành 2 nhóm là STa và STb, khác nhau

về cấu trúc và cơ chế hoạt động Gen mã hóa cho cả 2 nhóm được tìm thấy chủ yếu trênplasmid và vài gen mã hóa ST cũng được tìm thấy trên transposon Sta (hay còn gọi là

ST-I) được tạo bởi ETEC và một vài vi khuẩn Gram âm khác như Yersinia

enterocolitica và V cholerae non – O1 ST giống 50% trình tự acid amin với độc tố chịu

nhiệt EAST1 của EAEC Gần đây, còn có báo cáo cho rằng một vài dòng của ETECcũng có thể sản sinh độc tố EAST1 ngoài độc tố STa Còn STb chỉ được tìm thấy ởETEC

 STa là một peptide gồm 18 -19 amino acid với trọnglượng phân tử khoảng 2 kDa STa được chia thành 2 loại là STp (ST porcine hay STIa)phân lập được đầu tiên trên heo và STh (ST human hay STIb) phân lập trên người Cả 2loại độc tố có thể được tìm thấy ở dòng ETEC người Receptor chính của STa làenzyme xuyên màng GCC (guanylate cyclase C) thuộc họ những enzyme receptorcyclase Sự kết hợp của STa vào GC-C kích thích hoạt tính GC, dẫn đến việc gia tănglượng cGMP nội bào Hoạt động này cuối cùng dẫn đến sự kích thích tiết Cl- hoặc ngăn

cản sự hấp thụ NaCl, gây ra sự tiết chất lỏng trong ruột STb: STb chủ yếu có liên quan

đến dòng ETEC phân lập từ heo mặc dù cũng có báo cáo về vài chủng ETEC ngườicũng sản sinh STb Không như STa, STb gây ra những tổn thương về mặt mô học trênlớp biểu mô ruột như mất tế bào nhung mao của biểu mô ruột và teo nhung mao mộtphần Receptor của STb chưa được biết rõ mặc dù gần đây người ta cho rằng độc tố cóthể kết hợp không đặc hiệu với màng tế bào chất trước khi vào trong tế bào Không tạo

ra sự tiết Cl- như STa, STb kích thích tế bào ruột tiết bicarbonat (HCO3-) STb không làmtăng cAMP hay cGMP nội bào mặc dù nó kích thích tăng lượng calci nội bào từ ngoạibào STb cũng kích thích phóng thích PGE2 và serotonin, từ đó người ta cho rằng ENS

có thể cũng có liên quan đến đáp ứng tiết gây ra bởi độc tố này (Hitotsubashi, 1992)

- Yếu tố định vị (CF): Cơ chế mà ETEC kết dính và cư trú trên lớp màng

nhầy ruột đã được nghiên cứu kỹ Để gây tiêu chảy, ETEC đầu tiên phải kết dính vào tếbào ruột non nhờ vào lông trên bề mặt của vi khuẩn, gọi là yếu tố định vị (CF) CFA cóthể được phân loại dựa trên đặc tính hình thái Có 3 loại chính gồm loại lông hình quecứng, lông hình que mềm có dạng bó, lông có cấu trúc mảnh mềm Gen của CFAthường được mã hóa trên plasmid, cũng là nơi mã hóa cho độc tố ST và/hoặc LT

d) Nhóm EAEC

- Những yếu tố độc lực chính của EAEC bao gồm các diềm bám dính kếttập AAF (aggregative adhesion fimbriae), yếu tố điều hòa bám dính kết tập aggR,protein Pet và độc tố EAST – 1 AFF được xem là yếu tố quyết định độc lực Ba loại

AAF đã được biết đến gồm AAF/I, AAF/II và AAF/III, trong đó loại I và loại II có cấutrúc bó, loại III có cấu trúc dạng sợi riêng biệt Các AAF tạo nên kiểu bám dính hìnhchồng gạch lên tế bào Hep – 2 Yếu tố aggR có vai trò điều hòa sự biểu hiện của cácAAF Protein Pet được tiết ra màng ngoài vi khuẩn gây ra sự tụ dịch và gây độc chobiểu mô tiêu hóa EAST – 1 có khả năng phá hủy tế bào biểu mô Ngoài các yếu tố độclực nêu trên, EAEC còn tiết ra một protein làm tan máu và làm mất thăng bằng vậnchuyển protein qua màng Các yếu tố độc lực nêu trên của EAEC chủ yếu được mã hóabởi các gen nằm trên plasmid có phân tử lượng 60 MDa Một số yếu tố độc lực được mãhóa trên các gen trên nhiễm sắc thể đang được nghiên cứu.

e) Nhóm EIEC

- EIEC gây bệnh chủ yếu do khả năng xâm nhập vào niêm mạc đại tràng.Khả năng xâm nhập được mã hóa bởi gen trên plasmid 140 MDa Các gen trên plasmidnày mã hóa cho các kháng nguyên xâm nhập (IpaA đến IpaD, Ipa: Invasion plasmid

antigen) EIEC còn có khả năng sản xuất độc ruột giống một số Shigella Gen mã hóa cho độc tố này có tên là sen (Shigella enterotoxin), cơ chế gây bệnh giống vi khuẩn lỵ.

EIEC xâm nhập vào trong tế bào biểu mô đại tràng, làm tiêu các túi thực bào và nhânlên trong bào tương, phá hủy tế bào và xâm lấn sang các tế bào khác

2.1.1.5 Khả năng gây bệnh

- E.Coli là nguyên nhân gây ra các bệnh như tiêu chảy, viêm đường tiết

niệu, viêm đường mật Là một trong những nguyên nhân chính gây ra bệnh nhiễmkhuẩn huyết, là căn nguyên thường gặp trong bệnh viêm màng não, viêm phổi ở trẻ mới

sinh E.Coli còn gặp trong nhiễm trùng ngoại khoa, nhiễm trùng trong bỏng.

- Trong các loại độc tố của E.Coli, độc tố Shiga là nguy hiểm nhất được

biết đến trên người, làm hủy hoại các vi nhung mao hấp thu của tế bào biểu mô ruột Nóxâm nhập vào tế bào biểu mô đại tràng, ức chế quá trình tổng hợp protein làm chết tếbào Hậu quả là gây viêm đại tràng xuất huyết, gây tiêu chảy phân như máu Nhữngtrường hợp họai tử nặng có thể gây thủng ruột

2.1.1.6 Các thực phẩm liên quan

- Các trung tâm kiểm soát dịch bệnh (CDC) tính rằng có 85% nguồn gốc

E.Coli có nguồn gốc là thực phẩm Trên thực tế, bất kỳ sự tiêu thụ thực phẩm nhiễm

phân (đặc biệt là phân gia súc) đều có thể dẫn đến việc nhiễm bệnh Các thực phẩmđược xác định là nguồn gây bệnh bao gồm thịt bò xay, thịt nai, xúc xích sấy khô (không

nấu chín), sữa chưa tiệt trùng, phô mai, nước trái cây chưa tiệt trùng, cỏ linh lăng, mầm

củ cải, rau và nước

2.1.1.7 Biện pháp phòng ngừa và kiểm soát

- Hiện nay chưa có biện pháp phòng ngừa đặc hiệu Để đề phòng nhiễm

khẩn đường tiêu hóa do E.Coli, thực hiện các biện pháp phòng ngừa không đặc hiệu

giống các loại vi khuẩn đường ruột khác

- Đề phòng nhiễm khuẩn đường tiết niệu do E.Coli : thực hiện về sinh

cùng hậu môn và bộ phận sinh dục ngoài Điều trị loại trừ các yếu tố nguy cơ khác vì

E.Coli là vi khuẩn gây bệnh cơ hội quan trọng.

2.1.2 Listeria monocytogenes

2.1.2.1 Giới thiệu

- Năm 1924, Muray và cộng sự trong quá trình nghiên cứu một dịch bệnhtrên các động vật được thí nghiệm, đã phân lập được một chủng vi sinh vật từ các hạchlympho của các động vật bị bệnh Sau đó ông lấy chủng vi khuẩn này tiêm cho các convật khỏe mạnh thì thấy có hiện tượng tăng bạch cầu đơn nhân (monocytosis), vì vậy ông

đặ tên cho nó là Bacillus monocytogenes Ba năm sau, tại Nam Phi, Pirie, khi đó đang nghiên cứu sự mang Yersinina pestis trên chuột, đã phân lập được từ gan chuột một chủng vi khuẩn và đặt tên cho nó là Listeria hepatolitica Loại vi khuẩn này hoàn toàn

không thể phân biệt được với chủng vi khuẩn của Muray Chính vì vậy, Pirie đã đề xuất

một tên mới cho các chủng vi khuẩn này, đó là Listeria monocytogenes.

- Các loài Listeria là trực khuẩn Gram dương, có kích thước ngắn (0,4 –

0,5 × 0,5 – 2,0 µm), chúng mọc trên các môi trường nuôi cấy không acid, không sinhnha bào Ở 20oC chúng di chuyển bằng lông mọc xung quanh thân (peritrichousflagella), nhưng sự di động không quan sát được ở 37oC Chúng là vi khuẩn kị khíkhông bắt buộc và có thể sinh trưởng trong một khoảng nhiệt độ dao động rộng từ 3 –

45oC (tối ưu là 30 – 36oC), mặc dù tốc độ mọc ở nhiệt độ thấp là rất chậm Chúng cũng

mọc trên một khoảng pH dao động rất rộng, một số chủng có thể mọc ở pH 9,6, nhưngđạt điều kiện tối ưu ở pH hơi kiềm hoặc môi trường trung tính.

Hình 2.2:

monocytomonogenes

2.1.2.4 Yếu tố độc lực

- Listeriolysin O (LLO) là yếu tố độc lực chính của Listeria

monocytigenes cho phép nó thoát khỏi sự thực bào LLO có khối lượng phân tử 58,6

kDa, hình thành bởi một chuỗi polypeptide đơn gồm 529 amino acids Trình tự đầu Nđại diện cho đặc điểm của trình tự dấu hiệu của vi khuẩn Gram dương điển hình: phầnđầu tiên có tính ái nước và mang điện tích dương được theo sau bởi 20 đầu kỵ nước.Trình tự này mã hóa trực tiếp cho protein và được phân cắt sau vị trí lysine 25 Kết quả

là LLO được bắt đầu từ amino acid 26, là một phân tử protein dài 504 aa và có trọnglượng phân tử 55,8 kDa

- LLO thuộc về họ độc tố gắn cholesterol được hoạt bởi nhóm thiol đượctạo bởi hầu hết các vi khuẩn Gram dương Hoạt tính ly giải của các độc tố này bởi giảmbớt một số tác nhân và bị kìm hãm bởi sự oxy hóa và biểu hiện khi có cholesterol hoặckháng thể kháng streptolysin O Cytolysin được hoạt hóa bởi thiol có một cystein đơn ởvùng đầu C làm cho chúng dễ bị bất hoạt bởi sự oxy hóa mặc dù cystein này có thể đượcthay thế bằng alanine mà không làm mất chức năng ly giải Chúng tạo nên những lỗkhông liên tục với đường kính bên trong lên đến 30 nm trong những màng chứacholesterol Cơ chế hoạt động của chúng dựa vào sự tương tác với cholesterol có chứcnăng không chỉ là vị trí gắn kết mà còn như một tác nhân làm thay đổi hoạt động củaenzyme dẫn đến quá trình oligomer hóa của khoảng 20 – 80 toxin monomer thành cấutrúc vòng hoặc giống vòng cung

- Hoạt tính dung huyết của LLO có liên quan đến pH của môi trường: nóhoạt động cao nhất ở pH 5,5 và gần như bị bất hoạt ở pH 7,0 Trái lại, các độc tố đượchoạt hóa ở gốc thiol có phổ pH hoạt động rộng hơn như pH 6.0 đối với pneumolysin, pH6.5 đối với perfringolysin O và alveolysin, pH 7.0 đối với streptolysin O Sự phát hiệnnày có thể giải thích vai trò của LLO trong quá trình xâm nhiễm của LM Sau quá trìnhthực bào, môi trường acid của không bào chứa tế bào vi khuẩn sẽ hoạt hóa LLO Chínhđộc tố này sẽ xúc tiến quá trình ly giải không bào và tế bào vi khuẩn xâm nhập vào tếbào chất trong khi đó môi trương pH cao hơn sẽ làm giảm hoạt tính của LLO Sự hư hạicủa màng tế bào chủ cũng bị ngăn cản bởi sự phân hủy nhanh của LLO trong tế bào chất

do sự nhận biết của một trình tự giống PEST Một trình tự amino acid giàu Proline (P),glutamic acid (E), serine (S) và threonine (T) được gọi là PEST và protein đích để phânhủy Trong đầu N của LLO nằm ở vùng 19 aa (từ 32 – 50) chứng minh đặc điểm này.Một điều thú vị khi loại bỏ motif giống PEST này không chỉ nâng cao độc lực của LLO

mà còn sửa đổi các yếu tố độc lực của vi khuẩn LM bị đột biến, thiếu trình tự PESTLLO, được chứng minh là việc thoát ra khỏi không bào thực bào theo một con đường rấtkhó khăn Điều này chứng tỏ rằng vùng này cũng rất quan trọng cho quá trình phá hủymàng

- Nguồn lây nhiễm Listeria chủ yếu là từ gia cầm, những kết quả theo dõi

gần đây cho thấy, hơn 62% mẫu thịt gà sống có khả năng bị nhiễm khuẩn Tỷ lệ nhiễm

L.monocytogenes ở thịt chín ít hơn thịt sống nhưng cũng có khả năng gây ra bệnh

Listeriosis trên người

- Listeria monocytogenes cũng đến từ các nguồn khác như patê, rau (kể cả

loại salad đóng sẵn), hải sản đặc biệt là thịt cua và cá hun khói, trong các sản phẩm đônglạnh

2.1.2.7 Biện pháp ngăn ngừa và kiểm soát

- Làm sạch bề mặt tiếp xúc với thực phẩm, có thể dùng cồn hoặc kết hợpvới amoni 4 để tăng hiệu suất khử trùng Thực phẩm lưu trữ cần được giữ lạnh dưới 4oC

để đảm bảo an toàn

- Thực hiện các biện pháp vệ sinh an toàn vệ sinh thực phẩm cho cộngđồng Kiểm tra các cơ sở giết mổ cung cấp thịt cho thị trường Đối với cá nhân, thựchiên vệ sinh ăn uống, ăn chín, uống sôi, rửa tay trước khi ăn, diệt khuẩn, diệt ruồi

- Phát hiện người mang vi khuẩn, đặc biệt là những người có liên quantrực tiếp đến ăn uống của tập thể như cấp dưỡng của các cơ quan, người chế biến thức

ăn, người phục vụ ở các nhà hàng ăn uống

- Chuẩn đoán sớm và cách ly bệnh nhân kịp thời, xử lý chất thải của bệnhnhân Đối với súc vật bị bệnh cần chữa triệt để hoặc tiêu hủy

2.2 Tổng quan về Salmonella sp.

2.2.1 Lịch sử phát hiện

- Năm 1885 Slamon và Smith (Mỹ) tìm được Salmonella từ lợn mắc bệnh dịch tả và gọi tên là Bacilus cholerasuis, hiện nay gọi là Salmonella Nhưng sau đó

Schweinittz và Dorset 1903 đã chứng minh bệnh dịch tả là do một loại vi rút gây nên và

đã xác định S.choleraesuis là vi khuẩn gây bệnh phó thương hàn.

- Năm 1888 A.Gartner phân lập được mầm bệnh từ thịt bò và lách người

bệnh, ông gọi vi khuẩn này là Bacillus enteritidis và ngày nay vi khuẩn này được gọi là S.enteritidis Vi khuẩn này cũng được gọi bằng nhiều tên khác như: Bacterium enteritidis, Bacillus gartner…

- Năm 1889 Klein phân lập được S.gallinarum và Rettger cũng đã phân lập được S.pullorum năm 1909 Trước đây người ta cho rằng đây là hai loại vi khuẩn gây ra hai bệnh khác nhau lên đã gọi chung là bệnh phó thương hàn gà (Typhus avium) và căn bệnh

có tên chung là S.gallinarum –pullorum.

- Năm1896 C.Archard và Rbensauded đã phân lập được vi khuẩn

S.paratyphi equi và S.paratyphi bacilus Ngày nay vi khuẩn này được gọi tên là S.paratyphi B và đến năm 1898, S.paratyphi A đã tìm được do N.Guyn và H Keyser

 Giống: Salmonella lignieres 1900

- Lúc đầu, các loài Salmonella được đặt tên theo hội chứng lâm sàng của chúng như S.typhi hay S.paratyphi A, B, C (typhoid = bệnh thương hàn, para = phó), hoặc theo vật chủ như S.typhimurium gây bệnh ở chuột (murine = chuột), về sau người

ta thấy rằng 1 loài Salmonella có thể gây ra nhiều hội chứng và có thể phân lập được ở nhiều loài khác nhau Vì những lý do đó mà các chủng Salmonella mới phát hiện được đặt tên theo nơi mà nó được phân lập như S.teheran, S.congo, S.london.

- Salmonella đã từng được chia thành các chi phụ và nhiều loài, mỗi loài

lại có khả năng có chi phụ Ví dụ như loài Salmonella enterica được chia thành 6 loài

phụ gồm S.enterica, S.salamae, S.arizonae, S.diarizonae, S.houtenae và S.indica.

- Bằng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại, những nghiên cứu sau này

cho phép xếp tất cả các loại Salmonella vào 1 loài duy nhất Mặc dù ý kiến này đã được

nêu ra nhưng cách truyền thống đã được sử dụng quá quen và có ý nghĩa riêng nên nókhông được chấp nhận

- Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, chủ yếu là kháng nguyên thân O và

kháng nguyên lông H, Salmonella được chia thành các nhóm và các type huyết thanh Hiện nay được xác định gồm trên 2500 type huyết thanh Salmonella.

2.2.3 Đặc điểm

2.2.3.1 Đặc điểm chung và đặc điểm nuôi cấy

- Salmonella là trực khuẩn Gram âm, kích thước trung bình từ 2 – 3 x 0,5 – 1 µm, di chuyển bằng tiên mao trừ S gallimarum và S pullorum, không tạo bào tử,

chúng phát triển tốt ở nhiê ̣t đô ̣ 60C – 420

C, thích hợp nhất ở 350C – 370

C, pH từ 6 – 9và thích hợp nhất ở pH = 7,2 Ở nhiê ̣t đô ̣ từ 180C – 400C vi khuẩn có thể sống đến 15ngày

- Salmonella là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi phát triển được trên các môi

trường nuôi cấy thông thường Trên môi trường thích hợp, vi khuẩn sẽ phát triển sau 24giờ Có thể mọc trên những môi trường có chất ức chế chọn lọc như DCA (deoxycholatecitrate agar) và XLD (xylose lysine deoxycholate), trong đó môi trường XLD ít chất ức

chế hơn nên thường được dùng để phân lập Salmonella Khẩn lạc đặc trưng của

Salmonella trên môi trường này là tròn, lồi, trong suốt, có tâm đen, đôi khi tâm đen lớn

bao trùm khẩn lạc,môi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ

glucose và sinh hơi Thường không lên men sucrose, salicin và inositol, sử dụng đượccitrate ở môn trường Simmons.

- Tuy nhiên không phải loài Salmonella nào cũng có những tính chất trên, các ngoại lệ được xác định là S.typhi lên men đường glucose không sinh hơi, không sử dụng citrate trong môi trường Simmon, hầu hết các chủng S.paratyphi và S.Cholerasuis

không sinh H2S, khoảng 5% các chủng Salmonella sinh độc tố sinh bacteriocin chống lại

E.Coli, Shigella và ngay cả 1 số chủng Salmonella khác.

2.2.4 Cấu trúc của Salmonella

- Salmonella có ba loại kháng nguyên, đó là những chất khi xuất hiện

trong cơ thể thì tạo ra kích thích đáp ứng miễn dịch và kết hợp đặc hiệu với những sảnphẩm của sự kích thích đó, gồm: kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H và kháng

nguyên vỏ K Vi khuẩn thương hàn (S.typhi) có kháng nguyên V (Virulence) là yếu tố

chống thực bào giúp cho vi khuẩn thương hàn phát triển bên trong tế bào bạch cầu

- Kháng nguyên vách tế bào (kháng nguyên thân O)

+ Thành phân cơ bản là vách tế bào có cấu trúc phức ta ̣ p gồm 2lớp Trong cùng là một lớp peptidoglycan mỏng, cách một lớp không gian chu chất vàtới lớp màng ngoài (outer membrane) là phức hợp lipidpolysaccharide gồm lipoprotein

và lipopolysaccharide

+ Bao bên ngoài lớp peptidoglycan là lớp phospholipid A và B(quyết định độc tố của Nội độc tố), sau đó là hai lớp polysaccharide không mang tínhđặc hiệu Kháng nguyên của nội độc tố có bản chất hóa học là lypopolysaccharide

(LPS) Tính đặc hiệu của kháng nguyên O và LPS là một, nhưng tính miễn dịch thì khácnhau : kháng nguyên O ngoài LPS còn bao gồm cả lớp peptidoglycan nên tính sinh miễndịch của nó mạnh hơn LPS Màng ngoài có cấu trúc gần giống tế bào chất nhưngphospholipid hầu như chỉ gặp ở lớp trong, còn ở lớp ngoài là lipopolysaccharide dàykhoảng 8- 10 nm gồm 3 thành phần : Lipid A, polysaccharide lõi, kháng nguyên O.Màng ngoài còn có thêm các protein: Protein cơ chất: porin ở vi khuẩn còn gọi làprotein lỗ xuyên màng với chức năng cho phép một số loại phân tử đi qua chúng nhưdipeptide, disaccharide, các ion vô cơ Protein màng ngoài: chức năng vận chuyển một

số phân tử riêng biệt và đưa qua màng ngoài Lipoprotein: đóng vai trò liên kết lớppeptidoglycan bên trong với lớp màng ngoài

- Kháng nguyên lông (kháng nguyên H)

+Kháng nguyên H: Chỉ có ở các Salmonella có lông Hầu hết Salmonella đều có lông chỉ trừ S.galilarum, S.pulorum gây bệnh cho gia cầm Kháng

nguyên H là một loại kháng nguyên có bản chất là protit, kém bền hơn kháng nguyên O.Kháng nguyên H rất dễ bị phá huỷ ở nhiệt độ cao hoặc xử lý bằng cồn, axit yếu

+ Kháng nguyên H chia làm 2 phase :

 Phase 1: Có tính chất đặc hiệu gồm có 28 loại khángnguyên lông được biểu thị bằng chữa số La tinh thường: a, b, c…

 Phase 2: Không có tính chất đặc hiệu, loại này có thể

ngưng kết với các loại khác đôi khi thành phần này có thể gặp ở E.coli Pha 2 gồm có 6

loại được biểu thị bằng chữa số Ả Rập 1-6 hay chữa số La Tinh e, n, x…

- Kháng nguyên vỏ K

+ Kháng nguyên K: Không phức tạp, có một kháng nguyên vỏ là

kháng nguyên Vi và cũng có ở 2 type huyết thanh S.typhi và S.paratyphi Kháng

nguyên Vi – angtigen được Felix và các cộng sự phát hiện năm 1935 Kháng nguyên Vigây hiện tượng ngưng kết chậm và xuất hiện các hạt vỏ, kháng nguyên Vi là khángnguyên vỏ bao bọc bên ngoài kháng nguyên O, khánh nguyên Vi không tham gia vàoquá trình gây bệnh

2.2.5 Yếu tố độc lực

- Vi khuẩn Salmonella có thể tiết ra 2 loại độc tố: Ngoại độc tố và nội độc

tố

+ Nội độc tố của Salmonella rất mạnh gồm 2 loại: Gây xung huyết

và mụn loét, độc tố ở ruột gây độc thần kinh, hôn mê, co giật

+ Ngoại độc tố chỉ phát hiện khi lấy vi khuẩn có độc tính cao chovào túi colodion rồi đặt vào ổ bụng chuột lang để nuôi, sau 4 ngày lấy ra, rồi lại cấytruyền như vậy từ 5 đến 10 lần, sau cùng đem lọc, nước lọc có khả năng gây bệnh chođộng vật thí nghiệm Ngoại độc tố chỉ hình thành trong điều kiện invivo và nuôi cấy kỵkhí Ngoại độc tố tác động vào thần kinh và ruột

2.2.5.1 Nội độc tố - Endotoxin

- Màng ngoài tế bào vi khuẩn gram âm nói chung và vi khuẩn Salmonella

nói riêng, được cấu tạo bởi thành phần cơ bản là lipopolysaccharide (LPS) LPS có cấutạo phân tử lớn, gồm 3 vùng riêng biệt với đặc tính và chức năng riêng biệt: Vùng ưanước, vùng lõi và vùng lipit A

- Vùng ưa nước bao gồm một chuỗi polysaccharide chứa các đơn vị cấutrúc kháng nguyên O Vùng lõi có bản chất là acid heterooligosaccharide, ở trung tâmnối kháng nguyên O với vùng lipit A Vùng lipit A đảm nhận chức năng nội độc tố của

vi khuẩn Cấu trúc nội độc tố gần giống cấu trúc của kháng nguyên O Cấu trúc nội độc

tố biến đổi sẽ dẫn đến sự thay đổi độc lực của Salmonella.

- Nội độc tố thường là lipopolysaccharide (LPS) được phóng ra từ vách tếbào vi khuẩn khi bị dung giải Trước khi thể hiện độc tính của mình, LPS cần phải liênkết với các yếu tố liên kết tế bào hoặc các receptor bề mặt các tế bào như: Tế bào lâm bacầu B, lâm ba cầu T, tế bào đại thực bào, tiểu thực bào, tế bào gan, lách.Rất nhiều các cơquan trong cơ thể chịu sự tác động của nội độc tố LPS: Gan, thận, cơ, hệ tim mạch, hệtiêu hoá, hệ thống miễn dịch; với các biểu hiện bệnh lý: Tắc mạch máu, giảm trương lực

cơ thiếu oxy mô bào, toan huyết, rối loạn tiêu hoá, mất tính thèm ăn…

- Nội độc tố tác động trực tiếp lên hệ thống miễn dịch của cơ thể vật chủ,kích thích hình thành kháng thể

- LPS tác động lên các tế bào tiểu cầu, gây sốt nội độc tố, theo cơ chế :

+ Giải phóng các chất hoạt động mạnh như: Histamin

+ Ngưng kết các tiểu cầu động mạch

+ Đông vón, tắc mạch quản

- LPS tác động lên quá trình trao đổi gluxit: LPS làm tăng cường hoạt lựccủa các men phân giải glucoz, các men phân giải glycogen, làm giảm hoạt lực các mentham gia quá trình tổng hợp glycogen…

2.2.5.2 Độc tố đường ruột

- Về cơ chế miễn dịch và di truyền các Enterotoxin của Salmonella có

quan hệ gần gũi với Choleratoxin, nên được gọi là Choleratoxin like enterotoxin (CT)

Còn về đặc tính sinh học Enterotoxin của Salmonella không chỉ với giống CT mà còn giống với Enterotoxin của E.Coli.

- Độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella có hai thành phần chính:

Độc tố thẩm xuất nhanh Rapid permeability facto (RPF) và độc tố thẩm xuất chậmDelayed permeability facto (DPF)

- RPF giúp Salmonella xâm nhập vào tế bào biểu mô của ruột, nó thực

hiện khả năng thẩm xuất sau 1-2 giờ và kéo dài 48 giờ và làm trương các tế bào CHO(Chinese Hamster Ovary cell) Độc tố thẩm xuất nhanh có cấu trúc, thành phần giống

với độc tố chịu nhiệt của E.Coli, được gọi là độc tố chịu nhiệt của Salmonella ST có

khả năng chịu được nhiệt độ 1000C trong 4 giờ, bền vững ở nhiệt độ thấp, có thể bảoquản ở nhiệt độ -20oC Cấu trúc phân tử gồm một chuỗi polysaccharide và một chuỗipolypeptide

- RPF kích thích co bóp nhu động ruột, làm tăng sự thẩm thấu thành mạch,

phá huỷ tổ chức tế bào biểu mô ruột, giúp vi khuẩn Salmonella xâm nhập vào tế bào và

phát triển tăng nhanh về số lượng Vi khuẩn tích cực tăng cường sản sinh độc tố làm rốiloạn cân bằng trao đổi muối, nước và chất điện giải Quá trình bệnh lý đường ruột và hộichứng tiêu chảy càng thêm phức tạp và nghiêm trọng

- DPF của Salmonella có cấu trúc, thành phần giống độc tố không chịu nhiệt của vi khuẩn E.Coli, nên được gọi là độc tố không chịu nhiệt của Salmonella Nó

thực hiện chức năng phản ứng chậm từ 18-24 giờ LT bị phá huỷ ở 700C trong vòng 30phút và ở 560C trong vòng 4 giờ LT có cấu trúc gồm 3 chuỗi polypeptid

- DPF làm thay đổi quá trình trao đổi nước và chất điện giải, dẫn đến tăngcường bài xuất nước và chất điện giải từ mô bào vào lòng ruột, cản trở sự hấp thu, gâythoái hoá lớp tế bào villi của thành ruột, gây tiêu chảy

2.2.5.3 Độc tố tế bào

- Khi cơ thể người và động vật bị tiêu chảy thì kèm theo hiện tượng mấtnước và mất chất điện giải là hiện tượng hàng loạt các tế bào biểu mô ruột bị phá huỷhoặc bị tổn thương ở các mức độ khác nhau Sự phá huỷ hay tổn thương đó là do độc tố tế

bào của Salmonella gây nên, theo cơ chế chung là: Ức chế tổng hợp protein của tế bào

Eukaryotic và làm trương tế bào CHO

- Ít nhất 3 dạng độc tố của tế bào:

+ Dạng thứ nhất: Không bền vững với nhiệt và mẫn cảm với

trypsin Dạng này được phát hiện ở rất nhiều serovar Salmonella; có trọng lượng phân

tử trong khoảng từ 56 đến 78 kDa; không bị trung hoà bởi kháng thể kháng độc tốShigella toxin hoặc Shigella - like Độc tố dạng này tác động theo cơ chế là ức chế tổnghợp protein của tế bào Hela và làm teo tế bào

+ Dạng thứ hai: Có nguồn gốc từ protein màng ngoài tế bào vi

khuẩn có cấu trúc và chức năng gần giống các dạng độc tố tế bào do Shigella và các

chủng (ETEC) sản sinh ra Dạng độc tố này cũng phổ biến ở hầu hết các serovar

Salmonella gây bệnh.

+ Dạng thứ ba: Có trọng lượng phân tử khoảng 62 kDa; có liên hệvới độc tố Hemolysin Hemolysin liên hệ với các độc tố tế bào có sự khác biệt với cácHemolysin khác về trọng lượng phân tử và phương thức tác động lên tế bào theo cơ chếdung giải các không bào nội bào

2.2.6 Cơ chế gây bệnh

- Tất cả các kiểu huyết thanh Salmonella đều mang cụm gen inv

(invasion) giúp cho quá trình xâm nhiễm vào trong thành ruột của người và động vật,

mở đầu của tiến trình gây bệnh Cụm gen này nằm trong hệ thống gen SPI - 1

(Salmonella pathogenicity island) có mặt trong tất cả các Salmonella, từ nhóm tiến hoá thấp nhất là S.bongori đến nhóm tiến hoá cao nhất là S.enterica.

2.2.6.1 Cơ chế gây bệnh thương hàn

- Bệnh thương hàn do S.typhi và S.paratyphi A, B, C gây ra Các yếu tố

độc lực chính của vi khuẩn thương hàn là khả năng bám và xâm nhập vào tế bào chủ,

khả năng nhân lên trong đại thực bào và nội độc tố Kháng nguyên Vi có mặt ở S.typhi

và S.pararatyphi C là yếu tố độc lực quan trọng, những chủng vi khuẩn gây bệnh

thương hàn không có kháng nguyên Vi thì số lượng cần thiết để gây bệnh cao hơn rấtnhiều so với những chũng có kháng nguyên này

- Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêu hóa do thức ăn hay nướcuống bị nhiễm bẩn, số lượng cần thiết để gây bệnh vào khoảng 105 đến 107

- Đầu tiên, vi khuẩn thương hàn phải vượt qua môi trường axit của dạ dày,

mặc dù chúng có khả năng đề kháng với axit nhờ có gen art (acid response tolerance),

nhưng ở người bình thường, vi khuẩn thương hàn không thể tồn tại lâu, nuôi cấy dịch dạdày âm tính sau 30 phút Sau khi vượt qua được rào cản ở dạ dày, vi khuẩn di chuyểnxuống ruột non rồi nhân lên ở đó, nhưng trong tuần đầu sẽ có 1 ít vi khuẩn đào thải theophân, cấy phân dương tính trong 5 ngày không có nghĩa là bệnh thương hàn sẽ xảy ra

Từ ruột non, vi khuẩn thương hàn đi vào hạch mạc treo ruột nhờ tế bào M, một đại thựcbào của mảng Peyer Sau đó theo đường bạch huyết và máu gây nhiễm trùng toàn thân.Sau khoảng một tuần, nhiễm khuẩn huyết thứ phát xuất hiện Vi khuẩn theo gan quađường mật lại tiếp tục xâm nhập vào ruột non, tiếp tục nhân lên ở các mảng Peyer Từmáu, vi khuẩn tới lách và các cơ quan khác Trong ruột non, vi khuẩn chết và giải phóng

ra nội độc tố Nội độc tố kích thích dây thần knh giao cảm ở ruột gây ra hoại tử chảymáu và có thể gây thủng ruột, vị trí gây tổn thương thường nằm ở các mảng Peyer Đây

là biến chứng hay gặp ở cá bệnh nhân ăn sớm khi chưa bình phục, nhất là ăn các thức ăncứng Nội độc tố theo máu lên hệ thần kinh và kích thích trung tâm thần kinh thực vật ởnão thất ba Giai đoạn toàn phát bệnh, bệnh nhân sốt cao, biểu đồ thân nhiệt tăng lêntheo thởi gian Thân nhiệt tăng những nhiệt độ không tăng gây ra hiện tượng mạch vànhiệt độ phân ly

- Thời kì chưa có điều trị bằng kháng sinh, khoản một tuần ủ bệnh, diễnbiến điển hình của bệnh thương hàn trải qua 4 giai đoạn, mỗi giai đoạn khoảng mộttuần, Tuần thứ nhất thân nhiệt tăng cao, tuần thứ hai thì đau bụng, gan và lách to dồngthời có sự xuất hiện của các đốm hồng trên da, tuần thứ 3 có thể xuất hiện thêm các biếnchứng như xuất huyết, thủng ruột, tuần thứ 4 sẽ xuất hiện thêm các biến chứng nguyhiểm dẫn đến tử vong, nếu không bệnh nhân sẽ bình phục

- Bệnh nhân thường đau đầu, buồn nôn hoặc nôn, chướng bụng, tiêuchảy, khoản 50% bệnh nhân sờ thấy gan và lá lách dưới sườn Những trường hợp nặngthường có dấu hiệu ly bì, hôn mê, trụy tim mạch, không chữa trị kịp thời có thể dẫn đến

tử vong Những biến chứng khác như viêm phổi cấp,, viêm màng não, viêm gan, viêmtủy xương cũng có thể gặp

- Những bệnh nhân qua khỏi có khoảng 5 – 10% vẫn tiếp tục thải vi khuẩnqua phân trong quá trình hồi phục và 1- 4% trở thành người mang vi khuẩn lâu dài do vikhuẩn vẫn tồn tại trong túi mật Tình trạng này có thể kéo dài đến nhiều năm và họ trởthành nguồn mang bệnh rất nguy hiểm.

2.2.6.2 Cơ chế gây nhiễm khuẩn và nhiễm độc thức ăn

- Bênh thường xảy ra do ăn phải thức ăn bị nhiễm Salmonella, nhưng cũng có thể lây truyền trực tiếp Căn nguyên thường do vi khuẩn S.enteritidis và

S.typhimurium.

- Vi khuẩn xâm nhập qua ruột non nhờ các tế bào M của mảng Peyer

Trên bộ gen của Salmonella có các tác nhân gây ức chế các chất kháng khuẩn có trong

lysosome, biến đổi tế bào chủ đảm bảo cho sự tồn tại của vi khuẩn, làm cản trở hoạtđộng nội bào như giảm lượng NADH oxidase rất cần thiết cho việc sản xuất các hợpchất kháng khuẩn

- Sự hủy hoại của đại thực bào và các tế bào biểu mô lân cận, sự chết của

vi khuẩn giải phóng nội độc tố đã gây nên tổn thương cho cơ thể vật chủ và gây ra cáctriệu chứng

- Thời gian ủ bệnh trung bình từ 10 – 48 giờ Sau thời gian ủ bệnh, ngườinhiễm thường có biểu hiện như sốt, nôn, đau bụng và tiêu chảy Mức độ sốt khác nhautùy vào thể trạng từng người, tiêu chảy phân thường không có máu Ở người lớn thườngchỉ dẫn đến tình trạng rối loạn đường tiêu hóa, nhưng ở trẻ sơ sinh thường gây ra nhiễmtrùng rất nặng, có thể dẫn đến tình trạng nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não và viêmxương Ở những người khỏe mạnh, nhiễm trùng do nhiễm độc thức ăn thường tự khỏisau 2- 5 ngày rồi tự khỏi

2.2.7 Nguồn gốc lây nhiễm

- Các sản phẩm thịt nói chung, nhất là thịt gia cầm và thịt lợn Tất cả các

thức ăn tươi sống có nguồn gốc động vật đều có thể là nguồn vi khuẩn Salmonella Vi khuẩn này sống tự do trong ruột động vật và có trên lông Gia cầm có nhiều Salmonella

nhất, tiếp theo là các động vật nuôi trong nhà và động vật hoang (vẹt, rùa, chó, ếch,chim mông biển, loài gặm nhấm, rắn) Vi khuẩn này có thể có trong thành phần dẫn xuấtcác chất từ động vật như gelatin hoặc nước bọt động vật, bởi côn trùng, loài gặm nhấm,chim hoặc các sản phẩm thịt nhiễm khuẩn gây nhiễm vào thực phẩm Ngoài ra có thể bịnhiễm từ người khỏe mạnh có mang vi khuẩn này Thư ̣c phẩm có nguồn gốc thực vâ ̣t ítcó nguy cơ nhiễm khuẩn Vì lí do bị ức chế bởi pH < 4 và có mặt vi khuẩn lactic nên các

sản phẩm lên men ít bị nhiễm Trứng và các sản phẩm trứng ví dụ như bột nhào, nước

sốt mayonnaise, protit đông tụ tách từ sữa, gia cầm là nguồn mang nhiều Salmonella,

nên trứng của nó cũng bị nhiễm vì vi khuẩn này có thể xuyên qua vỏ trứng và sinh sảntrong lòng đỏ trứng

- Các sản phẩm sữa như sữa không thanh trùng, phomát từ sữa tươi, kemchất béo sữa, và các sản phẩm từ sữa nói chung được chế biến từ các nông trại, các thiết

bị đều có thể gây nhiễm vào nguyên liệu, tạo môi trường thuận lợi choSalmonella, và từ

đó gây nhiễm độc cho sản phẩm sữa Nếu tiến hành axit hóa chậm thì vi khuẩn dễ dàngsinh sản trong phomát nhưng nó bị phá hủy với pH < 4,5 Những sản phẩm có sữa phảiđược giám sát chặt chẽ bởi chúng không được thanh trùng nữa, vì vậy nếu cóSalmonellatrong sữa bột thì chúng vẫn có thể sinh sản được bởi chúng có khả năng tồn tại ở điềukiện khô hạn và lây nhiễm sang các sản phẩm khác

2.2.8 Tình hình nhiễm Salmonella trong nước và trên thế giới

do kiểm soát tốt Salmonella trong thực phẩm từ năm 1990, bao gồm các thực phẩm sữa,

trứng, nước trái cây, sản phẩm tươi sống, rau, bánh kẹo, và đặc biệt là thịt Một đợt dịch

gần đây ở Mỹ gây ra bởi S.typhimurium nhiễm trong bơ đậu phộng đã gây ảnh hưởng

đến hơn 700 người trên khắp nước Mỹ

- Từ tháng 7/2009 tới nay, số ca nhiễm khuẩn Salmonella được phát hiện

ở Mỹ đã tăng lên 184 người, thuộc 38 bang khác nhau Cơ quan y tế của nước này vẫnchưa xác định nguyên nhân chính xác khiến số ca nhiễm khuẩn Salmonella tăng nhanhnhư vậy Tuy nhiên, mới đây các chuyên gia y tế của bang Oregon cho rằng nguồn lâylan vi khuẩn Salmonella từ các sản phẩm xúc xích.Vừa qua, các cơ quan điều tra Mỹ đãthu hồi hơn 560 tấn xúc xích do nghi bị nhiễm vi khuẩn Salmonella, tất cả số lượng nàyđều do Công ty Daniele International sản xuất.Tuy nhiên, ông Jason Maloni, phát ngônviên của công ty này khẳng định: “Chưa có bằng chứng nào chứng minh các sản phẩm

xúc xích của chúng tôi bị nhiễm vi khuẩn Salmonella” Sự bùng nổ của số ca nhiễm

khuẩn Salmonella ở khu vực tây bắc Thái Bình Dương đã khiến các cơ quan điều tranghi ngờ rằng nguồn gây bệnh cho ổ dịch này là từ các sản phẩm xúc xích sau khi họ

phát hiện rất nhiều người ăn xúc xích mua tại các cửa hàng ở khu vực này bị nhiễm

khuẩn Salmonella Các nhân viên điều tra tại bang Washington cũng cho biết 14 bệnh nhân bị nhiễm khuẩn Salmonella ở bang này, đã từng ăn xúc xích của hãng Daniele.

Ngoài ra, các chuyên gia y tế khẳng định họ đã kiểm tra và phát hiện khuẩn Salmonella

có trong các mẫu xúc xích của công ty này Hiện tại, các nhân viên điều tra liên bang

Mỹ vẫn đang làm việc để tìm ra nguyên nhân chính xác gây ra dịch nhiễm khuẩnSalmonella ở nước này Vì thế, họ vẫn chưa thể kết luận sản phẩm xúc xích của Công tyDaniele có phải là nguồn lây bệnh chính hay không Vì thế, những sản phẩm xúc xíchcủa công ty này bị thu hồi là do kiểm tra bị nhiễm khuẩn Salmonella

2.2.8.2 Trong nước

- Theo ông Nguyễn Công Khẩn, Cục trưởng Cục ATVSTP cho biết, hiệnnay, mạng lưới kiểm nghiệm ATVSTP đã được hình thành rộng khắp trong cả nướcnhưng thực tế năng lực kiểm nghiệm nhiều chỉ tiêu về an toàn thực phẩm tại các địaphương vẫn rất hạn chế Trong 330 mẫu hoa quả có tới 2,7% số mẫu có tỷ lệ tồn dưthuốc bảo vệ thực vật cao, nhất là ở táo đỏ, quýt và lê Đặc biệt, trong số 1.416 mẫu thịt

và sản phẩm từ thịt đã phát hiện tới 40,9% số mẫu nhiễm khuẩn Salmonella gây ra các

bệnh về đường tiêu hóa Hơn nữa, khu vực TP Hồ Chí Minh và Đồng Nai là những địaphương có tỷ lệ mẫu thực phẩm nhiễm Salmonella cao nhất, chiếm từ 84- 95% mẫuđược giám sát

2.3 Các phương pháp phát hiện Salmonella

2.3.1 Phương pháp truyền thống

2.3.1.1 Nguyên tắc

- Salmonella có thể được phát hiện ( phân tích định tính ) bằng một quy

trình bao gồm 4 bước là tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định

Salmonella thường có mặt trong mẫu với một số lượng nhỏ, bị tổn thương và cùng hiện diện chung với một số lượng lớn vi sinh vật thuộc họ Enterobacteriaceae có tính cạnh tranh mạnh và ức chế sự tăng trưởng của Salmonella

+ Bước tăng sinh : tùy theo đặc tính thành phần hóa học của mẫucần chọn quy trình tăng sinh phù hợp Thông thường tỷ lệ giữa mẫu và môi trường tăngsinh là 1 : 9, tuy nhiên tùy trường hợp mà tỷ lệ này có thể thay đổi

+ Bước tăng sinh chọn lọc : Các môi trường tăng sinh chọn lọc

thường dùng để phát hiện Salmonella trong các mẫu thực phẩm là Rappaport Vassiliadis

(RV), Selenite Cystein Broth,Tetrathionate Mueler Kauffmanm Broth (TT )… Cácnghiên cứu gần đây cho thấy môi trường RV có thể thay thế cho các môi trường khác để