Công nghệ sinh học thực vật

Khái quát về Công nghệ sinh học thực vật Khái niệm CNSH “Là quá trình sản xuất ở qui mô công nghiệp có sự tham giacủa các tác nhân sinh học, ở các mức độ tổ chức như tế bào, cơthể hoặc

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THỰC VẬT

(Bài giảng có sử dụng hình ảnh của các đồng nghiệp quốc tế)

TS Khương Thị Thu Hương ĐT: 0969043158

Email: huongktt19@gmail

Giới thiệu môn học

Giáo trình

1 Nigel G Halford, Plant Biotechnology: Current and Future Applications ofGenetically Modified Crops, John Wiley & Sons Ltd, 2006

Tài liệu tham khảo

1 Plant Biotechnology Journal, published by Wiley-Blackwell in association withthe Society for Experimental Biology (SEB) and the Association of AppliedBiologists (AAB) https://onlinelibrary.wiley.com/journal/14677652

Giới thiệu môn học

Giáo trình, tài liệu tham khảo

Chương I Khái quát về Công nghệ sinh học thực vật

 Khái niệm CNSH

“Là quá trình sản xuất ở qui mô công nghiệp có sự tham giacủa các tác nhân sinh học, ở các mức độ tổ chức như tế bào, cơthể hoặc dưới tế bào (phân tử), dựa trên thành tựu tổng hợp củanhiều bộ môn khoa học khác nhau, nhằm mục đích tạo ra củacải vật chất cho xã hội, và đảm bảo lợi ích của con người”

“Plant biotechnology can be defined as

the use of tissue culture and genetic engineering techniques to produce

genetically modified plants that exhibit

new or improved desirable characteristics”

Chương I Khái quát về Công nghệ sinh học thực vật

Khái niệm về CNSH TV

Chương I Khái quát về Công nghệ sinh học thực vật

CNSH TV:

Nuôi cấy mô tế bào thực vật

Biến đổi di truyền thực vật: GMO và genome editing

Khái niệm về CNSH TV

Chương I Khái quát về Công nghệ sinh học thực vật

Các dấu mốc phát triển Công nghệ sinh học thực vật

Chương I Khái quát về Công nghệ sinh học thực vật

Các dấu mốc phát triển Công nghệ sinh học thực vật

Vai trò của công nghệ sinh học trong phát triển kinh tế xã hội

 Nguy cơ về dân số

 Nguy cơ về dịch bệnh

 Đất nông nghiệp giảm

 Thiếu hụt dinh dưỡng

 Biến đổi khí hậu

 Mong muốn học hỏi khám

phá các bí mật của tự nhiên

Chương I Khái quát về Công nghệ sinh học thực vật

 Cần nhiều cây trồng hơn

 Cần cây trồng có chất lượng tốt hơn

 Cây trồng “khỏe mạnh” hơn

 Bảo tồn nguồn gen cây trồng

 Cần nhiều các thực phẩm chức năng từ thiên nhiên

 Cây trồng mới có các đặc tính và năng suất vượt trội

 Nâng cấp bộ máy di truyền thông qua sự kết hợp các gen mới trênnền vật chất di truyền cũ

 Thêm các giá trị mới vượt ra ngoài các mục đích sử dụng hiện có

Chương II Công nghệ mô và tế bào thực vật

Plant tissue culture

Lịch sử phát triển công nghệ NCM –TB TV

Gottieb Haberlandt (1854-1945)

Cha đẻ của NCM TB TV là Nhà Thực vật họcngười Đức tên là G.Haberlandt

Học thuyết Tính toàn năng của tế bào, 1902(Totipotency of the plant cell)

Chương I Khái quát về Công nghệ sinh học thực vật

Các dấu mốc phát triển Công nghệ sinh học thực vật

Cơ sở khoa học của công nghệ mô - tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật

Điều kiện

Phòng thí nghiệm và thiết bị chuyên dụng;

Vai trò sinh lý và ứng dụng trong NCM - TB TV

Nuôi cấy mô tế bào thực vật

Điều kiện về cơ sở vật chất, vật tư, hóa chất

Môi trường NCM -TB TV

 C hất dinh dưỡng khoáng:

 Nhóm nguyên tố đa lượng:

Môi trường NCM -TB TV

Một số công thức môi trường được sử dụng phổ biến:

 Murashige and Skoog medium (MS) 1962:

Knudson C Orchid; Chu (N6) medium; Anderson's Rhododendron; Chée and Pool medium; CLC/Ipomoea CP medium; De Greef and Jacobs medium; DKW/Juglans Medium; Eriksson(ER) Medium, Knop medium…

 White’s medium, 1963

 Gamborg B5 medium, 1968 by Gamborg, et al

 Woody Plant Medium by Lloyd and McCown, 1981

Ảnh hưởng của thànhphần môi trường lên

Valeriana glechomifolia(thuộc họ kim ngân)

(Russowski et al, 2006)

Môi trường NCM -TB TV

Mỗi loại môi trường có ảnh hưởng khác nhau lên mô nuôi cấy

Điều kiện cơ sở vật chất, trang thiết bị

Phòng nuôi cấy cây vô trùng:

- Diện tích 20-30m2, dàn cây tích hợp bộ điều chỉnh ánh sáng phù hợp, điềuhòa nhiệt độ, tủ nuôi cấy tối…

- Có phòng đệm trước khi vào phòng vô trùng, áo blou

- Khử trùng thường xuyên: Lau thiết bị bằng cồn 96o, xông formon…

- Tủ cấy vô trùng và

thiết bị đi kèm…

Điều kiện cơ sở vật chất, trang thiết bị

Phòng chuẩn bị môi trường: Bồn rửa, tủ lạnh để hóa chất, tủ kính thường để hóa chất, nồihấp vô trùng, máy đo pH khuấy từ, cân phân tích, bồn rửa khử trùng, máy cất nước cất…

Điều kiện cơ sở vật chất, trang thiết bị

Dụng cụ: Bình nuôi cây in vitro, que cấy, khay cấy, kéo, giấy thấm, giỏ inox, xe

đẩy inox, giỏ nhựa, găng tay, áo blou…

Điều kiện cơ sở vật chất, trang thiết bị

Buồng sinh trưởng (growth plant chamber): với các điều kiện có kiểm soát:

thích ứng cây in vivo trước khi đưa ra điều kiện tự nhiên.

Vườn ươm/Nhà kính/Nhà

lưới/Nhà màng

Các bước cơ bản trong NCM -TB TV:

Tạo vật liệu khởi đầu: Đưa mẫu vào ống

nghiệm: Hạt, chồi, rễ, lá….; Tác nhân khử trùng; Vô

trùng và tỉ lệ sống cao.

Cảm ứng tạo chồi: Nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy

mô phân sinh, nuôi cấy phôi soma; trực tiếp hoặc

gián tiếp qua phôi soma, cần cytokinin; mẫu cảm ứng

chồi tốt xuất hiện cụm phôi soma/chồi.

Nhân nhanh chồi: cần cytokinin; tăng số

lượng chồi => tăng hệ số vi nhân giống.

Tạo rễ/tạo cây hoàn chỉnh: cần auxin; rễ

khỏe, chồi sức sống cao

Vì dụ ở Banana

Ra cây: chuyển cây ra ngoài ống nghiệm; buồng sinh

trưởng, vườn ươm/nhà kính/nhà lưới; Tỉ lệ cây sống sót

cao, cây ST - PT tốt.

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy hạt phấn, bao phấn

Các hình thức NCM TB TV Các hình thức NCM TB TV

Lá in vitro (a) -> Tách tế bào trần từ

tế bào mô dậu (b,c)

-> Tế bào phân chia tạo mô sẹo (d-j)

-> Tạo chồi (k)

– > Tạo rễ (l)

-> Ra cây

• Nhân giống vô tính loài cây có giá trị ở qui mô công nghiệp

• Tạo giống cây sạch bệnh phục tráng giống

• Tạo giống mới: Chọn dòng tế bào, lai tế bào trần, chuyển gen…

• Cứu phôi lai xa: Lai hữu tính khác xa về di truyền phôi khó sống.

• Nghiên cứu cơ bản: Di truyền biến dị, sinh lý, hóa sinh….

• Sản xuất các chất trao đổi thứ cấp

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

Ứng dụng của NCM -TB TV:

Vi nhân giống/nhân giống in vitro

Định nghĩa: Tạo cây con từ mô, tế bào của cây mẹ trong điều kiện in vitro

Ứng dụng: Nhân giống cây trồng quí hiếm có giá trị kinh tế cao ở qui mô công

nghiệp (lan, khoai tây ), bảo tồn nguồn gen (Sâm ngọc linh, tùng, bách, khoai

môn ), nhân giống cây lai vô tính (Keo lai), nhân cây khó sinh sản hữu tính, tạo

cây trồng biến đổi gen

Thành tựu: Việt Nam đã thành công trên rất nhiều đối tượng cây trồng khác nhau:

Cây nông nghiệp: khoai tây, lúa, ngô, đậu tương

Cây thân gỗ: Các loài keo (keo lai, tai tượng, lá tràm), bạch đàn, thông, thủy tùng, bách xanh,hông

Cây dược liệu: Sâm ngọc linh, sâm cau, sâm bố chính, lan kim tuyến, hoàng liên

Cây hoa, cây cảnh: Các loài hoa lan: Lan hồ điệp, địa lan hoa ly, hoa hồng, thược dược

Qui trình nhân giống in vitro

Vi nhân giống/nhân giống in vitro

Tạo chồi in vitro

Nhân nhanh chồi

Tạo rễ/tạo cây hoàn chỉnh

Chọn mẫu

Phát triển chồi

Ra cây

Khử trùng mẫu

Vi nhân giống/nhân giống in vitro

Chuyển cây ra bầu

Chuyển cây ra vườn ươm

Tạo giống cây sạch bệnh

Nuôi cấy mô phân sinh sẽ tạo được

cây sạch bệnh tạo bởi virut: Chuối,

khoai tây, đu đủ, cam quýt…

Nuôi cấy mô phân sinh ở câyGentiana kurroo

Mô phân sinh có đặc điểm miễn nhiễm

với virut gây bệnh ở cây trồng

Qui trình chọn dòng tế bào cây hoa Li sạch virut

Tạo giống cây sạch bệnh

Dung hợp tế bào trần (Protoplast fusion)

Tạo con lai soma mang đặc tính tốt của cả bố và mẹ

Qui trình dung hợp tế bào trần ở Asteraceae

Dung hợp tế bào trần

Chọn dòng tế bào

Chọn dòng tế bào chống chịu bệnh

CHƯƠNG III CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT

Khái quát chung

Chuyển gen ở thực vật là kỹ thuật đưa một hoặc một số gen

ngoại lai (ADN/ARN) vào tế bào thực vật để cải thiện hoặc tạomới một tính trạng nào đó ở cây trồng

Cây trồng biến đổi gen là những cây trồng đã bị biến đổi vật liệu

di truyền do con người tiến hành theo mục đích đã định trước

Chuyển gen ở thực vật

Công nghệ tạo ra sinh vật biến đổi gen nói chung và thực vật nói riêng này được gọi với nhiều

tên gọi khác nhau như:

Công nghệ sinh học hiện đại (modern biotechnology);

Công nghệ gen (gene technology);

Công nghệ ADN tái tổ hợp (recombinant DNA technology);

Kỹ nghệ di truyền (genetic engineering);

Chuyển gen (genetic transformation/DNA transformation);

Biến đổi di truyền (Genetic modification)…

Khái quát chung

Chuyển gen ở thực vật

Để tạo cây trồng chuyển gen cần thực hiện các bước chính sau đây:

1 Lựa chọn gen quan tâm.

2 Phân lập gen quan tâm.

3 Nhân dòng gen quan tâm để sản xuất nhiều bản copy.

4 Thiết kế vector mang gen quan tâm

5 Nhân dòng vector mang gen quan tâm.

6 Chuyển gen quan tâm vào mô thực vật

7 Sàng lọc và tái sinh tế bào, mô mang gen quan tâm thành cây hoàn chỉnh.

8 Phân tích cây chuyển gen.

9 Đánh giá sự di truyền gen quan tâm qua các thế hệ con cháu.

10 Đánh giá an toàn sinh học cây chuyển gen.

Chuyển gen ở thực vật

Quy trình chung để tạo cây trồng chuyển gen

Các phương pháp chuyển gen (biến nạp) vào thực vật

Trong mỗi phương pháp đều có ưu, nhược điểm riêng Việc lựa chọn phương pháp nào phụ thuộc vào điều kiện PTN và mục đích của nghiên cứu.

Chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens

(Khuong et al, 2019)

Chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens là vi

khuẩn đất gram âm, có khả năng

cảm ứng gây mụn và khối u hay

lông rễ ở thực vật hai lá mầm, một

vài loài một lá mầm và hạt trần

Loài vi khuẩn này có thể xâm nhập dễ dàng qua vết thương ở thực vật

và có khả năng trao đổi di truyền với thực vật

=> Do đó, Agrobacterium tumefaciens được coi là công cụ di truyền

quan trọng của công nghệ gen thực vật

Chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens

Năm 1974, Ti plasmid được phát hiện là thànhphần của tế bào vi khuẩn gây bệnh khối u ởthực vật

Plasmid Ti là loại plasmid lớn, có kích thướckhoảng 200 kb

Ti plasmid

Các bước của qui trình chuyển gen vào

thực vật nhờ Agrobacterium tumfaciens

Chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens

NHỮNG THÀNH TỰU TRONG NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT

Trên thế giới

Tình hình nghiên cứu và khảo nghiệm cây trồng biến đổi gen ở Việt Nam

Ở Việt Nam, từ những năm cuối của thế kỷ XX, các nghiên cứu chuyển genthực vật đã được quan tâm triển khai trên nhiều đối tượng cây trồng nhưngô, đậu tương, bông, đậu xanh, đu đủ, thông, bạch đàn…

Các nghiên cứu này tập trung vào các tính trạng như chống chịu điều kiệnbất lợi hạn, mặn, kháng côn trùng, virut, tăng sinh trưởng (bạch đàn)…

NHỮNG THÀNH TỰU TRONG NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT

Việc đánh giá an toàn sinh học và quản lý rủi ro là nhằm đảm bảo

an toàn nhưng không được trở thành rào cản đối với việc nghiên cứu

và phát triển các sản phẩm biến đổi gen có giá trị

Kết quả đánh giá rủi ro là cơ sở khoa học để đưa ra các biện phápquản lý và giám sát hiệu quả, cũng như quyết định ứng dụng GMOstrong thực tiễn

VẤN ĐỀ AN TOÀN SINH HỌC CÂY TRỒNG BIẾN ĐỔI GEN

CHƯƠNG IV CÔNG NGHỆ CHỈNH SỬA GEN

Genome editing

Khái quát về Công nghệ chỉnh sửa gen

• CRISPR - Clustered regularly interspaced short palindromic repeats - nhóm các đoạn ngắn đối xứng lặp lại thường xuyên.

• Cas - CRISPR-associated proteins systems - hệ thống protein kết hợp với CRISPR.

CRISPR/CaS9 là gì?

CRISPR/CaS hoạt động như một chiếc kéo phân tử

có thể cắt bỏ những phần gen không mong muốn và

thay vào đó những đoạn DNA khỏe mạnh

Khái quát về Công nghệ chỉnh sửa gen

CRISPR/CaS9 có thể cắt bỏ, chỉnh sửa, hay chèn thêm đoạn DNA mới => Đột biến gen

Lịch sử phát triển của Công nghệ chỉnh sửa gen

Khám phá trarcRNA

(Delcheva et al,)

2012: Công bố

ứng dụng hệ thống

CRISPR/cas và đăng ký sang chế công nghệ (Chapentier and Duana,)

2015: - Biến đổi gen

muỗi alophen chống bệnh sốt rét (Jame et

al, )

- Lần đầu tiên ứng dụng CRISPR/cas chỉnh sửa gen phôi người (Zhang et al,)

2013: Sử dụng CRISPR/cas trên tế bào chuột và người (Zhang et al,)

2018: Công bố

đứa trẻ đầu tiên

ra đời nhờ CRISPR/cas

(Ziankui et al,)

2020: Giải Nobel về CRISPR/cas (Chapentier and Duana,)

Một số dấu mốc:

Nguyên lý chỉnh sửa gen nhờ CRISPR/cas 9

Qui trình chỉnh sửa gen ở thực vật nhờ CRISPR/cas

1) gRNA with spacer sequence paired to targeting PAM-site;

2) RNA Polymerase III (Pol III) promoter and Pol III terminator

(Pol III Ter) to control the transcription of gRNA Ex

snoRNA U3 promoter, snoRNA U6 promoter….

3) Cas9 with nuclear localization signal (NLS)

4) RNA polymerase II (pol II) promoter and Pol II terminator

(Pol II Ter) to control the transcription of Cas9 gene Ex:Pol

II promoter: CaMV 35S promoter, maize UBIQUITIN

promoter, rice ACTIN promoter…

Vector CRISPR/cas

(Xie and Yang, 2013)

RGE vector for Rice Gene Editing:

Qui trình chỉnh sửa gen ở thực vật nhờ CRISPR/cas

Các hướng ứng dụng của Công nghệ chỉnh sửa gen ở thực vật

Nấm: Phấn trắng; Đạo ôn;Thối rễ Kháng sâu bệnh: Virut gây bệnh cuộn/xoăn lá

Sinh tổng hợp chất có hoạt tính sinh học: phytohormone, flavonoid

Tăng cường năng suất và chất lượng

Tăng cường chống chịu tác nhân vật lý hóa học:

hạn, mặn chất diệt cỏ….

Chế biến sau thu hoạch

(Noman et al, on Front Plant Sci., 21 November 2016)

Ứng dụng công nghệ chỉnh sửa gen ở thực vật

THẢO LUẬN

• Các nhóm nhận chủ đề thảo luận từ giáo viên

• Chuẩn bị bài thuyết trình theo yêu cầu