Phương pháp và ứng dụng công nghệ sinh học thực vật và lương thực

Ứng dụng điển hình của công nghệ sinh học làviệc tạo ra các giống cây trồng công nghệ sinh học/ cây trồng biến đổi gen GeneticallyModified Crops - GMCs mang những đặc tính mong muốn thôn

Tổng quan 1

Tình hình lương thực hiện nay 1

Phương pháp và ứng dụng công nghệ sinh học thực vật và lương thực 5

Kỹ thuật chuyển gen tạo gạo vàng 13

Đối tượng nghiên cứu 13

Phương pháp nghiên cứu 14

Kỹ thuật chuyển gen ở gạo vàng 14

Kết quả, thảo luận 23

Kết luận 24

Tài liệu tham khảo 24

Mục lục

I Tổng quan

1 Tình hình lương thực hiện nay

1.1 Tình hình lương thực trên thế giới

Tình hình lương thực trên thế giới đang ở mức báo động nhất là ở các quốc gia châu Phi do ảnhhưởng của hạn hán, sa mạc hóa, xâm nhiễm mặn, hiện tượng El nino Đứng trước tình hình đócông nghệ sinh học truyền thống và hiện đại đã có những bước nghiên cứu, phát triển vượt bậc

và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực Ứng dụng điển hình của công nghệ sinh học làviệc tạo ra các giống cây trồng công nghệ sinh học/ cây trồng biến đổi gen (GeneticallyModified Crops - GMCs) mang những đặc tính mong muốn thông qua kỹ thuật chuyển gen Năm 2013, 27 quốc gia trên thế giới canh tác đại trà cây trồng công nghệ sinh học (19 quốc giađang phát triển và 8 quốc gia phát triển), trong đó dẫn đầu là Hoa Kỳ (70,1 triệu hecta), Brazil(40,3 triệu hecta), Argentina (24,4 triệu hecta); Ấn Độ (11 triệu hecta) và Canada (10,8 triệuhecta) Trong 18 năm (1996 - 2013), diện tích đất canh tác cây trồng công nghệ sinh học trêntoàn cầu đã tăng liên tục tới hơn 100 lần (từ 1,7 triệu hecta vào năm 1996 lên 175,2 triệu hectatrong năm 2013) Điều này cho thấy đối với cây trồng, đây là công nghệ được ứng dụng vớiquy mô lớn nhất và tốc độ nhanh nhất trên thế giới Các loại cây trồng công nghệ sinh học đượctrồng nhiều nhất hiện nay trên thế giới là đậu tương, bông, ngô và cải dầu

Hình 1: Diện tích canh tác các giống cây trồng công nghệ sinh học trên thế giới giai đoạn

1996-2013 (triệu hecta) (James, 2013)

1.2 Tình hình lương thực ở Việt Nam

Ở Việt Nam, các chính sách, đề án, chương trình về công nghệ sinh học trong nông - lâmnghiệp, thủy sản, y tế, công nghiệp và môi trường đã và đang được xây dựng và triển khai thựchiện Bên cạnh đó, cơ sở hạ tầng phục vụ nghiên cứu và đào tạo nguồn nhân lực về công nghệsinh học cũng được ưu tiên đầu tư Trình độ nghiên cứu và ứng dụng công nghệ sinh học vớicác công nghệ nền được đẩy mạnh Công nghệ sinh học đã góp phần tạo ra nhiều sản phẩm cógiá trị Việt Nam là nước xuất khẩu gạo thứ nhì thế giới Chương trình trọng điểm phát triển vàứng dụng CNSH trong lĩnh vực NN&PTNT giai đoạn 2011-2015 đã chọn tạo được 42 giốngcây trồng nông nghiệp bằng công nghệ chỉ thị phân tử và công nghệ tế bào; tạo được 33 dòngcây trồng chuyền gen

Nhiều địa phương đã ứng dụng CNSH vào trồng trọt đạt hiệu quả kinh tế cao Đơn cử như việctriển khai 14 đề tài chọn tạo giống cây trồng nông nghiệp bằng phương pháp chỉ thị phân tử đãchọn tạo được 7 giống lúa chịu hạn, 2 giống lúa kháng đạo ôn, 4 giống lúa kháng rầy nâu, 2giống lúa thơm chất lượng cao, 2 giống chè có triển vọng về năng suất, chất lượng, 8 giốngbông kháng bệnh xanh lùn

Những người nông dân sau vụ trồng thử nghiệm ngô biến đổi gen đầu tiên ở ba tỉnh Phú Thọ,Vĩnh Phúc và Lào Cai đều đánh giá cao về năng suất, chất lượng và mức độ dễ dàng hơn khitrồng loại ngô này so với ngô thường Người nông dân hầu như không phải làm cỏ và phunthuốc trừ sâu, vừa tiết kiệm được chi phí vừa góp phần bảo vệ sức khỏe người nông dân và bảo

- Tạo điều kiện cho các cơ sở khoa học mở rộng liên kết, tổ chức đào tạo và nhập khẩucông nghệ, thiết bị của nước ngoài mà trong nước chưa triển khai thực hiện các dự ánnghiên cứu ứng dụng.

- Hạn chế về công nghệ: so với các nước ASEAN, trình độ năng lực nghiên cứu CNSHcủa Việt Nam còn có khoảng cách lớn và không thể so sánh được với những nước cồngnghiệp phát triển Nhà nước có chương trình nghiên cứu về CNSH đã được hơn 15 năm

và gần đây có thêm chương trình Kĩ thuật- kinh tế về CNSH, nhưng vẫn chưa có nhữngthành tựu mang tính đột phá Các kết quả nghiên cứ phần lớn là CNSH truyền thống vàmới dừng ở quy mô phòng thí nghiệm, chưa được áp dụng vào sản xuất

- Hoàn thiện hệ thống pháp luật và cơ chế, chính sách và tăng cường công tác quản lý nhànước,về nghiên cứu, ứng dụng, phát triển công nghệ sinh học

- Sớm hình thành hệ thống tổ chức quản lý nhà nước về an toàn sinh học

- Xây dựng và tổ chức thực hiện có hiệu quả kế hoạch tổng thể phát triển công nghệ sinhhọc và công nghiệp sinh học Cần tập trung chỉ đạo phát triển công nghiệp sinh học,trong đó ưu tiên lĩnh vực y - dược

- Có chính sách thu hút đa dạng hoá các nguồn đầu tư trong nước và ngoài nước chonghiên cứu, sản xuất các sản phẩm công nghệ sinh học thiết yếu Ngân sách Nhà nướctập trung đầu tư cho một số chương trình trọng điểm về xây dựng phòng thí nghiệm, đàotạo nguồn nhân lực, nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ

- Xây dựng và áp dụng chính sách ưu đãi cho phát triển nhanh các doanh nghiệp côngnghệ sinh học vừa và nhỏ.

- Có chính sách gắn kết chặt chẽ hoạt động khoa học và công nghệ với hoạt động sản xuấtkinh doanh của doanh nghiệp, khuyến khích và hỗ trợ mạnh mẽ các hoạt động phổ biến,chuyển giao, ứng dụng các tiến bộ kỹ thuật trong lĩnh vực công nghệ sinh học vào sảnxuất và đời sống

- Hỗ trợ các doanh nghiệp xây dựng cơ sở nghiên cứu và ứng dụng công nghệ sinh học

- Mở rộng quan hệ hợp tác quốc tế, tranh thủ mọi cơ hội để đào tạo đội ngũ cán bộ đầuđàn, chuyên gia giỏi và nâng cao trình độ nghiên cứu, phát triển công nghệ trong lĩnhvực công nghệ sinh học của đất nước

2 Phương pháp và ứng dụng của công nghệ sinh học thực vật và lương thực

2.1 Phương pháp chuyển gen

2.1.1 Chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

- Vi khuẩn A tumefaciens không sản xuất được một số acid amin như octopin, nopaline.

- Để tồn tại, nó chuyển gen của nó vào thực vật, thực vật sản xuất các chất cần thiết, vikhuẩn phân hủy các chất này để lấy năng lượng

Trong quá trình cộng sinh này, vi khuẩn cũng chuyển các gen tổng hợp các chất kích thíchsinh trưởng làm các tế bào nhiễm vi khuẩn phân chia vô tổ chức, gây phát sinh khối u ở thựcvật

Con người lợi dụng tính chất này của Agrobacterium để chuyển gen vào tế bào thực vật.

 Ưu - nhược điểm

- Số bản sao của gen được chuyển vào tế bào thực

vật thấp Do vậy, giảm tối thiểu sự không biểu

hiện của gen được chuyển, tăng khả năng

chuyển gen bền vững, hiệu quả chuyển gen cao

- Tránh được sự hình thành của các cây chuyển

gen khảm

- Kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện

- Không đòi hỏi thiết bị đắt tiền

- Phương pháp này được sử dụngthành công ở nhiều cây hai lámầm Nhưng hiệu quả chuyểngen ở cây một lá mầm cònthấp

- Trong khi nhiều cây một lámầm là những cây lương thựcquan trọng như lúa, ngô, lúamì…

2.1.2 Chuyển gen bằng súng bắn gen

Súng bắn gen (Gene gun) là một thiết bị sử dụng để đưa thông tin di truyền vào tế bào, đượcthiết kế đầu tiên cho biến nạp DNA ngoại lai vào tế bào thực vật Tên chính xác và đầy đủ củasúng bắn gen là hệ thống phân phối hạt biolistics (biolistic particle delivery system) và kỹ thuật

này thường được gọi một cách đơn giản là biolistics (sự kết hợp giữa hai thuật ngữ biology(sinh học) và ballistics (sự bắn tung)) Mặc dù có nhiều thiết kế kỹ thuật khác nhau nhưngnguyên lý chung của phương pháp này là sử dụng áp lực xung của khí helium để gia tốc cáchạt.

 Ưu – nhược điểm

- Có thể áp dụng với hầu hết các loại mô, tế bào Quá

trình chuyển gen nhanh, đơn giản về mặt kỹ thuật

- Có thể xử lý một lượng mẫu lớn trong thời gian ngắn

- Các vecto mang gen tái tổ hợp có cấu tạo đơn giản

không đòi hỏi cấu trúc gen kiểu T-DNA như trường

hợp chuyển gen bằng Agrobacterium

- Chỉ cần một lượng nhỏ plasmid DNA

- Biểu hiện tạm thời của gen biến nạp có thể quan sát

thấy trong vòng vài ngày sau biến nạp

- Nhiều bản sao của genbiến nạp có thể đượcchuyển vào tế bào cùnglúc, gây khó khăn choviệc phân tích biểu hiệncủa các gen không bềnvững

- Hiệu quả chuyển gen thấp

- Đòi hỏi thiết bị đắt tiền,chi phí vật tư đắt

2.1.3 Chuyển gen bằng xung điện

- Phương pháp chuyển gen nhờ xung điện thường được sử dụng cho việc chuyển gen vào

tế bào trần

- Người ta sử dụng dòng điện có hiệu điện thế cao phát xung trong thời gian cực ngắn đểtạo ra trên bề mặt tế bào trần tạm thời các lỗ có đường kính khoảng 30 nm, mà qua đócác DNA biến nạp có thể thâm nhập vào tế bào

 Ưu – nhược điểm

- Hiệu quả chuyển

2.1.4 Biến nạp nhờ PEG (polyethylene glycol)

- Cũng giống như phương pháp chuyển gen bằng xung điện, phương pháp chuyển gennhờ PEG thường được sử dụng để cuyển gen vào các tế bào trần

- Ở nồng độ cao, PEG làm DNA cần biến nạp không còn ở trạng thái hòa tan nữa mà kếtdính lại trên màng sinh chất Sau đó, bằng cách loại bỏ PEG và xử lý nồng độ cao của CA2+hoặc ở độ pH cao, DNA biến nạp ào trong tế bào protoplast.

 Ưu – nhược điểm

- Hiệu quả chuyển gen

cao, ổn định nếu quá

2.1.5 Chuyển gen bằng vi tiêm

Là phương pháp sử dụng các thiếp bị hiển vi và máy vi nhu động để chuyển gen trực tiếp vào tếbào Đến nay, các tế bào đã được sử dụng phương pháp này để chuyển gen gồm các tế bàoprotoplast, các tế bào tiền phôi của hợp tử hay hạt phấn

 Ưu – nhược điểm

- Hiệu quả chuyển gen

cao, ổn định nếu quá

 Cây đậu tương chuyển gen:

- Kháng sâu bệnh => góp phần giảm lượng thuốc trừ sâu cần sử dụng => bảo về môitrường và giảm chi phí sản xuất

- Thay đổi thành phần axit béo

- Làm thay đổi thành phần và giá trị dinh dưỡng

 Cây ngô chuyển gen:

- Kháng bệnh và sâu bệnh

- Chín sớm => rút ngắn thời gian trồng trọt

- Kháng thuốc diệt cỏ

 Cây cà chua chuyển gen:

- Gen kéo dài thời gian chín => tăng chất lượng quả và kéo dài thời gian bảo quản sau thuhoạch

- Gen kháng bệnh viruts => kháng với virus CMV

- Góp phần giảm lượng thuốc trừ sâu sử dụng trong quá trình trồng trọt

 Giống lúa vàng:

- Sau khi tiêu hóa, B-carotene được chuyển hóa thành vitamin A

2.2 Phương pháp nuôi cấy invitro

 Khái niệm: là việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật trong điềukiện vô trùng, bắt đầu bằng các mảnh cắt nhỏ ở nhiều bộ phận khác nhau của thực vật.Sau khi làm sạch vi sinh vật, những mảnh này được nuôi cấy vô trùng (trong ốngnghiệm hoặc trong các loại bình nuôi khác) Trong thực tế, thuật ngữ nhân giống invitro

và nuôi cấy mô được sử dụng để chỉ mọi phương thức nhân giống thực vật trong điềukiện vô trùng.Kết quả sẽ tạo ra đồng loạt cấc cây con có đặc điểm di truyền đồng nhấtvới tế bào mẹ xuất phát điểm ban đầu, trừ trường hợp xảy ra quá trình đột biến trong quátrình nuôi cấy

 Ưu – nhược điểm

- Đảm bảo tạo ra cây con mang đặc tính

giống hoàn toàn với cây cha mẹ (ổn

định mặc di truyền)

- Có thể tiến hành ở một số loài thực vật

mà biện pháp nhân giống thông thường

không thể thực hiện được

- Tạo được một số lượng lớn cây con

trong thời gian ngắn

- Cần tỉ mỉ đúng quy trình

- Cần điều kiện trang thiết bị đầy đủ

- Điều kiện vô trùng phải được đảm bảonghiêm ngặc

- Một sô loài cây trồng rất dễ gây biến dịkhi nhân giống bằng phương pháp cấymô

 Ứng dụng

- Nhân giống invitro tạo cây khoai tây sạch bệnh virus

II Kỹ thuật chuyển gen tạo gạo vàng

1 Đối tượng nghiên cứu

- Sử dụng phôi non và hạt gạo các giống lúa Taipei 309, IR64 và MTL 250 (Indica) có đặcđiểm tốt về nông học, chất lượng để thực hiện biến đổi gen

- Sử dụng công nghệ biến đổi gen đưa một gen của cây thủy tiên hoa vàng hoặc từ cây

ngô và vi khuẩn Erwinia uredovora vào bộ gen của lúa, tạo ra giống lúa mới có hàm

lượng vitamin A

- Sử dụng hai loại vector chuyển gen gồm hai plasmid là pCaCar và pFun3 để chuyển

gen vào vi khuẩn Agrobacterium tumefactien.

- Dùng vi khuẩn A tumefactien đã được gắn plasmid nói trên để chuyển đoạn DNA mong

muốn vào trong phôi của các giống lúa được chọn lọc

2 Phương pháp nghiên cứu

- Sử dụng phôi của hạt lúa nuôi cấy mô tái sinh cây lúa phòng thí nghiệm rồi chuyển gen

bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để đưa tất cả các gen lạ vào phôi hạt lúa sau

đó

- Kiểm tra biểu hiện của gen qua kiểm tra kiểu hình (hạt gạo có màu vàng), kiểm tra theo

phương pháp đánh giá cảm quan bằng mắt thường

- Kiểm tra sự xuất hiện của các gen chuyển trong cây lúa chuyển gen bằng phương pháp

điện di và PCR

3 Kỹ thuật chuyển gen gạo vàng

3.1 Cơ chế tạo gạo vàng

Bản thân hạt gạo có chứa geranyl geranyl diphosphate (GGPP) một tiền chất quan trọng trong tiến trình sinh tổng hợp β-caroten Nhưng cây lúa thường thì lại không hề chứa β-caroten, bằng chứng là hạt gạo thường có màu trong suốt mà không hề có màu vàng đặc trưng của β-caroten

Để GGPP chuyển hóa thành các chất trung gian rồi chuyển thành β-caroten thì cần có các Ezimxúc tác tương ứng, nhưng bản thân cây lúa lại không có chứa các gen có nhiệm vụ sinh tổng hợp ra các enzim cần thiết để xúc tác cho các phản ứng chuyển hóa GGPP thàn β-caroten Khi chuyển các đoạn gen psy, crtI, lcy vào trong cây lúa thì sẽ tạo ra một sự thay đổi rất lớn Khi

đó, gen psy là gen mã hóa để sinh tổng hợp ra enzim phytoen synthase có nhiệm vụ xúc tác để chuyển hóa GGPP (20 C) thành phytoen (40 C) Tiếp theo đoạn gen crtI mã hóa để sinh tổng hợp enzim phytoene desaturase có nhiệm vụ chuyển hóa phytoen thành ζ-Caroten rồi chuyển hóa tiếp thành Lycopen Cuối cùng gen lcy mã hóa để sinh tổng hợp enzim Lycopen β-Cyclase

có nhiệm vụ xúc tác chuyển hóa Lycopen thành β-caroten Và kết quả là hạt gạo chuyển gen thểhiện kiểu hình có màu vàng đặc trưng của β-caroten và chứa một lượng tiền vitamin A rất lớn

so với hạt gạo bình thường

3.2 Quy trình kỹ thuật

Bước 1:

Giống lúa Taipei 309, IR64 và MTL 250 (Indica) được trồng trong nhà kính với các điều kiện môi trường tối ưu, được sinh trưởng phát triển tốt, đảm bảo sạch bệnh Người ta chọn những cây lúa có đặc điểm tốt, chọn hạt chắc mẩy, bóc vỏ để chọn phôi tốt rồi tiến hành bảo quản trong môi trường vô trùng

Hình 1 Cây lúa được trồng trong các điều kiện nhân tạo tối ưu để lấy nguyên liệu chuyển gen.

Bước 2:

 Tiến hành nuôi cấy mô từ phôi đã chọn lọc ở Bước 1 để chuẩn bị nguyên liệu cho giai đoạn chuyển gen Quá trình nuôi cấy sử dụng môi trường MS có thành phần như sau

 Chuẩn bị môi trường MS 1 lit:

- Chuẩn bị một bình dung tích 2 lít, chứa sẵn 400ml nước cất

Tách chiết ADN từ vi khuẩn đất Erwinia uredovora, sau đó tiến hành cắt bằng enzym EcoRI

và Kpnl để thu nhận đoạn gen ctrI

 Lấy 1 ml nước cho và một ít giống vi sinh vật (vi khuẩn Erwinia uredovora) trên ống thạch nghiêng cho vào ống eppendorf rồi đem cân Lấy thêm một ống eppendorf khác, thêm nước vào sao cho có khối lượng bằng với khối lượng của ống thí nghiệm và đem hai ống đi ly tâm.

 Đưa hai ống vào máy ly tâm, đặt sao cho 2 ống ở vị trí đối xứng tâm với nhau qua trục quay của máy ly tâm Đóng cửa của máy và đặt chế độ ly tâm cho máy như sau

 Sau 30 phút lấy ống thí nghiệm ra khỏi máy ổn nhiệt và đem ống đi lắc mạnh trong 10 giây bằng máy vortex Sau đó tiếp tục đưa ống vào đặt trong bể ổn nhiệt ở 950C hoặc nước sôi trong 8 phút Bấm đồng hồ để canh thời gian

 Sau 8 phút, lại lấy ống ra đem lắc mạnh bằng vortex trong 10 giây Rồi đem ly tâm với chế độ ly tâm được cài đặt là:

Bước 4:

Hoa thủy tiên (hoặc ngô) được trồng trong nhà kính với các điều kiện môi trường tối ưu, đảm bảo sạch bệnh, được chọn lọc với điều kiện cây sinh trưởng phát triển tốt, cho hoa có màu vàngtươi Người ta chọn những bông hoa (quả ngô) đang trong thời gian phát triển mạnh để chiết xuất gen Gen psy và gen lyc của các bông hoa (quả) này được tiến hành theo các giai đoạn nhưsau: