Báo cáo thực hành ứng dụng sinh học

Bài 1: SẢN XUẤT RƯỢU VANG Bài 2: Bài 1: SẢN XUẤT RƯỢU VANG Bài 2: ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM ENZYME PECTINASE TRONG SẢN XUẤT NƯỚC QUẢ bài 3: THU NHẬN ENZYME BROMELIN TỪ DỨA bài 3: THU NHẬN ENZYME BROMELIN TỪ DỨA

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

BÀI 1 SẢN XUẤT RƯỢU VANG 1.1 CƠ SỞ LÍ THUYẾT

1.1.1 Tổng quan về rượu và rượu nho

Rượu vang (từ tiếng Pháp vin) là một loại thức uống có cồn được lên men từ nho.Rượu vang đỏ thường được lên men từ nước ép và vỏ quả nho, còn rượu vang trắng đượclên men chỉ từ nước nho

Nước từ các hoa quả khác có thể được lên men tạo thành rượu, nhưng theo luậtnhiều nước, từ “rượu vang” cho mục đích thương mại chỉ được sử dụng cho rượu lên men

từ nho vì vậy các loại rượu này tuy sản xuất theo quy trình của rượu vang nhưng chỉ đượcgoi là rượu trái cây Tại thị trường Việt Nam thường gọi rượu vang trái cây

Rượu vang thu được không qua chưng cất có hương vị thơm ngon tự nhiên, là loạinước uống giàu chất dinh dưỡng Rượu vang có thành phần rất phức, đến nay ngay cả cácnước có nền sản xuất rượu vang lâu đời cũng chưa biết hết thành phần cấu tạo của rượuvang

Thành phần chủ yếu của rượu vang :

o Cồn ethanol : một thành phần quan trọng nhất của rượu vang.

o Đường (62-132g/l) : chủ yếu là fructose,glucose và một ít galactose Tùy loại

đường khử còn lại trong rượu vang sau khi đã lên men xong mà người ta phân biệt ra cácloại:

 Rượu vang khô (dưới 10g đường/l)

 Rượu vang nửa khô ( 20-30g đường/l)

 Rượu vang nửa ngọt ( 45g đường/l)

 Rượu vang ngọt (80-110g đường/l)

Lượng đường khử càng cao thì lượng cồn càng phải cao để cân đối giữa độ cồn và

độ ngọt

o Các acid vô cơ và acid hữu cơ : độ pH của rượu vang từ 2.9-3.9

o Các loại muối : có hàm lượng thấp, chất muối trong rượu vang giữ vai trò rất quan

trọng

o Vitamin các loại : các vitamin chính trong rượu vang gồm B1, B2, B6, PP Biotin,

B12, acid pantothenic

o Chất màu, hương vị : chất màu được trích từ nguyên liệu vào trong sản phẩm.

Còn hương vị của rượu phụ thuộc vào nguyên liệu và quá trình chuyển hóa giữa các sảnphẩm sinh ra

Ngoài ra trong rượu vang quả còn có thành phần rượu bậc cao, trong đó quan trọngnhất là acetaldehyde, các este, các hợp chất polyphenol Hợp chất polypheno có nhiều vỏquả Do đó rượu vang sẽ giàu polyphenol hơn vang trắng nên cũng tốt cho sức khỏe hơn

1.1.2 Cơ chế lên men rượu

Quá trình lên men rượu là quá trình chuyển hóa đường thành rượu ethylic và CO2

nhờ một số vi sinh vậtt trong điều kiện kỵ khí, trong đó nấm men Saccharomyces

ccerevisae là đối tượng có khả năng lên men rượu mạnh nhất và được ứng dụng nhiều

trong công nghiệp sản xuất rượu bia Nấm mốc và vi khuẩn cũng có khả năng lên menrượu nhưng cho năng suất thấp nên không được sử dụng trong sản xuất

Lên men rượu vang là sự lên men đường có trong nho (trái cây) do nấm men

Saccharomyces ccerevisae, loại nấm men nổi thực hiện Quá trình chuyển hóa đường

thành rượu được thực hiện qua một chuỗi phản ứng rất phức tạp liên quan mật thiết đếnquá trình phosphoryl hóa các hợp chất hữu cơ

Phương trình chuyển hóa đường thành rượu tổng quát:

C6H12O6 + 2H3PO4 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATPĐường cùng chất dinh dưỡng khác của môi trường lên men, được hấp thụ trên bềmặt của tế bào nấm men, sau đó khuếch tán qua màn tế bào (màng bán thấm) và vào bêntrong tế bào nấm men Đường được chuyển hóa theo chu trình đường phân Embden –Meyerhof – Parnas, qua hàng loạt các sản phẩm trung gian để tạo thành acid pyruvic

glucose Acid pyruvicAcid pyruvic trong điều kiện yếm khí, dưới tác dụng của enzyme pyruvatdecacboxylase sẽ bị khử thành acetaldehyde và CO2 Sau đó, acetaldehyde bị khử thànhrượu ethylic dưới tác dụng của enzyme ancoldehydrogenase của nấm men Rượu ethylic

và CO2 tạo thành sẽ thoát ra khỏi tế bào mà khuếch tán ra môi trường xung quanh

1.1.3 Hệ vi sinh vật tham gia lên men rượu

Các loại nấm men chủ yếu gồm:

Aspergillus oryzae: mốc vàng

Asp awamori: mốc xám đen

Giải thích quy trình công nghệ

 Pha chế dịch lên men

Pha loãng dịch quả với nước không phải áp dụng đối với các loại quả Đối với nho,

ta không cần bổ sung, nhưng đối với sơri, xoài, mận, mơ,… thì phải thêm nước từ20-30%

Dịch trái cây thường thiếu đường, không đủ cơ chất để nấm men lên men tạo độcồn cần thiết Do đó, chúng tôi sử dụng đường Saccharose bổ sung vào dịch lên men đểđiều chỉnh nồng độ chất khô 25 Bx Lượng đường cần thiết được bổ sung 3 lần:

 Lần thứ I bổ sung 4/7 lượng đường cần bổ sung cho dịch ngay ngày đầu lên men

 Lần thứ II bổ sung 2/7 lượng đường cần bổ sung cho dịch sau 3 ngày lên men

 Lần thứ III bổ sung lượng đường còn lại cần bổ sung cho dịch vào ngày lên menthứ 6

Dịch quả được điều chỉnh pH bằng CaCO3 và acid citric…pH =3-3,5 là tối ưu cholên men rượu Nếu quá kiềm quá trình lên men sẽ không tạo rượu ethylic mà thay vào làhàm lượng glycerol tăng cao

Dịch trái cây có hàm lượng đạm thấp, để tăng lượng nitơ cần thiết cho nấm men sửdụng trong giai đoạn phát triển sinh khối, chúng tôi sử dụng NH4Cl bổ sung vào hỗ dịchlên men với hàm lượng 0,2-0,4g/l

Bổ sung Na2S2O5 với tỷ lệ 0,16g/l hoặc NaHSO3 với tỷ lệ 0,2-0,3g/l nhằm chốngoxi hóa, hạn chế sự phát triển cũng như tiêu diệt các vi sinh vật có hại cho quá trình lênmen

 Lên men chính

Quá trình lên men chính được thực hiện ở nhiệt độ phòng 28-300C Không nêncho dịch lên men quá đầy bình, phải để trống phía trên khoảng 1/3-1/4 thể tích để đề

phòng khi lên men sủi bọt mạnh, dịch trái cây không bị trào ra ngoài và nhiễm vi sinh vậtkhông mong muốn Cũng không nên chừa trống bình quá nhiều, tạo môi trường cung cấpoxi thừa, giảm hiệu suất lên men rượu của nấm men Tránh để nhiệt độ thay đổi nhiều,hoặc nhiệt độ tăng cao làm nấm men ngừng hoạt động.

Men giống sau khi được cấy, nhân giống qua 2 cấp được bổ sung với nồng độ banđầu 20 triệu tb/ml

Thời gian lên men khoảng 1 tuần, trong quá trình lên men theo dõi sự tạo bọt,không đậy nắp quá chặt tránh khí tạo nhiều làm bật nắp bình

Khi kết thúc lên men chính tiến hành xác định các thông số sau lên men gồm: hàmlượng chất không, pH và độ acid, độ cồn của rượu

 Lên men phụ, tàng trữ và lọc trong

Sau khi lên men chính, rượu được tách cặn, chiết đầy chai, nút kín và trữ ở15-180C để ổn định chất lượng rượu Quá trình lên men phụ và tàng trữ kéo dài 4 tuần.Trong thời gian này, cần tiến hành gạn lọc, để lắng, chiết chai vài lần để loại hết xác nấmmen lắng dưới đáy chai, hoặc có thể lọc chân không (có thể bổ sung ít bột trợ lọc) để làmtrong rượu nhanh hơn

1.2.2 Kế hoạch thí nghiệm

Buổi 1: Chuẩn bị:

 Tính toán và pha chế môi trường Hansen để giữ giống và nhân giống, mỗi nhómcần 2 ống Hansen nghiêng, 1 ống chứa 9ml Hansen lỏng 7oBx và 1 erlen chứa 45mlHansen long và 45ml dịch trái cây 12oBx Lưu ý khi làm môi trường nhân giống cấp 2 cần

đo Bx của dịch trái cây sau khi phối trộn với môi trường Hansen lỏng để tính toán lượngđường bổ sung cho đạt 12oBx

sinh lý và bao gói các pipet hoặc đầu típ để vô trùng…

 Cấy chuyền giữ giống từ ống giống sang ống thạch nghiêng

nhằm tăng sinh khối và tăng hoạt lực giống Ở quy mô phòng thí nghiệm, ta tiến hànhnhân giống qua 2 cấp

 Nhân giống cấp 1 (trước buổi 2 khoảng 1 ngày): cho 2 ml nước muối sinh lývào ống giống thạch nghiêng, dùng que cấy hòa toàn bộ giống vào nước muối,

đổ nước này vào ống nghiệm chứa môi trường Hansen lỏng có nống độ đường

7oBx đã vô khuẩn ở 121oC trong 20 phút Nuôi trên máy lắc trong 18-24 giờ

 Nhân giống cấp 2 (trước buổi 2 khoảng 1 ngày): Sử dụng môi trường Hansenlỏng có bổ sung dịch trái cây (theo tỷ lệ 1:1) đa vô khuẩn nhằm giúp nấm menquen dần với môi trường dịch lên men Sinh khối nấm men sau khi nhân giốngcấp 1 được cấy truyền theo tỷ lệ 1:10 sang môi trườn mới, nuôi trên máy lắctrong 18-24 giờ

Công thức: Môi trường Hansen để nuôi cấy nấm men

Cách pha: Agar được nấu tan, thêm Pepton được hòa tan trước đó trong nước ấm.

Cho thêm các thành phần còn lại vào, khuấy đều Đun sôi trở lại và nhấc xuống, phân vàoống nghiệm để làm thạch đứng và thạch nghiêng, gắn nút bông, khử trùng 1 atm trong 15phút (Môi trường Hansen lỏng thì không cho agar)

Buổi 2: Sản xuất rượu vang trái cây

 Kiểm tra chất lượng canh trường men giống (đã nhân giống 1 ngày trước đó): đếm

số tế bào nấm men/1ml canh trường, tỷ lệ sống chết, tỷ lệ này chồi Hút 1ml dịch nhângiống, pha loãng đến độ thích hợp, đếm bằng buống đếm hồng cầu (Phụ lục 1) Tính toánthể tích dịch nhân giống tương ứng với thể tích dịch lên men, dựa theo nguyên tắc mengiống được bổ sung với nồng độ ban đầu 20 triệu tb/ml

 Xử lý nguyên liệu, pha chế dịch lên men Lưu ý, sau khi ổ sung giống mới kiểm tra

độ Bx của dịch lên men và tính toán lượng đường cần bổ sung

 Thực hiên lên men chính và các bước tiếp theo

Buổi 3: Kiểm tra sản phẩm

 Cảm quan: độ ngọt, vị chát, màu sắc, độ trong, múi thơm

 Định lượng độ cồn ethanol theo phương pháp bình tỷ trọng (phụ lúc 2, 3-1, 3-2)

 Định lượng đường khử theo phương pháp DNS (phụ lục 4)

cuối đạt độ cồn 12%v/v và độ ngọt thích hợp

KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM BÀI : SẢN XUẤT RƯỢU VANG

- Pha hóa chất Hansen lỏng, rắn

- Pha SPW

- Pha 45ml Hansen lỏng + 45ml dịch nho vô bình tam giác

- Làm thạch nghiêng để đi cấy → Ủ → Nhân giống cấp 1 → Nhân giống cấp 2

- Pha loãng từ bình tam giác sang SPW ở 3 nồng độ 10-1, 10-2, 10-3

- Quan sát mật độ nấm men trên kính hiển vi theo các nồng độ đã pha

- Đổ hết dung dịch từ bình tam giác qua hết thùng nho

- Đo dịch mẫu ban đầu có độ Bx 13

- Tính toán được lượng đường 300g cho vô thùng nho để được độ Bx 25

- Tính được thể tích trong bình tam giác:

2.106 tb/ml → X

2.107 tb/ml → 2,4 lít

Vậy X = 240ml

BÀI 2 : ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM ENZYME PECTINASE TRONG

SẢN XUẤT NƯỚC QUẢ

2.1 CƠ SỞ LÍ THUYẾT

2.1.1 Giới thiệu chung về enzyme pectinase

Enzyme pectinase là enzyme xúc tác thủy phân liên kết ester hoặc liên kết glucoside có mạch polymer của pectin, sản phẩm của quá trình này là acid galcturonic,

galactose,arabinose,methanol,…Đây là một nhóm enzyme được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chỉ đứng sau Amylase và Protease

Enzyme pectinase trong tự nhiên có ở thực vật, vi sinh vật Pectinase được sản xuất chủ yếu bởi nấm mốc Aspergillus sp, Botryis ,Fusarium moniliforme, Rhizopus stolonifer, Trichoderma sp , Neurospora crassa,…

Ở thực vật, sự thủy phân pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái chín Vì vậy những enzyme này có vai trò rất quan trọng trong quá trình chín tự nhiên của trái cây hay trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả

Enzyme pectinase có vai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả

Nhiệt độ hoạt động tối ưu của enzyme pectinase thường khoảng 45-550C, pH hoạt động thường khoảng 3,5-4

2.1.2 Ứng dụng của pectinase trong công nghệ thực phẩm

Pectinase thường được sử dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm sau:

- Sản xuất rượu vang;

- Sản xuất nước hoa quả và nước uống không có cồn;

- Sản xuất các mặt hàng từ quả: nước quả cô đặc, mứt nhừ, mứt đông,…

- Sản xuất nước giải khát;

- Sản xuất trà, cà phê và cà phê hòa tan;

- Xử lý tế bào thực vật để tạo tế bào trần

Enzym pectinase được ứng dụng nhiều trong chế biến thực phẩm, đặc biệt là khả nănglàm nước hoa quả Việc kiểm soát enzyme pectinase cũng có thể kiểm soát được độ nhờncủa sản phẩm

Trong sản xuất rượu vang, cũng như trong sản xuất nước quả và các nước uống khôngcồn, đều có thể sử dụng pectinase một các hiệu quả Nhờ tác dụng của pectinase mà cácquá trình ép, làm trong và lọc dịch quả rất dễ dàng, do đó làm tăng hiệu suất sản phẩm.Chẳng hạn đưa pectinase vào khâu nghiền quả thì khối quả nghiềm sẽ có tình trạng tháikeo, do đó khi ép dịch quả không thoát ra được Nhờ pectinase phân giải các chất pectin

di mà dịch quả trong suốt không bị vẩn đục và lọc rất dễ dàng Không những vậy, enzympectinase còn góp phần chiết rút được các chất màu, tanin và những chất hòa tan nữa, do

đó làm tăng thêm chất lượng của thành phần

Ngoài ra pectinase cũng được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực khác như trích ly đượcliệu, xử lý môi trường, chế biến thực ăn gia súc,…

2.2 Nội dung thí nghiệm

Nguyên liệu

Chọn, phân loại

Xử lý với enzymeNghiềnChầnNgâm

Rửa,(gọt vỏ), bỏ lõi, cắt miếng

Gia nhiệt

Phối trộnLọc tinh

Lọc thôÉp

Thanh trùngRót chai,ghép mí

Làm nguội

Nước thơm

 Thuyết minh quy trình công nghệ:

Nguyên liệu:

Là loại thơm có hình thức và chất lượng tốt: trái thơm tươi mới, vừa chính tới

nhiều nước, màu vàng đậm,, vị ngọt

Ép:

Ép là phương pháp chủ yếu để tách dịch bào ra khỏi nguyên liệu nhằm thu dịch quả táosau quá trình xử lý enzyme Sử dụng thiết bị ép chuyên dụng sau đó thì lọc lại bằng khăn.Lọc thô có tác dụng loại bỏ bã táo còn lại sau ép.

Xử lý với enzyme:

Đây là công đoạn quan trọng giúp phá vỡ màng tế bào và quyết định phần lớn độ trongcủa sản phẩm nước quả Dịch thơm được bổ sung enzyme pectinase (khoảng 1-2%), gianhiệt đến nhiệt độ (khoảng 40-450C) sau đó được ủ trong khoảng thời gian thích hợp(khoảng 2 – 4h) phụ thuộc vào độ tinh khiết của enzyme và hàm lượng sử dụng, nhiệt độphản ứng và sự biến đổi của loại táo được chọn

Nước dứa 11 độ brix (cho vào 350ml syrup 270brix)

 Tổng dịch syrup + nước dứa thì đạt 200Brix (có 650ml thu được)

- Cốc có enzyme

Nước dứa 11 độ brix (cho vào 500ml syrup 270brix)

 Tổng dịch syrup + nước dứa thì đạt 190Brix (có 800ml thu được)

Rót chai – Ghép mí:

Sử dụng chai thủy tinh trong suốt loại tốt cho phép dùng trong thực phẩm, ngăn cản tiabức xạ và chịu nhiệt tốt Chai và nắp được xử lí qua công đoạn rửa sạch sẽ Đây cũng làmột trong những công đoạn quan trọng nhằm cách ly thực phẩm với môi trường khôngkhí và sinh vật bên ngoài, bảo quản chất lượng sản phẩm nước quả trong suốt quá trìnhsản xuất và lưu hành trên thị trường Sau khi rót dịch nước quả vào chai cần được bài khítrước khi ghép nắp Bài khí là quá trình đuổi bớt chất khí tồn tại trong chai nhằm:

- Giảm áp suất bên trong chai đựng dung dịch nước quả khi thanh trùng

- Hạn chế quá trình oxy hóa

- Hạn chế sự phát triển của vi sinh vật hiếu khí tồn tại trong đồ hộp sau khi thanhtrùng,

Phạm vi PTN ta bài khí bằng cách rót nóng thật nhanh rồi đóng nắp chai Yêu cầu nắpchai phải được gắn thật kĩ và chắc chắn, đảm bảo cho công đoạn thanh trùng không bịbung nắp

Thanh trùng – Làm nguội:

Công đoạn này rất quan trọng có tác dụng tiêu diệt và ức chế mọi hoạt động của vi sinhvật có trong sản phẩm nhằm bảo quản chất lượng sản phẩm lưu hanh trên thị trường theothời gian Thời gian và nhiệt độ thanh trùng là:

KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM BÀI 2: ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM ENZYME

PECTINASE TRONG SẢN XUẤT NƯỚC QUẢ

Nhận xét:

- Đánh giá cảm quan với sản phẩm không bổ sung Enzym

+ Mùi: có mùi thơm nhẹ đặc trưng của dịch nước dứa + Vị: chua ngọt êm nhẹ, dư vị không kéo dài

+ Màu sắc: màu vàng đục

+ Độ trong: có lắng cặn đục, độ trong không nhiều

- Đánh giá cảm quan với sản phẩm có bổ sung Enzym

+ Mùi: có mùi thơm nồng đặc trưng của dịch nước dứa + Vị: chua ngọt êm nhẹ, dư vị kéo dài không ngấy

+ Màu sắc: màu vàng trong

+ Độ trong: có ít cặn nhưng không đục, độ trong cao

Kết luận: bổ sung Enzym làm tăng cảm quan của sản phẩm, giúp sản phẩm trong hơn vàngọt ngon hơn

BÀI 3 THU NHẬN ENZYME BROMELIN TỪ DỨA 3.1 CƠ SỞ LÝ THUYẾT

Cây dứa (Ananas comosus) thuộc họ đơn từ diệp, thuộc họ Bromeliaceae có nguồngốc từ Nam Mỹ Hiện nay, ở nước ta loại dứa đang đựợc trồng nhiều nhất là Ananascomosa được dùng làm nguồn thực phẩm tươi, đóng hộp, là nguồn thu nhận enzyme vàđược sử dụng trong một số lĩnh vực như mỹ phẩm, dược phẩm Phần thân và lá sau khithu hoạch có thể làm giấy, lấy sợi làm phân bón

Thành phần của dứa: Trong quả dứa chín, nước chiếm đố, hàm lượng 80-86%,cacbonhydrat chiếm 10- 18% (trong đó saccharose 60 - 67% glucose và fructose chiếm30-40%), protein 2- 3%, axit hữu cơ 0,1- 1.6 (axit citric chiếm 87% và axit maleic chiếm13%), tro 0.3%, sắc tố 0.03- 0,6% và các hợp chất phenolic (tạo màu) các hợp chất tạomùi, các vitamin: A, B, C, và enzyme bromelin

 Bromelain có hoạt tỉnh xúc tác sự phân giải protein tương tự như papain trong mů

đu đủ hay ficin trong cây thuộc họ Sung

 Enzyme bromelin có trọng lượng phân tử lớn khoảng 33000 Da, lớn 1.5 lần so vớipapain