Giáo trình vi sinh đại cương

Đặc tính chung của giới nguyên sinh vật gồm: - Đơn vị sống là đơn bào, tự mỗi tế bào có thể tổng hợp lấy chất dinh dưỡng cần thiết được thực vật và động vật thì các tế bào chuyên hóa cao

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

GIÁO TRÌNH Tài liệu lưu hành nội bộ

VI SINH ĐẠI CƯƠNG

AN GIANG, 8-2017

Chương 1 ĐỐI TƯỢNG VÀ LƯỢC SỬ NGÀNH VI SINH HỌC

1.1 ĐỐI TƯỢNG NGÀNH VI SINH HỌC

Vi sinh học (Microbiology, Microbiologie) là ngành khoa học nghiên cứu về cấu tạo và hoạt động sống của vi sinh vật Vi sinh vật học hiện đại ngày nay đi sâu vào việc

sử dụng vsv nhằm phục vụ lợi ích của con người và giữ vững hệ sinh thái trên trái đất

Vi sinh vật (microorganism) là những sinh vật rất nhỏ, có cấu tạo đơn bào hoặc đa bào rất kém phân hóa và chỉ có thể nhìn thấy với kính hiển vi

Dựa vào sự tiến hóa của từng nhóm mà xếp loại chúng vào các nhóm, lớp, bộ và

họ khác nhau nhằm phục vụ cho nghiên cứu Trong hệ thống phân loại tổng quát, vi sinh vật gồm các nhóm:

- Vi sinh vật nhân nguyên (Prokaryotic) gồm vi khuẩn (Bacteria), xạ khuẩn (Actinomycetes), Mycoplasma, Ricketxia (Rickettsias), Chlamydia, dạng L của vi khuẩn (L-form) và tảo lam hay thanh thực vật (Cyanophyta)

- Vi sinh vật nhân thực (Eukaryotic) gồm nấm (Eumycetes), Rong tảo (Algae)

và nguyên sinh động vật (Protozoa)

- Nhóm virus là các vi sinh vật có mức độ tiến hóa thấp

Giữa các nhóm vi sinh vật trên tuy có sự khác biệt nhau về hình thái, phân loại nhưng chúng cũng có những đặc điểm chung giống nhau như:

- Kích thước nhỏ bé thường được đo bằng đơn vị µm (micromet), riêng virus được đo bằng đơn vị nm (nanomet)

1 nm = 10-3 µm = 10-6 mm = 10-9 m

Hình 1.1 Kích thước của một số nhóm sinh vật trong tự nhiên

- Sinh trưởng và phát triển nhanh

- Hấp thu nhiều, chuyển hóa nhanh

- Khả năng thích ứng và phát sinh biến dị rất cao

- Phân bố rộng, chủng loài nhiều

- Là một trong những đối tượng xuất hiện sớm nhất trên trái đất

Hình 1.2 Vết tích của các vi sinh vật hóa thạch

Về mặt ứng dụng: ngành vi sinh học gồm có các chuyên ngành như vi sinh học công nghiệp, vi sinh học thực phẩm, vi sinh học y học, vi sinh học thú y, bệnh lý thực vật, vi sinh vật đất, vi sinh học nước, vi sinh học không khí,

1.2 SƠ LƯỢC LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN NGÀNH VI SINH HỌC

1.2.1 Giai đoan phát hiện ra vi sinh vật

Người đầu tiên nhìn thấy và mô tả vi sinh vật là Antoni Van Leeuwenhook 1723) người Hà Lan Leeuwenhook đã chế tạo ra chiếc kính hiển vi thô sơ với độ phóng đại từ 270 - 300 lần và quan sát thế giới vi sinh vật quanh Ông như nước sông hồ, nước

(1632-ao tù, nước cống và trong bựa răng Năm 1695, Leeuwenhook xuất bản quyển "Phát hiện của Leeuwenhook về những bí mật của giới tự nhiên" nhằm mô tả lại toàn bộ quan sát của Ông về vi sinh vật

Hình 1.3 (a) Antoni Van Leeuwenhook (632 – 1723); (b) Kính hiển vi do Leeuwenhook chế tạo; (c) Hình vẽ các vi khuẩn trong miệng người

(a)

Hình 1.4 Cấu tạo chi tiết kính hiển vi đầu tiên do Leeuwenhook chế tạo

Sau Leeuwenhook, nhiều loại vi sinh vật được mô tả nhưng chỉ nhằm chứng minh

có sự hiện diện của thế giới vi sinh vật, việc mô tả và phân loại chúng một cách rất thô

sơ Trong quyển "Hệ thống tự nhiên", Carl Linne (1707-1778), nhà phân loại thực vật nổi tiếng trên thế giới đã xếp vi sinh vật vào một chi (genus) gọi là "Chaos", nghĩa là hỗn loạn

Cuối thế kỷ 18, những hiểu biết về vi sinh vật mới dần dần phong phú hơn, thu hút nhiều nhà bác học đi sâu vào nghiên cứu thế giới nhỏ bé này và nhận thấy được sự gắn bó chặt chẽ giữa chúng với đời sống

1.2.2 Giai đoạn vi sinh học thực nghiệm

Người có công lớn nhất khai sinh ra vi sinh vật học thực nghiệm là nhà bác học người Pháp Louis Pasteur (1822 – 1895), Ông đã đi vào nghiên cứu các hoạt động sinh

lí, sinh hóa của vi sinh vật và ứng dụng các vi sinh vật này trong quá trình lên men Qua quá trình nghiên cứu và thực nghiệm, Pasteur đã chứng minh vi sinh vật không thể "tự sinh" hay "ngẫu sinh" như nhiều nhà bác học cùng thời chủ trương Thí nghiệm của Ông được thực hiện trong bình cổ cong uốn khúc hình chữ U, trong bình có chứa nước canh thịt đã đun sôi (Hình 1.5) và để yên lâu ngày vẫn không hư và không có mùi hôi, nhưng nếu đập vỡ cổ bình thì ít lâu sau nước canh thịt sẽ hư thối vì nhiễm vi sinh vật có sẵn trong không khí

(a) (b)

Hình 1.5 (a) Louis Pasteur, (b) Các loại bình cổ cong Pasteur sử dụng để bác bỏ

thuyết tự sinh

Pasteur có công rất lớn với nhân loại vì đã giải quyết được phương pháp tẩy độc rượu vang (đun đến 600C, giữ trong chai đậy kín), đưa đến phương pháp tẩy độc sữa, thực phẩm vẫn còn áp dụng đến nay Ngoài ra Ông giải quyết được dịch bệnh tằm gai (bệnh Pébrine) một dịch bệnh làm ngành nuôi tằm của Pháp bị suy sụp bằng cách chứng minh bệnh này do vi sinh vật gây ra và truyền từ tằm bệnh sang tằm khỏe

Pasteur đã chứng minh các bệnh truyền nhiễm ở người và động vật là do các vi sinh vật gây nên Từ năm 1878 đến 1880, Pasteur đã khám phá ra được ba chủng vi khuẩn là liên cầu khuẩn (Streptococcus), tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) và phế cầu khuẩn (Pneumococcus)

Xuất phát từ quan niệm một loại bệnh sẽ do một loại vi sinh vật nhất định do nhiễm từ môi trường bên ngoài gây nên, Pasteur đã thiết lập nên những nguyên tắc quan trọng trong vô khuẩn góp phần làm giảm đáng kể tỉ lệ tử vong hậu phẫu và hậu sản Năm 1880, Pasteur thành công trong việc tạo miễn dịch cho gà chống lại bệnh tả bằng cách cho tiếp xúc với môi trường nuôi cấy vi khuẩn tả "già" (vi khuẩn này giảm độc lực) Những con gà này sau đó có khả năng chống lại bệnh tả khi được tiêm vi khuẩn độc lực mạnh Ông nhanh chóng áp dụng nguyên lý này để tạo ra vaccin ngừa bệnh cho cừu, dê chống lại bệnh than, vaccin tụ huyết trùng gà, bệnh heo bị đóng dấu, Công lao lớn nhất của Ông đối với nhân loại là việc chế vaccin ngừa và trị bệnh chó dại là bệnh nan y hiện giờ Năm 1885, lần đầu tiên Pasteur đã dùng vaccin trị cho một em bé bị chó dại cắn thoát khỏi bệnh Ngày nay, khắp nơi trên thế giới đều có các viện Pasteur để tiến hành các nghiên cứu chế tạo vaccin và thực hiện các chiến dịch phòng chống lại các bệnh truyền nhiễm

1.2.3 Giai đoạn sau Pasteur và vi sinh học hiện đại

Tiếp theo Pasteur, Robert Koch (1843-1910), người có công lớn trong phát triển các phương pháp nghiên cứu vi sinh vật Ông đề ra phương pháp chứng minh một vi sinh vật là tác nhân gây ra bệnh truyền nhiễm mà ngày nay mọi nhà nghiên cứu bệnh học phải tuân theo, đó là qui tắc Koch (Postulate de Koch) Đến ngày 24-3-1882, Koch

đã công bố công trình khám phá ra vi trùng bệnh lao (một bệnh nan y thời đó) và gọi nó

là Mycobacterium tuberculosis Khám phá đã mở đường cho việc chữa trị bệnh này

Hình 1.6 Rober Kock đang quan sát mẫu trong phòng thí nghiệm

Học trò của Kock là Juliyes Richard Petri (1852-1921) đã chế tạo ra được đĩa Pêtri, một loại dụng cụ vẫn đang được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu vi sinh vật hiện nay Ông cũng đã nêu ra các biện pháp nhuộm màu vi sinh vật

S I Vinogradxki (1856-1953) người Nga và M W Beijerinck (1851-1931) người

Hà Lan là những nhà vi sinh học có công lớn trong việc phát triển ngành vi sinh học đất Ivanopxki (1892) và Beijerrinck (1896) là những người phát hiện ra virus đầu tiên trên thế giới khi chứng minh vi sinh vật nhỏ hơn vi khuẩn, qua được lọc bằng sứ xốp, là nguyên nhân gây bệnh khảm cây thuốc lá

Ngày nay, ngành vi sinh học đã phát triển rất sâu với nhiều nhà bác học có tên tuổi và nhiều người tham gia nghiên cứu Các nghiên cứu đã dần đi sâu vào bản chất của sự sống ở mức phân tử và dưới phân tử, kỹ thuật cấy mô và tháo lắp ghép gen ở vi sinh vật và ứng dụng kỹ thuật này để chữa bệnh cho người, gia súc và cây trồng,…

Hình 1.7 Một số nhà sinh học tiêu biểu 1.3 HỆ THỐNG SINH GIỚI VÀ VỊ TRÍ CỦA CÁC NHÓM VSV

1.3.1 Khái niệm về giới sinh vật

Giới (Kingdom) là đơn vị phân loại lớn nhất hiện nay bao gồm những sinh vật có chung những đặc điểm nhất định Các hệ thống phân loại sinh vật là kết quả của hơn

200 năm nghiên cứu về hệ thống học

Hệ thống các cơ thể ngày càng hợp lý nhờ những hiểu biết sâu sắc về sinh học phân tử Ngày nay, nhờ các phương pháp phân loại hiện đại như: hóa phân loại (Chemotaxonomy), phân loại số (Numerical taxonomy), phân loại chủng loại phát sinh (Phylogeney taxonomy), mà khoa học đã xác định vị trí khá chính xác của các nhóm

cơ thể và mối liên hệ chủng loại phát sinh giữa chúng

Thế giới sinh vật vô cùng phong phú và đa dạng Để nghiên cứu chúng các nhà khoa học phải dựa vào các tiêu chí về cấu tạo, dinh dưỡng, sinh sản, để sắp xếp chúng vào bậc thang phân loại và đặt tên

Các sinh vật được sắp xếp theo thang phân loại từ thấp đến cao: Loài (Species), Chi (Genus), Họ (Family), Bộ (Order), Lớp (Class), Ngành (Phylum) và Giới (Kingdom) Hiện nay trên giới còn có một mức phân loại nữa gọi là lĩnh giới (Domain) Ngoài ra còn có các mức phân loại trung gian như Loài phụ (Subspecies), Chi phụ (Subgenus), Họ phụ (Subfamily), Bộ phụ (Suborder), Lớp phụ (Subclass), Ngành phụ (Subphylum)

Loài là bậc thang phân loại thấp nhất, giới là cấp phân loại cao nhất Bất kỳ một sinh vật nào cũng được sắp xếp vào một loài nhất định Nhiều loài thân thuộc tập hợp thành chi, nhiều chi thân thuộc tập hợp thành họ, nhiều họ thân thuộc tập hợp thành bộ, nhiều bộ thân thuộc tập hợp thành lớp, nhiều lớp tập hợp thành ngành, nhiều ngành hợp thành một giới Để tránh nhầm lẫn người ta đặt tên loài theo nguyên tắc dùng tên kép

1 Antony van Leeuwenhoek (1632-1723);

2 Louis Pasteur (1822-1895);

3 Robert Koch (1843-1910);

4 Alexander Fleming (1881-1955);

5 J D Watson (1928-?)

(theo tiếng Latinh) Tên thứ nhất là tên chi (viết hoa chữ cái đầu tiên), tên thứ 2 là tên loài (viết thường) Ví dụ: Escherichia coli Khi cần viết tắt ta chỉ viết tắt tên chi, tên loài viết đầy đủ (bằng chữ thường) Ví dụ: E coli

1.3.2 Một số hệ thống phân loại sinh vật

1 Aristotle (384 – 322 TCN); 2 Carl Von Linne (1707 – 1778);

3 Ernst Heinrich Haeckel (1834 – 1919); 4 Robert Whittaker (1921-1981)

Hình 1.8 Một số nhà phân loại sinh vật tiêu biểu Trước Linne có nhiều tác giả phân loại sinh vật nổi tiếng, đáng chú ý là Aristotle (384 - 322 TCN) có nhiều đóng góp trong phân loại động vật

Bảng 1.1 Một số hệ thống phân loại sinh vật

Hình 1.9 Hệ thống ba lĩnh giới (Domain) Carl R Woese, 1990

Hình 1.10 Hệ thống phân loại 8 giới sinh vật (T Cavalier – Smith, 1993)

Gần đây hơn có các hệ thống phân loại được nhiều người chú ý:

Hình 1.11 Hệ thống phân loại 6 giới sinh vật ( P H Raven and G B Johnson, 2002) Trước khi ngành vi sinh vật được nghiên cứu tường tận như hiện nay, các nhà nghiên cứu chia sinh vật làm 2 giới: giới thực vật (vegetalia) và giới động vật (Animalia), vi sinh vật cũng xếp vào 2 giới trên như nấm, tảo và vi khuẩn được xếp vào giới thực vật, còn nguyên sinh động vật (protozoa) được xếp vào giới động vật Tuy nhiên, với sự hiểu biết ngày càng sâu về vi sinh vật thì sự phân loại trên gặp nhiều khó khăn và không hợp lý Đến năm 1866, Ernest Haeckel, học trò của Darwin, đề nghị lập thêm giới nguyên sinh vật (Kingdom protista) dành cho vi sinh vật Đặc tính chung của giới nguyên sinh vật gồm:

- Đơn vị sống là đơn bào, tự mỗi tế bào có thể tổng hợp lấy chất dinh dưỡng cần thiết được (thực vật và động vật thì các tế bào chuyên hóa cao hơn và giữ một số nhiệm

vụ nhất định nên không thể sống độc lập được)

- Còn siêu vi khuẩn hay virus tuy không có cấu tạo tế bào nhưng cũng được xếp chung vào giới nguyên sinh vật

Giới nguyên sinh vật được chia ra làm 6 nhóm chính như sau:

a Vi sinh vật nhân thực (giới nhân thực - chân hạch – Eukaryota) gồm những sinh vật có nhân thực sự, nhân có màng bao bọc với tế bào chất của tế bào Gồm 3 nhóm:

 Nhóm 1: Nguyên sinh động vật (protozoa): đơn bào, di động theo lối biến hình trùng (amib) gần với động vật

 Nhóm 2: tảo hay rong (Algae): đơn bào hoặc kết hợp thành khối đa bào nhưng chưa chuyên hóa, có khả năng quang hợp

 Nhóm 3 (Eumycetes): đơn bào hoặc kết hợp thành khối đa bào nhưng các tế bào chưa chuyên hóa, không quang hợp

b Vi sinh vật nhân nguyên (giới nhân nguyên - tiền hạch – Prokaryota) gồm các

vi sinh vật không có nhân thực sự, các chuỗi DNA tập trung thành vùng nhân nhưng không có màng nhân bao bọc, nên không phân biệt với tế bào chất của tế bào Gồm có:

 Nhóm 4: vi khuẩn (Schizomycetes) bao gồm vi khuẩn, dạng L của vi khuẩn (L-form), xạ khuẩn (Actinomycetes), tảo lam hay vi khuẩn lam (Cyanobacteria), Mycoplasma, Rickettsia, Chlamydia

c Các nhóm khác gồm

 Nhóm 5: siêu vi khuẩn hay virus: cấu tạo đơn giản, không có dạng tế bào, là dạng sống thấp và đơn giản nhất của vi sinh vật

 Nhóm 6: các dạng tế bào thực vật và động vật được nuôi cấy trong phòng thí nghiệm (invitro) (cấy mô) qua nhiều thế hệ đã trở nên đơn bào, có khả năng sống tự lập trong môi trường nuôi cấy

Tóm lại, chúng ta có thể sắp xếp vi sinh vật theo các nhóm từ thấp đến cao, theo mức tiến hóa, như sau:

Giới nhân nguyên Vi khuẩn, dạng L của vi khuẩn,

Mycoplasma, Ritketsia, Chlamydia, Xạ khuẩn, Tảo lam

Giới nhân thực Protozoa, Tảo và Nấm

Giới thực vật

Giới động vật

1.3.3 Những sai khác giữa các tế bào Prokaryote và Eukaryote

Nhóm sinh vật Nhân sơ và Nhân chuẩn có những sai khác cơ bản (Bảng1.5):

Bảng 1.2 Những sai khác giữa các tế bào Prokaryote và Eukaryote

Đặc điểm Nhóm Nhân sơ

(Prokaryote)

Nhóm Nhân chuẩn (Eukaryote)

1 chiều qua plasmid

Có

> 1

Có

Có Bằng sự kết hợp giao tử

* Các cấu trúc của tế bào:

- Kích thước ribosome 70S 80S ở nhân, 70S - bào quan

- Sợi thoi vô sắc Không có Có

- Vách tế bào chứa PG

(Peptidoglycan)

Có murein ngoại trừ Mycoplasma và vi khuẩn cổ

Đôi khi có Đôi khi có Màng bào quan Chuyển động nội bào rõ rệt

1.4 SỰ PHÂN BỐ VSV TRONG TỰ NHIÊN

Vi sinh vật phân bố rộng rãi trong tự nhiên Trên bề mặt hoặc bên trong tất cả các vật thể sống hoặc không sống trong tự nhiên đều có nhiều ít vi sinh vật Trong phần này

ta chỉ nghiên cứu về sự phân bố của vi sinh vật trong không khí, đất và nước

1.4.1 Vi sinh vật trong không khí

Không khí không phải là môi trường thuận lợi cho vi sinh vật phát triển Tuy nhiên, trong không khí vẫn có vi sinh vật do cuốn theo bụi đất và sự hô hấp và bài tiết của người và động vật

Đa số vi sinh vật trong không khí là loại hoại sinh như cầu khuẩn, trực khuẩn có bào tử, nấm mốc, nấm men Nhiều khi trong không khí cũng có vi sinh vật gây bệnh như trực khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis), trực khuẩn bạch hầu (Corynebacterium diphtheriae), liên cầu khuẩn tan máu, tụ cầu khuẩn gây bệnh, trực khuẩn ho gà, virus cúm, sởi, quai bị, từ bệnh nhân hay người lành mang mầm bệnh tiết ra

Số lượng vi sinh vật trong không khí thay đổi tùy địa điểm, dân số, mùa trong năm Trên núi cao số lượng ít hơn dưới thấp Nơi có tuyết phủ, 1 m3 không khí có 4 - 5

vi khuẩn Không khí ở thành thị có nhiều vi sinh vật hơn ở nông thôn Những nơi đông dân cư, nơi công cộng thường có nhiều vi khuẩn, virus do người bài tiết ra làm ô nhiễm bầu không khí trong một thời gian nhất định Môi trường ẩm thấp cũng có nhiều vi sinh vật Không khí quanh bệnh nhân có nhiều vi sinh vật hơn người lành

Mặc dù vi sinh vật trong không khí không nhiều lắm, không sinh sản và phát triển, nhưng cũng cần hết sức chú ý, vì không khí là phương tiện truyền vi sinh vật từ chỗ này sang chỗ khác Không khí cũng là nguồn nhiễm bẩn thực phẩm và gây nên một

số bệnh truyền nhiễm

Sau những trận mưa lớn, không khí trở nên trong sạch Các biện pháp trồng cây xanh, xây dựng nhà cửa cao ráo thoáng khí, hàng ngày mở cửa phòng ở, phòng làm việc cho không khí lưu thông, để ánh sáng vào có tác dụng tốt trong việc làm sạch không khí

Trong một số trường hợp để khử trùng không khí, người ta thường dùng một vài chất: acid lactic, formol, trietylenglycol, ozone, gần đây người ta dùng đèn phát tia tử ngoại để sát trùng không khí các phòng mổ, phòng sản xuất và bảo quản lạnh trong công nghiệp thực phẩm

Trong đất canh tác, có nhiều chất hữu cơ, thoáng khí, số lượng vi sinh vật lên tới hàng triệu cá thể trong 1 g đất, đất hoang hóa và đất sa mạc có số lượng ít hơn

Số lượng vi sinh vật thay đổi theo độ sâu của đất: trên bề mặt có ánh sáng mặt trời, khô ráo nên có ít vi sinh vật, ở độ sâu 0,5 – 25 cm có số lượng nhiều, 100 – 200 cm

số lượng bắt đầu giảm, ở độ sâu vài mét vi sinh vật ít tồn tại vì thiếu chất hữu cơ và ôxi

Các nhóm vi sinh vật trong đất thường xuyên có liên quan với nhau, có khi tác động tương hỗ lẫn nhau như Nitrosomonas và Nitrobacter, có khi chống đối nhau như các loài vi khuẩn, vi nấm, xạ khuẩn phát sinh ra các chất kháng sinh ức chế sự phát triển của các loại vi sinh vật khác

Vậy hệ vi sinh đất chính là nguồn lây nhiễm cho nước, không khí Rồi chúng theo nước và không khí lan truyền khắp mọi nơi Cần đề phòng vi sinh vật đất làm hư hỏng lương thực thực phẩm và có thể gây một số bệnh hiểm nghèo như: bệnh than, bệnh uốn ván, hoại thư sinh hơi, ngộ độc thịt,

Mặt khác, vi sinh vật đất có tầm quan trọng đặc biệt trong sự hình thành chất mùn Trong đất còn có những vi khuẩn cố định N2 sống tự do hoặc cộng sinh làm giàu thêm nitơ cho đất Nhưng ngược lại trong đất cũng có những vi khuẩn phản nitrate hóa, phản sunfat hóa, mức độ phì nhiêu của đất phụ thuộc vào sự hoạt động của chúng Do đó ta phải khống chế hoạt động của chúng để phát huy ảnh hưởng tốt, hạ thấp ảnh hưởng xấu, đưa năng suất mùa màng lên cao Đất cũng là nguồn tốt để phân lập VSV hữu ích 1.4.3 Vi sinh vật nước

Nước là một vấn đề quan trọng trong đời sống cũng như trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, Để hiểu rõ vấn đề này ta tìm hiểu sự phân bố vi sinh vật trong nước, vấn đề làm sạch nước và vấn đề nước thải

Cũng như đất, nước tự nhiên là một môi trường rất thuận lợi cho vi sinh vật tồn tại

và phát triển Sự phát triển của vi sinh vật trong nước phụ thuộc vào một số yếu tố như nhiệt độ, pH, nồng độ O2, , trong đó quan trọng hơn cả là thức ăn trong nước Nước càng bị bẩn do xác bã hữu cơ - nghĩa là càng nhiều thức ăn thì càng chứa nhiều vi sinh vật Điều này ta sẽ thấy rõ khi nghiên cứu từng loại nước

- Nước ngầm (nước mạch) có ít vi sinh vật là do nước đã được thấm qua các lớp đất dày, vi sinh vật và các thức ăn hữu cơ được giữ lại trong lớp đất này Nước ngầm càng sâu thì càng sạch Các giếng mạch nếu tìm được nguồn mạch tốt, sâu và có bảo vệ

để tránh nhiễm bẩn ở bờ thì sẽ cho ta nước rất tốt cho việc ăn uống

- Nước ao, hồ bị nhiễm phân, rác rưởi có nhiều chất hữu cơ thì số lượng chủng loại vi sinh vật tăng nhiều

- Nước ở trong những hồ, biển lớn bụi bị lắng chìm nên số lượng vi sinh vật ít hơn

- Nước ở những vùng sông, ngòi gần dân cư thì số lượng vi sinh vật nhiều hơn vùng xa dân cư

Nước trong tự nhiên có khả năng tự làm sạch do tác dụng của ánh sáng mặt trời và

do sự cạnh tranh sinh tồn mà hủy diệt lẫn nhau, hoặc là do chất kháng sinh của các thực vật thủy sinh tiết ra

Nước cũng là nguồn truyền bệnh nguy hiểm như vi khuẩn thương hàn (Salmonella typhi, trực khuẩn lỵ (Shigella spp.), phẩy khuẩn tả (Vibrio cholerae), ngoài những vi sinh vật sống trong nước, còn có những vi sinh vật gây bệnh do người và động vật làm ô nhiễm Các vi sinh vật gây bệnh này chỉ tồn tại trong nước một thời gian nhất định Chúng tồn tại trong nước lâu hay mau tùy theo nguồn nước, tính chất, nhiệt độ, pH của nước

1.5 VAI TRÒ CỦA VSV TRONG ĐỜI SỐNG CỦA CON NGƯỜI

Cho đến nay, con người vẫn sử dụng các phương pháp vi sinh vật cổ điển như sản xuất rượu, bia, men nở bột mỳ, các sản phẩm sữa nhờ vi khuẩn lactic; dấm nhờ vi khuẩn acetic; chế biến tương, đậu nành nhờ nấm mốc,

Hầu hết các chất kháng sinh đều do vi sinh vật tổng hợp

Một số sản phẩm của vi sinh vật cũng được sản xuất nhờ các phương pháp vi sinh vật hiện đại: carotinoid và steroid từ nấm mốc, acid glutamic và các aminoacid khác cũng như nucleotit từ vi khuẩn Nhiều enzyme quan trọng đều do vi sinh vật tổng hợp Chỉ có vi sinh vật mới có khả năng chuyển hóa các nguyên liệu đặc biệt, trữ lượng lớn như dầu lửa, khí đốt, cellulose thành sinh khối hoặc các sản phẩm trung gian tiết vào môi trường

Năm 1982, hai nhà khoa học y học Australia Robin Warren và Barry Marshall đã phát hiện ra vai trò của vi khuẩn Helicobacter pylori và cơ chế gây bệnh viêm loét dạ dày và viêm ruột ở người (giải Nobel năm 2005)

Kỹ thuật di truyền hiện đại có thể đưa một đoạn DNA bất kỳ vào vi khuẩn, buộc chúng tổng hợp một protein tương ứng như hormon, kháng nguyên, kháng thể Việc chuyển các gene cố định N2 và các gene kháng sâu hại sang cây hay chuyền khả năng điều trị các bệnh do khuyết tật sinh hóa gây nên, cũng đang được quan tâm đặc biệt

Ở Việt Nam, chúng ta cũng đã dùng phương pháp trực tiếp bắn gene và phương pháp gián tiếp chuyển gene bằng con đường plasmid để chế vaccine có kết quả Tháng 2 năm 2004, viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh cũng đã giải mã thành công bộ gene

H5N1 (gây bệnh cúm ở người từ gà) để có hướng điều trị bệnh này

Những thành tựu khoa học hiện nay, những kinh nghiệm của thế giới đã chứng minh rằng: vi sinh học là ngành khoa học tuy mới phát triển nhưng có ý nghĩa về mặt lý luận cũng như thực tiễn, có tương lai phát triển rực rỡ trong tương lai

Hình 1.12 Barry J Marshall, J Robin Warren và vi khuẩn Helicobacter pyroli sống trong đáy dạ dày

Chương 2 PHƯƠNG TIỆN VÀ THỦ THUẬT TRONG NGHIÊN CỨU VI SINH HỌC 2.1 PHƯƠNG TIỆN

2.1.1 Kính hiển vi quang học

Độ phân giải của một hệ quang học là khả năng phân biệt các điểm không gian, được định nghĩa bằng khoảng cách giữa hai điểm gần nhau nhất có thể phân biệt được nhờ hệ quang học này Độ phân giải của kính hiển vi quang học bị quy định bởi khả năng phân giải của các thấu kính, mà ở đây bị giới hạn bởi hiện tượng nhiễu xạ ánh sáng Độ phân giải của kính hiển vi quang học sẽ bị giới hạn bởi bước sóng ánh sáng khả kiến và chỉ số khẩu độ:

λ là bước sóng ánh sáng,

NA là thông số khẩu độ

Vì thế, độ phân giải của các kính hiển vi quang học tốt nhất chỉ vào khoảng vài trăm nm Ví dụ với hệ kính sử dụng ánh sáng xanh (λ = 550 nm), chỉ số khẩu độ đối với không khí là 0,95 hoặc có thể đạt cao nhất là 1,5 nếu sử dụng dầu Như vậy, độ phân giải tốt nhất của hệ có thể đạt được khoảng dưới 200 nm Có nghĩa là những điểm trong khoảng cách này sẽ không thể nào phân biệt được

Những kính hiển vi đầu tiên được phát minh vào năm 1590 tại Middelburg, Hà Lan Ba người thợ tạo kính là Hans Lippershey (người đã phát triển các kính viễn vọng trước đó), Zacharias Janssen, cùng với cha của họ là Hans Janssen là những người đầu tiên xây dựng nên những kính hiển vi sơ khai Năm 1625, Giovanni Faber là người xây dựng một kính hiển vi hoàn chỉnh đặt tên là Galileo Galilei Đến năm 1655, Robert Hooke đã phát minh ra kính hiển vi quang học (photonic microscope) nhờ đó quan sát được các tế bào Các kính hiển vi thường (quang học) được hoàn thiện dần đến nay có

độ phóng đại cỡ 2000 lần

Kính hiển vi quang học là một loại kính hiển vi sử dụng ánh sáng khả kiến để quan sát hình ảnh các vật thể nhỏ được phóng đại nhờ một hệ thống các thấu kính thủy tinh Kính hiển vi quang học là dạng kính hiển vi đơn giản, lâu đời nhất và cũng là phổ biến nhất Các kính hiển vi quang học cũ thường phải quan sát hình ảnh trực tiếp bằng mắt nhìn qua thị kính, nhưng các kính hiện đại hiện nay còn được gắn thêm các LCD camera hoặc các phim ảnh quang học để chụp ảnh

2.1.1.1 Kính hiển vi thường

Kính gồm nhiều thấu kính quang học để phóng đại vật quan sát lên nhiều lần Kính có 2 hệ thống thấu kính: vật kính và thị kính Mỗi bộ phận là một hệ thống thấu kính hội tụ phức tạp Vật để quan sát AB được đặt trước vật kính một khoảng cách lớn hơn tiêu cự của vật kính một chút Ảnh thật đảo ngược A’B’ của vật thu được ở bên kia vật kính, nằm trong tiêu cự của thị kính Qua thị kính ta thấy ảnh ảo A”B” được phóng

to lên của ảnh A’B’(Hình 2.1)

Hình 2.1 Sơ đồ đường đi của các tia sáng khi quan sát mẫu vật dưới kính hiển vi

Cấu tạo và chức năng của các bộ phận trong kính hiển vi: gồm 2 phần chính:

- Tụ quang gồm hệ thống thấu kính và chắn sáng Một số kính còn mang vòng

đỡ để mang kính lọc ánh sáng Tụ quang được gắn trên giá đỡ, có thể nâng lên hay hạ xuống

- Vật kính: phần quan trọng nhất trong hệ thống quang học của kính hiển vi, nó quyết định khả năng nhìn rõ của kính Chúng là một hoặc có thể là hệ thống thấu kính

có tiêu cự ngắn, cho phép phóng đại vật Nhờ có giá điều chỉnh nên các vật kính khác nhau có thể xoay để thay đổi độ phóng đại Bên ngoài mỗi vật kính có khắc độ phóng to của vật kính (4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 100x,…) và các đặc tính khác Một số vật kính thường dùng (Bảng 2.1) Ba vật kính đầu không đòi hỏi điều kiện độ dầy của lá kính Hai vật kính sau (vật kính khô có độ phóng to cao và vật kính chìm) yêu cầu độ dầy của

Khoảng cách giữa vật kính và

Kính hiển vi quan sát vật nhờ các tia sáng chiếu xuyên qua vật nhờ đó có thể quan sát được cơ cấu bên trong của vật nếu chúng được cắt mỏng ra Yếu điểm của kính này

là không quan sát được hình dạng nổi bên ngoài của vật vì chỉ nhìn được vật trên một mặt phẳng thẳng góc với ống ngắm

Cách tính độ phóng to chung của kính hiển vi: L

Độ phóng đại thường nhỏ, không quá 200 lần Kính gồm hai ống ngắm ghép song song nhau và quan sát với hai mắt cùng một lúc Nhờ đó chúng ta thấy được hình ảnh nổi Khác với kính hiển vi thường, kính này thường dùng tia sáng phản chiếu để quan sát

Hình 2.3 Kính hiển vi soi nổi (kính phóng đại hai ống ngấm)

2.1.1.3 Kính hiển vi đáy đen (Darkfield microscope)

Kính hiển vi này gồm một kính hiển vi thường có gắn bộ hội tụ tia sáng (condenser) đặc biệt Bộ hội tụ này hoặc được cấu tạo đặc biệt hoặc được che ở phần giữa, do đó ngăn các tia sáng chiếu thẳng vào vật và chỉ cho các tia sáng chiếu xiên vào vật mà thôi (Hình 2.4)

Hình 2.4 Sơ đồ bộ tụ quang đáy đen trong một kính hiển vi đáy đen

Khi quan sát sẽ thấy thị trường có màu đen, vì chỉ quan sát được với tia sáng xiên Nếu có vật, tia sáng xiên chiếu vào vật sẽ cho tia bức xạ, chúng ta quan sát được ảnh bên ngoài của vật nhờ các tia bức xạ này

Công dụng của kính hiển vi là có thể quan sát không cần nhuộm màu do đó quan sát được vật đang còn sống

2.1.1.4 Kính hiển vi tương phản (Contrast phase microscope)

Cùng mục đích với kính hiển vi đáy đen, kính hiển vi tương phản dùng để quan sát các vật quá nhỏ trong tình trạng vật đang sống (không nhuộm màu) Kính hiển vi tương phản cho hình ảnh của vật rõ hơn kính hiển vi đáy đen và thấy được các chi tiết bên trong

Kính hiển vi này cũng chỉ là kính hiển vi thường, nhưng có gắn thêm hai bộ phận

Mẫu vật

đặc biệt: vòng mở tia sáng (annuar diaphragm) ở bộ phận điều chỉnh lưu lượng ánh sáng

và đĩa tạo tương phản hay tạo lệch pha (phase shifting element) đặt trong vật kính (Hình 2.5) Nhờ 2 bộ phận này, ánh sáng đi ngang qua vật quan sát được phân tích thành hai chùm tia, một chùm tia sáng cứng đi ngang qua vật và chùm tia sáng bị khúc xạ đi qua chung quanh vật Vì vật chất trong vi sinh vật có chiết suất gần bằng nhau do đó rất khó nhận thấy nếu không nhuộm màu (như khi ta quan sát một miếng thủy tinh đặt trong chậu nước) Nhờ dùng 2 chùm tia có độ dài sóng khác nhau chiếu xuyên qua nên ta có thể thấy được các vật khác nhau có chiết suất gần giống nhau

Hình 2.5 Sơ đồ đường đi của các tia sáng trong kính hiển vi tương phản để tạo ra sự

lệch pha giúp cho thấy rõ các chi tiết bên trong mẫu vật hơn

2.1.2 Kính hiển vi điện tử

2.1.2.1 Nguyên tắc

Kính hiển vi quang học ngày càng được cải tiến Từ thập niên 1690 đến nay, kính hiển vi từ một thấu kính đơn giản với độ phóng đại vài mươi lần, ngày nay chúng ta có kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1500 - 2000 lần, thậm chí lên 2500 lần Tuy nhiên kính hiển vi quang học không thể vượt lên khỏi giới hạn trên được, do đó không thể giúp chúng ta quan sát được virus Lý do của giới hạn này là vì ánh sáng thường mà chúng ta để quan sát trong kính hiển vi quang học, có độ dài sóng tương đối lớn (400 –

700 nm) Với độ dài sóng như vậy chúng ta không thể quan sát các vật nhỏ, như trong Hình 2.6

Hình 2.6 Thí dụ chứng minh vì sao kính hiển vi quang học không thể quan sát vật có kích thước quá nhỏ (virus)

A Với các hạt bụi mịn (bước sóng tia điện tử) bàn tay sẽ hiện rõ ra với các chi tiết của các ngón tay

B Với các hạt bụi to hơn (bước sóng của ánh sáng thấy được), các ngón tay không thể hiện ra được

Điều quan trọng nữa là đối với kính hiển vi không phải số lần phóng đại mà cái được gọi là giới hạn phân giải (resolution limit) tức giới hạn nhỏ nhất mà người ta phân biệt được hai điểm kề sát nhau không chập lại thành một Giới hạn này tuỳ thuộc bước sóng ánh sáng, nên kính hiển vi thường chỉ phân biệt được khoảng cách nhỏ nhất khoảng 0.2 µm Do đó, hướng phát minh ra những dụng cụ giúp chúng ta quan sát được những vật cực nhỏ được đặt ra Năm 1931, Knoll và Ruska (Đức), đã lần đầu phát minh

ra kính hiển vi điện tử

Kính hiển vi điện tử này áp dụng nguyên tắc là nếu một nguồn bắn điện tử đặt ở một hiệu điện thế cao (khoảng 30 – 150 KV) sẽ bắn các tia điện tử có độ dài sóng rất ngắn (0,5 nm) Các độ dài sóng này có thể bị từ trường làm lệch đường đi (giống như thấu kính làm lệch đường đi của tia sáng) (Hình 2.7)

Hình 2.7 Nguyên tắc cấu tạo của kính hiển vi điện tử (A) So sánh với kính hiển

vi quang học (B)

Áp dụng nguyên tắc trên kính hiển vi điện tử được cấu tạo như sau:

2.1.2.2 Cấu tạo kính hiển vi điện tử xuyên thẳng (transmission electron microscope)

Hình 2.8 Ảnh chụp bên ngoài của một kính hiển vi điện tử xuyên thẳng

Tất cả các bộ phận được đặt trong một trụ kín và tạo chân không bằng một bơm hút Trong chân không hoạt động của điện tử không bị cản trở

Các điện tử bắn xuyên qua mẫu vật được các vật kính và thị kính bằng điện tử làm tản rộng ra (phân kỳ), sau cùng hiện lên màng huỳnh quang có bộ máy chụp ảnh để chụp ảnh khi cần Tia điện tử khi xuyên qua mẫu vật sẽ bị ngăn cản hoặc không tùy theo tính chất của mẫu vật sẽ hiện hình trên màng huỳnh quang thành ảnh đen trắng Các nơi của mẫu vật ngăn cản tia điện tử sẽ có màu đen

Để có thể quan sát mẫu vật với kính hiển vi điện tử, mẫu phải được cắt (vi phẫu thuật) thành những lát thật mỏng, bề dày dưới 1 µm, có thể đạt đến 0,02 µm Để cắt những lát mỏng như vậy mẫu vật cần được định hình, sau đó ngâm và đúc khuôn rồi cắt lát với máy siêu vi phân Dao để cắt lát làm bằng thủy tinh, để có thể tạo những cạnh thật bén mới có thể tạo được những phẫu thức mỏng như vậy Mẫu vật cần được nhuộm với các chất cản điện tử để tạo ra sự tương phản của hình ảnh trên màng huỳnh quang

Có rất nhiều hóa chất dùng để nhuộm mẫu vật, thường là basic lead citrate hoặc uranyl acetate 1% hoặc phosphotungstic acid,

Vĩ chứa mẫu vật là miếng lưới đồng, trên phủ một lớp phim thật mỏng bằng vật chất không hấp thu hoặc không làm tản mất tia điện tử, phải bền, không bị tia điện tử bắn thủng

Ngoài ra để quan sát mẫu vật, có thể phủ lên trên một lớp mỏng kim loại (shadowing) Thủ thuật này được thực hiện trong một lòng kín chân không, sợi kim loại vàng hoặc palladium, được đun nóng bằng điện và bốc hơi, hơi kim loại rơi xuống phủ lên vật quan sát Nếu vật quan sát được đặt nghiêng so với hướng phủ của kim loại,

sẽ có bóng ngã tùy theo chiều cao của vật, nhờ đó khi quan sát chúng ta thấy được hình ảnh của vật nổi lên

Ảnh do kính hiển vi điện tử cung cấp có thể quan sát trực tiếp được, cũng có thể chụp ảnh nhờ một bộ phận chụp ảnh đặt bên dưới màng huỳnh quang

2.1.2.3 Cấu tạo kính hiển vi soi nổi (scanning electron microscope)

Hình 2.9 Kính hiển vi điện tử soi nổi (scanning electron microscope)

Cũng với nguyên tắc trên, tia điện tử thay vì xuyên qua mẫu vật, trong kính hiển

vi điện tử soi nổi (scanning electron microscope) (cũng còn gọi là kính hiển vi điện tử quét) tia điện tử chiếu lên bề mặt của mẫu vật, phản chiếu lại và hiện hình ảnh bên ngoài của mẫu vật lên mành huỳnh quang

Để có thể quan sát với kính hiển vi điện tử nổi, mẫu vật cần được phủ bằng một lớp kim loại, thường dùng vàng, để có thể phản chiếu các tia điện tử

2.1.3 Máy ly tâm (Centrifuge)

Máy ly tâm là dụng cụ dùng để lắng các vật thể to trong một dung dịch hoặc để phân tách các vật thể có khối lượng khác nhau trong một dung dịch Các loại máy ly tâm:

2.1.3.1 Bộ ly tâm quay tay (Hand-crank centrifuge)

Cấu tạo đơn giản, quay bằng tay, vận tốc quay thường kém (khoảng 700 - 1500 vòng/ phút, có loại đật tốc độ 3000 vòng/phút) Thường dùng để lắng tuyến trùng, bào

tử nấm, vi khuẩn

2.1.3.2 Máy ly tâm thông thường (Centrifuge)

Quay bằng động cơ điện, vận tốc thực dùng tối đa khoảng 16000 vòng/ phút, thông thường là 3.000 vòng/ phút Rất thông dụng trong các phòng nghiên cứu vi sinh học

2.1.3.3 Máy siêu ly tâm (Ultracentrifuge)

Có vận tốc quay rất nhanh, có thể đạt đến 150.000 vòng/ phút Tuy nhiên ở vận tốc trên 25.000 vòng/ phút, máy cần có bộ phận tạo chân không cho nồi quay không bị

ma sát vì không khí, để tránh nguy hiểm Ngoài ra, máy còn được trang bị thêm bộ phận làm lạnh ở nhiệt độ cố định Máy rất cần thiết cho các nghiên cứu về virus

Khi sử dụng máy ly tâm, nhất là máy siêu ly tâm cần quan tâm đến việc làm cân bằng trọng lượng các ống ly tâm Một sự chênh lệch nhỏ về trọng lượng giữa hai ống ly tâm đối xứng nhau, có thể gây nguy hiểm chết người nếu với vận tốc quay lớn

2.2 CÁC THỦ THUẬT CĂN BẢN TRONG NGHIÊN CỨU VI SINH HỌC

Phần lớn màu nhuộm trong vi sinh học là các muối và được phân làm hai nhóm: nhóm màu acid gồm các muối mà ion mang màu là anion (mang điện tích -) và nhóm các bazơ có ion mang màu là cation (mang điện tích +) Thí dụ: sodium+ eosinate- là màu eosin có tính acid và methylene blue (methylene+chloride-) có tính bazơ

Màu acid vì ion mang màu sẽ phối hợp với một bazơ để cho ra một muối màu Còn màu bazơ vì ion mang màu có tác động như một bazơ, phối hợp với một acid cho ra một muối màu

Một cách tổng quát màu acid phối hợp chặt (ăn màu) với thành phần của tế bào chất của tế bào và màu bazơ phối hợp (ăn màu) với thành phần của nhân tế bào (có tính acid) Một số các màu nhuộm chỉ bao phủ ngoài mặt mẫu vật được nhuộm do quá trình hấp thu hoặc là nó tan hay kết tủa chung quanh vật được nhuộm

2.2.1.1 Nhuộm đơn

Phần lớn màu để nhuộm đơn thường dùng là methylene blue, crystal violet, basic fuchsin Chúng thuộc nhóm màu aniline (hắc in) Có rất nhiều công thức và thủ thuật để nhuộm đơn mẫu vật Đối với vi khuẩn, thường dùng dung dịch Loeffler's methylene blue

Đối với nấm, thường dùng dung dịch Lactophenol cotton blue:

Phenol (tinh thể tinh ròng) 20 g

2.2.1.2 Nhuộm gram

Dùng để nhuộm vi khuẩn Đây là phương pháp nhuộm màu có phân biệt, vì không phải nhuộm tất cả vi khuẩn mà chỉ nhuộm một số chi vi khuẩn còn các chi vi khuẩn khác thì không ăn màu Qua phương pháp nhuộm Gram, chúng ta chia vi khuẩn ra làm hai nhóm, vi khuẩn gram dương và vi khuẩn gram âm Phương pháp này rất quan trọng trong việc phân loại vi khuẩn

Để nhuộm gram, trước hết ta nhuộm mẫu vật với màu crystal violet (30 giây) Sau khi rửa sạch màu, nhuộm thêm với dung dịch lugol iodine (30 giây) Tất cả vi khuẩn đều

ăn màu tím sẫm Đem nhúng mẫu trong cồn 950(20 giây đến 1 phút), cồn sẽ tẩy màu tím trên một số vi khuẩn Ta gọi các vi khuẩn còn giữ màu tím là vi khuẩn gram dương (+), còn vi khuẩn bị tẩy màu là gram âm (-) Để có thể phát hiện vi khuẩn gram (-), ta nhuộm mẫu với màu đỏ eosin, hoặc đỏ safranin hoặc lục brillant green hoặc nâu Bismarck brown

Vi khuẩn gram (+) có màu tím còn vi khuẩn gram (-) có màu đỏ hoặc lục hoặc nâu tùy hóa chất

Lý do của vi khuẩn gram (-) bị khử màu tím bởi cồn 950 là do cấu tạo lý tính và hóa tính của vách tế bào vi khuẩn 2 nhóm này khác nhau Vi khuẩn gram (+) có vách dày còn

vi khuẩn gram (-) có vách gồm nhiều lớp phức tạp Cấu tạo lý tính và hóa tính của vách vi khuẩn gram (+) đã tạo ra tình trạng giữ màu tím crystal violet và iod rất chặt nên không bị cồn khử

Hình 2.10 Nhuộm gram 2.2.1.3 Nhuộm roi

Đường kính roi của vi khuẩn rất nhỏ nên khó quan sát được qua kính hiển vi quang học Để quan sát được cần nhuộm màu đặc biệt Nguyên tắc nhuộm trước hết là phủ lên roi một lớp hóa chất để làm cho roi to ra và hóa chất này cũng giữ màu nhuộm Hóa chất

để tô phủ roi có thể là tannic acid, màu nhuộm có thể dùng pararosaniline

2.2.2 Khử trùng

Trong khi nghiên cứu vi sinh vật, chúng ta thường áp dụng thủ thuật nuôi cấy vi sinh vật thuần chủng Trong một ống nghiệm hoặc lọ kín hoặc đĩa petri nếu chỉ chứa một chủng loại vi sinh vật thì ta gọi là một mẻ cấy (inoculum)

Trong lúc nuôi cấy, để có thể giữ được một mẻ cấy thuần chủng, cần phải thực hiện việc nuôi cấy trong điều kiện vô trùng Vi sinh vật có mặt ở khắp nơi, trong không khí, hơi thở, và trong môi trường để nuôi cấy nên làm cho mẻ cấy bị nhiễm vi sinh vật lạ Do

đó, chúng ta cần khử trùng môi trường và dụng cụ nuôi cấy

2.2.2.1 Nguyên tắc: có 3 nguyên tắc trong khử trùng

Thanh trùng (Sterilization): Tiêu diệt tất cả vi sinh vật trên và trong dụng cụ cần thanh trùng Thường dùng nhiệt, hơi như formol, ethylen oxide, các dung dịch hóa chất như HgCl2, Sodium hypochloride, hoặc dùng các tia cực tím, tia gamma Hoặc tách vi sinh vật ra khỏi dung dịch cần thanh trùng với phương pháp ly tâm, phương pháp lọc, Tẩy độc (disinfection): Chỉ diệt hoặc tách các vi sinh vật có thể gây nhiễm trùng, không cần phải tách hoặc diệt tất cả các vi sinh vật Thí dụ: tẩy độc sữa tươi (milk pasteurization) Để bảo quản sữa tươi trong nhiều ngày ở nhiệt độ lạnh mà sữa không hư, người ta đưa sữa lên đến 71 – 800C trong 15 - 30 giây Ở nhiệt độ và thời gian này tất cả các vi sinh vật chịu lạnh đều chết hết, chỉ còn lại vi sinh vật chịu nhiệt độ trung bình và vi sinh vật chịu nóng Hai nhóm này không phát triển được ở nhiệt độ lạnh của tủ tồn trữ (4 -

100C) Ngoài ra phương pháp tẩy độc này không làm mất dưỡng chất có trong sữa tươi Kiềm hãm (microbistasis): (statis là giữ lại, không cho phát triển thêm): không giết

vi sinh vật ngay mà chỉ giữ vi sinh vật trong tình trạng bất động (không gia tăng thêm mật số) trong một thời gian lâu dài và sau đó vi sinh vật tự chết dần mà không sinh sản thêm Thường dùng các tác nhân như sự khô ráo, nhiệt độ lạnh, chất kháng sinh, các hóa chất thuộc nhóm sulfonamic, một số màu nhuộm dung dịch ưu trương

2.2.2.2 Phương pháp: các phương pháp thường dùng là:

* Phương pháp dùng nhiệt

Dùng nhiệt khô: áp dụng để thanh trùng các dụng cụ không cháy, thí dụ như kim loại, thủy tinh, Phần lớn vi sinh vật bị giết chết ở 1000C Tuy nhiên có một số chi vi khuẩn có khả năng tạo nội bào tử (nội bào tử còn được gọi là nha bào = endospore) và chịu đựng được nhiệt độ này trong một thời gian Do đó khi thanh trùng dụng cụ bằng phương pháp nhiệt khô chúng ta phải dùng nhiệt độ 150 - 1800C trong tối thiểu 1 giờ hoặc

1200C trong tối thiểu 4 giờ, mới đảm bảo giết được vi sinh vật bám trên dụng cụ

Dùng nhiệt ướt: để thanh trùng hoặc tẩy độc môi trường nuôi cấy, thực phẩm, dụng cụ, hóa chất

+ Thường dùng hơi nước sôi (1000C) tối thiểu là 1 giờ để tẩy độc, với mục đích loại virus và một số vi khuẩn thường gặp Thường áp dụng khi nghiên cứu virus

+ Để thanh trùng vi khuẩn và nấm, phải dùng hơi nước sôi trong nồi kín để tạo

áp suất từ 1 kg/ cm2 trở lên, để đưa nhiệt độ lên đến 1210C Thời gian thanh trùng tối thiểu

20 phút (nồi autoclave)

+ Đối với các hóa chất bị phân hủy ở nhiệt độ trên 1000C ta thanh trùng ở nhiệt

độ 1000C trong 1 giờ, sau đó để ở nhiệt độ thường (20 – 300C) trong 1 ngày Hôm sau lại thanh trùng ở nhiệt độ 1000C trong 1 giờ rồi để ở nhiệt độ thường Lặp lại 3 lần (phương pháp này còn gọi là Tyndallization) do:

 Ở 1000C giết tất cả các vi sinh vật ở dạng đang hoạt động trừ các dạng lưu tồn như nội bào tử, bì bào tử, Các dạng lưu tồn sẽ chuyển sang dạng hoạt động khi trở lại nhiệt độ bình thường

 Lần thứ hai để giết những vi sinh vật hoạt động trở lại này

 Lần thanh trùng thứ ba nhằm đảm bảo diệt tất cả vi sinh vật còn sót lại sau hai đợt thanh trùng trước

Lưu ý: Khi sử dụng nồi thanh trùng bằng hơi nước cần kiểm tra lại xem đó là nồi autoclave hay nồi thanh trùng Tyndall (Tyndallization)

* Phương pháp dùng hóa chất: có nhiều hóa chất có khả năng diệt vi sinh vật được dùng

 Sulfat bạc: thuốc nhỏ mắt dành cho trẻ sơ sinh (1%)

 Sulfat đồng: dùng để diệt rong xanh (làm xanh nước) trong hồ nước và là thuốc diệt nấm trong nông nghiệp

Lưu ý là các kim loại nặng là những chất lưu tồn rất bền ngoài thiên nhiên, trong dây chuyền thực phẩm Nó là một trong các chất gây ô nhiễm cho môi trường sống Cần hết sức thận trọng trong khi sử dụng Không được đổ các chất này ra cống thoát nước khi chưa xử lý

- Các chất khác

 Phenol: là chất chống vi sinh vật rất tốt, được dùng trong y khoa, như tẩy rửa phòng mổ Vào thời sau Pasteur, các bác sĩ phải rửa tay bằng acid phênic loãng trước khi vào phòng mổ

 Cồn: cồn ethyl và cồn isopropyl được dùng để thanh trùng như rửa tay, thanh trùng vết thương khi chích Cồn ethyl dùng thanh trùng tốt nhất ở 70% Dùng nồng độ cao hơn 95% hoặc 100%, hiệu quả kém hơn

 Xà bông: dùng rửa tay, dụng cụ

 Chất tẩy: bột giặt tổng hợp có tính thanh trùng tốt, nhất là với virus

 Formol: có tính thanh trùng mạnh, giết được bào tử vi khuẩn Formol bốc hơi nhanh, nên formol có thể thanh trùng nhà cửa, phòng ốc hoặc dụng cụ Điều kiện tốt nhất để hơi formol phát huy tác dụng thanh trùng là ẩm độ 70% và nhiệt độ khoảng 220C Formol hòa nước cũng có khả năng thanh trùng mạnh

* Phương pháp dùng tia sáng

- Tia cực tím (ultraviolet light): là sóng điện từ có bước sóng ngắn hơn ánh sáng nhìn thấy (400 – 700 nm) nhưng dài hơn tia X (tia Rontgen) (10 nm – 100 pm), tia cực tím có tính thanh trùng mạnh, diệt được cả bào tử vi khuẩn Phổ tia cực tím có thể chia ra thành tử ngoại gần (380 – 200 nm) và tử ngoại xa hay tử ngoại chân không (200 – 10 nm) Chỉ có các tia cực tím 230 - 280 nm, đặc biệt là 253,7 nm, là có tác dụng thanh trùng mạnh nhất Dùng thanh trùng phòng, dụng cụ Cần bảo vệ mắt

* Phương pháp lọc

Ruột bằng sứ xốp của bình lọc nước, các loại giấy lọc đặc biệt nhờ có các lỗ hỏng nhỏ nên có thể để cho các chất lỏng đi qua nhưng ngăn cản vi khuẩn, nấm lại, nên có thể dùng để thanh trùng hoặc tẩy độc

Màng lọc cực mịn (ultra-filter) được làm bằng collodion cellulose acetate hoặc những chất tương tự có lỗ rất nhỏ nên được dùng cho rất nhiều mục đích Kích thước lỗ lọc có thể từ 0,005 – 1 µm Nhờ đó có thể dùng màng lọc thích nghi để loại tất cả vi sinh vật, kể cả virus nhỏ nhất ra khỏi dung dịch muốn thanh trùng

2.2.3 Ly tâm

Ly tâm được sử dụng nhiều trong nghiên cứu về vi sinh học Nguyên tắc của phương pháp ly tâm là khi một vật bị tác dụng bởi ly tâm sẽ bị lôi kéo bởi một lực và di chuyển theo chiều hướng ly tâm Khối lượng của vật bị tác dụng càng lớn, lực ly tâm càng lớn Trong một dung dịch có chứa vi sinh vật, nếu chịu tác dụng của ly tâm, các vi sinh vật có kích thước to sẽ chịu tác dụng của lực ly tâm lớn có khuynh hướng di chuyển về phía đáy ống nếu lực ly tâm thắng được độ nhớt của chất lỏng Ở một tốc độ quay nhất định, các vật to sẽ bị lắng vào đáy ống Còn các vật nhỏ sẽ còn lơ lửng trong dung dịch Nguyên tắc này được áp dụng trong:

- Tẩy độc dịch chứa vi khuẩn: lắng vi khuẩn xuống đáy ống, dịch bên trên không chứa vi khuẩn Ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 20 phút ta có thể lắng tất cả vi khuẩn trong nước xuống đáy ống Các vi sinh vật nhỏ hơn, như virus thì hãy còn lơ lửng trong nước Như vậy, chúng ta có thể tách vi khuẩn ra khỏi dịch chứa virus với phương pháp ly tâm

- Thu thập hay cô đọng vi sinh vật trong một huyền phù với mật số cao hơn: ly

tâm với tốc độ quay và thời gian thích hợp để vi sinh vật ấy lắng xuống đáy ống Sau khi

bỏ lớp dịch bên trên, ta cho một ít chất lỏng mới, có thể là dung dịch đệm (buffer), rồi khuấy vi sinh vật ấy lên cho hòa lại trong dung dịch đệm này

- Tinh ròng vi sinh vật: trong một dịch chứa nhiều loại vi sinh vật và các thành phần nhỏ của vi sinh vật, chúng ta có thể áp dụng phương pháp ly tâm để phân tách các vi sinh vật và các vật thể có kích cỡ khác nhau chứa trong dung dịch ra từng lớp

Trước hết phải ly tâm ở vận tốc quay và thời gian thích hợp để vi sinh vật có thể lắng xuống đáy ống và cô động lại, đồng thời loại bớt các thành phần nhỏ hơn Trong dịch mới chúng ta có vi sinh vật muốn tinh ròng lẫn với vi sinh vật khác cùng kích thước hoặc

to hơn, đồng thời có lẫn các tạp chất có cùng kích thước hoặc to hơn

Sau đó đem nhỏ dịch này lên trên mặt dung dịch đường có độ nhờn tăng dần từ trên xuống đáy của các ống ly tâm Sau đó đem ly tâm ở tốc độ và thời gian cần thiết (sugar gradient centrifugation) Vì độ nhờn của dung dịch đường lớn và được sắp xếp để có nồng

độ tăng dần từ trên xuống dưới đáy ống, nên sau cùng các vật chất sẽ được sắp xếp lại thành từng lớp trong ống ly tâm, mỗi lớp chứa một số vật chất có kích thước bằng nhau

Vi sinh vật muốn tinh ròng cũng được tập trung một lớp riêng biệt, chúng ta có thể thu thập bởi một máy nhỏ giọt từ đáy ống ly tâm

Chương 3 DINH DƯỠNG, TĂNG TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NGOẠI CẢNH ĐẾN SỰ

TĂNG TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT

3.1 SỰ DINH DƯỠNG

3.1.1 Thành phần hoá học của vi sinh vật

Thành phần hóa học của vi sinh vật bao gồm các chất dinh dưỡng mà vi sinh vật hấp thu từ môi trường để làm nguyên liệu cung cấp cho quá trình sinh tổng hợp ra các thành phần của tế bào hoặc để cung cấp cho quá trình trao đổi năng lượng của chúng Vi sinh vật sinh trưởng rất nhanh, cường độ trao đổi chất mạnh Do đó, việc xác định thành phần hoá học tế bào của vi sinh vật gặp rất nhiều khó khăn Thành phần hóa học của tế bào VSV sẽ quyết định nhu cầu dinh dưỡng của chúng Thành phần hóa học của các chất dinh dưỡng trong tế bào vi sinh vật được cấu tạo từ các nguyên tố C, H, O, N, các nguyên

tố đa lượng và vi lượng và có thể được chia làm 2 nhóm lớn: nhóm nước, các muối khoáng và nhóm chất hữu cơ

Nước chiếm đến 70 – 90% khối lượng cơ thể vi sinh vật và là yếu tố quyết định sự dinh dưỡng của vi sinh vật Phần lớn nước trong cơ thể vi sinh vật là nước tự do, chúng có thể tham gia vào quá trình trao đổi chất trao đổi chất của vi sinh vật Nước kết hợp là phần nước liên kết với các hợp chất hữu cơ cao phân tử trong tế bào Nước liên kết mất khả năng hòa tan và lưu động

Muối khoáng chiếm 2-5% khối lượng khô của tế bào và thường ở dạng các muối sunphat, phosphat, cacbonat, clorua,… Các muối này thường ở dạng ion, các ion này tồn tại ở tỉ lệ nhất định nhằm duy trì pH và áp suất thẩm thấu thích hợp ở từng loại vi sinh vật Các chất hữu cơ trong cơ thể vi sinh vật chủ yếu cấu tạo từ các nguyên tố: C, H, O,

N, P, S, K, Na, Ca Các nguyên tố này có thể chia ra hai nhóm (nhóm các nguyên tố tối cần và nhóm các nguyên tố thứ yếu)

Nhóm các nguyên tố tối cần (C, H, O, N, P, S và K), là thành phần cấu tạo của các hợp chất như protein, chất béo, đường bột,… Trong đó, các chất C, H, O, N chiếm 90 - 97% (Khi đốt ta thu được C, H, O, N theo tỉ lệ: C: 46-50%, H: 6-8%, O: 30%, N: 7-14%, tro 2-14%) Bốn nguyên tố C, H, O, N gọi là nguyên tố tạo hình của vi sinh vật (organogen), là nguyên tố chủ yếu của các hợp chất protein, axit nucleic, lipid, hydratcacbon Tỉ lệ Cac-bon chiếm nhiều nhất, là trụ cột của cơ thể, C dễ dàng kết hợp với nhau để thành các chất cao phân tử và trở thành trạng thái keo phù hợp với nguyên sinh chất Đặc biệt C rất linh động về mặt hoá học Một số nguyên tố nhóm tối cần như

Ca, Na, Fe, Mg nhưng tùy theo nhóm vi sinh vật Thí dụ: Fe rất cần thiết cho vi khuẩn hiếu khí, các vi sinh vật có quang hợp rất cần Mg

Nhóm các chất vi lượng gồm: các nguyên tố rất cần cho sự tăng trưởng của vi sinh vật nhưng với lượng rất ít, như: Fe, Mn, Ca Các vitamin cũng như những chất vi lượng vì chỉ cần một lượng nhỏ cũng kích thích được sự tăng trưởng của vi sinh vật, nhu cầu vitamin có sự khác nhau rất lớn giữa các vi sinh vật Có những vi sinh vật tự dưỡng có thể

tự tổng hợp ra các hợp chất vitamin cần thiết nhưng cũng có nhiều vi sinh vật dị dưỡng đòi hỏi phải cung cấp nhiều loại vitamin khác nhau với liều lượng khác nhau Ngoài ra, một số acid amin (amino acids) cũng là chất vi lượng cần thiết cho vi sinh vật Thí dụ: Khi nuôi vi khuẩn Salmonella typhi, gây bệnh thương hàn, nếu thiếu chỉ một lượng nhỏ tryptophan thì vi khuẩn không phát triển tốt được

3.1.2 Cơ cấu hấp thu và sự hấp thu chất dinh dưỡng của vi sinh vật

3.1.2.1 Khả năng hấp thu chất dinh dưỡng của VSV

Trong sinh giới, vi sinh vật tuy nhỏ bé nhưng năng lực hấp thu và chuyển hóa của chúng có thể vượt xa các sinh vật bậc cao, như vi khuẩn lactic (Lactobacillus) trong 1 giờ

có thể phân giải một lượng đường lactozơ nặng hơn 1000 - 10000 lần khối lượng của chúng Năng lực chuyển hoá sinh hoá mạnh mẽ của vi sinh vật dẫn đến những tác dụng hết sức lớn lao của chúng trong thiên nhiên cũng như trong hoạt động sống của con người

Vi sinh vật hấp thu chất dinh dưỡng trên toàn bộ bề mặt của tế bào vì cấu tạo cơ thể chủ yếu là đơn bào và không có cơ quan tiêu hoá chuyên biệt Sự hấp thu chất dinh dưỡng từ ngoài môi trường vào trong cơ thể, sau đó cơ thể mới chế biến lại để kiến tạo nên cơ thể Các chất dinh dưỡng vi sinh vật hấp thu phải phụ thuộc các yếu tố sau:

- Cấu tạo của màng cho chất nào đi qua và cản chất nào

- Sự chênh lệch nồng độ các chất dinh dưỡng trong và ngoài màng tế bào

- Tốc độ chuyển hoá chất dinh dưỡng trong tế bào

- Chất dinh dưỡng hoà tan trong môi trường, nếu tan trong mỡ sẽ đi qua phần màng cấu tạo lipid, còn tan trong nước qua phần màng cấu tạo protein

- Kích thước của chất dinh dưỡng

Các chất dinh dưỡng muốn vào tế bào vi sinh vật phải được hoà tan trước hoặc sẽ

bị các enzyme do các VSV tiết ra để phân giải các chất dinh dưỡng này thành các chất dễ tan, đơn giản, dễ hấp thu

Các nguyên tố cấu thành lên cơ thể VSV là C, H, O, N nên khi muốn nuôi cấy cần cung cấp các nguyên tố trên, tuỳ theo đối tượng mà ta cung cấp các chất cần thiết Cần cung cấp nguồn carbon và nitơ cho VSV còn hydro và oxy thì cung cấp theo lượng khí thổi vào môi trường

Đối với nguồn carbon VSV sử dụng ở dạng vô cơ và hữu cơ, dạng đơn giản hay dạng phức tạp Nhưng VSV sẽ sử dụng các nguồn dễ hấp thu trước theo quy luật:

- Đường: sử dụng đường đơn trước, đường kép sau Đường đơn thì sử dụng dạng 6 carbon trước (glucose)

- Rượu đơn chức sử dụng trước, đa chức sau

- Axit hữu cơ: ít nhóm COOH càng dễ sử dụng

Đối với nguồn Nitơ: vi sinh vật sử dụng cả dạng vô cơ, hữu cơ và cả dạng nitơ vô cơ

vô hiệu (N2)

- VSV sử dụng protein trong cấu trúc nhỏ hơn hay bằng 5 axit amin, còn protein phải thuỷ phân thành các axit amin Axit amin càng ít nhóm NH2 càng được hấp thu nhanh

- Các hợp chất hữu cơ chứa nitơ phức tạp như ure, axit uric, kitin, bazơ nitơ VSV phải tiết ra các enzym thuỷ phân thành các sản phẩm trung gian, sau đó mới hấp thu

3.1.2.2 Cơ chế hấp thu dinh dưỡng của VSV: 2 cơ chế chính

* Cơ chế khuyếch tán: dựa vào sự chênh lệch nồng độ hay sự chênh lệch điện thế

ở hai phía màng mà chất dinh dưỡng đi vào trong hay đi ra ngoài tế bào, rất ít chất dinh dưỡng vào tế bào theo cơ chế này, chủ yếu là nước tự do

* Cơ chế vận chuyển không gian đặc biệt: Đa số các chất hòa tan qua màng theo

cơ chế này Các phân tử làm nhiệm vụ vận chuyển chất dinh dưỡng sắp xếp trong màng nguyên sinh chất liên kết với các chất dinh dưỡng hoà tan và chuyển vào trong tế bào Các phân tử protein vận chuyển chính là protein thấm – pecmeaza

3.1.2.3 Các cách dinh dưỡng

Các vi sinh vật thuộc nhóm nguyên sinh động vật có thể tiêu thụ được các vật rắn khác, thí dụ như ăn vi khuẩn hoặc nguyên sinh động vật nhỏ hơn Lối dinh dưỡng này được gọi là dinh dưỡng theo kiểu động vật hay thực bào (holozoic nutrition)

Các vi sinh vật khác, như vi khuẩn không thể tiêu thụ được các vật rắn được, mà chỉ tiêu thụ được các phân tử tương đối nhỏ hòa trong nước, các chất này có thể qua màng

tế bào bởi sự khuếch tán hoặc bởi các cơ nguyên khác Đây là cách dinh dưỡng theo kiểu thực vật (holophytic) Các cách dinh dưỡng của siêu vi khuẩn về cơ bản có khác hơn các

A Vi khuẩn tiết bên ngoài các loại enzyme để thủy phân các chất dinh dưỡng

B Phân tử dinh dưỡng được thủy phân thành các phân tử đơn giản hơn

C Các phân tử đơn giản như glucozo, acid amin nhờ có kích thước phân tử nhỏ nên chui vào bên trong tế bào vi khuẩn qua các lỗ hổng ở vách tế bào

Phần lớn vi sinh vật tiêu hóa thức ăn bằng cách dùng enzyme thủy phân thức ăn Nhờ các enzyme tương ứng, thức ăn như chất đường bột, chất béo và chất đãn bạch (protein) được phân ra thành các phân tử nhỏ hơn có thể tan được trong nước Đường bột được cắt ra thành các dạng đường đơn; Còn protein được thủy phân thành các amino acid Các phân tử này thường có kích thước nhỏ tan được trong nước nên có thể chui qua màng

tế bào chất của vi sinh vật Sau đó, bên trong tế bào còn có hệ thống enzyme khác để biến các chất đơn giản này thành năng lượng hay các vật chất của tế bào

Các nấm, vi khuẩn và một số rong tiêu hóa thức ăn do các enzyme tiết ra bên ngoài môi trường sống của chúng, enzyme tiếp xúc với thức ăn và phân giải chúng để hấp thu được (Hình 3.1)

Ngoài ra, vách tế bào của vi sinh vật này có vô số các lỗ khuyết rất nhỏ, có công dụng như những cái miệng li ti, qua đó chất lỏng và các phân tử thức ăn đơn giản và nhỏ

đi xuyên qua vách tế bào để vào trong tế bào chất

Sau khi vào trong tế bào, các phân tử thức ăn được tế bào vi sinh vật sử dụng giống như ở tế bào động vật, thực vật và các nguyên sinh động vật

3.1.4 Phân nhóm vi sinh vật theo nguồn gốc cung cấp C và năng lượng:

Tùy theo cách sử dụng thực phẩm cũng như nguồn cung cấp C của thức ăn chúng

ta có thể chia vi sinh vật ra các nhóm chính:

- Vi sinh vật tự dưỡng (Autotrophs): gồm các vi sinh vật có khả năng tiết ra các enzym làm xúc tác cho các phản ứng tổng hợp C từ CO2thành ra một chất hữu cơ phức tạp đáp ứng được nhu cầu của tế bào Gồm một số VSV quan trọng trong nông nghiệp và công nghiệp Lối dinh dưỡng này giống như ở cây đậu xanh

- Vi sinh vật quang dưỡng (Phototrophs): Là các vi sinh vật cần được chiếu sáng bằng ánh sáng mặt trời (hoặc ánh sáng nhân tạo) mới sống được, chúng cần lấy năng lượng từ ánh nắng hoặc ánh sáng nhân tạo Nhóm vi sinh vật quang dưỡng còn có thể chia

ra làm hai: vi sinh vật quang khoáng dưỡng (photolithotrophs) khi lấy H từ nước trong quá trình quang hợp để khử O của CO2; và vi sinh vật quang hữu cơ dưỡng (photoorganotrophs) lấy H từ H2S thay vì từ nước

- Vi sinh vật hóa dưỡng (Chemotrophs): Là các vi sinh vật không cần ánh sáng vẫn sống được Chúng lấy năng lượng từ các phản ứng hóa học xảy ra bên trong tế bào

Các vi sinh vật trong nhóm hóa dưỡng, nếu phản ứng lấy năng lượng căn cứ trên các chất vô cơ (thí dụ: oxyt hóa chất vô cơ để sinh ra năng lượng) được gọi là hóa khoáng dưỡng hóa năng vô cơ (Chemolithotrophs) (litho = đá, chất vô cơ)

Thí dụ như:

NaNO2 + 1/2 O2  NaNO3 + năng lượng

H2S + 2 O2  H2SO4 + năng lượng

CO + 1/2 O2  CO2 + năng lượng Các sinh vật khác, lại lấy năng lượng từ phản ứng oxi hóa chất hữu cơ được gọi là hóa khoáng dưỡng năng hữu cơ (hóa hữu cơ dưỡng = Chemoorganotrophs)

- Vi sinh vật dị dưỡng (Heterotrophs): nhóm này không có khả năng tổng hợp được chất hữu cơ từ nguyên tử C Nhóm này chiếm đại đa số trong vi sinh vật Cách dinh dưỡng này giống như ở động vật

- Vi sinh vật hoại sinh (Saprophytes): Gồm các nấm dị dưỡng và các vi khuẩn, chúng lấy carbon từ chất hữu cơ còn nguyên vẹn ở chung quanh nó hoặc từ nước cống rãnh hoặc từ một vi sinh vật đã chết

- Vi sinh vật ký sinh (Parasites): Các vi sinh vật vừa có thể lấy C từ chất hữu cơ trong cơ thể sinh vật còn sống

Trong bệnh học, các vi sinh vật ký sinh là nguyên nhân phần lớn bệnh của động vật và thực vật

Trong nhóm vi sinh vật ký sinh còn có thể chia ra làm hai nhóm, ký sinh bắt buộc

và ký sinh tùy ý

Ký sinh bắt buộc là những vi sinh vật chỉ có thể sống ký sinh trên một mô còn sống của một sinh vật khác và nó không thể sống hoại sinh, tức sống trên mô đã chết hoặc trên vật chất không là sinh vật

Thí dụ: Virus là ký sinh bắt buộc

Nấm gây bệnh rỉ trên cây trồng cũng là ký sinh bắt buộc vì chỉ sống trên lá, thân cây còn sống và không thể sống được trên môi trườmg nuôi cấy nhân tạo

Ký sinh tùy ý là những vi sinh vật vừa có thể ký sinh trên mô sống của một sinh vật khác, nhưng cũng có thể sống hoại sinh trên mô đã chết cũng như trên vật chất thích hợp Thí dụ: vi khuẩn gây bệnh cho người, gia súc và cây trồng vừa sống được trong mô của ký chủ, vừa có thể nuôi cấy được (sống được) trên môi trường nuôi cấy nhân tạo (vật chất, không sống)

3.1.5 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Có 4 loại môi trường nuôi cấy: môi trường tự nhiên còn gọi là môi trường thực nghiệm (empirical media), môi trường tổng hợp, môi trường bán tổng hợp và môi trường sống Các loại môi trường này khác nhau rất nhiều về hình thức và thành phần tùy theo loài vi sinh vật cần nuôi cấy cũng như tùy thuộc vào mục đích của công tác nuôi cấy

Kỹ thuật và các nghiên cứu về vi sinh học đã đạt đến mức rất cao, nên số loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật được sử dụng rất phong phú, tùy loài hoặc chủng của vi sinh vật cũng như tùy theo mục đích Thí dụ: khi nuôi cấy vi khuẩn Xanthomonas campestris

pv oryzae gây bệnh cháy bìa lá lúa, người ta thường dùng môi trường Wakimoto Tuy

nhiên trong lúc cần phân lập và tách ròng vi khuẩn từ một tế bào thì vi khuẩn này mọc không được tốt trên môi trường Wakimoto Để thực hiện công tác này phải thêm vào môi trường Wakimoto một số lượng rất nhỏ Fe dưới dạng chelat hóa, gọi là môi trường Wakimoto biến đổi Vi khuẩn sẽ mọc thành các khuẩn lạc (từ một tế bào) rất tốt trên môi trường mới này

3.1.5.1 Môi trường nuôi cấy tự nhiên

Môi trường thuộc nhóm này được phân lập ra dựa trên kinh nghiệm hơn là dựa vào sự hiểu biết về thành phần dinh dưỡng đối với vi sinh vật nuôi cấy Các môi trường tự nhiên được dùng phổ biến là: sữa, nước trích thịt bò, nước trích các loại rau củ hoặc mễ cốc, Các loại môi trường này thường chứa đựng nhiều chất hữu cơ và vô cơ tan trong nước có thể đáp ứng yêu cầu về dưỡng chất của một số lớn vi sinh vật Các loại môi trường trong nhóm này vừa dễ chuẩn bị vừa rẻ tiền lại có thể sử dụng cho nhiều mục đích thông thường trong nghiên cứu vi sinh vật

Khuyết điểm của loại môi trường tự nhiên là không thể biết chính xác thành phần dinh dưỡng Thành phần dinh dưỡng của những lần chuẩn bị khác nhau cũng sẽ rất khác nhau Do đó đôi khi kết quả nuôi cấy có thể sẽ không giống nhau

3.1.5.2 Môi trường nuôi cấy tổng hợp

Để bổ sung khuyết điểm của môi trường nuôi cấy tự nhiên thì các môi trường nuôi cấy tổng hợp được thiết lập, trong đó các thành phần dinh dưỡng của môi trường được kiểm soát chặt về số lượng và chất lượng Tùy theo loại thành phần dinh dưỡng sử dụng,

* Khuyết điểm của môi trường tổng hợp là:

- Ít được sử dụng cho mục đích nuôi cấy thường ngày trong nghiên cứu vi sinh vì: tương đối đắt tiền, chuẩn bị khá phức tạp so với môi trường tự nhiên

- Chỉ sử dụng cho từng loài vi sinh vật Trường hợp vi sinh vật chưa xác định, không thể nuôi cấy trên môi trường loại này một cách bảo đảm

3.1.5.3 Môi trường nuôi cấy bán tổng hợp

Là môi trường nuôi cấy tự nhiên được bổ sung thêm với một số chất dinh dưỡng được xác định, thí dụ: Môi trường bán tổng hợp Wakimoto dùng nuôi cấy vi khuẩn Xanthomonas campestris pv oryzae, gồm:

- Nước trích khoai tây 200 g

3.1.5.4 Môi trường nuôi cấy sống

Dùng để nuôi cấy một số vi sinh vật đặc biệt có tính ký sinh bắt buộc Thí dụ: Virus không nuôi cấy được trên môi trường nuôi cấy nhân tạo, do đó cần nuôi cấy chúng trên sinh vật đang sống

Đối với virus gây bệnh đậu mùa, người ta nuôi cấy chúng trên bò còn sống và sau

đó thu thập vi rút trên con bò ấy để làm thuốc chủng bệnh đậu mùa Phần lớn các vi rút ký sinh trên động vật chúng ta phải nuôi cấy trong phôi của trứng gà lộn hoặc trên chuột, thỏ,

Đối với vi rút ký sinh trên thực vật, phải nuôi cấy chúng trên ký chủ của chúng Đối với virus TMV gây bệnh khảm trên cây thuốc lá cần cấy chúng vào cây thuốc lá mạnh để sau đó ít lâu thu thập lấy vi rút ấy với mật số tăng hơn nhiều lần trong mô cây thuốc lá được chủng bệnh

Đối với các nấm gây bệnh rỉ, thí dụ nấm Phakopsora sojae gây bệnh rỉ trên lá cây đậu nành, chúng ta phải cấy bào tử nấm bệnh trên lá cây đậu nành mạnh để sau đó thu thập bào tử mới được sinh ra từ các đốm rỉ ở lá cây được tiêm chủng bệnh

3.2 SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT

3.2.1 Các phương pháp tinh ròng mẻ nuôi cấy vi sinh vật

Vi sinh vật rất nhỏ nên khi quan sát sự tăng trưởng và sự sinh sản của vi sinh vật không thể quan sát trên một cá thể của vi sinh vật ấy mà chỉ có thể quan sát trên một mẻ cấy (inoculum) tức là gồm nhiều vi sinh vật cùng loài được nuôi cấy trong cùng ống nghiệm hoặc trong một dung dịch chất dinh dưỡng lỏng Do đó, cần có mẻ cấy ròng để quan sát

3.2.1.1 Định nghĩa

Mẻ cấy ròng (thuần) tức là mẻ cấy mà trong đó chỉ có một loài, hoặc tốt nhất là chỉ một chủng vi sinh vật duy nhất sống mà thôi Như vậy mẻ cấy ấy phải từ một cá thể vi sinh vật

3.2.1.2 Lý do phải tinh ròng mẻ cấy

- Một mẻ cấy nếu không ròng, tức còn lẫn các loài vi sinh vật khác thì kết quả của nghiên cứu sẽ không chính xác

- Trong không khí và trong môi trường sống thông thường chung quanh chúng ta có vô số loài vi sinh vật hoại sinh hoặc ký sinh, khi chúng lẫn vào mẻ cấy, chúng có thể tăng trưởng và sinh sản nhanh hơn, lấn át vi sinh vật nuôi cấy và làm hỏng mẻ cấy

3.2.1.3 Nguyên tắc của việc tinh ròng mẻ cấy

- Mẻ cấy phải được cấy ra từ một tế bào để bảo đảm được thuần chủng

- Mẻ cấy phải được thực hiện trong điều kiện vô trùng

- Mẻ cấy phải được bảo quản trong điều kiện không bị vi sinh vật lạ xâm nhập vào

3.2.1.4 Phương pháp tinh ròng mẻ cấy

 Đối với vi khuẩn:

* Phương pháp vạch trên mặt đĩa pêtri

+ Môi trường nuôi cấy: Môi trường dinh dưỡng thích hợp cho vi sinh vật muốn nuôi cấy, thêm khoảng 2 - 3% thạch (agar) cho môi trường được cứng hơn sẽ dễ vạch hơn Môi trường được đổ thành lớp phim mỏng trong đĩa pêtri và làm khô mặt

+ Cách vạch để có thể có khuẩn lạc (colony, colonies) mọc ra từ một tế bào: pha loãng và vạch ra (Hình 3.1)

+ Tách lấy một khuẩn lạc nuôi vào mặt nghiêng trong ống nghiệm

Hình 3.2 Tinh ròng bằng phương pháp vạch trên đĩa petri

* Phương pháp đổ vào đĩa pêtri: (plating method)

- Dùng môi trường nuôi cấy kể trên, đun cho thạch lỏng ra để nguội đến 450C

- Pha loãng huyền phù vi khuẩn ra nhiều lần: dùng 1 ml huyền phù vi sinh vật cho vào 10 ml môi trường nuôi cấy lỏng ở 450C

- Đổ tất cả vào đĩa petri, tráng cho môi trường phẳng mặt và đậy nắp đĩa lại

Hình 3.3 Tinh ròng bằng phương pháp đổ trên đĩa petri

- Khuẩn lạc được thành lập từ một tế bào được thu thập và nuôi cấy trên mặt nghiêng trong ống nghiệm

* Phương pháp lọc

- Dùng màng lọc mịn, đường kính ≥ 0,5 μm

- Pha loãng huyền phù vi khuẩn ra nhiều lần để có khoảng 1 x 10 đến 5 x 10 tế bào/10 ml

- Cho qua màng lọc khoảng 5 – 10 ml huyền phù đã pha loãng

- Lấy màng lọc đặt trên mặt phim dinh dưỡng trong đĩa pêtri

Phương pháp này áp dụng cho các nấm khó sinh ra bào tử hoặc cho trường hợp muốn bảo đảm thuần chủng và không tinh ròng từ bào tử được

Là số vi sinh vật ấy trong một đơn vị không gian chứa chúng Thông thường ta dùng

số vsv/1 ml trong trường hợp đếm vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy lỏng, trong nước hoặc trong sữa, Trong trường hợp vi sinh vật trong đất, chúng ta thường dùng số vsv/1 g đất Trong trường hợp sợi nấm, có thể dùng đơn vị là mg/100 g dung dịch hoặc dùng tốc

độ tăng trương là cm/ngày

3.2.2.2 Các phương pháp xác định mật số vi sinh vật

Có rất nhiều phương pháp để đếm vi sinh vật tùy theo mục đích, phương tiện và loài vi sinh vật Một vài phương pháp thông dụng:

a Đếm trực tiếp

- Đếm vi sinh vật bằng lam (buồng) đếm: Dùng một kính đựng vật đặc biệt có vạch

ô vuông với diện tích ô đã được biết (hemacytometer) Nhỏ lên khoảng dành để đếm huyền phù chứa vi sinh vật muốn đếm, quan sát với kính hiển vi, đếm số vi sinh vật chứa trong khoảng vuông, từ đó, suy ra mật số Thường đếm hồng huyết cầu trong máu bằng phương pháp này

Phương pháp này cho phép đếm cả vi sinh vật còn sống lẫn đã chết và chỉ áp dụng cho các vi sinh vật không cần nhuộm màu (Hình 3.4)

- Đếm vi sinh vật đã nhuộm (smear count): Nhỏ một thể tích nhất định của huyền phù muốn đếm lên trên kính đựng vật Định hình và nhuộm màu, thường là với xanh metylen hoặc với loại màu phù hợp với vi sinh vật ấy Sau đó, đếm số vi sinh vật trên một đơn vị diện tích, từ đó suy ra mật số của vi sinh vật ấy

Phương pháp này áp dụng cho trường hợp phải đếm các vi sinh vật khó quan sát phải nhuộm màu Đếm tổng số vi sinh vật sống và đã chết trong huyền phù

Hình 3.4 Sơ đồ một lam đếm hồng cầu (hematocytometer):

(A) nhìn từ trên; (B) nhìn ngang; (C) phóng to phần vạch chứa huyền phù vi khuẩn

- Đếm vi sinh vật trên màng lọc (membrane filter count): cho huyền phù chứa vi sinh vật muốn đếm đi qua một phim dinh dưỡng để vi sinh vật mọc thành khuẩn lạc và đếm số khuẩn lạc, suy ra mật số vi sinh vật trong huyền phù Với cách này chỉ đếm được

vi sinh vật còn sống

Có thể đếm trực tiếp số vi sinh vật trên màng lọc bằng cách nhuộm màu vi sinh vật

và làm cho màng lọc trong suốt với immersion oil và đếm số vi sinh vật dưới kính hiển vi

- Phương pháp pha loãng: Nguyên tắc của phương pháp này là pha loãng huyền phù ra nhiều lần Xong, cho vi sinh vật hiện lên bằng khuẩn lạc để đếm số vi sinh vật trong huyền phù đã pha loãng, từ đó suy ra mật số của vi sinh vật ấy trong huyền phù gốc Kết quả của phương pháp này cho chúng ta con số gần đúng nhất (most probable number) của mật số của huyền phù chứ không có được con số chính xác

Phương pháp này cho phép đếm vi sinh vật sống, không đếm được vi sinh vật đã chết Sai số thường rất lớn, do đó phải thực hiện đếm 2 hoặc 3 lần và lấy trị số trung bình,

để giảm bớt sai số (Hình 3.5)

Hình 3.5 Sơ đồ mô tả cách đếm vi khuẩn bằng cách pha loãng

b Đếm gián tiếp

- Phương pháp đo độ đục của huyền phù vi sinh vật (Turbidometric method):

Phương pháp này thường được sử dụng để đếm vi khuẩn và bào tử nấm ở trong một huyền phù

Nguyên tắc của phương pháp này là dùng chùm tia sáng đơn sắc chiếu xuyên qua huyền phù chứa vi sinh vật muốn đo, vi sinh vật làm phân tán bớt chùm tia sáng nhiều hoặc ít tùy theo mật số của chúng trong huyền phù Số tia sáng còn lại sau khi xuyên qua huyền phù sẽ kích thích một tế bào quang điện (photoelectric cell) Tùy theo cường độ còn lại của chùm tia sáng mà tế bào quang điện nhận được, một cây kim di động và chỉ số phần trăm tia sáng bị phân tán trên bảng chỉ thị

Nếu dịch đem đếm không chứa vi sinh vật nào cả (thí dụ như nước cất) thì tất cả tia sáng xuyên qua và kích thích bóng đèn quang điện tối đa Ta điều chỉnh cho kim chỉ thị ở

số 100 Đưa huyền phù để đo vào, vì có vi sinh vật trong huyền phù nên một số tia sáng bị phân tán đi Chỉ còn lại một số ít xuyên qua và kích thích lên tế bào quang điện Kim chỉ thị chỉ số lượng tia sáng xuyên qua được So sánh với bảng chuẩn sẽ biết được mật số trong huyền phù Chúng ta có thể áp dụng biện pháp này đối chiếu với phương pháp đếm trực tiếp để lập một bảng chuẩn cho từng loại vi sinh vật

Ưu điểm: đơn giản, nhanh

Khuyết điểm: là mật số của cả vi sinh vật chết lẫn sống Phải làm cho vi sinh vật phân phối đều trong huyền phù

Hình 3.6 Nguyên tắc của phương pháp đo độ đục của huyền phù vi khuẩn

- Máy đếm điện tử (electronic counter)

Với máy đếm loại này, chúng ta có thể đếm được hàng ngàn tế bào vi sinh vật trong vòng vài giây Nguyên tắc là vi sinh vật được đưa qua tia sáng của “mắt điệntử” (electronic eye), vi sinh vật cản tia sáng và ghi dấu hiệu trên bộ đếm của máy

- Đo trọng lượng khô của vi sinh vật

Phương pháp đo các vi sinh vật đa bào (thí dụ sợi nấm nuôi trong môi trường dinh dưỡng lỏng và trong trường hợp này ta thường so sánh mức độ tăng trưởng hơn là đếm mật số) Thông thường chúng ta trích lấy nấm ấy bằng cách ly tâm hoặc lọc, kế đó rửa sạch, sấy khô và cân trọng lượng khô Sự gia tăng trọng lượng so với lúc đầu chứng tỏ có

sự tăng trưởng và cho biết tốc độ tăng trưởng của nấm

3.2.3 Sự tăng trưởng của vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy tĩnh

Trong phòng thí nghiệm, ta theo dõi ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên sinh trưởng và phát triển của VSV nhờ các phương pháp nuôi cấy thích hợp Hai phương pháp

cơ bản nuôi cấy VSV: nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy liên tục

Nuôi cấy tĩnh là trong suốt thời gian nuôi cấy, ta không thêm chất dinh dưỡng cũng như không loại bỏ các sản phẩm của quá trình trao đổi chất

Trong một mẻ nuôi cấy thích hợp vi sinh vật thường tăng trưởng theo 4 giai đoạn chính (hình 3.7)

- Giai đoạn chuẩn bị (latent phase): là giai đoạn ngay sau khi nuôi cấy, vi sinh vật chưa gia tăng mật số, có thể đây là giai đoạn vi sinh vật làm quen với môi trường nuôi cấy mới và chuẩn bị cho sự tăng trưởng vượt bậc sau đó

- Giai đoạn tăng trưởng nhảy vọt (logarithmic phase, exponential phase): Vi sinh vật sau khi đã am hợp với môi trường, bắt đầu nhân mật số lên với tốc độ rất nhanh theo cấp số nhân Trong giai đoạn này mật số tổng cộng và mật số vi sinh vật sống không chênh lệch nhau nhiều vì trong giai đoạn này còn nhiều chất dinh dưỡng cung ứng đủ nhu cầu, nên số vi sinh vật chết chưa tăng cao

- Giai đoạn an định (stationary phase): Đây là giai đoạn mà mật số vi sinh vật không tăng thêm mà giữ an định ở một mức Lúc này mật số vi sinh vật chết có tăng, nên mật số tổng cộng đã chênh lệch so với mật số vi sinh vật sống Giai đoạn này có thể do vi

sinh vật thu hút và làm cạn dần một vài thành phần dinh dưỡng hoặc là do tác động của vài chất đối kháng do chính vi sinh vật ấy tiết ra trong quá trình tăng trưởng

- Giai đoạn chết (death phase): mật số vi sinh vật sống giảm dần trong khi đó mật

số vi sinh vật tổng cộng hơi tăng nhẹ Đây là giai đoạn trùng hợp vào lúc mà dưỡng chất trong môi trường bị hao mòn dần hoặc là do sự tích lũy các chất đối kháng ngày càng nhiều

-

Hình 3.7 Sơ đồ mô tả sự phát triển của vi khuẩn Escherichia coli được nuôi cấy theo phương pháp nuôi cấy liên tục:

1: giai đoạn chuẩn bị; 2, 3, 4: giai đoạn tăng trưởng nhảy vọt; 5: giai đoạn an định; 6: giai đoạn chết

3.2.4 Sự tăng trưởng của vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy liên tục

Với phương pháp nuôi cấy tĩnh trên, ta thấy mật độ vi khuẩn tăng thì cơ chất giảm

do đó xuất hiện các pha sinh trưởng Đối với thực tiễn sản xuất, đòi hỏi lúc nào VSV cũng sinh trưởng trong pha tăng trưởng nhảy vọt nên phải thường xuyên cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn Phương pháp này là nuôi cấy liên tục Phương pháp đơn giản nhất là nuôi cấy vi khuẩn trong bình có vòi ra và vào: vòi vào để cung cấp chất dinh dưỡng, vòi

ra để thu vi khuẩn và loại trừ sản phẩm của quá trình trao đổi chất (hình 3.8) Chemostat

và Turbidostat là hai thiết bị nuôi cấy liên tục

Hình 3.8 Mô hình nuôi cấy liên tục

3.3 ẢNH HƯỞNG CỦA YẾU TỐ NGOẠI GIỚI LÊN SỰ TĂNG TRƯỞNG VÀ SINH SẢN CỦA VI SINH VẬT

3.3.1 Nhiệt độ

Đây là yếu tố tối quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và sinh sản của vi sinh vật Khi nhiệt độ gia tăng, các hóa chất và các phản ứng của enzyme trong tế bào tăng nhanh do đó sự sinh trưởng của vi sinh vật cũng tăng nhanh lên Mặt khác, các chất đãn bạch, acid nhân và các chất khác trong tế bào sẽ nhạy cảm với nhiệt độ cao và có thể trở nên bất động Do đó thông thường nếu nhiệt độ tăng dần thì sự tăng trưởng và biến dưỡng của vi sinh vật cũng tăng theo đến một nhiệt độ nhất định thì tất cả đình lại Nếu nhiệt độ tăng cao hơn nữa thì hoạt động của vi sinh vật sẽ xuống đến mức không Do đó, đối với mỗi sinh vật chúng ta có thể có 3 mức độ về nhiệt độ

- Nhiệt độ thấp nhất (minimum temperature): dưới nhiệt độ này, vi sinh vật không hoạt động được

- Nhiệt độ tối hảo (optimum temperature): Ở nhiệt độ này, hoạt động của vi sinh vật đạt mức cao nhất

- Nhiệt độ tối đa (maximum temperature): Trên nhiệt độ này, vi sinh vật không hoạt động được

Ba mức nhiệt độ trên là đặc tính của từng loài vi sinh vật Ngoài ra, ba mức này cũng không cứng nhắc cho từng loài vì nó có thể thay đổi tùy theo một số tác nhân khác tác động vào, thí dụ như pH của môi trường nuôi cấy và dưỡng chất trong môi trường nuôi cấy

Do có ba mức nhiệt độ khác biệt nhau nên có thể chia vi sinh vật ra làm ba nhóm: nhóm vi sinh vật chịu nóng (thermophiles), nhóm vi sinh vật chịu lạnh (psychrophile) và nhóm vi sinh vật chịu ấm (mesophiles) (Hình 3.9) Ở những vùng hàn đới, chúng ta vẫn gặp được sự sống của vi sinh vật trong đất, trong nước và trong không khí Ở vùng này, nhiệt độ thường xuyên dưới 00C

Hình 3.9 Sơ đồ mô tả mức nhiệt độ của các nhóm vi sinh vật

Vi sinh vật chịu lạnh: là vi sinh vật có khả năng sống được ở 00C và có thể chia làm hai nhóm nhỏ: vi sinh vật chịu lạnh bắt buộc (obligate psychrophiles) và vi sinh vật chịu lạnh tùy ý (facultative psychrophiles) Vi sinh vật chịu lạnh bắt buộc chỉ có thể sống ở môi trường lạnh cố định và chúng thường chết mau lẹ khi đưa ra nhiệt độ bình thường trong phòng, nhiệt độ tối hảo của chúng vào khoảng 150C và nhiệt độ tối đa vào khoảng 200C Còn vi sinh vật chịu lạnh tùy ý, dù có thể sống được ở 00C nhưng nhiệt độ tối hảo trong khoảng 25 – 300C và nhiệt độ tối đa từ 350C trở lên Trong thịt tươi, sữa, trái cây, rau cải

và các sản phẩm khác của sữa khi tồn trữ lạnh vẫn có thể bị vi sinh vật chịu lạnh làm hư hỏng Thông thường, nhiệt độ tồn trữ càng thấp tốc độ hư hỏng càng chậm lại Tuy nhiên nếu thực phẩm được đông lạnh ở nhiệt độ dưới 00C (thường là từ -160C trở xuống) thì sự hoạt động của vi sinh vật mới gần như bị đình chỉ

Ở nhiệt độ lạnh các phản ứng của enzym bên trong vi sinh vật chịu lạnh vẫn còn hoạt động, tuy nhiên yếu và chậm dần theo độ lạnh Mặc dù sự hoạt động của vi sinh vật chịu lạnh thường ngưng ở nhiệt độ - 300C, nhưng hoạt động của enzym vẫn còn và mức giới hạn mà phản ứng sinh hóa ngưng lại là -1400C Do đó đông lạnh có thể làm ngưng hoạt động của vi sinh vật chứ không giết chết vi sinh vật được Khi vi sinh vật bị đông lạnh, thông thường vi sinh vật ấy còn có thể sống trong một thời gian lâu dài

Vi sinh vật chịu ấm: là các vi sinh vật thích nhiệt độ trung bình (mesophiles) có nhiệt độ tối hảo trong khoảng từ 25 – 400C Nhiệt độ này trùng vào nhiệt độ do ánh nắng mặt trời cung cấp cho thực vật, động vật máu lạnh và đất Trong cơ thể động vật máu nóng, nhiệt

độ vào khoảng 370C cũng thích hợp cho sự phát triển của vi sinh vật trong nhóm này Do

đó tất cả vi sinh vật lây bệnh cho người, động vật và thực vật đều thuộc nhóm này Đối với vi sinh vật gây bệnh cho người và gia súc khi nuôi cấy cần được úm ở nhiệt độ 370C Còn đối với vi sinh vật gây bệnh cho thực vật, nhiệt độ 28 – 300C thích hợp hơn cả

Vi sinh vật chịu nóng (thermophiles) có nhiệt độ tối hảo trong khoảng từ 45 – 500C Trong tự nhiên nhiệt độ trong khoảng này có thể gặp trong đất bị ánh nắng chiếu trực tiếp, trong khu vực của suối nước nóng, trong các đống rác đang lên men, Mặt đất bị ánh nắng chiếu trực tiếp có thể có nhiệt độ trên 500C, có khi lên đến 700C ở đất có màu sậm