Tóm tắt Luận án tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên (M, GP5, GP5ectoM) của virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trong cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc

Mục đích của luận án nhằm tạo cơ sở khoa học và thực nghiệm để biểu hiện các gen mã hoá kháng nguyên của chủng virus PRRS gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn đang lưu hành ở Việt Nam bằng phương pháp biểu hiện gen tạm thời trong thực vật phục vụ cho định hướng phát triển sản xuất vaccine thế hệ mới.

VI N HÀN LÂM KHOA H C VÀ CÔNG NGH  VI T NAM Ệ Ọ Ệ Ệ

VI N CÔNG NGH  SINH H C Ệ Ệ Ọ

NGUY N TH  MINH H NG  Ễ Ị Ằ

NGHIÊN C U BI U HI N KHÁNG NGUYÊN (M, GP5, Ứ Ể Ệ   GP5ectoM) C A VIRUS GÂY H I CH NG R I LO N Ủ Ộ Ứ Ố Ạ   SINH S N VÀ HÔ H P   L N TRONG CÂY THU C LÁ Ả Ấ Ở Ợ Ố  

HÀ N I – 2019 Ộ

Công trình đ ượ c hoàn thành t i Vi n Công ngh  sinh h c ạ ệ ệ ọ

Vi n Hàn lâm Khoa h c và Công ngh  Vi t Nam ệ ọ ệ ệ

Ng ườ ướ i h ng d n khoa h c ẫ ọ :  1. TS. Nguy n Trung Nam  ễ

      Vi n Công ngh  sinh h c ệ ệ ọ

Lu n án đ ậ ượ c b o v  t i H i đ ng ch m lu n án phiên chính  ả ệ ạ ộ ồ ấ ậ

th c t i Vi n Công ngh  sinh h c ứ ạ ệ ệ ọ

Vào h i ……gi … , ngày… tháng… năm 2019 ồ ờ

Có th  tìm hi u lu n án t i: ể ể ậ ạ

­ Th  vi n Qu c gia Vi t Nam ư ệ ố ệ

­ Th  vi n Vi n Công ngh  sinh h c ư ệ ệ ệ ọ

­ Trang web c a B  GD & ĐT ủ ộ

NH NG CÔNG TRÌNH CÔNG B  LIÊN QUAN Đ N LU N ÁN Ữ Ố Ế Ậ

1 Nguyên Thi Minh Hăng ̃ ̣ ̀ , Hô Thi Th ̀ ̣ ươ ng, Nguyên Thu Giang, Pham Bich ̃ ̣ ́   Ngoc, Nguyên Trung Nam, Chu Hoang Ha ( ̣ ̃ ̀ ̀ 2017). Tách dòng và đ ng bi u ồ ể  

hi n gen mã hóa hai lo i kháng nguyên v  GP5ecto (vùng ngo i bào) và M ệ ạ ỏ ạ  

c a virus gây h i ch ng r i lo n sinh s n và hô h p   l n ủ ộ ứ ố ạ ả ấ ở ợ  Tap chi Khoa hoc ̣ ́ ̣  

2 Nguyên Thi Minh Hăng ̃ ̣ ̀ , Hô Thi Th ̀ ̣ ươ ng, Nguyên Thu Giang, Pham Thi ̃ ̣ ̣  Vân, Pham Bich Ngoc, Nguyên Trung Nam, Chu Hoang Ha ( ̣ ́ ̣ ̃ ̀ ̀ 2017).   Bi u ể  

hi n và tinh s ch protein M c a virus PRRS gây b nh l n tai xanh b ng công ệ ạ ủ ệ ợ ằ   ngh  bi u hi n t m th i trong lá thu c lá  ệ ể ệ ạ ờ ố Nicotinana benthamiana. Tap chí ̣  

3 Nguyên Thi Minh Hăng ̃ ̣ ̀ , Hô Thi Th ̀ ̣ ươ ng, Pham Bich Ngoc, Nguyên Trung ̣ ́ ̣ ̃   Nam, Chu Hoang Ha ( ̀ ̀ 2018). Xác đ nh kh  năng kích thích t o kháng th  đ c ị ả ạ ể ặ  

hi u c a kháng nguyên tái t  h p GP5­ELP c a virus PRRS gây h i ch ng ệ ủ ổ ợ ủ ộ ứ  

r i lo n sinh s n và hô h p   l n trên đ ng v t thí nghi m.  ố ạ ả ấ ở ợ ộ ậ ệ T p chí Khoa ạ  

nguyên M và GP5ectom/PRRSV được s n xu t t  th c v t trên chu t b ch. H iả ấ ừ ự ậ ộ ạ ộ  ngh  Khoa h c Công ngh  sinh h c toàn qu c 2018: 194­199.ị ọ ệ ọ ố

6 Nguyên Thi Minh Hăng ̃ ̣ ̀ , Hô Thi Th ̀ ̣ ươ ng, Nguyên Thu Giang, Pham Bich ̃ ̣ ́   Ngoc, Nguyên Trung Nam, Chu Hoang Ha ( ̣ ̃ ̀ ̀ 2016). Đánh giá s  bi u hi n t m ự ể ệ ạ  

th i kháng nguyên GP5 tái t  h p c a virus PRRS trong mô lá thu c lá ờ ổ ợ ủ ố  

v c phía nam, 2016: “ ng d ng Công ngh  sinh h c vào th c ti n”; P1­ ự Ứ ụ ệ ọ ự ễ 14:57.

M  Đ UỞ Ầ

1. Tính c p thi t c a đ  tàiấ ế ủ ề

H i ch ng r i lo n sinh s n và hô h p   l n (Porcine reproductive andộ ứ ố ạ ả ấ ở ợ  respiratory syndrome – PRRS) là b nh truy n nhi m nguy hi m trên l n do virusệ ề ễ ể ợ  gây ra.   Vi t Nam, b nh còn đỞ ệ ệ ược g i là “B nh l n tai xanh” (theo ngôn ng  đ iọ ệ ợ ữ ạ  chúng) do l n m c b nh thợ ắ ệ ường b  xung huy t   tai, lúc đ u đ  s m, sau tím xanh.ị ế ở ầ ỏ ẫ  PRRS gây thi t h i kinh t  r t l n   nh ng nệ ạ ế ấ ớ ở ữ ước có b nh. PRRS đệ ược phát hi n ệ ở 

M  vào năm 1987. Hàng năm nỹ ước M  ph i ch u nh ng thi t h i do b nh này ỹ ả ị ữ ệ ạ ệ ướ  ctính kho ng 664 tri u USD cho vi c tiêu huy l n chêt, l n ôm, chi phi chông dichả ệ ệ ̉ ợ ́ ợ ́ ́ ́ ̣  

va x  ly môi tr̀ ử ́ ường

 Vi t Nam, dich PRRS do virus th  đ c l c cao xu t hi n l n đ u tiên vào

năm 2007. T  đo đên nay, dich đa xuât hi n   hâu hêt cac đia phừ ́ ́ ̣ ̃ ́ ệ ở ̀ ́ ́ ̣ ương trong cả 

nươc. Theo th ng kê c a C c Thú y, t  cu i tháng 4/2016 đ n tháng 11/2016, đã́ ố ủ ụ ừ ố ế  

xu t hi n 14   d ch PRRS t i 8 huy n c a 4 t nh là Qu ng Tr , H u Giang, Nghấ ệ ổ ị ạ ệ ủ ỉ ả ị ậ ệ 

An và Hà Tĩnh, làm 3.433 con l n m c b nh, trong đó có 1.242 con l n b  tiêu hu ợ ắ ệ ợ ị ỷ  PRRS đã anh hu ng n ng nê t i nganh chan nuoi l n trong n̉ ̛ở ặ ̀ ́ơ ̀ ̆ ̂ ợ ước. B nh v n xu tệ ẫ ấ  

hi n   m t s  đ a phệ ở ộ ố ị ương và có tính ch t 2­3 năm m t l n. Đi u này cũng choấ ộ ầ ề  

th y nguy c  xu t hi n tr  l i c a d ch b nh này trong th i gian t i.ấ ơ ấ ệ ở ạ ủ ị ệ ờ ớ

Hi n nay, các vaccine phòng PRRS ch  y u là vaccine vô ho t và nhệ ủ ế ạ ượ  c

đ c. Cac vaccine vô ho t thộ ́ ạ ương an toan nh ng kh  năng bao h  thâp. Cac vaccinè ̀ ư ả ̉ ộ ́ ́  

nhược đ c bao h  t t h n nh ng còn nhi u lo ng i v  tính an toàn c a các loaộ ̉ ộ ố ơ ư ề ạ ề ủ ị vaccine này. Vaccine nhược đ c có th  giam dân m c bao h  do giam m c tộ ể ̉ ̀ ứ ̉ ộ ̉ ư ươ  ́ ngđông v i chung m i (n u có) va ban thân virus vaccine sau nhiêu lân truyên nhi m̀ ớ ̉ ớ ế ̀ ̉ ̀ ̀ ̀ ễ  cũng co thê đ t biên tr  thanh ć ̉ ộ ́ ở ̀ ương đ c. M c dù v y, phòng ch ng PRRS t ì ộ ặ ậ ố ạ  

Vi t Nam đã đ t hi u qu  cao. Hi n nay, d ch ch  xu t hi n l  t , trong nh ngệ ạ ệ ả ệ ị ỉ ấ ệ ẻ ẻ ữ  năm g n đây h u nh  không có d ch, m t ph n là nh  bi n pháp ch  đ ng tiêmầ ầ ư ị ộ ầ ờ ệ ủ ộ  phòng cho l n.ợ

Virus gây H i ch ng r i lo n sinh s n và hô h p   l n   nộ ứ ố ạ ả ấ ở ợ ở ước ta hi n nayệ  

được xác đ nh là th  đ c l c cao và ch a có thu c đ c tr  Vi c phòng ch ng d chị ể ộ ự ư ố ặ ị ệ ố ị  

ch  y u v n là tiêm phòng vaccine k t h p các bi n pháp thú y (Tiêu đ c khủ ế ẫ ế ợ ệ ộ ử trùng, v  sinh tru ng tr i, cách ly và tiêu hu  l n b nh  ). Đ  phòng ch ng virusệ ồ ạ ỷ ợ ệ ể ố  

th  đ c l c cao đang l u hành t i Vi t Nam c n ph i có thêm vaccine phù h p.ể ộ ự ư ạ ệ ầ ả ợ  

Nhu c u v  các lo i vaccine PRRS th  h  m i trong đó có vaccine ti u đ n v , anầ ề ạ ế ệ ớ ể ơ ị  toàn và hi u qu  h n là v n đ  c p thi t. ệ ả ơ ấ ề ấ ế

Protein GP5 và M là nh ng protein c u trúc chính c a virus PRRS (PRRSV)ữ ấ ủ  

đượ ực l a ch n là nh ng  ng viên ti m năng đ  s n xu t vaccine ti u đ n v  ch ngọ ữ ứ ề ể ả ấ ể ơ ị ố  PRRSV. Các kháng th  kháng GP5 và M   l n là các kháng th  có kh  năng trungể ở ợ ể ả  hoà PRRSV. S  k t h p đo n peptit mi n ngoài c a ự ế ợ ạ ề ủ kháng nguyên GP5 (GP5ecto) 

được cho là ch a các epitope trung hoà c a GP5 v i protein M v i mong mu n s  t oứ ủ ớ ớ ố ẽ ạ  

được protein tái t  h p heterodimer GP5ectoM có kh  năng kích thích t o đáp  ngổ ợ ả ạ ứ  

mi n d ch m nh và tr  thành m t trong nh ng  ng viên ti m năng đ  phát tri n s nễ ị ạ ở ộ ữ ứ ề ể ể ả  

xu t vaccine ch ng PRRSV.ấ ố

Kháng nguyên c a virus PRRS có th  đủ ể ược s n xu t trong h  th ng th cả ấ ệ ố ự  

v t nh m phát tri n vaccine ti u đ n v  phòng PRRS thông qua phậ ằ ể ể ơ ị ương pháp bi uể  

hi n gen t m th i. H  th ng bi u hi n gen t m th i   th c v t b ng phệ ạ ờ ệ ố ể ệ ạ ờ ở ự ậ ằ ương pháp 

th m l c nh  ẩ ọ ờ Agrobacterium nh m s n xu t kháng nguyên có nhi u  u đi m nh :ằ ả ấ ề ư ể ư  

M c đ  bi u hi n kháng nguyên cao, có th  s n xu t   quy mô l n, phứ ộ ể ệ ể ả ấ ở ớ ương pháp 

th c hi n đ n gi n, th i gian nhanh, không b   nh hự ệ ơ ả ờ ị ả ưởng b i v  trí g n gen đíchở ị ắ  trong t  bào th c v t và có th  ti n hành bi u hi n trong các mô đã bi t hóa hoànế ự ậ ể ế ể ệ ệ  toàn nh  lá, cung c p kháng nguyên cho m c đích s n xu t vaccine ch ng ch ngư ấ ụ ả ấ ố ủ  virus m i xu t hi n m t cách nhanh chóng khi d ch b nh x y ra.ớ ấ ệ ộ ị ệ ả

Căn c  vào các lu n c  khoa h c và tình hình th c ti n nêu trên, lu n án đứ ậ ứ ọ ự ễ ậ ượ  c

th c hi n v i đ  tài “ự ệ ớ ề Nghiên c u bi u hi n kháng nguyên (M, GP5, GP5ectoM)ứ ể ệ  

c a virus gây H i ch ng r i lo n sinh s n và hô h p   l n trong cây thu c láủ ộ ứ ố ạ ả ấ ở ợ ố  

b ng phằ ương pháp th m l c nh  ẩ ọ ờ Agrobacterium” v i m c đích t o c  s  khoaớ ụ ạ ơ ở  

h c và th c nghi m đ  bi u hi n các  ọ ự ệ ể ể ệ gen mã hoá kháng nguyên c a ch ng virusủ ủ  PRRS gây h i ch ng r i lo n sinh s n và hô h p   l n đang l u hành   Vi t Namộ ứ ố ạ ả ấ ở ợ ư ở ệ  

b ng phằ ương pháp bi u hi n gen t m th i trong th c v t ph c v  cho đ nh hể ệ ạ ờ ự ậ ụ ụ ị ướ  ngphát tri n s n xu t vaccine th  h  m i.ể ả ấ ế ệ ớ

2. M c tiêu nghiên c u ụ ứ

M c tiêu chungụ

Nghiên c u c  s  khoa h c và th c nghi m c a vi c s n xu t kháng nguyênứ ơ ở ọ ự ệ ủ ệ ả ấ  tái t  h p M/GP5/GP5ectoM c a ch ng virus PRRS (PRRSV) đang gây b nh l n taiổ ợ ủ ủ ệ ợ  xanh   Vi t Nam b ng công ngh  bi u hi n t m th i trên cây thu c lá ph c v  choở ệ ằ ệ ể ệ ạ ờ ố ụ ụ  

đ nh hị ướng phát tri n vaccine th  h  m i.ể ế ệ ớ

M c tiêu c  thụ ụ ể

Thi t kế ế được 3 c u trúc ấ vector chuy n genể  mang gen m, gp5optimize (gp5opt) 

và gp5ecto­m c a ch ng virus th  đ c l c cao gây H i ch ng r i lo n sinh s nủ ủ ể ộ ự ộ ứ ố ạ ả  

và hô h p   l n dấ ở ợ ướ ự ềi s  đi u khi n bi u hi n b i promoter ể ể ệ ở CaMV 35S. 

T i  u các đi u ki n bi u hi n t m th i gen mã hoá 3 lo i kháng nguyên Mố ư ề ệ ể ệ ạ ờ ạ , GP5 và GP5ectoM c a ch ng PRRSV th  đ c l c cao trong lá cây thu c lá vàủ ủ ể ộ ự ố  tinh s ch đạ ược kháng nguyên M, GP5 và GP5ectoM tái t  h p t  mô lá thu c lá.ổ ợ ừ ốĐánh giá được tính sinh mi n d ch c a protein tái t  h p M, GP5 và GP5ectoMễ ị ủ ổ ợ  trên đ ng v t thí nghi m.  ộ ậ ệ

 3. N i dung nghiên c uộ ứ

(1) Thi t k  c u trúc vector chuy n gen th c v t mang các ế ế ấ ể ự ậ gen m/gp5opt/gp5ecto­m 

mã   hoá  kháng   nguyên   M­ELP/   GP5­ELP   /GP5ectoM­ELP   và   t o   ch ngạ ủ  

Agrobacterium  mang vector tương  ng; (2) T i  u các đi u ki n bi u hi n t mứ ố ư ề ệ ể ệ ạ  

th i  ờ gen  m/  gp5opt/ gp5ecto­m   lá cây thu c lá  ở ố N. benthamiana  Bi u hi n t mể ệ ạ  

th i và tinh s ch các kháng nguyên M­ELP/ GP5­ELP/ ờ ạ GP5ectoM­ELP tái t  h p;ổ ợ  (3)  Đánh giá tính sinh mi n d ch d ch th  c a kháng nguyên  ễ ị ị ể ủ M­ELP/ GP5­ELP/ GP5ectoM­ELP tái t  h p trên đ ng v t thí nghi m.ổ ợ ộ ậ ệ

4. Đóng góp m i c a lu n ánớ ủ ậ

Lu n án đã ti n hành th c hi n nghiên c u m t cách t ng th , t  vi c thi t kậ ế ự ệ ứ ộ ổ ể ừ ệ ế ế vector chuy n gen mang các gen mã hóa kháng nguyên c a virus PRRS gây b nh l nể ủ ệ ợ  tai xanh, t i  u các đi u ki n bi u hi n gen t m th i trong th c v t, bi u hi n và tinhố ư ề ệ ể ệ ạ ờ ự ậ ể ệ  

s ch kháng nguyên và đánh giá tính sinh mi n d ch c a kháng nguyên tái t  h p trênạ ễ ị ủ ổ ợ  

K t qu  c a lu n án cũng đã ch ng minh đế ả ủ ậ ứ ược các kháng nguyên tái t  h p M­ổ ợELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP có kh  năng kích thích sinh kháng th  đ c hi uả ể ặ ệ  kháng virus PRRS trên đ ng v t thí nghi m. Trong đó,ộ ậ ệ  kháng nguyên GP5ecto (vùng ngo i bào c a GP5) dung h p v i kháng nguyên M (GP5ectoM­ELP) kích thích đápạ ủ ợ ớ  

ng kháng th  đ c hi u t t h n kháng nguyên M­ELP, GP5­ELP riêng l  Kháng

nguyên GP5ectoM­ELP và GP5­ELP là hai  ng viên ti m năng đ  s n xu t vaccineứ ề ể ả ấ  

ti u đ n v  ch ng PRRSV th  đ c l c cao đang gây b nh   Vi t Nam.ể ơ ị ố ể ộ ự ệ ở ệ

5. Ý nghĩa khoa h c và th c ti nọ ự ễ

5.1. Ý nghĩa khoa h c ọ

Lu n án cung c p c  s  khoa h c quan tr ng trong vi c thi t k  các c u trúcậ ấ ơ ở ọ ọ ệ ế ế ấ  vector chuy n gen mang gen ể m/gp5opt/gp5ecto­m mã hóa cho các kháng nguyên tái tổ 

h p ợ M, GP5 và GP5ectoM c a ủ PRRSV dung h p Elastin ­ like polypeptide (ELP); bi uợ ể  

hi n t m th i kháng nguyên tái t  h p trên cây thu c lá b ng phệ ạ ờ ổ ợ ố ằ ương pháp th m l cẩ ọ  

nh  ờ Agrobacterium;  tách chi t, tinh s ch và đánh giá kh  năng kích thích đáp  ngế ạ ả ứ  

mi n d ch d ch th  c a các kháng nguyên tái t  h p này trên đ ng v t thí nghi m. K tễ ị ị ể ủ ổ ợ ộ ậ ệ ế  

qu  đ  tài lu n án là b ng ch ng khoa h c v  ti m năng c a vi c s n xu t, phátả ề ậ ằ ứ ọ ề ề ủ ệ ả ấ  tri n vaccine ti u đ n v  phòng ể ể ơ ị PRRS trong th c v t.ự ậ  

5.2. Ý nghĩa th c ti n ự ễ

Các c u trúc vector chuy n gen th c v t mang gen m/ gp5opt/ gp5ecto­m mãấ ể ự ậ  hóa các kháng nguyên tái t  h p M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP c a ch ng virusổ ợ ủ ủ  PRRS đang l u hành   Vi t Nam và các ch ng ư ở ệ ủ A. tumefaciens mang các vector này có 

th  để ượ ử ục s  d ng đ  nghiên c u bi u hi n, s n xu t và phát tri n vaccine ti u đ n vể ứ ể ệ ả ấ ể ể ơ ị phòng PRRS

Quy trình bi u hi n gen t m th i trên lá cây thu c lá b ng phể ệ ạ ờ ố ằ ương pháp th mẩ  

l c nh   ọ ờ A. tumefaciens v i các đi u ki n t i  u c a đ  tài lu n án có th   ng d ngớ ề ệ ố ư ủ ề ậ ể ứ ụ  

đ  s n xu t các kháng nguyên tái t  h p M­ELP, GP5­ELP, GP5ectoM­ELP ho c cácể ả ấ ổ ợ ặ  protein tái t  h p khác.ổ ợ

Kháng nguyên tái t  h p GP5­ELP và GP5ectoM­ELP đổ ợ ượ ạc t o ra trong đ  tàiề  

lu n án là hai  ng viên ti m năng cho s n xu t vaccine ti u đ n v  phòng b nh l n taiậ ứ ề ả ấ ể ơ ị ệ ợ  xanh   Vi t Nam.ở ệ

6. C u trúc c a lu n ánấ ủ ậ

Lu n án g m 131 trang (T  M  đ u đ n K t lu n và ki n ngh , không bao g mậ ồ ừ ở ầ ế ế ậ ế ị ồ  Danh m c các công trình công b , Tóm tát lu n án b ng Ti ng Anh, tài li u thamụ ố ậ ằ ế ệ  

kh o và các ph  l c), đả ụ ụ ược chia thành các ph n: M  đ u g m 5 trang; Chầ ở ầ ồ ương 1: 

T ng quan tài li u, 37 trang; Chổ ệ ương 2: V t li u và phậ ệ ương pháp, 17 trang; Chươ  ng3: K t qu  nghiên c u, 47 trang; Chế ả ứ ương 4: Bàn lu n k t qu  nghiên c u, 22 trang;ậ ế ả ứ  

K t lu n và đ  ngh : 2 trang; Các công trình đã công b  liên quan đ n lu n án: 1 trang;ế ậ ề ị ố ế ậ  Tóm t t lu n án b ng ti ng anh: 7 trang; Lu n án có 7 b ng s  li u, 51 hình. Ngoài ra,ắ ậ ằ ế ậ ả ố ệ  tài li u tham kh o: 229 tài ệ ả li u tham kh o, trong đó 14 tài li u ti ng Vi t và 215 tài li uệ ả ệ ế ệ ệ  

ti ng Anh; Ph  l c: 5 trang;ế ụ ụ  

Chương 1

T NG QUAN TÀI LI UỔ Ệ

Lu n án đã tham kh o và t ng k t 16 tài li u trong nậ ả ổ ế ệ ước, 217 tài li u nệ ước ngoài 

v i các n i dung liên quan, bao g m: (1) H i ch ng r i lo n sinh s n và hô h p   l n,ớ ộ ồ ộ ứ ố ạ ả ấ ở ợ  

nh : S  lư ơ ược tình hình d ch b nh; b nh tích c a PRRS; virus PRRS; (2) Vaccineị ệ ệ ủ  phòng PRRS: Vaccine s ng ­ nhố ược đ c; vaccine vô ho t; ộ ạ các d ng vaccine th  nghi mạ ử ệ  

d a vào kháng nguyên GP5 và M ch ng PRRSV; ự ố (3) Bi u hi n t m th i kháng nguyênể ệ ạ ờ  

c a PRRSV   th c v t b ng phủ ở ự ậ ằ ương pháp th m l c nh  ẩ ọ ờ Agrobacterium, nh : L i thư ợ ế 

c a phủ ương pháp bi u hi n gen t m th i nh  ể ệ ạ ờ ờ A. tumefaciens; quá trình th m l c nhẩ ọ ờ 

A. tumefaciens; m t s  gi i pháp tăng cộ ố ả ường bi u hi n gen t m th i   th c v t. ể ệ ạ ờ ở ự ậ

V i các d n li u thu th p đớ ẫ ệ ậ ược, k t qu  phân tích cho th y H i ch ng r i lo n sinhế ả ấ ộ ứ ố ạ  

s n và hô h p   l n (PRRS) do virus PRRS (PRRSV) gây ra, là m t b nh truy nả ấ ở ợ ộ ệ ề  nhi m nguy hi m   l n, đễ ể ở ợ ược phát hi n ệ l n đ u tiên   M  vào năm 1987 và đã lâyầ ầ ở ỹ  lan   nhi u qu c gia trên th  gi i, gây thi t h i nghiêm tr ng cho ngành chăn nuôiở ề ố ế ớ ệ ạ ọ  

l n. ợ PRRSV là loai virus RNA không ôn đinh, thay đôi nhanh chóng ca vê đ c tính dị ̉ ̣ ̉ ̉ ̀ ặ  truyêǹ và kháng nguyên, có t c đ  ti n hóa nhanh nh t trong s  các virus RNA. Đi uố ộ ế ấ ố ề  này, gây ra nhi u khó khăn cho vi c nghiên c u s n xu t vaccine phòng PRRS. Hi nề ệ ứ ả ấ ệ  nay, trên th  gi i đã có h n 20 lo i vaccine thế ớ ơ ạ ương m i phòng PRRS. Các vaccineạ  

đượ ảc s n xu t t  các ch ng virus dòng châu Âu và dòng B c M  dấ ừ ủ ắ ỹ ưới hai d ng chạ ủ 

y u là vaccine s ng – nhế ố ược đ c và vaccine vô ho t.ộ ạ  Vaccine vô ho t thạ ường an toàn, 

có kh  năng phòng ng a các tri u ch ng lâm sàng nh ng hi u qu  b o h  không cao.ả ừ ệ ứ ư ệ ả ả ộ  Vaccine nhược đ c t o ra mi n d ch b o h  t t v i các ch ng tộ ạ ễ ị ả ộ ố ớ ủ ương đ ng nh ngồ ư  

m c b o h  có th  gi m d n do gi m m c tứ ả ộ ể ả ầ ả ứ ương đ ng v i các ch ng m i, có nguyồ ớ ủ ớ  

c  phát tri n đ c tính tr  l i, b n thân virus vaccine sau nhi u l n truy n nhi m cóơ ể ộ ở ạ ả ề ầ ề ễ  

nhược đ c ch ng Hanvet 1.VNộ ủ  đ  phòng ch ng PRRS   Vi t Nam. Tuy nhiên, dể ố ở ệ o sự 

bi n đ i di truy n ph c t p c a PRRSV, các lo i vaccine đang l u hành trên th cế ổ ề ứ ạ ủ ạ ư ự  

đ a hi n nay đang m t d n hi u l c. Virus gây d ch tai xanh   nị ệ ấ ầ ệ ư ị ở ước ta hi n nayệ  

được xác đ nh là th  đ c l c cao, ị ể ộ ự thu c ch ng PRRSV Băc My type II, ộ ủ ́ ̃ tương đ ngồ  

v i ch ng virus gây b nh th  đ c l c cao   Trung Qu c nên ớ ủ ệ ể ộ ự ở ố vi c phòng b nh khóệ ệ  khăn, d ch cũng nguy hi m h n và c n ph i có vacxin phù h p. ị ể ơ ầ ả ợ

Đ  nâng cao hi u qu  phòng ch ng PRRS, vi c nghiên c u s n xu t các lo iể ệ ả ố ệ ứ ả ấ ạ  vaccine th  h  m i có s  b o h  cao v i các bi n ch ng m i c a PRRSV hi n nayế ệ ớ ự ả ộ ớ ế ủ ớ ủ ệ  

là r t c n thi t  ấ ầ ế Vaccine ti u đ n v  để ơ ị ược s n xu t trong th c v t phòng PRRS làả ấ ự ậ  

hướng nghiên c u ứ đã được đánh giá là có nhi u tri n v ng và  u đi m nh   n đ nhề ể ọ ư ể ư ổ ị  

và b n v ng, ề ữ đ m b o ho t tính sinh h c, ả ả ạ ọ d  dàng s n xu t v i kh i lễ ả ấ ớ ố ượng l n, chiớ  phí s n xu t th pả ấ ấ  Protein GP5 và M là nh ng protein c u trúc chính c a virusữ ấ ủ  PRRS đượ ực l a ch n là nh ng  ng viên ti m năng đ  s n xu t vaccine ti u đ n vọ ữ ứ ề ể ả ấ ể ơ ị 

ch ng virus PRRS. Nhi u h  th ng bi u hi n GP5 và M c a PRRSV đã đố ề ệ ố ể ệ ủ ược thử nghi m. Bi u hi n gen t m th i   th c v t b ng phệ ể ệ ạ ờ ở ự ậ ằ ương pháp th m l c nhẩ ọ ờ 

Agrobacterium  là phương pháp đ  s n xu t kháng nguyên có nhi u  u đi m đãể ả ấ ề ư ể  

được ch ng minh, nh : Hàm lứ ư ượng kháng nguyên cao, có th  s n xu t v i sể ả ấ ớ ố 

lượng l n, chi phí th p, th c hi n đ n gi n, th i gian nhanh, không b   nh hớ ấ ự ệ ơ ả ờ ị ả ưở  ng

b i v  trí g n gen đích trong t  bào th c v t và có th  ti n hành bi u hi n trongở ị ắ ế ự ậ ể ế ể ệ  các mô đã bi t hóa hoàn toàn nh  mô lá. ệ ư V i s  hi u rõ v  c u trúc phân t  h  genớ ự ể ề ấ ử ệ  

và tính kháng nguyên c a virus  ủ PRRS gây b nh l n tai xanh  ệ ợ và các thành t u đ tự ạ  

được v  bi u hi n, s n xu t vaccine ti u đ n v  trong th c v t phòng ch ng b nhề ể ệ ả ấ ể ơ ị ự ậ ố ệ  virus là căn c  đ  chúng tôi th c hi n đ  tài lu n án này.ứ ể ự ệ ề ậ

2.1.2. Các vector và v t li u th c v t, đ ng v t ậ ệ ự ậ ộ ậ

Vector nhân dòng pRTRA ch a đo n promoter 35S và đo n 100xELP (ứ ạ ạ pRTRA 35S­H5­Histag­Cmyc­100xELP) (Scheller và đ ng tác gi , 2006; Hoang, 2012). Vectorồ ả  

pCB301­Kan (Xiang  et al.,  1999); Plasmid pGEM­PRRS (VN07196) mang gen  m và 

gp5  phân l p t  virus PRRS ch ng Vi t Nam; vector pBSK mang đo n gen  ậ ừ ủ ệ ạ gp5opt 

(gp5  optimize)  đã đượ ố ưc t i  u mã di truy n. Cây thu c lá  ề ố Nicotiana benthamiana; 

Chu t b ch ch ng BALB/C;  L n con 20 ngày tu i;  t  bào MARC ­145 và ch ngộ ạ ủ ợ ổ ế ủ  virus PRRS 07196. 

2.1.4. Hóa ch tấ

Kit tách chi t plasmid, kit thôi gel và kit tinh s ch DNA (QIAGEN), thang DNA 1ế ạ  

Kb, thang protein (Fermentas), cac loai enzyme c t gi i h n cua Fermentas. ́ ̣ ắ ớ ạ ̉ Các hoá 

ch t   Yeast   extract,   Agarose,   Trypton,   v.v   các   lo i   kháng   sinh   kanamycin,ấ ạ  rifamycine và các hóa ch t thông d ng khác c a các hãng Merck, Sigma,v.v.ấ ụ ủ  Kháng 

th  kháng Cmyc, kháng th  ể ể anti­mouse IgG c ng h p HRP ộ ợ (Promega ­ USA), kháng nguyên scFv (50 ng/µl), kháng th  ể rabit anti­pig  IgG  c ng h p  ộ ợ Peroxidase,  hóa ch tấ  

hi n màu TMB, DAB, kit hi n phim (Thermo Scientific), Protein (H5­pII)3 v.v.ệ ệ

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C UỨ

2.2.1. Nhân dòng gen m, gp5opt và gp5ecto­m và ghép n i vào vector ố pRTRA

Đo n gen ạ m và gp5ecto­m được nhân dòng b ng PCR s  d ng khuôn là plasmidằ ử ụ  pGEM­PRRS (VN07196) và đo n gen  ạ gp5opt được nhân dòng t  khuôn là plasmidừ  

pBSK mang gen gp5opt v i các m i đ c hi u tớ ồ ặ ệ ương  ng. Thành ph n ph n  ng PCRứ ầ ả ứ  bao g m 0,3 μM primer, 0,2 μM dNTPs, 2,5U Pwo SuperYield DNA polymerase, 5 μlồ  

đ m 10X Pwo SuperYield PC, 20 ng DNA khuôn trong t ng s  50 µl h n h p. Chuệ ổ ố ỗ ợ  trình nhiêt nh  sau: 94̣ ư 0C/ 3 phút; 32 chu k  v i 94ỳ ớ 0C/ 30 giây, 550C/ 50 giây, 720C/ 1 phút; ti p đó là 72ế 0C/ 10 phút và s n ph m đả ẩ ược gi    4ữ ở 0C. S n ph m PCR đả ẩ ượ  c

đi n di trên gel agarose 0,8%, ệ sau đó đượ  tinh s ch và x  lý v i enzyme c t gi i h nc ạ ử ớ ắ ớ ạ  

đã được thi t k  đ  ghép n i vào plasmid ế ế ể ố pRTRA 35S­Histag­Cmyc­100xELP và bi nế  

n p vào ạ E. coli  theo ph ng pháp s c nhi t c a Sambrook và đtg (2012).ươ ố ệ ủ  

Khu n l c mang vector tái t  h p đẩ ạ ổ ợ ược ch n l c trên môi trọ ọ ường LB đ c b  sungặ ổ  kháng sinh 50 mg/l  kanamycin. Vector tái t  h p đổ ợ ược tách chi t t  các khu n l cế ừ ẩ ạ  

dương tính (Colony­PCR) được gi i trình t  và phân tích ki m tra tính chính xác b ngả ự ể ằ  

ph n m m BioEdit 7.0 và Lasergen 7 (DNAstarinc, Madison, WI, USA).ầ ề

2.2.2. Thi t k  c u trúc vector pCB301 mang gen ế ế ấ m/ gp5opt/ gp5ecto­m 

Vector nhân dòng pRTRA tái t  h p mang gen ổ ợ m, gp5opt và gp5ecto­m và vector 

pCB301 cùng được phân c t b ng enzyme  ắ ằ HindIII. Các s n ph m c t t  vectorả ẩ ắ ừ  pRTRA bao g m 35S­ồ m­Histag­Cmyc­100xELP;  35S­gp5opt­Histag­Cmyc­100xELP; 

35S­gp5ecto­m­Histag­Cmyc­100xELP và được ghép n i vào vector pCB301 s  d ngố ử ụ  T4 DNA ligase và được bi n n p vào t  bào ế ạ ế E. coli DH5  kh  bi n b ng phα ả ế ằ ươ  ngpháp s c nhi t (Sambrook ố ệ et al., 2012). Vi c ch n các dòng khu n l c mang vector táiệ ọ ẩ ạ  

t  h p đổ ợ ược th c hi n trên môi trự ệ ường LB đ c có ch a 50 mg/l kanamycin và b ngặ ứ ằ  

ph n  ng Colony­PCR. Các vector tái t  h p  pCB301 mang gen ả ứ ổ ợ m/ gp5opt/gp5ecto­m, 

được tách chi t t  các dòng khu n l c dế ừ ẩ ạ ương tính và ki m tra b ng ph n  ng c t v iể ằ ả ứ ắ ớ  enzyme gi i h n ớ ạ HindIII và NcoI. Các vector chuy n gen sau đó để ược bi n n p vàoế ạ  

ch ng ủ A. tumefaciens C58C1 b ng phằ ương pháp xung đi n. ệ

Tách chi t và tinh s ch plasmid:ế ạ  Plasmid đ c tách chi t theo ph ng pháp c aượ ế ươ ủ  Sambrook và c ng s  (2012)  ộ ự S  d ng b  Kit do hãng Fermentas cung c p đ  tinhử ụ ộ ấ ể  

s ch plasmid.ạ  Ph ng pháp x  lý DNA b ng enzyme c t gi i h n:ươ ử ằ ắ ớ ạ  Thành ph n ph nầ ả  

ng c t đ c th c hi n theo s  h ng d n c a  hãng s n xu t b  Kit s  d ng enzyme

ứ ắ ượ ự ệ ự ướ ẫ ủ ả ấ ộ ử ụ

2.2.3. Bi u hi n t m th i gen mã hoá kháng nguyên tái t  h p trong lá thu c lá ể ệ ạ ờ ổ ợ ố

2.2.3.1. Chu n b  d ch khu nẩ ị ị ẩ

Ch ng  ủ A. tumefaciens  mang vector pCB301 35S­m­Histag­Cmyc­100xELP ho cặ  

pCB301   35S­gp5opt­Histag­Cmyc­100xELP   ho c   pCB301   35S­ặ gp5ecto­m­Histag­

Cmyc­100xELP và ch ng ủ A.  tumefaciens C58C1 mang vector pIBT­35S­2bCMV ho cặ  vector  pIBT­35S­HC­Pro PVY  được nuôi trong môi trường YEB có b  sung khángổ  sinh, nuôi l c 200 v/ph, 12­18h   28ắ ở 0C cho đ n khi m t đ  vi khu n ODế ậ ộ ẩ 600 đ t 0,5 ­ạ  1,0.  Vi khu n đẩ ược thu nh n sau khi ly tâm d ch nuôi   t c đ  5.000 v/ph trong 15ậ ị ở ố ộ  phút. C n khu n c a 2 ch ng đặ ẩ ủ ủ ược hòa tan trong đ m MES t i ODệ ớ 600 = 0,5 đ  dùngể  cho bi n n p. D ch khu n có th  dùng riêng r  hay tr n v i nhau theo t  l  1:1, tùyế ạ ị ẩ ể ẽ ộ ớ ỷ ệ  theo m c đích c a thí nghi m. ụ ủ ệ

2.2.3.2. Phương pháp bi n n p gen đích vào lá cây thu c lá ế ạ ố

Quá trình bi n n p đế ạ ược ti n hành v i cây thu c lá tr ng t  3 ­ 8 tu n. Câyế ớ ố ồ ừ ầ  đượ  c

úp ngược và nh n chìm toàn b  ph n lá vào bình ch a d ch khu n đã đấ ộ ầ ứ ị ẩ ược chu n b  ẩ ị ở trên, ti p theo chuy n h  th ng này vào bình hút chân không. Áp su t bình hút chânế ể ệ ố ấ  không được ch nh t i t i 27 inches Hg, hút trong 1,5 phút, sau đó gi m áp su t bình vỉ ớ ớ ả ấ ề 

áp su t không khí và m  n p. Các cây thu c lá sau khi bi n n p đấ ở ắ ố ế ạ ược ti p t c nuôi vàế ụ  chăm sóc trong bu ng sinh trồ ưởng.   

2.2.4. Đánh giá  nh hả ưởng c a các đi u ki n bi u hi n gen t m th i đ n m c đ  ủ ề ệ ể ệ ạ ờ ế ứ ộ

bi u hi n protein tái t  h p ể ệ ổ ợ trong lá cây thu c láố

2.2.4.1. Đánh giá  nh hả ưởng c a vector h  tr  bi u hi n gen ủ ỗ ợ ể ệ

Đ  đánh giá  nh hể ả ưởng c a vector h  tr  đ n m c đ  bi u hi n c a các gen ủ ỗ ợ ế ứ ộ ể ệ ủ m,  gp5opt và gp5ecto­m trong lá thu c lá, d ch ố ị A. tumefaciens mang vector pCB301 ch aứ  

gen m/ gp5opt/ gp5ecto­m được lây nhi m vào lá ho c d ch vi khu n này k t h p v iễ ặ ị ẩ ế ợ ớ  

d ch  ị A. tumefaciens  mang  vector h  tr  ỗ ợ pIBT­35S­2bCMV/  pIBT­35S­HC­Pro PVY, 

v i l  d ch (1:1)ớ ệ ị  (xâm nhi m kép ễ ). M u lá đẫ ược thu sau 3, 4, 5, 6 ngày sau bi n n p,ế ạ  tách chi t protein t ng s  đ  đánh giá m c đ  bi u hi n c a gen chuy n. M c đế ổ ố ể ứ ộ ể ệ ủ ể ứ ộ 

bi u hi n gen chuy n để ệ ể ược đánh giá b ng phằ ương pháp lai Western blot s  d ngử ụ  kháng th  kháng Cmycể

2.2.4.2. Đánh giá  nh hả ưởng c a n ng đ  acetosyringoneủ ồ ộ

Thí nghi m đệ ược b  trí v i d ch ố ớ ị A. tumefaciens mang vector chuy n gen m c tiêuể ụ  

và A. tumefaciens ch a vector pIBT­35S­HC­Pro PVY,ứ  không được b  sung AS và bổ ổ sung AS v i n ng đ  450 µM và 600 µM. ớ ồ ộ

2.2.4.3. Đánh giá  nh hả ưởng c a m t đ  vi khu n dùng cho bi n n pủ ậ ộ ẩ ế ạ

Thí nghi m đánh giá m t đ  khu n đệ ậ ộ ẩ ược ti n hành v i v i d ch khu n có giá tr  ODế ớ ớ ị ẩ ị 600 

t    0,2; 0,5; 1,0 (g m ch ng  ừ ồ ủ A. tumefaciens  mang vector chuy n gen m c tiêu vàể ụ  

ch ng ủ A. tumefaciens mang vector h  tr  pIBT­35S­HC­Pro PVY, lỗ ợ ượng d ch 2 lít v iị ớ  

t  l  1:1)ỷ ệ  và b  sung AS   n ng đ  450 µM). ổ ở ồ ộ

2.2.4.4. Đánh giá  nh hả ưởng c a tu i c a lá đủ ổ ủ ược xâm nhi mễ

Thí nghi m:ệ  Lá non g m các lá th  1, 2, 3  t  ng n xu ng; lá bánh t  g m nh ngồ ứ ừ ọ ố ẻ ồ ữ  

lá t i v  trí chính gi a c a thân cây; lá già g m nh ng lá 1, 2, 3 t  g c lênạ ị ữ ủ ồ ữ ừ ố  

2.2.4.5. Đánh giá  nh hả ưởng c aủ  tu i câyổ

Cây thu c lá 3, 4, 5, 6, 7 và 8 tu n tu iố ầ ổ ; các lá non và lá bánh tẻ đượ  cho xâm cnhi m v i d ch khu n ễ ớ ị ẩ (g m ch ng ồ ủ A. tumefaciens mang vector chuy n gen m c tiêuể ụ  

và ch ng ủ A. tumefaciens mang vector pIBT­35S­HC­Pro PVY, OD600 = 0,5) v i n ngớ ồ  

đ  AS 450 µM. ộ

2.2.5. Tách chi t và xác đ nh ế ị n ng đ  protein t ng s   ồ ộ ổ ố

Protein t ng s  t  m u lá đổ ố ừ ẫ ược tách chi t b ng d ch chi t PBS  và b o qu n ế ằ ị ế ả ả ở 

­20oC. Hàm lượng protein t ng s  đổ ố ược đo   bở ước sóng 595 nm theo phương pháp 

c a Bradford (1976) v i đủ ớ ường chu n đẩ ược xây d ng d a vào protein BSA chu n đãự ự ẩ  

đượ ủ ớc   v i kháng th  2 anti­mouse IgG có g n HRP (đ i v i m u huy t thanhể ắ ố ớ ẫ ế  chu t) ho c anti­pig IgG g n peroxidase (đ i v i các m u huy t thanh l n). Phátộ ặ ắ ố ớ ẫ ế ợ  

hi n s  có m t c a kháng nguyên tái t  h p b ng cách ngâm màng lai trong dungệ ự ặ ủ ổ ợ ằ  

d ch hi n màu có ch a c  ch t DAB trong 15 phút (Phan, 2012). ị ệ ứ ơ ấ

2.2.7. Tinh s ch protein M, GP5 và GP5ectoM ạ

2.2.7. 1. T i  u n ng đ  PEG trong quá trình thu nh n protein đíchố ư ồ ộ ậ

Thí nghi m: PEG 8000 đệ ược b  sung   d i n ng đ  (2% ­ 10%) vào 2 ml d chổ ở ả ồ ộ ị  chi t lá th c v t chuy n gen. D ch chi t lá sau đó đế ự ậ ể ị ế ược ly tâm   13.000 v/p, trong 30ở  phút,   4ở oC. Protein d ch đị ược bi n tính và ki m tra m c đ  thu nh n protein đíchế ể ứ ộ ậ  

b ng lai Western blot. ằ

2.2.7.2. Tinh s ch protein tái t  h p b ng phạ ổ ợ ằ ương pháp mITC 

Protein tái t  h p g n ELP đổ ợ ắ ược tinh s ch b ng phạ ằ ương pháp mITC theo phươ  ngpháp c a Phan, 2012.ủ

2.2.7.2. Phương pháp tính hi u su t thu h i protein tinh s chệ ấ ồ ạ

Tính hi u su t thu h i protein tinh s ch d a s  d ng protein chu n (ScFv­cmyc)ệ ấ ồ ạ ự ử ụ ẩ  

đã bi t trế ước hàm lượng và đo b ng phằ ương pháp Bradford

2.2.8.Phương pháp đánh giá tính sinh mi n d ch c a các kháng nguyên tái t  h p trênễ ị ủ ổ ợ  

đ ng v t  ộ ậ thí nghi mệ

2.2.8.1. Gây mi n d ch trên chu tễ ị ộ

Kháng nguyên tái t  h p sau khi tinh s ch đ c s  d ng đ  gây mi n d ch trên chu tổ ợ ạ ượ ử ụ ể ễ ị ộ  

b ch ạ 6 tu n tu iầ ổ  v i hàm l ng 5 µg/con chu t. Kháng nguyên đ c tr n đ u, đ ng nh tớ ượ ộ ượ ộ ề ồ ấ  

v i ch t b  tr  v i t  l  1:1ớ ấ ổ ợ ớ ỷ ệ  Chu t độ ược chia làm 5 nhóm. Nhóm 1: Tiêm vaccine PRRS nhược đ c (đ i ch ng dộ ố ứ ương); nhóm 2: Tiêm PBS (đ i ch ng âm), nhóm 3:ố ứ  Tiêm kháng nguyên M­ELP; nhóm 4: Tiêm kháng nguyên GP5­ELP; nhóm 5: Tiêm kháng nguyên GP5ectoM­ELP. Nhóm 1 được tiêm vaccine PRRS nhược đ c ch ngộ ủ  

Hanvet 1.VN m t l n duy nh t. Các nhóm 2, 3, 4, 5 độ ầ ấ ược tiêm nh c l i 3 l n. M uắ ạ ầ ẫ  máu đượ ấc l y đ  chi t huy t thanh t i ba th i đi m: Ngày 0 (Trể ế ế ạ ờ ể ước khi tiêm), 21 và 

35.  Phân tích huy t thanh chu t sau 2 l n tiêm và sau 3 l n tiêm b ng ELISA vàế ộ ầ ầ ằ  Western blot. 

2.2.8.2. Gây mi n d ch trên l nễ ị ợ

L n con 3 tu n tu i kh e m nh, âm tính v i kháng th  kháng PRRSV đợ ầ ổ ỏ ạ ớ ể ược chia thành b n nhóm, m i nhóm 3 con l n. Nhóm 1: Tiêm vaccine PRRS nhố ỗ ợ ược đ c ch ngộ ủ  Hanvet 1.VN; nhóm 2: Tiêm d ch chi t lá thu c lá không chuy n gen (WT); nhóm 3:ị ế ố ể  Tiêm d ch chi t thô ch a protein GP5­ELP (150 µg/ml); nhóm 4:ị ế ứ  Tiêm d ch chi t thôị ế  

ch a protein GP5ectoM­ELP (150 µg/ml)  ứ Nhóm 1 được tiêm vaccine  PRRS nhượ  c

đ c ộ m t l n duy nh t. Các nhóm 2, 3 và 4 độ ầ ấ ược tiêm nh c l i 3 l n: ngày 0, 14 và 28.ắ ạ ầ2.2.8.3. Xác đ nh kháng th  kháng GP5­ELP và GP5ectoM­ELP trong huy t thanh l nị ể ế ợ

M u máu c a l n đẫ ủ ợ ượ ấc l y đ  chi t huy t thanh t i ể ế ế ạ b n th i đi m: Ngày 0, 14,ố ờ ể  

28, 35 và 49. Các huy t thanh chi t t  các m u máu c a l n thí nghi m đế ế ừ ẫ ủ ợ ệ ượ ử ụ  c s  d ng

v i vai trò là kháng th  1 cho vi c xác đ nh kháng th  IgG đ c hi u b ng ELISA,ớ ể ệ ị ể ặ ệ ằ  Western blot và ph n  ng IPMA. T t c  các huy t thanh l n đã đả ứ ấ ả ế ợ ược pha loãng 20 

l n. Kh  năng s n sinh kháng th  IgG đ c hi u c a t ng lo i kháng nguyên tầ ả ả ể ặ ệ ủ ừ ạ ươ  ng

hi n màu có ch a c  ch t TMB, 15 phút, s n ph m ph n  ng cho màu xanh, sau đóệ ứ ơ ấ ả ẩ ả ứ  

c  đ nh màu b ng HCl 1N, màu c a ph n  ng đố ị ằ ủ ả ứ ược đo   bở ước sóng 450 nm

Phương pháp Western blot: Ph n  ng lai Western đả ứ ược th c hi n nh  m c 2.2.6.2ự ệ ư ụ  

v i thay đ i kháng th  th  nh t đớ ổ ể ứ ấ ược dùng trong trường h p này là kháng th  trongợ ể  huy t thanh c a chu t/l n. ế ủ ộ ợ

Lai mi n d ch chéo ễ ị : Ph n  ng Western blot đả ứ ược th c hi n v i kháng nguyên táiự ệ ớ  

t  h p; kháng th  s  c p là kháng huy t thanh c a nhóm chu t/l n đổ ợ ể ơ ấ ế ủ ộ ợ ược tiêm vaccine PRRS nhược đ c ch ng Hanvet 1.VN; kháng th  th  c p là anti­mouse IgG g n HRPộ ủ ể ứ ấ ắ  (Đ i v i huy t thanh chu t)/ anti­pig IgG g n peroxidase (Đ i v i huy t thanh l n).ố ớ ế ộ ắ ố ớ ế ợ

  Phương pháp mi n d ch có g n enzyme trên th m t  bào m t l p (IPMA):ễ ị ắ ả ế ộ ớ  

Phương pháp th c hi n theo tiêu chu n qu c gia TCVN 8400­21:2014 v  B nh đ ngự ệ ẩ ố ề ệ ộ  

v t.ậ

X  lý và phân tích th ng kê k t qu  th c nghi mử ố ế ả ự ệ : Phân tích th ng kê đố ược th cự  

hi n trên chệ ương trình Ecxel s  d ng phử ụ ương pháp Student’ t­test p ≤ 0,05 là có ý nghĩa th ng kê.ố

2.3. Đ a đi m nghiên c u:  ị ể ứ Phòng Công ngh  T  bào th c v t, Phòng thí nghi mệ ế ự ậ ệ  

tr ng đi m Công ngh  gen, Phòng th  nghi m sinh h c ­ Vi n Công ngh  sinh h c vàọ ể ệ ử ệ ọ ệ ệ ọ  Trung tâm ch n đoán thú y T  ẩ Ư

Chương 3

Gen m (528 bp) được khu ch b ng PCR và ghép n i thành công vào vector pRTRAế ằ ố  

t o thành vector tái t  h p pRTRA 35S­ạ ổ ợ m­Histag­Cmyc­100xELP; sau đó vector đượ  c

bi n n p t  bào ế ạ ế E. coli. K t qu  đã đế ả ược ki m tra b ng k  thu t colony­PCR và b ngể ằ ỹ ậ ằ  

c t   enzyme   gi i   h n   (Hình   3.1)  ắ ớ ạ Vector   pRTRA   35S­m­Histag­Cmyc­100xELP   và 

vector chuy n gen pCB301 để ược x  lý b ng cùng  ử ằ HindIII; s n ph m thu đả ẩ ược là: 

Đo n DNA g m c u trúc 35S­ạ ồ ấ m­Histag­Cmyc­100xELP có kích thước kho ng 3,0 kbả  

và khung vector pCB301 m  vòng có kích thở ước kho ng 5,5 kb.ả

Hình 3.1. Tao vector tách dòng pRTRA 35S­m­Histag­Cmyc­100xELP. (A): S n ph mả ẩ  

PCR nhân gen m; (B): S n ph m colony­PCR ch n dòng vi khu n; (C): S n ph mả ẩ ọ ẩ ả ẩ  

c t pRTRA tái t  h p b ng ắ ổ ợ ằ BamHI.3.1.1.2. Thi t k  vector pCB301  ế ế 35S­ m­Histag­ Cmyc­100xELP 

Khung vector pCB301 được ghép n i v i c u trúc cassette 35S­ố ớ ấ m­Histag­Cmyc­

100xELP  t o   vector  chuy n  gen   pCB301   35S­ạ ể m­Histag­Cmyc­100xELP  K t   quế ả 

ki m tra b ng ể ằ k  thu t colony­PCR và b ng c t enzyme gi i h n (3.2) cho th y đãỹ ậ ằ ắ ớ ạ ấ  thi t k  thành công vector ế ế pCB301 mang cassette 35S­m­Histag­Cmyc­100xELP đ oả  chi u   v i   cassete   gen   ch n   l c   (Nos   pro­ề ớ ọ ọ nptIII­Nos   ter)  Vector   chuy n   gen   cóể  

cassette đ o chi u này đả ề ược dùng đ  bi n n p vào ể ế ạ A. tumefacines ph c v  cho thíụ ụ  nghi m bi u hi n t m th i.ệ ể ệ ạ ờ

Hình 3.2. K t qu  thi t k  vector pCB301 35S­m­Histag­Cmyc­100xELP ế ả ế ế  (A): Vector 

chuy n gen pCB301 tái t  h p để ổ ợ ượ ắ ằc c t b ng HindIII; (B): Vector pCB301 tái t  h pổ ợ  

c t   b ng  ắ ằ NcoI;   (C):   S   đ   vơ ồ ector  pCB301   mang  cassette  35S­m­Histag­Cmyc­

100xELP đ o chi u v i cassete Nos pro­ả ề ớ nptIII­Nos ter. 

Vector   chuy n   gen   pCB301   35S­ể m­Histag­Cmyc­100xELP   được   bi n   n p   vàoế ạ  

ch ng ủ A. tumefaciens C58C1. K t qu  đã t o thành công ch ng ế ả ạ ủ A. tumefaciens C58C1 

mang vector chuy n gen pCB301 35S­ể m­Histag­Cmyc­100xELP. 

3.1.2. Vector chuy n gen mã hoá kháng nguyên GP5 ể ­ELP

K t qu  đế ả ược ki m tra b ng k  thu t colony­PCR và b ng c t enzyme gi i h n choể ằ ỹ ậ ằ ắ ớ ạ  

th y đã t o thành công pRTRA 35S­ấ ạ gp5opt­Histag­Cmyc­100xELP (Hình 3.3).

3.1.2.2. Thi t k  vector pCB301  ế ế 35S­gp5opt­Histag­Cmyc­100xELP

K t qu  đã thi t k  thành côngế ả ế ế  vector pCB301có cassette gen 35S­gp5opt­Histag­

Cmyc­100xELP đ o chi u so v i cassette gen NOS pro­ả ề ớ nptIII­NOS ter (Hình 3.4).

Hình 3.4  K t qu  thi t k  vector chuy n gen pCB301 35S­gp5opt­Histag­Cmyc­ ế ả ế ế ể 100xELP.  (A): Vector chuy n gen pCB301 tái t  h p để ổ ợ ược c t b ng  ắ ằ HindIII;  (B): 

Vector pCB301 tái t  h p c t b ng  ổ ợ ắ ằ NcoI; (C): S  đ  vơ ồ ector  pCB301 mang  cassette 

35S­gp5opt­Histag­Cmyc­100xELP đ o chi u. ả ề

Đã t o đạ ược ch ng  ủ A. tumefaciens  C58C1 mang  vector pCB301  35S­gp5opt­

Histag­Cmyc­100xELP. K t qu  đế ả ược ki m tra b ng ể ằ k  thu t Colony – PCR.ỹ ậ

3.1.3. Vector chuy n gen mã hoá h n h p kháng nguyên  ể ỗ ợ GP5ectoM­ELP

3.1.3.1. T o vector pRTRA 35S­ạ  gp5ecto­m­Histag­Cmyc­100xELP

Đo n gen ạ gp5ecto (192 bp) mã hóa cho m t đo n protein GP5 vùng ngo i bàoộ ạ ạ  

(GP5 ectodomain) và gen m (528 bp) mã hóa protein M được khu ch đ i đ n lế ạ ơ ẻ 

b ng ph n  ng PCR v i c p m i đ c hi u tằ ả ứ ớ ặ ồ ặ ệ ương  ng. S n ph m PCR nhân genứ ả ẩ