Nhập môn công nghệ sinh học phần 2

M Ở ĐẦUứng dụng đạt nhiều thành công nổi bật của công nghệ sinh học thực vật + Kỹ thuật thuật vô trùng các bộ phân tách rời của TV  Nhân giống in vitro thành công nhiều loài cây trồng

CHƯƠNG 4 CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THỰC VẬT

Viện Công nghệ sinh học

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam ĐT: 091 534 3660; 02 4 379 11059;

Email: ddhong60vn@yahoo.com ; ddhong@ibt.ac.vn ; ddhong@tlu.edu.vn

TLU, 3.2020

N ỘI DUNG

I M Ở ĐẦU

ứng dụng đạt nhiều thành công nổi bật của công nghệ sinh học thực vật

+ Kỹ thuật thuật vô trùng các bộ phân tách rời của TV

 Nhân giống in vitro thành công nhiều loài cây trồng

có giá trị mà phương thức nhân giống truyền thống

gặp nhiều khó khăn

+ Nhiều kỹ thuật đã áp dụng thành công:

+Nuôi cấy đơn bội (1n) để tạo dòng thuần chủng cho phục tráng giống cây trồng;

+ Dung nạp protoplast giúp mở rộng nguồn gen tạo tính trạng mới;

+ Chọn dòng biến dị soma và biến dị giao tử có khả năng chống chịu với đ/kiện môi trường bất lợi, sản xuất cây sạch bệnh virus từ những các thể nhiễm virus

I M Ở ĐẦU

 Biến nạp và biểu hiện các gen ngoại lai trong tế bào TV

+ Biến đổi di truyền ở TV bằng cách đưa DNA ngoại lại vào trong tế bào là một quá trình phức tạp nhờ có: (1) RE; (2)

kỹ thuật lai phân tử và gen chỉ thị; (3) Thiết kế vector biểu hiện cao; (4) Xây dựng kỹ thuật chuyển gen hiện đại…

+ Thành công không chỉ ở mức tế bào mà còn ở mức độ

cơ thể hoàn chỉnh, truyền lại cho thế hệ sau

 Chuyển các gen quan trọng có giá trị kinh tế vào thực vật nhờ biến nạp và tải nạp để cải thiện phẩm chất cây trồng

 Nuôi cấy dịch huyền phù thực vật thành công trong bioreactor để khai các hợp chất tự nhiên

có giá trị sinh học cao (SX protein ngoại lai để điều trị bệnh ở

TV có ưu điểm các chất nhiễm bẩn và virus TV không phải là tác nhân gây bệnh cho người so với protein có nguồn gốc từ tế bào động vật)

L ỊCH SỬ PHÁT TRIỂN

• 1902 – 1930: Thử nghiệm ban đầu

• 1934 – 1954:

- Nuôi thành công tế bào cà rốt (Gautheret, 1937);

- Phát hiện vitamine, auxin và cytokinin

• 1957 – 1992 :

- Tách và nuôi tế bào đơn;

- Vai trò auxin/cytokinin;

- Tạo protoplast và tái sinh cây;

- Tạo cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn;

• Sản xuất quy mô lớn và trên diện rộng

 Nuôi cấy mô (tissue culture) là thuật ngữ dùng để chỉ quá trình nuôi cấy vô trùng in vitro các bộ phận tách rời khác nhau của thực vật (MĐ: nhân giống và cải thiện di truyền,SX sinh khối các sản phẩm hóa sinh, bệnh học TV, duy tì bảo quản nguồn gen quý= Các hoạt động của CNSH TV)

 Thuật ngữ nhân giống in vitro (in vitro propagation) hay còn gọi là vi nhân giống (micropropagation) được sử dụng đặc

biệt cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau của thực vật có kích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện vô trùng trong các ống nghiệm hoặc trong các loại bình nuôi cấy khác

CƠ SỞ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ- TẾ BÀO

- Tế bào bất kì của cơ thể

sinh vật nào cũng mang toàn bộ lƣợng thông tin

di truyền cần thiết và

đủ của sinh vật đó, khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành cá thể hoàn chỉnh

Tùy từng tế bào, từng loại mô, từng thời kì sinh trưởng, phát triển

mà các gen phù hợp hoạt động; các gen không cùng hoạt động như nhau trong các giai đoạn phát triển của cơ thể (do cơ chế điều hòa hoạt động của gen)

 SỰ PHÂN CHIA, PHÂN HOÁ, PHẢN PHÂN HOÁ CỦA CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ-TẾ BÀO

 Phân hóa: 1 tế bào,1khối tế bàophân hóa tạo

mô cơ quan hệ cơ quan

 Phản phân hóa: khi các tế bào đã phân hóa thành các mô chức năng riêng biệt nhƣng vẫn

có thể quay về trạng thái chức năng phôi sinh ban đầu khi gặp điều kiện thuận lợi

NHỮNG ƢU THẾ CỦA NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO

Micropropagation

- Hệ số nhân giống cao, chủ động

- Giữ nguyên đặc tính cây mẹ

 Các thuật ngữ trong quá trình nhân giống

 Nuôi cấy đỉnh phân sinh (merstem – tip culture): PP nhân giống bằng cách dùng các phần rất nhỏ của đỉnh chồi (shoot –tip) bao gồm mô phân sinh đỉnh riêng rẽ (single apical meristem) và mầm lá non (young leaf primordia) để kéo dài chồi (shoot elongation) ngay sau đó  lần đầu tiên dùng để làm sạch virus (virus free) ở TV 

nếu ko thể sống và tạo rễ một cách độc lập thì thay thế bằng phương thức vi ghép (micrografting)  nhân giống thành công cây 1 lá mầm (hoa lan, dứa, huệ và chuối… hoặc cây 2 lá mầm (khoai tây, cà chua và cúc…)

 Sinh sản chồi nách (axillary shoot proliferation) : Sử dụng chồi ở các điểm sinh trưởng bên và ngọn – nơi mà sự kéo dài của chồi tận cùng (elongation of termination shoot) bị kìm hãm và sự sinh sản chồi nách được đẩy mạnh cho

phép nhân nhanh các chồi in vitro (mcroshoots), là các chồi có thể tách ra và tạo rễ in

vitro để hình thành cây trong ống nghiệm (microplants ), hoặc cắt nó ra riêng biệt để

tạo thành các cành giâm in vitro (microcuttings) để tạo rễ bên ngoài in vitro (thành

công ở cây hai lá mầm như cúc, cà chua, thuốc lá…)

 Tạo chồi bất định (adventitious shoot induction): cho phép hình thành các chồi bất định hoặc trực tiếp trên mẫu vật hoặc gián tiếp từ mô callus được hình thành trên bề mặt vết cắt của mẫu vật Yêu cầu của hệ thống này tương tự với nuôi cấy mô phân sinh đỉnh; chỉ khác về nguồn mẫu vật và nguồn gốc bất định của các chồi mới Một số mẫu vật được dùng như: đoạn thân (thuốc lá, cam, chanh, cà chua, bắp cải); mảnh lá (thuốc lá, cà chua, bắp cải, cà phê, ca cao); cuống lá (thủy tiên), các bộ phận của hoa (súp lơ, lúa mỳ, thuốc lá), nhánh củ (họ hành, họ lay ơn, họ thủy tiên), đoạn mầm (măng tây…)

 Phát sinh cơ quan (organogenesis): để mô tả quá trình tái sinh chồi hoặc/và rễ bất định từ các khối tế bào callus; quá trình xảy ra sau thời điểm mẫu vật được đặt vào MT nuôi cấy và bắt đầu cảm ứng tạo

callus Đối với nhân giống in vitro: nhân được cây khá đồng nhất về mặt di truyền; nhiều trường hợp mô nuôi cấy ko tái sinh được cây ngay mà tạo khối callus  cấy chuyển nhiều lần sẽ ko ổn định về mặt

di truyển  để tránh việc nêu trên nên dùng callus vừa phân sinh

 Phát sinh phôi vô tính (somatic embryogenesis): dùng cho sự phát

triển của các phôi hoàn chỉnh từ các tế bào sinh dưỡng được sản xuất

từ các nguồn mẫu vật khác nhau sinh trưởng trong nuôi cấy in vitro

Thuật ngữ tương đương với sự phát triển phôi ở TV sinh trưởng trong điều kiện tự nhiên là phát sinh phôi hữu tính (zygotic

embryohenesis) và phát sinh phôi vô tính (apomitic embryogenesis)

Phôi vô tính có cấu trúc tương tự phôi hữu tính của TV sinh trưởng

trong ĐK tự nhiên Điểm khác nhau cơ bản : Phôi HT luôn đi kèm với

nội nhũ (cơ quan dự trữ năng lượng và chất dinh dưỡng phục vụ cho quá trình nẩy mầm) còn phôi VT : hoàn toàn ko có nội nhũ

Phương thức tạo phôi vô tính có hiệu quả cao trong SX hạt nhân tạo (synthetic seed)

1.2 NHÂN GIỐNG IN VITRO VÀ CÁC HỆ THỐNG NUÔI CẤY MÔ

1.2.1.Tái sinh cây mới từ các cấu trúc sinh dưỡng

a/ Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh hay đỉnh phân sinh

- Phương thức này sử dụng các bộ phận nhỏ nhất của đỉnh chồi hay đỉnh sinh trưởng (apex) làm mẫu vật nuôi cấy Nó bao gồm mô phân sinh đỉnh và các mầm

lá non

- Kích thước mẫu: 0,1- 0,15 mm tính từ chóp sinh trưởng

- Các thực vật phổ biến nhất sử dụng phương pháp này: phong lan, dứa, mía, chuối…

 Xét về nguồn gốc của các cây đó có ba khả năng:

- Cây phát triển từ chồi đỉnh (chồi ngọn);

- Cây phát triển từ chồi nách phá ngủ;

- Cây phát triển từ chồi mới phát sinh

Hoa lan  thành công đem lại hiệu quả cao; Gần đây: cây ăn quả và cây lâm nghiệp (cà phê, táo, lê; thông, bồ đề….) trên 30 chi khác/n

đã đƣợc nuôi cấy thành công

 Ghép đỉnh chồi (shoot apex grafting) hay vi ghép

b/ Nuôi cấy chồi bất định (adventitious shoot

culture)

Giống với nuôi cấy mô phân sinh đỉnh, chỉ khác

về nguồn mẫu vật và nguồn gốc bất định của

- Cuống lá : thủy tiên…

- Các bộ phận của hoa : súp lơ, lúa mỳ, thuốc lá…

- Nhánh củ : họ hành, họ lay ơn, họ thủy tiên…

- Đoạn mầm : măng tây

S Ự PHÁT SINH CHỒI

2.2 NHÂN GIỐNG THÔNG QUA GIAI ĐOẠN CALLUS

 T rong nhiều trường hợp mô nuôi cấy không tái sinh cây ngay mà phát triển thành khối callus

 Tế bào callus khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không

ổn định về mặt di truyền

 Cần  sử dụng loại callus vừa phát sinh  thu cây tái sinh đồng nhất

2.3 NHÂN GIỐNG THÔNG QUA PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH - CÔNG NGHỆ HẠT NHÂN TẠO

CÁC HÌNH DẠNG PHÔI VÔ TÍNH

HÌNH CẦU, HÌNH TRÁI TIM, HÌNH CÁ ĐUỐI

N UÔI CẤY PHÔI SOMA

Các tế bào tiền phôi có khả năng biệt hóa nhưng sự phát triển của chúng có thể bị ngăn cản do mất cân bằng của các chất trong môi trường nuôi cấy Sự hình thành các cụm phát triển phôi và sự kết dính phôi có thể xảy ra nếu những môi trường có nồng độ auxin cao sau khi tế bào đã biệt hóa

Hai loại môi trường được sử dụng:

+ Môi trường có auxin : tạo các tế bào có khả năng phát sinh phôi

+ Môi trường không có auxin hoặc có với nồng độ thấp : môi trường cho những tế bào phát triển thành phôi

Hạt nhân tạo

Trạng thái phát triển của phôi

vô tính đƣợc duy trì ở nhiệt

C ÁC BƯỚC CƠ BẢN TẠO HẠT NHÂN TẠO

- Nuôi và nhân tế bào trong dịch lỏng;

2.3.3 NHÂN GIỐNG TRONG CÁC NỒI PHẢN ỨNG SINH

HỌC

là bình lên men ( fermenter ) chủ yếu đƣợc dùng cho công nghệ vi sinh;

 Vận hành theo nguyên tắc của bình lên men;

Các phương thức tạo cây hoàn chỉnh in vitro

3 CÁC GIAI ĐOẠN TRONG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG

VÔ TÍNH IN VITRO

Quy trình nhân giống vô tính in vitro

đƣợc thực hiện theo ba (hoặc bốn) giai đoạn tùy theo tác giả

G IAI ĐOẠN CẤY GÂY

G IAI ĐOẠN CẤY GÂY Một số dạng môi trường dinh dưỡng phổ biến:

- Muối khoáng : Theo White (1943), Heller (1953), Murashige và Skoog (1962) (Bảng 4.2)

- Chất hữu cơ:

+ Đường saccharose 1-6 %

+ Vitamin : B1, B6, myo-inositol, nicotinic acid

+ Amino acid: Arg, Asp, Asp-NH2, Glu, Glu-NH2, Tyr

+ Phytohormone:

Nhóm auxin: IAA, IBA, NAA, 2,4-D…

Nhóm cytokinin : BAP, kinetin, 2-iP, zeatin

Nhóm gibberellin : GA3

3.2 G IAI ĐOẠN II- NHÂN NHANH

Ở giai đoạn này  kích thích tạo cơ quan phụ hoặc các cấu trúc khác mà từ đó cây hoàn chỉnh có thể phát sinh

Những khả năng tạo cây đó là:

- Phát triển chồi nách;

- Tạo đỉnh sinh trưởng mới

3.2 G IAI ĐOẠN II- NHÂN NHANH

3.3 G IAI ĐOẠN III- CHUẨN BỊ VÀ ĐƯA RA NGOÀI

ĐẤT

 Đây là giai đoạn quan trọng bao gồm việc tạo rễ, huấn luyện thích nghi với thay đổi nhiệt độ, độ ẩm, sự mất nước, sâu bệnh và chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng hoàn toàn

 Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2-3 tuần, trong thời gian này cây phải được chăm sóc và bảo bệ trước những yếu tố bất lợi sau:

- Mất nước nhanh làm cho cây bị héo khô

- Nhiễm vi khuẩn và nấm gây nên hiện tượng thối nhũn

- Cháy lá do nắng

4 NHÂN GIỐNG IN VITRO VÀ VIỆC SỬ DỤNG GIỐNG

ƢU THẾ LAI

 Là biện phát tăng năng suất bậc nhất

 Các đối tƣợng nhƣ: ngô, cà chua, lúa, cải dầu, bắp cải, hành tây, măng tây, và đặc biệt là các giống hoa…

 Giúp tăng năng suất từ 20-40%

 Con lai đồng đều so với giống bố mẹ

 Nghiên cứu các quy trình nhân giống tối ƣu và cải tiến quy trình

Kiểu hình ưu thế lai khi lai giống ngô B73 x Mo17

Ảnh minh họa về cây ngô và bắp ngô của giống B73 (trái),

Mo17 (phải) và con lai ( 3 hàng ở giữa phía trên + 2 bắp ở giữa phía dưới)

5 NHÂN GIỐNG IN VITRO VÀ CÁC ĐẶC ĐIỂM KHÔNG DI

TRUYỀN

5.1 Hiện tượng các đặc điểm epigenetic (ngoại di truyền) được lưu lại

5.2 Hiện tượng các đặc điểm epigenetic không được lưu lại

Cây Phyllanthus amarys

Dứa Cayen

- Mô phân sinh của cành khác

mô phân sinh của thân

- Khi nhân giống vô tính các

bộ phận khác nhau sẽ thu

được các dạng cây khác nhau

Khi gieo hạt hoặc nuôi cấy phôi vô tính từ mô phôi tâm

sẽ thu được những

cá thể có gai

 Lịch sử phát triển công nghệ chuyển gen thực vật

Năm 1980, lần đầu tiên DNA ngoại lai (transposon Tn7) được

chuyển vào thực vật nhờ VK đất Agrobacterium tumefaciens

Tuy nhiên, T-DNA (Ti-plasmid của VK đất) vẫn chưa được

thay đổi

Năm 1983, nhiều nhóm nghiên cứu đã biến đổi T-DNA và

đưa DNA ngoại lai vào, tạo ra tính kháng một số chất kháng sinh

Năm 1984 , biến nạp bằng tế bào trần (protoplast) ở ngô được thực hiện nhờ polyethylene glycol (PEG) hoặc xung điện (electroporation)

Năm 1986 , tạo được thực vật kháng virus

Năm 1987, phương pháp biến nạp phi sinh học được

sử dụng 43

THỰC VẬT

 Chuyển gen là kỹ thuật sử dụng DNA ngoại

lai (tinh khiết) để đƣa vào cơ thể hoặc tế bào khác và theo dõi sự biểu hiện của thông tin di truyền mới này

 Mặc dù thực vật có chứa 3 bộ gen: nhân, ty

thể, lạp thể, nhƣng đa số các nghiên cứu chuyển gen đều thực hiện với bộ gen của nhân, chỉ một số ít thực hiện trên bộ gen ty thể hoặc lạp thể

đối với nông nghiệp và môi trường

Tăng thu nhập, giảm đói nghèo ở các nước đang phát triển

Cho phép các nhà tạo giống thực vật đưa ra giống mới nhanh hơn và vượt

truyền thống

GIỚI THIỆU CHUNG VỀ THỰC VẬT

CHUYỂN GEN

CÁC ĐIỀU KIỆN CẦN CHO CHUYỂN

GEN Ở THỰC VẬT

 Muốn đưa 1 gen vào tế bào thực vật, trước tiên nó

phải được gắn vào 1 vector Đặc tính của 1 vector cần có:

+ Kích thước của vector càng nhỏ càng tốt

+ Có khả năng tái bản + Cho phép pháp hiện dễ dàng, được mã hóa bởi các gen chỉ thị chọn lọc

+ Chứa ít nhất một vị trí nhận biết của enzyme giới hạn để dùng làm vị trí ghép ADN trong tạo thể tái tổ hợp

+ Đưa một hoặc vài gen ngoại lai vào thực vật Các gen ngoại lai này phải được truyền thông qua dòng mầm Vì vậy, mọi tế bào kể cả tế bào mầm sinh sản đều chứa vật chất di truyền đã được sửa đổi như nhau

Một số điểm cần lưu ý khi chuyển gen :

Không phải tất cả các tế bào đều thể hiện tính toàn năng

Các cây khác nhau có phản ứng không giống nhau với sự xâm nhập của một gen ngoại lai

tế bào có khả năng tái sinh và khả năng thu nhận gen biến nạp vào genome

nạp và tái sinh cây

1 Tách DNA plasmid và DNA

tế bào cho nhờ enzym cắt

2 Trộn chung DNA plasmid

với đoạn DNA TB cho, thêm

enzym nối ligaza tạo DNA

tái tổ hợp hoàn chỉnh

3 Biến nạp DNA tái tổ hợp

vào tế bào nhận (VK E coli)

4 Chọn lọc và tạo dòng vi

khuẩn mang gen lạ Sau đó,

tạo điều kiện để gen biểu

hiện tạo ra sản phẩm

3 Các bước

 Cản trở lớn nhất của sự tiếp nhận DNA ở thực vật là thành TB => phá vỡ thành TB, để tạo ra

TB trần

 Ở thực vật chuyển gen, sản phẩm cuối cùng thường là một cơ thể biến nạp hoàn toàn

 Phần lớn thực vật được tái sinh dễ dàng bằng nuôi cấy mô TB Tuy nhiên, tái sinh cây một lá mầm như ngũ cốc và các loại cỏ khác cũng gặp một vài khó khăn

 Từ một TB duy nhất người ta có thể tạo ra một cây chuyển gen, trong đó mỗi TB mang DNA ngoại lai và tiếp tục chuyển cho thế hệ sau khi

nở hoa và tạo hạt

C ÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT

 3 1 Chuyển gen gián tiếp

a Chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium

 Vùng vir làm tăng tần số biến nạp

