Cơ sở di truyền học

Tách chương I cũ "Vật chất di truyền" thành 3 chương mới :1 Vật chất di tru yền ; 2 Sao chép ADN ; 3 Đột biến, có sủa đổi v à bổ sung một vài khái niệm ch o nhất quán vói các chưong khác

LÊ ĐÌNH LƯƠNG - PHAN c ự NHÂN

C ơ s ở DI TRUYỀN HỌC

( T á i b íiii lcìn t h ứ s ú n )

NH À X U Ấ T B Ả N G IÁ O D Ụ C

4 (v >(°7 )

GD - 04

L Ò I N Ó I Đ A U

g iai đoạn I và giai đoạn II, của Đại học Quốc g ia Hà Nội S á ch dùng làm giáo trình cho sin h viên c á c trUòng Đại học Tổng họp, Đại học sư phạm và làm tài liệu tham khảo cho sin h viên c á c trường Đại học Nông, Lâm, Ngư nghiệp, Y, Dược và cho c á c ngành liên quan

Phân công biên soạn :

G iáo SƯ Lê Đình Lương biên soạn :

Chưong II - Mã di truyền

Chương III - Di truyền thực khuần thể

Chưong IV- Di truyền vi khuẩn

Chướng V - ADN tái tổ hợp

Chương VI - Di truyền nhiễm s ắ c thể

Chương VII - Di truyền vi nấm

Chương VIII - Di truyền ngoài nhiễm sắ c thể

Chương IX - Di truyền quần thể

Chương XI - Cơ sỏ di truyền của chọn giống

Thuật ngử chuyên dụng

* Giáo SƯ Phan Cự Nhân biên soạn :

Chương I - Vật chất di truyền

Chương X - Di truyền học ngưòi và di truyền y học

Cuốn sách ra mắt bạn đọc, c h ắ c không thể tránh khỏi một số thiếu sót C á c tác già xin chân thành cám ơn những ý kiến đóng góp x â y dựng để lần xu ấ t bản sau cuốn sách dUộc hoàn chinh hơn

Ý kiến đóng góp xin gửi v'ê Nhà xuất bàn G iáo dục 81 T rầ n Hưng Đạo, Hà Nội

C á c tác giá

3

1 Tách chương I cũ "Vật chất di truyền" thành 3 chương mới :

1) Vật chất di tru yền ; 2) Sao chép ADN ; 3) Đột biến, có sủa đổi v à bổ sung một vài khái niệm ch o nhất quán vói các chưong khác và cập nhật

2 T ách phẩn biến d| trong chương "Cơ sở di truyền của chọ n giống" cũ thành một chương "Biến d|" riêng.

3 BỔ sung thêm phần "Cơ ch ế phân bào" vào chương "Di truyền nhiễm sắ c thể'1

vi phẵn này không thể thiểu trong một giáo trình di truyển học ca s ở và dồng thời nó là nền tảng của chương này.

4 Sắp xếp lại chương "Di truyển học người và di truyển y học" cho hợp lý hơn

C ó sửa và bổ su n g đôi chút ở chương này

5 Sửa lại phẩn "Intron và exon" ở chương I cho rõ hơn và cập nhật.

4

CHUONG I

VẬT CHẤT DI TRUYỀN

I A X IT N U C L E IC LÀ VẬT C H A T DI T R U Y Ê N

1 N h ữ n g t iê u c h u ẩ n c ủ a v ậ t c h ấ t di tru y ề n

V ật c h ấ t di trư y é n đóng vai trò trọ n g yếu tro n g hoạt động củ a tế bào và cơ thể,

vì vậy nó phải th ỏ a m ãn nhữ ng tiê u chuẩn cơ bản sau đây :

- P h ải ch ứ a đ ự n g th ông tin ở d ạn g bền vừng cần th iế t cho việc cấu tạo, h o ạ t động

và sin h sản củ a t ế bào

- P h ải được sao chép m ột cách c h ín h xác để thông tin di tru y ể n củ a th ế hệ sau

giống như củ a th ế hệ trước

- T hông tin chứ a đự ng tro n g v ậ t ch át di tru y ền phải được sử d ụng đ ể sinh ra

n h ữ n g phân tử c ẩ n cho cấu trú c v à hoạt động của tế bào

- V ật c h ấ t di tru y ề n phài có k h ả n ân g bị biến đổi

Các a x it nucleic : a x it deoxyribonucleic (ADN) và axit ribonucleic (ARN), đáp ứng

t ấ t cả các tiê u ch u ẩn này

2 C ấ u tr ú c c ủ a a x it n u c le ic

Cà ADN và ARN đều là n h ữ n g p h ân tử polym er lớn m ạch dài gổm nhiều m onom er

nối với n h au , m ỏi m onom er tro n g ADN gọi là nucleotid và tro n g ARN thỉ gọi là ribonucleotid Mỗi nucleotid gốm b a th àn h phán : bazơ nitơ (là dẵn x u ấ t củ a purin

hoặc pyrim idin), đường pentose và nhóm phosphat (h.I—1)

( T

0 '

Hình / - / C áu tr ú c cá c n u d e o lid của A DN v à A R N :

a ) củ a ADN ; b ) cù a ARN

Vị t r í cùa cacbon trê n m ạch vòng của đường pentose được đánh dẫu từ 1 ’đến 5 \

Các nucleotid m an g nhóm p h o sp h at ỏ cacbon 5’ c ó tẩ m q u an trọ n g đặc biệt đói với cấu trú c và chức n ăn g củ a ADN v à ARN

5

0

-0 — p = 00

0 — p = 0

0

Các hợp p h ẩn chù yếu của ADN là bổn deoxyribom icleotid, chúng khác n h au vé loại

bazơ n itơ có tro n g th à n h phẩn của chúng Bón loại bazơ n itơ đò là a denin (A)y g u a n in (G) (dẫn x u ấ t của p u rin ) và ty m in (T), cytosin (C) (d ẫn x u ẫ t của pyrim idin) Tương

tự như ADN, ARN cũ n g m an g các bazơ nitơ adenin, g u a n in và cytosin, n h ư n g thay

tym in b ằ n g uracil (U ) m ộ t bazơ có các tính ch ấ t hóa học v à v ật lý tư ơ ng tự như

tym in Các bazơ đ ín h với đường pentose bằng mối liên k ết đồng hóa trị giữ a cacbon1’ củ a đư ờng và n itơ ở vị trí 9 cù a p u rin hoặc nitơ ở vị t r í 1 củ a pyrim ỉdỉn M ột khác

b iệt nữ a giữ a ADN v à ARN là ờ đường pentose

P entose tro n g ADN là 2 - deoxy - D -ribose, còn

tro n g ARN là ribose Do khác b iệt này m à hai

loại ax it nucleic có nhữ ng tín h ch ất hóa học

khác n h a u r ấ t quan trọ n g vé m ặ t sin h học Chẳng

hạn, có th ể d ùng n h ữ n g enzym đăc hiệu đối với

ADN hoặc ARN đ ể tách biệt hai loại phân từ

này tro n g phòng th í nghiệm

T ro n g ADN cũ n g như ARN các nucleotid nổi

với n h au qua các n hóm phosphat và pentose tạo

th à n h bộ k h u n g gổm h ai nhóm này luân phiên

nhau Các bazơ nàm ngoài bộ khung này (h 1-2)

P h â n tử a x it nucleic m an g tín h phân cực : đưòng

pentose ở m ộ t đấu của nó m ang nhóm phosphoryl

hoặc hyđroxyl ở vị trí 5 ' (đẫu 5 ’) con đường

ở đ ẩ u k ia lại m a n g nhóm hyđroxyl ỏ vị trí 3*

(đấu 3*).

CH U Ố I XOẮN K ÉP ADN

N ăm 1953 J D W atson và F.H c Crick

đ ã đư a r a m ột mô hlnh m à ở đó ADN có dạng

m ột chuỗi gốm hai sợi xoán phải dự a trên các

d ẫ n liệu sau :

1 P h á n tử ADN gốm các bazơ nitơ, đường,

các n hóm p h o sp h at nối với n h au th à n h chuỗi

polynucleotid như đ ã nói đến ở trê n

2 C ác số liệu nghiên cứu th ủ y phân ADN của

E C h a rg a ff đ ã cho th ấ y số lượng các purin bao

giờ củng b à n g các pyrim ỉdỉn, đặc b iệt là luôn

luôn A = T và G = c N hư vậy, bao giờ cũng

tổ n tạ i công th ứ c : A + G = c + T, nghỉa là

A + G/ c + T = 1 ; A + T/ G + c khác 1 tro n g

p h ần lớn trư ờ n g hợp A + T / G 4* c gọi là tỳ

$ố bazơ và th ư ờ n g được biểu diễn b àn g p h ân

trâ m các bazơ G và c Tỷ số này r ấ t khác nhau

ở các sin h v ật khác n h au như ng ở m ỗi loài thì

lại là m ộ t h ằn g số

3 N h ữ n g k ết q u ả phân tích các sợi ADN b àn g

n h iễu x ạ tia X củ a R F ra n k lin và M H F

W ilkins đ ã cho th ấ y ADN là m ộ t cấu trú c xoán

gồm hai hay n h iều sợi cuốn q u an h nhau

c tronqchuôi phộtphát

J <z s tc r

Hình 1 -3 Mô h ìn h A D N cù a VVatson - C rick : a) Mỏ

h in h p hân lủ củ a chuỏi x oắn k ép A D N , b ) Srt đ ổ chuỗi

x oắn k ép A D N ; c) Sd đ ố c ắ t ngang m ộ i sợi cúa chuổi

n h ìn d ọ c th e o Irụ c tru n g tAn* : khung d ư ò n g - phosphai

ỏ p h ía ngoài, c á c bazrt ỏ ph ía trong.

W atson và Crick đ ẵ phối hợp t ấ t cả các số liệu hóa học v à v ật lý nói trê n tro n g

m ột cẫu trú c hài hòa phù hợp với t ấ t cả các số liệu v à đống thời m an g đáy đủ các đặc tín h m à vật c h ấ t di tru y ễ n cẵn phài cố Mô hỉnh ADN của W atson - C rick gồm

hai chuỗi polynucleotid cuốn quanh n h au tạo nên chuỗi xoán kép ịh 1-3) H a i chuỗi

gắn với n h a u bởi các mối liên k ết hydro giữa các bazơ Còn bộ k h u n g đường - phosphat thì nằm phía ngoài của chuỗi xoắn Mô hình cho thấy mỗi vòng cùa chuỗi xoán gốm mười

cặp bazơ và chiểu dài của nó là 3,4nm vi khoảng cách giữa hai cặp bazơ lân cận là 0,34nm Đặc điểm quan trọ n g n h ấ t của mô hình là sự kết đôi đặc th ù giữa các bazơ Chi

những cặp bazơ tương hợp A - T và G - c, mới có th ể tạo nên các mối liên k ết bến tro n g cấu trú c của chuỗi xoán kép Kết quả là hai sợi đơn trong chuỗi xoán kép tương

hợp với nhau Tính ch ấ t tuơng hợp đặc thù này trong việc kết cặp các bazơ cổ tẩ m quan

trọ n g đặc biệt đối với nhiểu chức náng của ADN như sao chép, phiên m ã và dịch mã Một đậc tín h quan trọ n g nữ a của mô hình là hai sợi của chuỗi xoắn kép phân cực ngược nhau : đẫu 3’ của m ột sợi nầm cùng phía với đáu 5’ của sợi kia và ngược lại

CẤC DẠNG ADN KHẤC NHAU

Mô hình ADN của W atson và Crick là chuỗi kép xoán phải gọi là dạng By d ạn g phổ biến n h ấ t (h 1—4), có 10 cập bazơ tro n g m ột vòng xoắn và các cặp này nằm th ẳ n g

góc với trụ c của chuỗi xoán

Hình Ị - 4 M ổ hìn h cả c d ạ n g A I)N kh ác nhau.

1'rong m ỗi trường hợp là m ộl đ o ạ n A D N c ó chiéu dãi 20 c ặ p ba/.íi P hía dưói là c á c h ĩnh n hìn d ọ c th e o irụ c chuối xoắn C ác đUrtng x oắn nél lié n là khung liưòng -p h o s p h íii c ò n cá c đuíin ngíin líi vị trí cá c c ặ p bazti.8

Các d ạ n g ADN khác khác với dạng B vẽ chiéu xoán của chuỗi, về khoảng cách và

độ n g h iên g củ a các cặp bazơ Dạng z (zigzag) có bộ khung xoắn Irái, mỗi vòng xoán

m an g 12 cặp bazơ và chúng được bố trí ờ phía ngoài của trụ c chuỗi xoắn (h 1-4).

D ạng ADN n à y thấy có ô m ột số nhiễm sác th ể nhân chuẩn và tro n g m ột số đoạn ADN m à chức n ãn g cúa gen chịu sự điéu hòa Trong th í nghiệm người ta đ à chuyển được d ạ n g B san g z và ngược lại Ngoài ra, còn có nhửng dạng ADN khác có chuỗi

kép xoắn phải A, c và D (h 1-4) Mỗi vòng xoắn m ang 11 cặp bazơ ở d ạn g A, 7,9

-9,6 cặp ở d ạ n g c và 8 cặp ỏ dạng D- ở dọn g A các cập bazơ được bố t r í ở phỉa ngoài của chuỗi xoắn ịh 1-4, p hần dưới) và nghiêng m ột góc 19[> so với trụ c chuỗi xoán ơ

d ạ n g c các cập bazơ nằm tập tru n g ở giừa chuỗi xoán giông n h u ở dan g B y nhưng

n ghiêng m ộ t góc với trụ c chuỗi xoán giống d ạn g A tuy góc này nhò hơn ADN dạng

D có th iế t diện không phải là vòng trò n như các dạn g A, B, c m à là hình bát giác

ik ỉ- 4 , p h à n dưới) Các cặp bazơ của dạng này bố trí ở phần giữa chuỗi xoán và củng

nghiêng m ộ t góc với trụ c chuỗi xoán

3 B ằ n g c h ứ n g v ê v ai trò m a n g th ô n g tin di tru yền củ a a x it n u c le ic

Có r ấ t n h iều bằng chứng chứng tò m ột cách chác chắn axit nucleic là vật ch ất di truyền, ỏ đây chi nêu lên ba thí dụ :

a) Axit nucleic háp th ụ tia từ ngoại cực đại ở bước sóng 260/i/n và điéu này phù hợp m ột cách chính xác với bước sóng m à tia tử ngoại có thể gây đột biến tối đ a à

các tế bào T ro n g khi đó độ hấp th ụ cực đại cùa protein là ở bước só n g 280nm

b) Năm 1928 F G riffith phát hiện thấy nòi s (khuấn lạc nhản do có vỏ bọc ngoài

tế bào) của vi khuẩn Diplococcus p neum oniae làm chết chuột khi đem tiêm vào chuột

T rong khi đó nòi R (khuần lạc n h ăn do khỏng có vỏ bọc t ế bào) lại không gây hại gi cho chuột Khi tiêm hỗn hợp các vi khuẩn R còn sổng với các vi khuẩn s đã ch ết vỉ

n h iệt vào ch u ộ t th ỉ chuột bị chết và từ m áu của chúng đ ã phân lập được vi khuần s

sông (h I - 5) N hư vậy, có m ột tác n h ân nào đó (sau này gọi là tác n h â n biến nạp)

từ vi k huẩn ch ết đã biến nạp vi khuẩn R th à n h vi k huẩn s Q uá trìn h này gọi là quá trỉn h biến nạp

N ãm 1944 o T Avery, c M Macleod và M M eCarty đã cAứng m in h được rằn g tác n h ân biến nạp là ADN vì nó có khả n ản g biến vi k huẩn R không vò bọc th àn h

vi khuẩn s có vỏ bọc và hiện tượng này chỉ bị m ấ t đi khi xử lý tác n h à n biến nạp tách r a được từ vi khuẩn s bằng deoxyribonuclease - m ột loại enzym phân hủy ADN.c) Nàm 1957 H Fraenkel - C o n rat và B S inger đă công bố th í nghiệm "láp ráp"

v iru t đốm th u ố c lá (VĐT) là v iru t không chứ a ADN, chỉ có lỗi ARN và vỏ protein Chúng có hai d ạn g A v à B Các tá c già đã láp ráp được lõi ARN của d ạn g này với

vỏ protein của d ạn g kia và ngược lại, tạo nên các virư t cổ vỏ và lõi thuộc hai dạng

khác nhau S au đó !ắn lượt đem nhiễm từ n g loại vào lá thuốc lá đ ể gây đốm K ết quả cho thấy t ấ t cả th ế hệ v iru t con phân lập được từ các vết đốm đẻu m ang cà vò protein

và lõi ARN thuộc cùng m ột dạng - dạng của lõi ARN đem nhiễm chứ không phải dạng

của vỏ protein {h 1-6) N hư vậy, th ông tin di tru y ẽ n ở VĐT được chứa đựng tro n g

ARN, chứ không phải tro n g protein

Ngày nay, chúng ta đêu biết ở p h ẩn lớn sinh vật, vật ch ất di tru y ê n là ADN và ở

m ột số ít v iru t nó là ARN

9

Hình ỉ - 5 Thí nghiệm biến n ạp của G riffiih

V ,r u t B

Hình 1 -6 B ằng c h ú n g c h ủ n g lò vật ch ắt di iruyổn củ a vin.1 t đ ồ m th u ố c lá là A R N khỏng phâi p ro le in C ác

p han từ A R N và p ro ie in v ỏ cù a hai nòi v irut k h á c n hau (A và B) đư ợ c tách ra hằng cá c phương p h á p h ó a sình

A R N cùa nòi A sau đ ó đ ư ợ c I rộ n vói p ro tein vỏ củ a nòi R d ẻ lạ o thành v irul h oàn chình c ó khà n ă n g gAy nhiễm Khi cá c v iru t h ỗ n h ộ p này c h o nhiỗm vào lá th u ố c lá thi th ế lìộ v iru i co n cô kiẻu íùnh và kiẻu g en girtng h ệt nòi

A lã nòi g ó p A R N v à o v iru l h ổ n hộp, và khác h ằn nôi B là nòi góp p ro tc in vò Còn khi v im t h ổ n h o p m a n g A R N

củ a kiểu B vã p r o te in kiẻu A Lhì Ihế hệ co n h o à n lo à n lã kiẻu II (T h í nghiệm củ a H P racnkeỉ - O o n ra t và

B Singcr 1957).

II C Ấ U T R Ú C C Ủ A N H IỄ M SA C T H Ể

1 N h iễ m s ắ c t h ể p h a g e

Các phage được n g h iên cứu kỷ n h ấ t về m ặ t di tru y ề n hiện nay là các v iru t xâm

nhiễm vi k h u ẩn E coli gọi là các phage T (/i 1-7) N hiễm sắc th ể cùa chúng là ADN

trấ n m ạch kép, khồng có protein C ả phage T2 và T4 đều có nhiễm sác th ể d ài hơn

hệ gen hoàn ch ỉn h cu a chúng Đó là kết quả của hiện tượng lặp lại dư th ừ a ỏ hai dàu và hiện tư ợ n g đố i chỏ do m ạch vòng, tự a như mỗi phage đễu chứ a n h ữ n g đoạn

ADN có chiều dài b ằ n g n h a u được c á t ra m ộ t cách ngẫu nhiên từ m ộ t vòng tr ò n nhiêmsác th ể lớn

Tách Ưỏ

T h ê h ệ

c o n

N h iê m /ào lá thuÔQ l á

Trong khi đó các phage T lẻ như T3, T5, T7 lại chỉ cđ tihiễni sắc th ể lặp lạ i dư

th ừ a ở hai đầu Có th ể hỉnh dung các kiểu nhiễm sắc th ể khác n h a u này n h ư s ạ u :

Hệ gen hoàn chinh

N hiễm sắc th ể lặp lại dư th ừ a ở hai đáu

Các nhiễm sắc th ể đổi chỗ do m ạch vòng

Các nhiễm sác thể lặp lại dư th ừ a ở h ai đấu và đổi chõ do mạch vòng

B ằng chứng vế sự tổ n tại các kiểu nhiễm sắc

th ể nói trê n ở phage đã thu được tro n g các thỉ

nghiệm xử lý ADN phage bằng enzym giới hạn

2 N h ỉễ m sắ c t h ể vi khuẩn

N hiễm sắc th ể vi khuẩn là nhữ ng phân tử ADN

trấ n , chuỗi kép, m ạch vòng ADN thường đỉnh với

m àn g tế bào ỏ một điểm hoặc m ột số điểm Mặc

dù vi khuẩn khồng có nhân, như ng ADN tập tru n g

ỏ m ột vùng rõ rệ t gọi là vùng nhân, không có m àng

bao bọc Dưới kinh h iể n .vi điện tử ADN có d ạn g

siêu xoắn T ính siêu xoán này chịu sự kiểm soát

ARN, như ng không cô ribosom Ngoài nhiễm sắc

th ể chính, ở vi k h u ẩn còn tháy có m ột loại ADN

khác ờ dạng vòng kép nhỏ gọi là các p la s m id

C hứng được sao chép {tổng hợp) không phụ thuộc

vào nhiễm sắc th ể chính Trong quấn th ể vi khuẩn

tự nhiên ADN plasm id có th ể chiếm tới 1 “ 2%

tố n g số ADN có tro n g tế bào

Bộ nhiễm sấc th ể cúa sinh v ật n h ân chuẩn gọi là kiểu n h â n bao gốm số lượng và

hỉnh d ạn g nhiễm sắc th ể (đặc biệt là vị trí của tâm động), ô động vật, kiểu n h â n ỏ giới tín h đực và cái thư ờng thường khác nhau do cổ các n h iễ m sắc th ề giới tín h X

và Y Đối với các nhiễm sắc th ể thường còn lại th ì kiểu n h â n của t ấ t cả các sin h vật

tro n g cùng loài đều giống nhau N hưng loài khác n h au có kiều n h â n khác n h au K iểu

n h â n của n a m giới ở người nêu trê n A.I-8 : có 46 nhiễm sác th ể gổm 22 cập nhiễm sác th ể thư ờng và h ai nhiễm sắc th ể giới tín h X và Y r ấ t khác n h au T ấ t cả được

p h ân th à n h 7 nhóm từ A đến G dựa theo kịch thước củ a chúng G ần đây , nhờ kỹ

th u ậ t n h u ộ m băng (banding techniques) người ta đã làm hiện lên n h ữ n g vạch nang

(bảng) đ ặc th ù n ằ m dọc theo mỗi nhiễm sắc t.hể, nhờ vậy có th ể dễ d àn g phân biệt được từ n g nhiễm sá c th ể tro n g kiểu nhân

Hình 1 -8 Kiểu n hân c ủ a ngưòí P hía irổ n : cá c nhiếm sắc th ẻ (rong nguyOn phân cù a ngưòí đ à n ông

binh thư ỏng (44 + X Y ) Phía d ư ỏ i : cũng c á c nhicm sắ c th ẻ đ ó nhưng xếp thành từ n g cặ p tương dồng.

13

cđ h isto n ) liên kết với ADN và đổ là tín h đặc trư n g củ a các nhiễm sắc th ể n h ân chuẩn

T ấ t cả các nhiễm sác th ể n h â n chuẩn đễu chứ a n ă m loại p ro te in h isto n khác n h au

đ ín h với ADN tro n g phức hệ ADN - histon gọi là H l , H2A, H 2B , H 3 và H4 (xem bảng dưới)

và ARN Với các chức nống đổ, như người ta dự đoán, số lượng các protein không

h isto n biến động tro n g euốt chu trin h t ế bào, v à r ấ t k h ác n h au ở các tế bào đả được

b iệ t hổa khác n h au, Điéu đò trá i ngược hẳn với các p ro te in h isto n luôn luổn có số

lượng cố định

Sỉgày nay người ta đ ã b iết nhiéu về sự sáp xếp củ a các p ro te in h isto n dọc theo

p h â n tử ADN tro n g khi lại b iết r ấ t ít về mối liên hệ cấu trú c giữ a ADN và các protein

k h ô n g histon

c ) T h ể n h â n (n u c le o s o m e )

N hiễm sác th ể là m ộ t phức hợp được bổ c h ặ t giữ a ADN v à p ro te in Từ lâu người

ta đ ả biết rằ n g ADN tro n g nhiễm sác th ể dài hơn n h iéu so với chiéu dài của nhiễm sấc th ể , chứng tỏ ntí phải được sắp xếp theo m ộ t e á c h nào đổ T rê n thực, tế, trong

c h ấ t nhiễm sắc, ADN được bó c h ặ t và th u gọn lại ít n h ẩ t 100 lẩn Đố là do ADN được cuộn vòng ở nhiéu m ức độ khác n h au Mức đơn g iả n n h á t là ADN cuổn xun g quanh

m ộ t cái lổi gồm các histon đ ể tạo th à n h m ột cấu trú c gọi là th ê n h ả n , và mức phức

tạ p n h ă t là sự cuộn xoắn của các phức hợp ADN - h isto n đ ể tạo n ê n các nhiễm sắc

th ể ở dạng q u an s á t th ấy khi phân bào như tr ê n A I-8 K hĩ q u a n s á t dưới kính hiển

vi đ iện tử th ì phức hợp ADN - p ro te in tro n g n h iễ m sá c th ể ctí d ạ n g sợi đường kính

k h o ản g 10n m Nếu được gỡ rối hoàn to à n thỉ sợi này trô n g g ióng n h ư m ột chuỗi h ạ t

m à m ối h ạ t là m ột th ể n h â n và p h ần sợi m ảnh nổi các h ạ t là ADN t r ẩ n gọĩ là ADN nổi.14

Mổi th ể n h â n riê n g biệt có d ạn g m ộ t khoanh giò đường kính 1 In m , dày 5,7nm gốm lõi protein h isto n th u ộ c các loại H2A, H2B, H3, H4 và sợi ADN đường kính 2n m gốm

146 cập bazơ q u ấ n v òng q u a n h lõi k h o ản g 1 vòng 3/4: Sự liên kết giữa ADN và p ro tein

c h ậ t đến mức ADN có th ể chống lại tá c động của các enzym phân hủy các ADN biệt lập (không liên k ế t với protein)

T rong tế bào, c h ấ t nhiễm sác tổn tạ i ở trạ n g th ái xoắn cao hơn n h iều so với sợi

10nni Mức độ xoắn tiế p th e o m ứ c ỈO nm là sợi nhiễm sác 3ồnni (h I-9 ) Sợi 30n m được hình th à n h từ sợi 10n m dư ờng như b àn g cách áp s á t các th ể n h ân với nhau ờ

ph ấn m ặ t p h ẳn g đ ể tạ o giải bãng xoán kép có đường kính xác định

H iston H I đ ó n g vai trò đặc b iệt quan t.rọng Nó nằm ờ điểm r a - vào th ể nhán cùa ADN C hất n h iễm sác không ch ứ a H I có th ể vẫn tạo nên sợi 10ntĩiy n h ư n g không tạo th à n h được sợi 30n m ; như vậy, H I phải có chức n ân g gán kết các th ể n h ả n lại với nhau để tạo n ê n các sợi 30n m ]ợ/ flfiịfỉrr

Hình 1 - 9 G ác m ílc d ộ cuộn x oắn cù a chuẢi các th ẻ n h â n : hăng zigzag d án lh ô n g qua

bãng zigzag c o ly n (hãnh h áng x oắn kép.

**

Sự h iểu b iết củ a khoa học vé m ức độ bố trí c h ấ t nhiễm sắc tiếp sau m ức sợi 30nm

hiện nay còn r ấ t ít Đ ường kính củ a nhiễm sấc th ể pha nghỉ cố th ể là 300nm , còn đường kính củ a n h iễm sắc th ể p h a giữ a cổ th ể khoàng 700nm Đ ể tạo n ê n các sợi có

kích thước n h ư th ế, giả th u y ế t đơn giản n h ấ t h iện nay là sợi 30nm cuộn xoắn lại nhưdây th ừ n g theo các k iể u khác n h a u đ ể tạo th à n h các nhiễm sác th ể có hình th á i đặc trưng

đ) C hất n g u y ê n n h iế m s á c v à c h ấ t d ị n h iễm s á c

Khi nhiễm € ấc th ể pha nghỉ được nhuộm và đem q u an s á t dưới kính h iể n vi người

ta thấy c h á t nhiễm sắ c p h â n th à n h hai kiểu khác biệt rõ r ệ t vé cáu tạo : m ộ t kiểu

được nhuộm rấ t n h ạ t gội là chát nguyên n h iễm sắc, kiểu kia được nhuộm r ấ t đậm gọi

là chát d ị nhiễm sắc C h ất nguyên nhiễm sác m ang c h ấ t nhiễm sắc ở trạ n g th á i dãn

xoắn, còn ch ất dị nhiễm sắc là trạ n g th á i cuộn xoắn cao cúa c h ấ t nhiễm sắc 0 nhữ ng sin h v ật khác n h au th ì c h ấ t dị nhiễm sắc phân bố khác n h au, có trư ờ n g hợp từ n g

p h ần hoặc to àn bộ nhiễm sắc th ể là ch ất dị nhiễm sác Noi chung n ằm rả i rá c ở d ạn g

n h ữ n g đoạn ngán xen kẽ với ch ất nguyên nhiễm sác và bọc q u an h các tâ m động Về

m ặt chức n â n g ch ấ t nguyên nhiễm sác chứa ADN ở trạ n g th á i h o ạ t động (cố th ể được phiên m ã), còn c h ấ t dị nhiễm sác th ì m an g ADN ở d ạn g không phiên m ã được C hất

dị nhiễm sắc sao chép m uộn hơn ch ất nguyên nhiễm sác tro n g chu trin h t ế bào

e ) C ác tr ìn h tự iặ p lạ i c ủ a ADN

Các th í nghiệm vể biến tín h (d en atu ratio n ) và hòi tín h (re n a tu ra tio n ) ADN ở các

sinh v ậ t khác n h au đ ã cho thấy các nhiễm sắc th ể n h ân sơ h á u như chỉ m an g m ột trìn h tự ADN duy n h ấ t tro n g khi nhiễm sác th ể ò sinh v ật n h â n chuẩn lại có nhiều đoạn lặp lại N hững sin h v ật n h â n ch u ẩn khác n h au có tầ n số các đoạn ADN lặp lại khác nhau Có n h ữ n g đoạn (chiểu dài từ vài cặp đến vài tră m cặp bazơ) có tầ n số ỉặp lại tới h à n g triệu lần tro n g m ột hệ gen Nói chung, n h ữ n g đoạn ADN có tầ n số lặp lạỉ cao th ư ờ n g nằm q u an h tâ m động và ở hai đẵu củ a nhiễm sác th ể , chúng được sao chép m uộn hơn các đoạn ADN khác và không được phiên m ả T rong khi các đoạn lặp lại vừa phải (từ vài chục đến vài n g hỉn lẩn) thi được phiên m ã Các gen s ả n r a ARN ribosom , ARN vận chuyển và các histon nằm tro n g các đoạn này

4 C á c y ếu t ố d i tr u y ề n vậ n đ ộ n g (g en n h ảy)

Ngoài các gen chiếm vị trí cố định trê n nhiễm sác th ể , ở các sin h v ật n h â n sơ cũngnhư n h â n chuấn đểu thấy cố sự tổn tạ i của các yếu tố di tru y é n đặc biệt có khả n ăn gvận động từ một vị trí đến các vị tr í khác tro n g hệ gen Các gen di động này được

đ ặ t tê n là các yéu tố di truỷên vận dộn g (transposable genetic elem ents - TGE) C húng

là n h ữ n g đoạn ADN đặc b iệt có khả n à n g xen vào m ột hoặc ưiột số vị trí tro n g hệgen và cũng cố th ể được c á t rời khỏi hệ gen C húng cố th ể tạo n ê n n h ữ n g biến đổi

di tru y é n khi xen vào gen hoặc vào đoạn k ế tiếp với gen và n h ữ n g biến đổi này sẽ

m ấ t đi nếu các TGE rời khỏi vị trí m à chúng đ ã xen vào

Loại TGE đơn giàn n h ấ t là các đoạn xen (insertion sequence -IS ), chúng cẵn th iế t

cho q u á trìn h xen ADN vào nhiễm sác th ể và cho q u á trìn h chuyển TGE từ m ộ t vị trí san g vị t r í khác tro n g hệ gen Cáu trú c của ch ú n g r á t giống n h au ở các sinh v ật khác nhau

Cho đến nay đoạn xen được nghiên cứu kỹ n h ấ t ở m ức p h ân tử là IS1 tìm thấy ở

vi k huẩn E.coli (h I —10) IS1 cò chứ a gen dài 720 cặp bazơ xác định enzym có chức

n ă n g "vận chuyển'1, G en này n ằm giữa hai đoạn lặp lại đáo ngược (inverted re p e a ts-lR ), mỗi đoạn dài 24 cặp bazơ P h ầ n dưới cùa h ìn h 1-10 ỉà m ộ t gen n h ả y (transpo3on-T n) gổm hai đoạn xen n ằ m ở hai đáu của m ột gen khác Ở đây là gen c ủ a E coli đài 552 cặp bazơ xác định độc tố chịu n h iệ t gây bệnh ỉa chày Cả cấu trú c này (gen nhảy) có

th ể vận động như m ộ t đơn vị nguyên vẹn với các đặc điểm n h ư m ộ t đoạn xen và như vậy m an g theo gen n ằ m giữa m ặc dù gen này không có chức n ã n g vận động

trinh Ỉ-ỈO D oạn xcn vá gcn nhày d u nó sinh ra, ISI m;ing gen qui dịn h err/.ym “iransposasc" chuyên trá c h sự

v ận đ ỏ n g cù a nó G e n này n ằm giữi '1 hai d o ạ n lặ p lại ngilỢc chiéu (1R ) liìii 24 c ặ p baxo (BI*)* B én dưỏi iĩi gcn nhày

I n gổm híii y6u tổ iS này ké hai hCn m ột g cn khác, ìí đ ây (.tó là gcn đ ộ c tri cùa M.coỉi.

Cơ chế xen gen nhảy vào nhiễm sác th ể có th ể hình đun g như sau (h I - l l ) : tại

điểm đích (điểm m à gen nhảy sẽ xen vào) trê n nhiễm sắc th ể xảy ra m ộ t v ết cát hỉnh chữ chi (cơ chế c ắ t đặc thù của các enzym giới hạn), gen nhảy xen vào giữa và vết

c ắ t được "hàn” lại theo nguyên tắ c bổ trợ K ết quả là ké với hai đ ẵ u của gen nhảy bao giờ cũng có h ai đoạn lặp cùng chiều (đirect repeats) nàm trê n nhiễm sắc th ể Hiện tượng này p h á t h iện th ấ y tro n g t ấ t cả các trư ờ n g hợp đă nghiên cứu vế trìn h tự các bazo nitơ n ằ m ké hai đáu cùa gen nhảy hoặc đoạn xen khi chúng đã đính vào nhiễm sắc th ề

N gày nay, người ta cho rằn g đoạn xen và gen nhày tổn tạ i m ột cách' phổ biến ỡ

t ấ t cả mọi sin h vật, từ n h ân sơ đến n h ân chuẩn N hững th í dụ nêu trê n là â vi khuẩn

T h ậ t ra, gen nhảy đẩu tiên được p h á t hiện là ở ngô từ n h ữ n g năm 50 tro n g công trin h củ a B M cClintock Bà nghiên cứu m ức độ h ìn h th à n h sác tố đỏ ở h ạ t ngô Bằng

n h ữ n g th í n ghiệm di tru y ế n học kinh đ iể n chính xác tác giả là người đầu tiên đ ã nêulên sự tổn tạ i của gen nháy Do vậy, cùng với n h ữ n g công trin h khác, bà đ ã được giảithư ởng Nobeì nãm 1983

TG E củng được p h á t hiện th á y và nghiên cứu ở nhiêu sinh vật n h â n ch u ẩn khác, đặc b iệt ở n ấ m m en, ruổi giấm v à người Cấu trú c và chức n ăn g của chúng r ấ t giống với các yếu tố này ở sin h vật n h ân sơ C húng cũng cđ khả n ã n g xen vào nhiễm sảc

th ể ớ nhiéu điểm và khi đó cũng gây nên n h ừ n g biến đổi đổi với gen m à nó đính vào

ơ nấm m en Saccharom yces cerevisiae đó là các yếu tố Ty Chẳng hạn T y l cđ chiểudài khoảng 5600 cặp bazơ vớĩ hai đoạn lặp cù n g chiều gọi ià đ e lta nằm ở hai đầu dài

338 cập bazơ và hai đoạn lặp n g án nầm trê n nhiễm sác th ể dài 5 cặp bazơ Trong mỗi tế bào nấm m en có khoảng 35 b ả n sao của T y l M ột số yếu tó vận động tương

tự tháy có ỏ ruổi giấm D rosophila, chẳng h ạ n yếu tố copia dài 5000 cặp bazơ với hai

đoạn lạp cù n g chiểu ở h ai đẩu dài 300 cặp bazơ và hai đoạn lặp ngán trê n nhiễm sắc

th ể dài 5 cập bazơ Ớ người có m ột nhóm các đoạn ADN m a n g n h iêu đoạn lặp và

DẠI HỌC QUỐC GIA HẢ NỘI

Y L - t V ĩlO ị

các đoạn Alu với chiêu dài mỗi đoạn khoàng 30 cặp bazơ P h ẩ n lớn các đoạn Alu đểu

cố m an g ờ hai đ á u các đoạn lặp cùng chiéu, vì vậy r ấ t có th ể chúng là các TGE

N hư vậy, hệ gen không tĩn h n h ư chúng ta hình dun g trư ớ c đây, nó rấ t động vì laôn luôn có những đoạn ADN vận động kháp hệ gen !àm th a y dổ.ị cấu trú c của nó và ảnh hưởng đến h oạt động của gen

I I I C Ấ U T R Ú C E X O N - IN T R O N C Ủ A G E N

Các gen của động v ậ t cố vú, đôi khi cả ở thự c v ậ t bậc cao v à nấm m en có các

đoạn không m ã hóa ax it am in (noncoding sequences) gọi là in tro n phân b iệt với các đoạn m ã hóa (coding sequences) gọi là exon.

CẢ các đoạn in tro n và exon đếu được phiên m ã đ ể tổng hợp ra phân tử tién chát

cùa mARN (p re-m R N A ) v à từ phán từ này, th ông qua quá trìn h gọi là tách ghép

(splicing) có tác d ụ n g c á t đi các in tro n , rổi sau đó nối các exon lại đ ể tổ n g hợp nêncác phân tử mARN d ừ n g cho việc dịch m à diễn r a trẽ n ribosom tro n g tế bào chất.Các in tro n được công bố lá n đầu tiên vào nãm 1977 tại Hội nghị vế C hất nhiễm

sác họp ở P hò n g th í nghiệm Cold S p rin g H arbor Các in tro n này p h á t hiện thấy ở

adenovirut Sau đó tìm th ấ y ở v iru t SV40 và rấ t n h an h sau dó người ta đã thấy sự

tổn tại của các in tro n ở các sinh vật n h ân chuẩn không còn là ngoại lê m à là rấ t

phổ biến

P ierre C ham bon và cộng sự ở Dại học Tổng hợp S trasbourg (Pháp) là m ột tro n g

nhừng người đ á u tiê n p h á t hiện các đoạn in tro n khi nghiên cứu sự điéu hòa di truyén

tro n g sinh tổ n g hợp ov alb u m in -m ộ t prdtein tro n g lòng trá n g trứ n g của gà, có chiéu

dài 386 ax it am in

Người ta tách mARN của gen ovalbum in Sau đó cho phiên m ã ngược, để tạo ra

cADN của nó và đ ả p h á t hiện thấy các phân tử mARN đáu tiên tro n g n h ân là những

phân tử dài hơn mARN bình thư ờng nàm tro n g tế bào chẵt

So sản h ADN củ a gen với cADN tạo ra từ mARN lẵy từ tế bào ch ất và giải trìn h

tự cả 2 loại p h â n tử , tá c giả thấy có các đoạn polynucleotid có tro n g ADN của gen

ban đẩu n h ư n g lại k h ô n g thấy có tro n g cADN được tổ n g hợp từ mARN lấy từ tế bào

ch át Họ còn p h á t hiện thẩy các đoạn polynucleotid nói trê n (intron) không được dịch

m à, chúng n ầ m xen kẽ với các đoạn có m an g thông tin để dịch m ả (exon)

Gen ovalbum in có 7 in tro n xen kẽ giữa 8 exon theo sơ đổ dưới đày :

Exon L là đ o ạn d ẫ n đ á u 5’ cù a mARN tro n g gen ovalbum in

Các exon 1 - 7 m ã h ó a các ax it am ỉn cỏa ovalbum in

In tro n đ ấ u tiê n p h á t hiện th ấ y ở thực v ật là tại gen phaseolin tro n g cây họ đậu

m ang 3 in tro n N đi ch ư n g các gen thực v ậ t bậc cao đéu m an g nhiểu in tro n và exon

N hư ng người ta củ n g th ẫ y không phải t ã t cả các gen n h ân chuẩn đéu m an g intron

Ví dụ, gen h isto n n h ím biển và bồn gen sốc n h iệ t ở D rosophila không m an g in tron

N hiếu gen khác ờ đ ộ n g vật, thực v ật bậc cao cũ n g không m ang intron

Nói chung, các in tro n đ ã được phát hiện, có kích thước r ấ t khác n h a u từ vài cặp

bazơ đến h à n g n g à n cặp bazơ

T rong nhiéu trư ờ n g hợp, mỏi exon m ã hóa m ột chức n à n g xác định tro n g protein Thí dụ, ở các gen globin, exon nàiiì giữa m ã hóa điểm gán hem a 0 nấm men, tro n g gen cytochrom e b, in tro n lại là một phán của exon thuộc các gen m ă hóa các enzym cần th iế t cho quá trìn h phiên mả Ngày nay, người ta tháy rõ rà n g rằ n g in tro n không

p h ả i là các đoạn ADN dư thừa như đã nghỉ trựớc đây C húng đổng vai trò quan trọ n g tro n g quá trìn h b iệt hóa của sinh v ật nhãn chuẩn đa bào, và vi vậy chúng là sàn

p h ẩm của quá trỉn h tiến h ó a Càng nghiên cứu sâu vé chức n à n g của các intron người

t a càng thấy rõ sự tổ n tại của các in tro n là h ết sức cẩn th iế t cho sự h o ạ t động và

b iể u hiện của gen, đặc biệt là ở các sinh v ật bậc cao

CÂU HÒI1) Nêu c á c liê u c h u ẩ n củ a m ột c h ấ t m ang th ô n g tin di truyền.

2) Đ ặc d iế m n à o tr o n g c ấ u trúc ADN d â m b ả o ch o c h ấ t này s a o c h é p chính x á c : S ộ\ ADN m ạch

k é p m âi sin h ra c ó trình tự nucleotiơ giống h ệ t sỢi kép làm khuôn b a n đầu.

3) C á c b ằ n g c h ứ n g sin h h ọ c v à v ậ t lý chứng tỏ AON v à đồi khỉ ARN là v ậ t c h ấ t di truyển.

4) D ặc đ iể m c ấ u trú c ADN cù a p h a g e T4 Hiện tượng lặp lại dư th ừ a ỏ hai đ ẩ u là gì ?

5) Đ ặc d iể r r c ấ u trú c c ủ a c á c g en nhân chuản.

6 ) C á c h s ắ p x ế p AĐN tro n g nhiềm s ắ c th ể n hân chuần.

7) C ấ u trú c v à q u y lu ậ t vận động củ a c á c g e n nhảy.

8 ) Khái niệm v ế c ấ u trú c e x o n - intron c ủ a gen C hức năng cú a in tro n v à ©xon Ý nghĩa củ a c ấ u trú c n à y dối vói c á c sin h v ật nhân chuẩn d a bào.

các ax it nucleic bị p h â n hủy lại có th ể chuyển hóa trở lại th àn h các nucieotid cẩn

th iết cho việc tổ n g hợp a x it nucleic Cà hai cách đếu q u an trọ n g đối với tế bào và mức độ quan trọ n g củ a chúng tùy thuộc vào nhữ ng điễu kiện tổn tạ i cụ th ể của t ế bào

1- S in h tổ n g h ợp p u r in và p y r im id in

Con đường sin h tổ n g hợp purin vể cờ bản là gióng n h a u ở nhiều sinh v ậ t khác

nhau, th í dụ E x o li, n ă m m en và người Cắn trú c m ạch vòng của p u rin được láp ráp

trên đường ribose 5 ’ -p h o sp h a t

Ọ "

1

' 0 — p — 0 — c h 2 h

N hiều hợp c h ấ t được sử dụng đ ể tạo nên vòng p urin, tro n g đó co các ax it am in

H ìn h I I - 1 tổ n g kết nguốn gốc các nguyên từ cấu th à n h vòng purin Sản p h ẩm ban

đầu của quá trin h sin h tổ n g hợp p u rin là ribonucleotid inosin m onophosphat (IMP)

và từ hợp c h ấ t này tạo th à n h các ribonucleotid ad en in và g uanin ịh II “ 2).

21

Nói chung, quá trin h sin h tổ n g hợp các pyrim idin khác với q u á trìn h sinh tổ n g hợp các p u rin ở chỗ vòng pyrim idin được lắp rá p trư ớ c và sau đó mới đ ín h với ribose

5 -p h o sp h at C ác hợp ch ất d ùng để tạo nên vòng pyrim iđin được nêu trê n h II-3 Còn

q u á trỉn h sin h tổng hợp pyrim idin th ỉ được tổ n g k ết trê n h II—4.

Hình / / - / N gu ổn gốc các nguyốn tử cacbon và Hình //- * Ngu ổ n gổc các ngiiyCn tữ cachon

nitcl c ủ a vòng purin V ÍI nilcí cù a võng pyrim idin.

Adenasiỉĩ 5 ‘■ manaptrospha/ Gi/đỉĩữỉtn 5''inơnơfl/rữsj>/w/

Hình Ỉ I - 2 Sinh lô n g hợp p u rin : các n u cleo ù d ad e n in vã guanin sinh ra từ inosin 5’-phosphat.

22

011HN/ C ^ C H

(u m p)

J Phosphã/

(ỉư ATP) ỵ/p h ữ sp /iã / (ỉữ A T P )H

H

r/ốữổớ 5’ -triphữs/i/te/

Ưridi/7 5 '-iriphospha/ (utp)

Hình Ị 1 -4 Sci đ ổ tông q u á t V Ể q u á trìn h sinh lỏng hợp pyrim idin

23

K o rn b erg nhữ ng ch ất cẩn th iế t cho q u á trìn h tổ n g hợp ADN in vitro lằ :

1 Hỗn hợp của tấ t cả bốn deoxyribonucleotid 5 ’- phosphat

2 Các ion Mg2+

3 ADN polym erase tin h sạch chiết x u ã t từ E.colỉ

4 ADN ctí khối lượng p h ân tử cao

T rong n h ữ n g thí nghiệm đ ẩ u tiên K ornberg đã n h ậ n được số lượng ADN lớn gấp

k h o ản g 20 lẩn sổ ADN đưa vào P h ả n ứ ng tiếp diễn cho đốn khi h ế t m ột tro n g các tiễ n ch ất 5 ’ - trip h o sp h at, mộc dù c h ấ t q u an trọ n g đối với p h ản ứ ng là enzym ADN polym erase có tác d ụng hình th à n h các m ổi liên kết phosphodiester 3 ’- 5 ’

Lúc đ ẵ u người ta cho rằ n g ADN khối lượng p h ân tử cao cổ th ể thực hiện hai chức

n ă n g tro n g p h ản ứ ng : m ộ t là làm đ oạn m òi (prim er) n g h ĩa là đống vai trò như đỉnh sin h trư ở ng đ ể bổ su n g các nucleotid mới H ai là đóng vai trò khuôn để tổ n g hợp sợi

ADN mới cổ trin h tự bổ trợ cho các bazơ nitơ T ấ t cả các sổ liệu hiện cổ đéu chứng

tỏ rằ n g ADN này chi thự c hiện chức n ăn g thứ hai

24

3 T ổ n g h ợ p A D N in vivo

a) T h í n g h iệ m c ủ a M e se lso n v à S ta h l

N ăm 1957 J S te n t và M D elbruck đả đư a ra ba k iểu sao chép ADN cđ th ể cò (h II- 6.) Đó là :

ĩ K iểu bảo toàn : chuỗi ADN xoán kép ban đẩu được giừ nguyên tro ng khi chuỗi

xoắn kép mới được hình th àn h ' hoàn toàn từ nguyên liệu mới

2 K iểu n ủ a bảo toàn : chuỗi xoán kép mới gốm m ột sợi đơn cũ của cha m ẹ và m ột

sợi đơn được tổ n g hợp từ nguyên liệu mới

3 K iểu p h ả n tá n : tro n g q u á trin h sao chép, các sợi ADN cũ đ ứ t r a th à n h cácđoạn nhỏ, mỗi đoạn nhò làm khuôn đ ể tổ n g hợp th àn h m ột đoạn nhỏ mới, sau đó các đoạn nhỏ nối lại với n h au Do vậy, sau khi được tố n g hợp, mỗi sợi mới đểu cđ chứa

cả các đoạn ÀDN củ và các đoạn ADN mới

Hình I I - 6 B a c á c h s a o c h é p A D N c ó th ổ c ó : A kiẻu b ào lo à n ; B kiẻu nửa b ả o to à n ;

c kiẻu phân lán

M eselson v à S tahl đ ã chứng m inh chỉ c<5 kiểu n ử a bào toàn là đ úng <II“ 7) Thí

nghiệm đã được tiế n h à n h như sau : vi k h u ắn E.coli được nuôi n h iéu th ế hệ trê n môi

trư ờ n g chi có nguồn n ito duy n h ấ t là l5N H 4Cl đo vậy toàn bộ ADN của nố ch ứ a 15N nặng, khác với ADN binh thường chứa l4N nhẹ H ai loại ADN này cđ th ể tá c h b iệt

b ằn g cách cho ly tâ m tro n g gradien nồng độ của CsCl, v à cho hai vạch tư ơ n g ứng

tro n g ố n g nghiệm : vạch nặng và vạch nhẹ S au đó đư a E.coli ndi trê n vào nuôi ở

môi trư ờ n g chỉ chứa 14N H 4C1 (nhẹ) m ộ t sổ t h ế hệ và sau mỗi th ế hệ đều tá c h ADN

và cho ly tâ m Sau th ế hệ thứ n h ấ t nếu sợi kép AQN hỉnh th àn h sau q u á trìn h tổ n g

hợp chứ a m ộ t sợi n h ẹ và m ột sợi n ặ n g (kiểu n ừ a bào toàn) hoặc cà hai sợi đéu có

n h ữ n g đoạn n g á n n ặ n g và nhẹ (kiểu p h ân tá n ) th ì sau khi ly tâm ta sẽ chỉ cđ m ột vạch tru n g binh Thực t ế th í nghiệm đ à cho thấy đúng như vậy Sau th ế hệ th ứ hai nuôi trê n môi trư ờ n g chứ a 14N nhẹ, các tá c giả đ â n h ậ n được hai vạch : nhẹ v à tru n g bình tro n g ống nghiệm , chứ ng tỏ q u á trìn h tổ n g hợp ADN đ ả diễn ra theo kiểu n ử a bảo

to à n vì nếu theo kiểu phân tá n th ì chỉ cò th ể cố m ộ t vạch giống với vạch tru n g binh

25

Hình II - 7 So đ ồ th í nghiộm cù a M M csclson và r S la h l T h í nghiộm đ â ch ú n g minh

cri ch ế s a o c h é p A D N th e o kìèú nửa b à o toiin.

b) S a o c h é p A D N k iể u n ừ a g iá n đ o ạ n

Vì t ấ t cả các enzym ADN polym erase khi tổ n g hợp ADN đều cấn cò đ ấ u 3 ’- OH

tự do nên cd th ể dễ đ à n g n h ận th ẩ y rằ n g chỉ cố m ột sợi ADN được tổ n g hợp liên tục,

gọi là sợi dẫn đ à u (leading stra n d ) Còn điéu gì xày r a với sợi th ứ hai ?

Bằng cách đánh d ẵu rấ t n h a n h ADN đ an g sao chép (vài giây m ột) b ằn g 3H -th im id in ,

R O kazaki đã chứ ng m in h rà n g p h ẩ n lớn ADN mới được tổ n g hợp là ở d ạ n g những

đoạn n g ắn từ 1000 đến 2000 nucleotid Các đoạn này gọi là các doạ n O kazaki tương

ứ n g với n h ữ n g đoạn ADN n g ắn mới được tổ n g hợp củ a sợi đơn th ứ h a i bổ trợ với sợi đơn th ứ n h ấ t T rên đoạti O kazaki ADN củng được tổ n g hợp theo chiéu 5 '- 3 \ Mỗi đoạn

O kazaki được b át đ ầ u b ằn g m ộ t chuỗi n g án polyribonucleotid (khoảng 10 đơn vị), chuỗi

này được dùn g iàm đoạn m ỗ i để kéo dài tiếp chuỗi polydeoxyribonucleotid (h 11-8)

Sau khi loại bò ARN và lấp đấy khoảng trố n g b ằ n g tá c d ụng c ú a ADN polym erase I

th ì các đoạn được nối lại với n h au b ần g lygase ADN Sợi ADN được tổ n g hợp bầng

cách nói các đoạn O kazaki lại 'với n h au gọi là sợi ra chậm (lagging stra n d ).

Cách sao chép ADN m à ở đó m ộ t sợi mới được tổ n g hợp liên tục dự a trê n khuônsợi cũ theo chiéu 3 ’~5’ v à sợi mới thứ hai được tô n g hợp không liên tụ c d ù n g khuôn

sợi cũ cố định hướng 5’- 3 \ gọi là k iểu sao chép nửa gián đoạn (sem idiscontinuous

replication)

26

c ) C ác e n z y m v à p r o te in th a m g ia v à o sa o c h é p ADN

Q uá trìn h sao chép ADN phức tạp ở E coli đòi hỏi phải cố sự th am gia của nhiều

protein và enzym m à m ột số tro n g đó cũ n g th am gia cả vào các quá trìn h khác như sửa chữa ADN, tá i tổ hợp di truyén Enzym chù yếu cán th iế t cho quá trìn h tổ n g hợp ADN là ADN polym erase

ỏ E.coli có b a loại ADN polym erase Có n h ữ n g khác b iệt đáng k ể giữa các enzym

Cả ba polym erase ,đéu xúc tác việc tổ n g hợp ADN mới theo chiéu 5'-3* N hưng tốc

độ tổng hợp ADN do các enzym khác n h au xúc tá c rấ t khác nhau : Pol III có hoạt tín h cao n h ấ t, còn Pol II có hoạt tín h thấp n h ấ t Đ ổng thời t ấ t cả các enzym này đểư

có h o ạt tín h của các exonuclease (exọnuclease có th ể c á t sợi axit nucleic từ đấu tự do tro n g khi endpnưclease lại c ắ t từ n h ử n g đ iềm nằm bên tro n g cùa sợi) Mỏi enzym đểu

có hoạt tín h exonuclease theo chiều 3*-5' cho nên người ta cho rằn g chúng có th ể cắt

bỏ nhừ ng chuỗi polynucleotid mới được tổ n g hợp và hoạt tín h exonuclease này dường như hoạt động n h ư m ột m áy sửa sai, nó p h á t hiện và c át bỏ nhữ ng bazơ k ết cặp sai

v à giúp cho quá trìn h sao chép chính xác được tiếp tụ c H iện tượng này gọi là đọc sừa (prooíreading) có chức n ăn g đảm bảo cho việc tổ n g hợp ADN diễn r a với độ chính

xác r á t cao

d) C ác c h u ỗ i A D N d ư ợ c b ắ t đ ă u t ổ n g h ợp b à n g d o ạ n m ồi ARN

K hông có enzym nào tro n g sô' ba ADN polym erase của E.coli (và cũng không có

poỉym erase nào được biết tới nay ở các sinh v ậ t nhân sơ và n h ân chuắn) có th ể khởi đầu cho việc tổ n g hợp các sợi ADN mới Thay vào đó, việc khởi đấu tổ n g hợp ADN đòi hỏi phải có m ộ t đoạn mòi n g án đ ể các deoxyribonucleotid đính vào th ô n g qua hoạt động của các ADN polym erase ỏ E.coli đoạn mổi là m ột chuỗi ARN ngán được sinh r a bởi enzym p rima.se T rình tự các bazơ của đoạn mổi được định hướng theo

trìn h tự của các nucleotid củ a sợi ADN làm khuôn Vé sau đoạn mồi ARN sẽ bị ADN

th ế chỗ (xem p h ầ n sau) N hư vậy mỗi đoạn O kazaki được khởi đẩu b ằ n g m ộ t đoạn ARN ngán

e) Mô h ìn h s a o c h é p ADN

H ìn h I I - 8 là m ồ hình sao chép ADN bao gồm tấ t cà các sự kiện nói trê n Bước

đáu tiên tro n g quá trìn h sao chép ADN là sự biến tín h và dãn xoắn cùa chuỗi xoắn

kép (h II-8 a ) Q uá trìn h này tạo r a cấu trú c hỉnh chữ Y gọi là chạc sao chép (replication

27

fork) T rên h ình II—8 chỉ vẽ m ột chạc sao chép n h ư n g n h iêu p h ân tử ADN n h â n sd,

cà m ạch th ẳ n g và m ạch vòng, đêu sao chép theo hai chiểu ngược n h au , b ắ t đ ấ u từ

m ộ t điểm , do vậy tạo nên hai chạc có các đẵu nối với n h au hỉnh th à n h m ộ t cấu trú c

trê n chuỗi ADN kép đ an g biến tín h gọi là vòng sao chép (replication bubble).

Việc d ã n xoán ADN kép tạo r a nhữ ng đoạn sợi đơn, các đoạn này trở nên bên vững

nhờ các p ro te in bám sợi dơn (single - stra n d e d binding protein, viết t ắ t là SSB), mỗi

p ro te in SSB bám vào 8 bazơ của sợi đơn ADN Mỗi chạc sao chép có tới hơ n 250

p ro tein SSB bám vào K hi các sợi đã dân xoắn th ỉ các bazơ phía tro n g chúng s ả n sàng

h ìn h th à n h các mổi liên k ết với các bazơ trê n chuỗi mới

Tiốp theo, ADN b ắ t đẩu sao chóp (h Il-S b ) ở E.coli các en7ym p rim ase b á m vào

ADN sợi đơn trê n cả h ai n hánh của chạc sao chép và tổ n g hợp nên n h ữ n g đ o ạn mổi

ng án Các đ o ạn m ổi được kéo dài th êm bởi h oạt động củ a ADN polym erase III là enzyni

tổ n g hợp chuổi ADN bổ trợ với sợi khuôn Vi 8ự phân cực ngược chiêu n h au c ủ a haisợi ADN khuôn và sự tổ n g hợp ADN mới chỉ diễn ra theo chiểu 5 ’- 3 ’ cho nên nhữ ng

đoạn mối n ằ m ở n h ữ n g vị trí tương đổi khác n h au trê n hai sợi khuôn (h II-8 b ).

d) Mở x oắn th è m n ữ a 5' 3'

Đ oạn Okazaki

28

5' 3' •

Kí HIỆU

c o ADN p o ly m erase 1 - ADN

r a ADN p o ỉy m erase ỉll -ADN đo AON p o ly m erase 1 xúc tá c

Đ oan môi - AON đo AON p o íy m erase III xúc tác

Mình I Ị - 8 C ác sự kiện diẻn ra xung q u an h c h ạ c b a s a o c h é p à n h iẻ m sắ c th ẻ E.coli.

29

Chuỗi kép' ADN tiếp tụ c d ã n xoắn (h II -8c) T rên sợi khuôn bên trá i, sợi m ới tiếp

tụ c được tổ n g hợp m ột cách liên tụ c theo chiểu trù n g với chiéu d ã n xoán N h ư n g vỉ

các ADN polym erase chỉ có th ể tổ n g hợp ADN theo chiêu 5*-3* cho nên việc tổ n g hợp

sợi m ôi trê n sợi khuôn bên phải diễn r a theo từ n g đoạn m ột (đoạn O kazaki), b á t đấu

từ đ iểm kể s á t với điểm h o ạ t động của helícase, sau đó hình th à n h đoạn mồi, đoạn

n ày được kéo dài bởi h o ạ t động của ADN polym erase III Toàn bộ quá trin h đó lại

được lặp lại như trê n h II-8 d K ết quà là sợi mới h ỉn h th à n h trê n sợi khuôn bên trá i

được tổ n g hợp m ột cách liên tục, tro n g khi trê n sợi khuôn bên phải th ỉ ADN được

tổ n g hợp m ột cách gián đoạn, tạo th à n h các đoạn O kazaki Sau đó, các đoạn n ày đượcnối với n h au đ ể hinh th à n h sợi ADN liên tục Q uá trìn h đó cẩn có flự th a m g ia của

các enzym : ADN polym erase I và ADN ligase (h II-8 e và f) N ếu chúng ta xem x ét

hai đoạn O kazaki nằm k ế tiếp n h a u th ì đ ầ u 3 ’ của đoạn ADN vừa được tổ n g hợp xong

sẽ tiếp cận chứ không nói với đoạn mổi ở đấu 5 ’ củ a đoạn được tổng hợp trư ớ c đó Enzym ADN polym erase III vừ a hoàn th à n h việc tổ n g hợp đoạn mới bằy giờ tá c h khỏi ADN v à enzym ADN polym erase I th ế chõ của nố E nzym này tiếp tục tổ n g hợp sợi ADN mới theo chiéu 5’- 3 ’ đổng thời do cố hoạt tín h exonuclease nó loại bô đ o ạ n mổi

của đoạn O kazaki trư ớ c đó theo chiéu 5*-3’ [h II~8e) Khi ADN polym erase I k ết thúc

th ì có m ột khe hd giữa h ai đoạn O kazaki m ỗi h ỉn h th àn h Khe hở này được nối lỉén (lăp kín) bởi tác dụng xúc tá c của ADN ligase, do vậy tạo r a sợi ADN dài hơn (h 11-80

Toàn bộ quá trìn h này chi k ết th ú c sau khi t ã t cả ADN được sao

chép-II SA O C H É P A D N ỏ S IN H V Ậ T N H Â N C H U A N

1 C h u tr ìn h t ế b à o n h â n c h u ẩ n

ở các sinh v ật n h â n sơ q u á trin h sao chép ADN được h iểu biết khá tư ờ n g tận

C hẳng h ạn , khi nuôi cấy trê n m ôi trư ờ ng dinh dưỡng các vi k h u ẩn tổ n g hợp ADN tro n g m ột chu trìn h t ế bào và sau đổ hai tế bào con được sin h r a do th à n h tế bào mới hình th à n h cát n g an g t ế bào Ngược lại, chu trin h tế bào của các sin h v ậ t nhân

ch u ẩn phức tạ p hơn r ă t n h iéu Chương này

sẽ trin h bày những khía cạnh hóa sin h của

chu trỉnh tế bào Còn chương X sẽ giới

th iệu cơ ch ế nguyên p h ân và giảm p h ân ỏ

m ức độ hình thái

ở các sinh vật nhân chuấn, đơn bào cũng

như đa bào, sự sinh sản của tế bào là m ột

quá trĩn h sinh trưởng, phân n h ân và phân

bào mang tính chu kỳ Quá trình đó gọi là

chu trình tế bào (cell cycle) ờ phẩn lớn các

tế bào soma của thực vật bậc cao và động

v ật chu trìn h t ế bào gốm bón p h a {h n -9 ).

T rinh tự các pha là G I (gap 1),

s (synthesỉs), G2 (gap 2), và M (mitosis)

Ba pha đẩu gộp lại gọi là giai đoạn nghỉ

hay kỳ trung gian (in terp h ase) Tiếp sau

G2 tế bào phân ch ia nguyên p h ân cho

hai t ế bào con Sau đó mổi t ế bào con lại Hình ĨI-9 Chu trinh tê bào nhan

G 2

b át đ ẩ u m ột chu trìn h t ế bào mới ở các tế

bào động v ậ t khi nuôi cấy, m ột chu trìn h tế

bào kéo d ài k h o ản g 24 giờ P h ầ n lớn nhữ ng

hiểu biết của c h ú n g ta vé sin h học phân tử

của chu trìn h t ế bào là b át nguỗn từ các thí

nghiêm nuôi cấy tế bào Đối với các mô tế

bào n h â n ch u ẩn thời gian củ a m ỗi pha cũng

như của m ỗi chu trìn h tế bào ỏ n h ữ n g sinh

vật khác n h au có khác nhau (k I I - 10) Hiện

nay h iếu biết củ a chúng ta ò m ức p h ân tử vé

các pha củ a chu trìn h tế bào còn r-ất hạn chế

2. P h a G I

P h a G I diễn ra tiếp theo sau nguyên phân

T rong pha này nhiêm sác th ể biến đổi từ

trạ n g th á i k ết đặc tro n g nguyên p h àn san g

trạ n g th á i kéo dài của pha nghỉ, đổng thời

diễn r a h à n g lo ạt n h ữ n g biến đổi dẫn đến sự

khởi đ ấ u sao chép ADN

T rong q u ắ n th ể đóng n h ấ t của các t ế bào

được nuôi cấy cd sự khác n h au vê thời gian

cùa chu trìn h t ế bào và đây là m ộ t khó khăn

lớn khi c ẩ n có n h ữ n g tế bào p h ân chia đống

thời GI là p h a dao động n h iếu n h ấ t vé độ

dài giữa các t ế bào cùng loại so với ba pha

kia Người ta cho rà n g độ dài củ a pha này

tương q u an với hàm lượng p ro tein cđ tro n g

tế bào G I là p h a q u an trọ n g đôi với to à n bộ

chu trin h tế bào vl n h ừ n g biến đổi vé tỗc độ

sinh sản của cá c tế bào liên q u a n m ậ t th iế t

với n h ữ n g biến đổi diễn ra tro n g pha G l Có

th ể có n h iều gen điéu hòa hoạt động tro n g G l

ở m ức độ p h ân tử các sự kiện chủ yếu

diễn r a tro n g G I n h ư sau : sau nguyên phân

các nhiễm sác th ể ít xoán vặn hơn và hoạt

tín h phiên m ã tă n g lên Một p h ắ n củ a hoạt

động phiên m ã này dẫn đến việc sản x u ấ t ra

h àn g lo ạt p h ân tử cấn th iế t cho vịệc khởi đấu

tổ n g hợp ADN T h ế nhưng, m ộ t số sinh vật

k hông có p h a G I rố rệ t (chẳng hạn như mốc

n h ầy P h y sa ru m p o lycep h a lu m , nấm m en

Schizosaccharom yces pombe, phôi cù a Xenopus

và phôi chuột) Tuy n h iên nhữ ng sự kiện dẵn

G2

G2

M?uyẽn bào ssưiciĩđ c/ĩỉyõ/

ĩO ,Q h

Hình ỈĨ—ỈO T hòi gian tương đ ố i cù a b ố n pha

tro n g chu Irình tế b ào của ba loại tế bào.nguyên p h ân tro n g pha G2 ở m ột hệđến việc tổ n g hợp ADN cố th ể diễn r a trước

th ống sống n h iểu hơn tro n g G I Đd là việc tổ n g hợp n h iều enzym và các pro tein khác cần th iế t cho việc n h ân đôi nhiễm sấc th ể

31

3 P h a s

a ) T ổ n g h ợ p A D N k h ô n g iiê n tụ c (g iá n đ o ạ n )

Trong pha s v ậ t ch ất di truyền của chất nhiễm sắc được nhân đôi Trong mô nuôi

cáy các t ế bào động v ật giai đoạn s kéo dài từ 6 đến 10 giờ, tro n g khi in uivo nó cố

th ể chỉ còn 10 p h ú t giống như nấm m en Schizosaccharomyces pom be, hoặc có th ể kéo

dài tớ i 35 giờ như các tế bào da ở tai chuột Có nhữ ng bằng chứng chứng tô rằng, giống như ở siiih v ậ t nhân sơ, sự sao chép ADN ở sinh v ật n h ân chuẩn cũng diễn ra theo kiểu n ừ a g ián đoạn Thí dụ, khi virut động v ật SV40 (sim ian virus 40) sao chép

ADN cúa nó in vitro thi những đoạn mới tổng hợp rói t-.hẩ tÁc.h r.hiết ra, chúng cổ khà

n ả n g tự nối lại để tạo thành các chuổi xoấn kép ngắn Cũng sẽ n h ận được kết quả như vậy nếu như các đoạn Okazaki được sinh ra trên hai sợi khuôn bổ trợ Đối với các t ế bào động v ật cũng có bằng chứng chứng tô rằn g các nucleotid nối với nhau

th à n h các sợi n g án (dài khoảng 100 nucleotid), rổi sau đó chúng nổi với n h au tạo

th à n h những sợi dài hơn

b ) C á c A D N p o ly m e ra s e

N hư đã nói ở trê n , tấ t cả các ADN polymerase của sinh vật n h ân sơ đểu không có khả n ân g khởi đẩu q u á trình tổng hợp ADN ; chúng chỉ trù n g hợp các deoxyribonuclectid trê n đoạn mối í t n h ấ t ở các tế bào động vật và v iru t động vật, quá trìn h tổ n g hợp ADN được khởi đấu bởi các đoạn mỗi ARN dài 9 -1 0 nucleotid, sau đó các đoạn mối'

bị cấ t bỏ

Các enzym cẩn th iế t cho quá trỉnh sao chép ADN đả được nghiên cứu ở n h iểu sinh

v ật n h àn chuẩn, ở sinh vặt bậc cao thấy có ba ADN polym erase alpha • (<x), b e ta {fi)y

và gam m a (ỵ), chúng khác nhau vỗ khối lượng phân tử, các đặc tín h sác ký, tín h m ẫn càm với c h ẫ t ức c h ế N - ethylmaleimide, tính m ẫn cảm với muổi và khả n ã n g sao

chép nhữ ng khuồn khác nhau Các đặc tín h này được tổng kết ở bảng dưới, C ả a và

ịi polym erase đểu ở tro n g nhân, tro ng khi enzym y lại ở tro n g các ty thể Các enzyni

a vả (i th ư ờ n g đính với các protein khác trong m ột phức hợp sao chép R ất khó khái

q u á t vẽ các enzym này vl ckúng rẩ t khác nhau ở nhử ng sinh v ậ t nhân ch u ẩn khác nhau Chẳng hạn, m ộ t số sinh vật có nhiều dạng enzym khác nhau, tro n g khi các sinh

v ật khác lại chủ yếu chỉ có một dạng Thực vật, Protozoa và nấm thiếu ịi polymerase, còn các vi sin h v ậ t n h ân chuẩn nói chung lại cố enzym gọi là a m ặc dù nò r ấ t khác vối a polym erase c ủ a động vật có vú.

Theo q u an niệm hiện nay thì ỏ các sin h , v ậ t n h ã n ch u ẩn bậc cao nói chung a poiym erase được sử d ụng đ ể sao chép ADN của nhân, (i polym erase có th ể hoạt động như m ộ t enzym sừ a chừa Còn y polym erase thỉ chuyên trá c h việc sao chép hệ gen ty

th ể K hông có enzym nào tro n g số này có h oạt tín h đọc sửa Ngược lại, các sinh vật

n h ân chuẩn bậc th ấp , ch ản g hạn như nấm men, có các ADN polym erase tro n g nhân

rá t giống với các enzym này cùa sinh v ật n h ả n sơ và c h ú n g có h oat tín h đọc sửa

c) C ác d ơn vị s a o c h é p

ỏ E coli có m ộ t điểm khòi đ ầ u sao chép duy n h ã t trê n nhiễnì sác th ể, và quá

trin h sao chép ADN diễn r a theo hai chiểu ngược nhau x u ấ t p hát từ điểm đó Việc nghiên cứu các nhiếm sác th ể n h àn chuẩn đ an g sao chép b à n g kính h iển vi điện tử

đã cho tháy rà n g m ỗi nhiễm sác th ể có nhiếu đơn vị sao chép (replication unit, viết

tá t là RU), còn gọi là các replicon, mỗi replicon có m ột đ iểm khởi đẩu và hai điểm

kết th ú c quá trin h sao chép Cách cấu tạo nhiễm sác th ể th à n h các đơn vị sao chép như th ề là cẩn th iế t đ ể cho số lượng ADN khổng 16 của sin h v ật nhân chuần (nếu đem so với tế bào vi khuẩn) có th ể sao chép tro n g m ột thời gian vừa phải

Các nghiên cứu d ù n g kính hiển vi điện tử và đánh dấu p h ó n g xạ đã cho thấy rằn g quá trìn h sao chép ADN b á t đầu b ằn g việc xuất hiện "chiếc vòng" trên ADN gổm hai chạc sao chép Các chạc này chuyển động theo hai chiéu ngược nhau tro n g quá trình

tổ n g hợp ADN cho đến khi chúng đ ạ t tới các đ iểm kết th ú c đặc thù Các tín hiệu

x u ẵ t p h á t và k ết th ú c là nhữ ng đoạn ADN đặc hiệu, cho đến nay, mới được xác định

ở m ộ t số v iru t động v ật (nhu SV40) và ở nấm m en Soccharoniyces cereuisiae Mò hinh

đơn giản n h ấ t là p ro tein khởi đầu đặc hiệu bám vào đoạn x u ấ t p h á t và do vậy làm cho phức hợp sao chép ADN bám vào điểm xuất p h á t củ a q u á trìn h sao chép ADN.Việc xem x ét kỹ hơn các nhiễm sác th ể đ an g sao chép b àn g kính hiển vi điện từ cho th ấ y rà n g khoảng cách giữa hai điểm khởi đấu sao chép biến động từ 30.000 đến 300.000 cặp bazơ n itơ tùy thuộc vào loại sinh v ật n h ân ch u ẩn đem nghiên cứu Chẳng hạn, có tới 100 đơn vị sao chép trê n m ột nhiễm sắc th ể tro n g các tế bào H ela (tế bào ung th ư ở người) Tốc độ chuyển động của phức hệ sao chép tro n g các đơn vị sao chép

r á t giống n h áu ờ p h ầ n lớn các sinh v ật n h â n chuấn, khoảng 1.000 đến 15.000 nucleotid tro n g m ộ t p h ú t ở 3 7 °c N hưng tốc độ chuyến động này củ a chạc sao chép r ấ t khác nhau ngay tro n g cùng m ột hệ thống vì nó chịu sự kiểm so át di truyền, sự kiểm soát của th ờ i gian và n h ữ n g biến đổi của môi trường

Sơ đổ sao chép của các đơn vị sao chép tro n g n h ân nêu trê n h ìn h I I - 11 Q uá trìn h

sao chép b á t đáu từ điểm o chuyển động theo hai chiếu ngược nhau, tạo th à n h các

"vòng mở" trê n ADN Q uá trỉn h này k ết th ú c khi các chạc sao chép k ế cận hòa nhập vào n h au Rõ rà n g là trin h tự chuyển động của các phức hệ sao chép m an g tín h đặc

th ù loài và nó được lặp lại ở mỗi th ế hệ Có b ằn g chứng cho th ấ y ràn g ADN giàu GC được sao chép trư ớ c, còn các đoạn ADN giàu AT được sao chép sau tro n g pha s

d ) L áp rá p A D N d á s a o c h é p v à o c á c th ể n h â n

Các nhiễm sắc th ể n h â n chuẩn gổm ADN và histon cù n g n à m tro n g cấu trú c của

các th ề n h â n (nucleosom e) Khi ADN sao chép th i các th ể n h â n phải n h ân đôi tro n g quá trin h tổ n g hợp các h iston mới và q u á trìn h lấp rá p các th ể nhân mới Có nhiéu

bản sao của các gen histon tro n g hệ gen n h â n chuẩn N h ừ n g b à n g chứng gấn đày cho tháy rằ n g các gen này h o ạt động ít n h ấ t là tro n g G l, s và có th ể cả tro n g G2, sinh

ra m ột số lượng lớn h isto n cân th iế t cho sự hình th à n h các th ể n h ân mới tro n g pha* s

Hình t ĩ - Ị L Trinh lự 4 hí li gian iro n g việc kh(*ii d ầu sa o c h é p ADN tro n g cá c d ơ n vị

sao chép nhiễm sắ c thủ n hân chu/in.

ADN mới được sao chép nhanh chóng hợp thành phức hệ với h isto n đ ể tạo nên các

th ể nhân Sự p h âh liổ cấc Mstôh tíủ và hỉẩtỡh mới được lổng hợp tro n g cáu Ih ể n h ân

củ a ADN mới sao chép hiện nay chưa rõ Trong n h ữ n g hệ th óng đ ã nghiên cứu th ỉ

th ấ y rằn g không có sự pha trộn nào giũa các histon mới và cũ tro n g các th ể nhân

Đ iều đó chứ ng tò nVng các octam er histon cũ được duy tri từ th ế h ệ nọ qua th ế hệ kia và các o ctam er chỉ bao gổ 111 nhữ ng histon mới tổ n g hợp được sử d ụ n g tạ i các chạc sao chép đ ể h ìn h thành các thể n h ân mới Một khi các th ể n h ân đà được lắp ráp tại

ch ạc sao chép th ì chỉ 2 - 15 p h ú t sau chúng được dùng đ ể chuyển hóa ch ất nhiễm sác san g trạ n g th á i chín (trưởng thành), nghỉa là san g trạ n g th á i không phân biệt được với c h ấ t nhiễm sác không sao chép

4 P h a G2

T rong G2 các nhiễm sắc th ể kết đặc lại đế chuẩn bị cho nguyên p h ân K ết độc là

q u á trỉn h cuộn xoắn ờ mức độ cao hơn của các sợi nhiễm sác, n h ư n g cơ ch ế của nó

h iện nay chưa được biết rõ Các nghiên cứu dùng c h ấ t ức ch ế đ ã cho th ấ y rằ n g việc

tổ n g hợp cà ARN và protein là cấn th iết để hoàn th à n h G2 Sự k ết th ú c của pha G2 báo hiệu sự b ắ t đẩu của nguyên phân Bước chuyển tiếp này r ấ t khó xác định bằng

k ín h hiển vi d ù n g ánh sáng

M ột sự kiện q u an trọng nữa tro n g G2 là việc tổ n g hợp protein tubulin Tubulin

được trù n g hợp hóa để tạo ra các vi óng cùa bộ máy thoi dùng đ ể p h ân ly các nhiễm sác th ể và các n h ả n con trong nguyên phân và giảm phân

5 C á c k h ía c ạ n h p h â n ỉử c ủ a n g u y ê n phân

N guyên p h â n là sự ph ân chia m ột tế bào th à n h hai t ế bào con giổng hệt n h au vể

m ặt di tru y ể n T rư ớc khi b á t đ ầ u nguyên phân, các nhiễm sắc th ể được nhân đôi vàsau đó c h ú n g phân bố về các tế bào con bàng quá trin h phân chia Sau đó các tế bàosinh r a n ằnì ở pha G l H o ạ t động của các nhiễm sác th ể tro n g nguyên phân sẽ được trin h bày ở chương VIII 0 đảy chỉ nêu lên n h ữ n g biến đối chưng vé hình thái và hóa sinh của nguyên p h ân

Dậc đ iểm của n g u y ên p h án là có n h ữ n g biến đổi lớn vé chức n ă n g và cấu trú c cùa

tể bào, n h ư n g cơ sở p h ân tử của các sự k iện này chưa được sản g tỏ Khi nguyên phân

b ảt đầu th ỉ việc tổ n g hợp giảm đi rổi sau đó dừ ng lại ở kì giữa và lại tiếp tụ c ở kì cuối Điểu đó có th ể vi thiếu n h ữ n g điểm khởi đẩu phiên mã do trạ n g th á i k ẽt đặc cao của các nhiễm sá c th ể Tóc độ tổ n g hợp p ro tein củ n g giảm đột ngột khi b ắ t đầunguyên p h ân , sau đố lại tă n g lên ở cuối kỉ tư ơ n g tự n h ư việc tổ n g hợp ARN C ùngvới việc ức c h ế các q u á trin h tổ n g hợp ARN và p ro tein th ì m àng n h ân và hạch n h ân

bị vỡ, các cấu trú c này lại hình th à n h trở lại tro n g các n h ân con ở cuói kl cuối

6 T ó m tắ t c á c sự k iệ n c ủ a c h u tr ìn h t ế bào

Chu trìn h t ế bào củ a m ột tế bào n h â n ch u ẩn cổ th ể tổ n g k ết lại như h ìn h 11-12.

T rình tự của các sự kiện tro n g chu trìn h phụ thuộc vào các q u á trin h phiên m ã và

dịch m ã c ủ a các gen chuyẽn trá ch chu trìn h tế bào theo một trìn h tự thời gian cụ

MGừ/Ễa/ P/iÂN ũừ/ĩỷ /ỚỢỹ /ĩơp/ĩX/ự

35

th ể Người ta đả xác định được các gen chuyên trá c h chu trìn h t ế bào ờ m ột số sin h vặt n h ư n ấm m en và tế bào động v ậ t có vú b àn g cách chọn lọc các th ể đột b iế n có

đ iéu kiện n g ả n trở n h ữ n g khâu khác nhau của chu trìn h tế bào Việc n g h iên cứ u các

th ể độ t biến này đ ã cung cẩp n h ừ n g th ông tin quý vé trin h tự và sự điẻu hòa các sự kiện củ a chu trìn h t ế bào ở m ức độ phân từ

I II KỸ T H U Ậ T N H Â N A D N Đ Ặ C H IỆ U (P H Ả N Ú N G P C R )

Kỹ th u ậ t n h ân ADN đ ặc hiệu, còn gọi là p h ản ứng chuỗi trù n g hợp hay kỹ th u ậ t PCR (P olym erase C h a in R eaction) được Kary M ullis hoàn th iện vào giữa n h ữ n g nầm

80 và đã đ ư a lại m ột cuộc cách m ạng tro n g di tru y ề n -h ọ c p h ân tử Kỹ th u ậ t này là

m ột phương pháp hoàn to à n mới tro n g việc nghiên cứu và p h ân tích các gen Khó

k h ăn lớn n h ấ t trước đây tro n g việc phân tích gen là ỡ chó chúng là n h ữ n g m ục tiêu đơn lẻ và r ấ t nhỏ tro n g m ộ t hệ gen phức tạp , khổng lố, ch ẳn g hạn n h ư hệ gen của

đ ộng v ậ t bậc cao chứa tới 100.000 gen Có r ấ t nhiẽu kỹ th u ậ t tro n g di tru y é n học p h ân

tử được hoàn th iện đ ể vư ợt qua khó khàn này N hưng chúng đòi hòi nhiễu thời gian, cổng k ển h và r ấ t khó k h ăn tro n g việc tìm kiếm n h ữ n g đoạn ADN đặc hiệu P h ả n ứng chuỗi trù n g hợp (PCR) đ ã thay đổi t ẵ t cả, giúp chúng ta có th ể tạo ra m ộ t số lượng

lớn các bản sao của đoạn ADN càn ỉựa chọn m à không cẩn tách và nhán dòn g (cloning).

1 P h ả n ứng c h u ỗ i tr ù n g h ợp ch o p h é p n h ân c á c đ o ạ n A D N đ ịn h trư ó c

Kỹ th u ậ t PC R sử d ụng các đặc điểm của quá trỉn h sao chép ADN ADN polym erase

d ùng các đoạn ADN m ạch đơn làm khuồn để tổ n g hợp nên sợi mới tư ơ n g hợp với nó Các sợi ADN khuôn m ạch đơn này có th ể được tạo ra theo cách đơn g iản là đun nóng

d u n g d ịch ADN m ạch kép tới gẩn n h iệ t độ sôi

ADN polym erase cũ n g đòi hòi phải có m ột đoạn ngắn ADN m ạch kép (đoạn mói)

đ ể khởi đ ẩ u q u ả trìn h tổ n g hợp Vì vậy, đ ể khởi đ ấ u quá trìn h tố n g hợp ADN cần

cu n g cấp đoạn mồi oligonucleotid (có độ dài từ 6 đến 30 nucleotid), đoạn này g á n k ết

với khuôn tạ i điểm khởi đầu sao chép Đó là dặc đ iềm quan trọng đ à u tiên cúa kỹ

th u ậ t PC R vi ADN polym erase được điéu khiển đ ể tổ n g hợp m ột đoạn ADN đặc th ù

C ả h ai sợi ADN đễu được d ùng để làm khuôn cho q u á trin h tổng hợp nếu các đoạn mồi oligonucleotiđ được cu n g cấp cho cà hai sợi T rong kỷ th u ậ t PCR, các đoạn mồi được chọn đ ể chặn hai đ ầ u củ a đoạn ADN cần nhân lên, sao cho các sợi ADN tổng hợp mới được b ắt đ áu tạ i mỗi đoạn mồi và kéo dài vé phía đoạn mổi n ằ m trê n sợi kia (H 11-13) Như vậy, sau mỗi chu kỳ các đ iểm bám cho các đoạn mỗi lại x u ấ t hiệntrê n mỗi sợi ADN mới được tổ n g hợp Hỗn hợp phản ứng lại được đ u n n óng lén đ ể

tá c h sợi ban đẩu khỏi sợi mới tổ n g hợp, các sợi này sa u đó lại được dùn g tiếp cho chu trỉn h tiếp theo, bao gổm các bước : gán đoạn mồi, tổ n g hợp ADN và tách rời các

đoạn K ết q u à cuối cùng của p h ản ứ ng PCR là sau n chu kỳ phản ứng, tín h theo lý

th u y ết, ta sẽ có 2" bàn sao các phán từ ADN m ạch kép nằm giữa hai đoạn mỗi (xem

b àn g bén) Đó là d ặc d iêm quan trọng thứ h ại của kỹ th u ậ t PCR, nó dần đến k ết quà

là m ột đoạn ADN định trước được "nhân lên"

đa n ân g và phổ ứ ng dụng hết sứ c rộ n g rãi

V ật liệu khởi đáu cho PCR là ADN có chứa đoạn cần nhân lên Không cán th iế t p hải tách

ch iết đoạn cán n h ân lên vì việc đó đã được các đoạn mối dùn g tro n g p h ản ứ n g xác định

H àm lượng ADN cần cho phản ứ n g PC R rấ t nhỏ T rong các th í nghiệm bình th ư ờ n g ở phòng

th í nghiệm chi cẩn khoảng m ộ t m icrogram ADN hệ gen là đủ ; tuy nhiên, n g ày n a y tro n g nhiéu trư ờ n g hợp, phản ứ ng PC R cổ th ể n h ân các đoạn ADN chỉ từ m ột p h ân tử riê n g lẻ

H ai đoạn mổi đ ể xác định các đ iể m b á t đấu

tổ n g hợp ADN, ADN polym erase, và hỗn hợp

củ a t ấ t cả bổn tién ch ấ t deoxynucleotid (dN TP) cẵn được đưa vào ống nghiệm cđ c h ứ a ADN khuôn D ung tích tổ n g số thư ờng là 100//1

Bước tiếp theo của quá trìn h là làm nống hỗn hợp phàn ứ ng đến khoàng 9 4 ° c T ại n hiệt

độ này, các phân tử ADN mạch kép tá c h n h au

r a hoàn toàn tạo nên các sợi đơn đ ể d ù n g làm khuôn cho các đoạn mồi v à ADN polym erase

Sau đó n h iệ t độ được hạ xuống 30 - 6 5 ° c để các đoạn mỗi gán với các trin h tự tư ơ n g hợp trê n các p h ân tử ADN làm khuôn

N h iệt độ gán kết này th a y đổi đ ể quyết định tín h đậc hiệu của phản ứng PCR N hiệt

độ và khoảng thời gian sử d ụ n g ở đây thay đổi tù y thuộc vào đoạn ADN cấn n h â n lên (từ

30 đến 70°C) Các điểu kiện này sẽ tạo ra khuôn được môi để cho ADN polym eràse h oạt động T rong bước tiếp theo n h iệt độ được n ân g

lên 72ơc , n h iệt độ tối ưu cho T a g AIÍN

polym erase bên n h iệ t'là m việc N h iệ t độ được duy t r ì ỏ 7 2 °c tro n g khoảng 5 p h ú t đ ể ADN được tổ n g hợp

Vào cuối giai đoạn này, n h iệt độ m ộ t lán nửa được n â n g lên 9 4 °c, n h ư n g lẩn này chỉ tro n g vòng 20 giây đ ể cho các m ẩu ngắn

của ADN m ạch kép (cả sợi ban đầu và sợi mới được tổ n g hợp) tách n h au ra Các sợi

đơn này trở th à n h khuôn cho m ột vòng tổng hợp ADN kháCj và chu kỳ gổm đ u n nóng

để tách các sợi, gán k ết các đoạn mối, và tổ n g hợp ADN bằng ADN polym erase, lại

được lặp lại từ 30 đến 60 chu kỳ

3 f5'

a) V ật liệu khởi đấu là phân tử ADN mạch kép

Các đơđíĩ Ĩ77Ơ/

5 ’3'

c) Tũg polym erase tổng hợp các sợi ADN

mới tương hợp với sợi khuôn, b á t đầu

từ đoạn mối kéo dài vé phía đoạn mồi nằm bên sợi kia

d) Hỗn hợp phản ứng lại được gia nhiệt Sợi ban đẩu và sợi mới tổng hợp tách nhau ra T rẻn 2 sợi mới tổ n g hợp

x u át hiện 2 điểm bám cho các đoạn mỗi gản vào

e) Tag polym erase tổ n g hợp các sợi tương

hợp mới, như ng các chuỗi mới lẩn này chi tiến đến đ ú n g vị tr í đã được xác định bởi cặp đoạn mối 'đ ă lựa

chon.

f) Quá trỉn h được lặp lại, các đoạn mổi tiếp tụ c gán vào các sợi mới tổng hợp

g) T a g polym erase tổ n g họp các đoạn

tư ơ n g hợp sinh r a hai đoạn ADN mạch kép giống h ệ t đoạn cấn tổng hợp Q uá trìn h cứ th ế tiếp tục

, ' / ỵ ẩ cứ // 7 ê f/'ề/j /ự c

Hình Ỉ I - U S(1 đ ố nguyên ly phíin ừng chuồi trù n g hợp PC?R

( D ẻ d ơ n giiìn hóa S«1 d ổ, 1 Ư p h á n d ) khòng võ hai Siìi A D N khuôn h an đ á u )

3 C á c lĩn h v ự c ứng d ụ n g c ủ a p hản ứng c h u ổ i t rù n g họp

Phàn ứng chuỗi trù n g hợp PCR từ khi được Kary M ullis để xuẵt và hoàn th iện ,

đà có nhữ ng ứng d ụ n g h ết sức rộng rã i tro n g nhiều lỉnh vực khác nhau, cả tro n g khoa học công nghệ v à tro n g đời sống xã hội

Trong nghiên cứ u khoa học, kỹ th u ậ t PCR giúp ích hữu hiệu cho việc xác định trin h

tự nucleotid củ a các đoạn ADN được n h ân ; giúp p hát hiện đ ột biển, cho phép phân tích liên kết gen từ n h ữ n g tế bão riên g lẻ ; giúp nghiên cứu q u á trin h tiến hóa ở mức phân tử Thậm chí giúp phục hổi nhữ ng gen đ ã tổ n tạ i cách đây hàng chục triệ u năm Trong chọn giố n g v ậ t nuôi và cây trổng, đác biệt đối với đ ộng vật và thự c v ậ t bậc rran, vốn trư ớ c đây việc lựa chọn cặp cha m ẹ làm giống là việc r ã t khó k h ản, cẩn nhieu nâm , th ì nay kỹ th u ậ t PCR cho phép thự c hiện chi tro n g vài ngày, th ậ m chỉ vài giờ.Trong y học PC R có th ể chẩn đoán chính xác các bệnh nhiễm trù n g từ v irú t đến

vi khuẩn và các bệnh do nấm , k ể cả HIV - AIDS, chẩn đoán sớm và theo dõi điéu trị ung thư

Trong tư vân di tru y ên y học PCR cho phép chẩn đoán n h a n h , chính xác các bệnh

di tru y én k ể cả c h ẩ n đoán trước sinh giới tín h và các dị t ậ t bẩm sinh có th ể có từ

khi th ai mới được 8 tu ầ n và điễu q u an trọ n g là không cẩn chọc ối, chì cắn lấy m ộtgiọt m áu ngoại vi củ a m ẹ để làm m ẫu th í nghiệm

Ngày nay kỹ th u ậ t PCR là không th ể thiếu tro n g khoa học hình sự, giúp chần đoán nhanh, chính xác th ủ phạm chi từ m ột vết m áu khô, m ột sợi tó c hoặc m ộ t sinh phẩm nào đó m à th ủ p h ạm để lại trê n hiện trường Ngoài ra kỹ th u ậ t này còn cho phép xác định chính xác q u an hệ huyết thống cha - con, ông - cháu v.v cũng chi tro n g vài giờ

T rong bảo vệ m ôi trường, việc xác định mức độ ô nhiễm sin h học có th ể thự c hiện

rấ t hiệu quả và n h a n h chóng bằng kỹ th u ậ t PCR

N hững ứ n g d ụ n g thục tiễn đa d ạn g của phàn ứng chuỗi trù n g hợp PCR th ậ t vô cùng

tậ n N ếu như n ă m 1985 mới cd 3 công trin h được công bố vể PC R th i 5 nồm sa u kỹ

th u ậ t này đ ã được sử d ụng tro n g h àn g nghin phòng th í n ghiệm trên, k h á p th ế giới.Ngay ờ nước ta, kỹ th u ậ t PCR cung đã đ an g được d ùng tro n g nhiéu trường đại học, việnnghiên cứu và n g ày càng trở nên phổ biến P h ản ứng chuỗi trù n g hợp th ậ t sự đ ầ đưa lại m ột cuộc cách m ạn g tro n g lỉnh vực ứng dụn g thự c t ế củ a di tru y én học p h ân tử

CÂU HỎI

1) C ó m ấ y c á c h tổ n g h<Jp n u c le o tid tro n g t ế b à o ?

2) Thí n g h iệ m c ù a K o rn b e rg v ể tổ n g h ộ p ADN ìn vìiro.

3) Thí n g h iệm M e se ls o n v à S ta h l vói c ơ c h ế tổ n g hợp ADN th e o k iể u n ừ a b ả o lo àn

4) T hế n ào là s a o c h é p ADN kiểu n ừ a g iá n đ o ạ n ? C á c đ o ạ n O k az ak i là gì ?

5) C á c en z y m v à p r o te in th a m g ia v à o q u á trình s a o c h é p ADN ỏ sin h v ậ t nhân s d ?

6 ) Đ oạn mổi là gi ? Vai trò c ủ a chúng tro n g q u á trình s a o c h é p AON.

7) Mô hỉnh tổ n g q u á t c ú a q u á trình s a o c h é p ADN.

8) Những đ ặ c đ iể m chính c ủ a ch u trình f ế b à o n hân chuẩn.

9) C á c AON p o ly m e r a s e à đ ộ n g v ật b ậ c c a o

10) Đ ặc đ iể m v à h o a t đ ộ n g c ủ a c ả c đơn vị s a o c h é p ỏ sin h v ậ t n h â n c h u ẩ n

11) N guyên lý c ù a k ỹ th u ậ t n hân ADN d ặ c hiệu (PCR).

12) Ý nghĩa, lý luận v à thực tiễ n củ a p h ả n ú n g chuỗi trùng hợp PCR.

39