Kỹ thuật cấy nuôi cấy tế bào động vật

Trang 1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

********&********

KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Trang 3

I - MỞ ĐẦU

những bước tiến mạnh mẽ Nuôi cấy tế bào động vật là một lĩnh vực quan trọng trong công nghệ tế bào động vật

 Ứng dụng của nuôi cấy tế bào động vật: mô hình thử

nghiệm và chuẩn đoán bệnh, sản xuất các hợp chất sinh học, làm vật liệu cấy ghép, tạo cơ quan từ tế bào động vật nuôi cấy…

 Trong nuôi cấy tế bào động vật in vitro, chìa khóa để thành

công là cần phải nắm vững một số các kỹ thuật cơ bản như: cấy chuyển, đông lạnh, giải đông, đếm số lượng tế bào…

3

Trang 4

II - NỘI DUNG

1 CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN

2 CẤY CHUYỂN TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO

Trang 5

CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN

 Cấy chuyển tế bào lớp đơn là kỹ

thuật chọn lọc và tách các tế bào

dạng lớp đơn từ kết quả nuôi cấy

sơ cấp, chuyển sang nuôi cấy

các loại tế bào khác nhau

 Trong dụng cụ nuôi cấy có môi

trường dinh dưỡng thích hợp

5

Trang 6

Chu kỳ sinh trưởng của tế bào

động vật gồm 4 pha:

 Pha tiềm sinh (lag phase)

 Pha tuyến tính (Stationary phase)

 Pha suy thoái (Death phase)

Trang 7

 Giai đoạn cấy chuyển vào gần cuối pha log

7

Trang 8

 Pipet, đầu côn vô trùng

 Bình nuôi cấy 25cm2 hoặc đĩa petri

Trang 9

Trang 10

 Hút bỏ môi trường cũ

- Loại bỏ tất cả các môi trường

từ nuôi cấy sơ cấp với một ống

pipet vô trùng.

- Nếu các tế bào bám chặt có thể

đổ bỏ môi trường.

- Nếu nhiều tế bào nổi hay bám

yếu, nên lắc nhẹ và rửa.

Trang 11

Trang 12

Trypsin là một serine protease

tìm thấy trong hệ tiêu hóa của

nhiều động vật có xương sống,

có vai trò thủy phân các protein.

Môi trường hoạt động

pH: 6-9 (tối ưu ở pH 8-9)

Trang 13

 Rửa và tách các tế bào

- Đặt đĩa trên một khay ấm 37°C từ 1-2 phút

- Gõ nhẹ đáy đĩa trên mặt bàn để tách các tế bào

- Kiểm tra quá trình nuôi cấy bằng kính hiển vi hồng ngoại

- Thêm huyết thanh hoặc môi trường có chứa huyết thanh để ức chế trypsin

13

Trang 14

 Chọn các tế bào thích hợp chuyển sang

môi trường mới

- Thêm một lượng bằng nhau dung dịch huyền phù tế bào cho các đĩa hoặc bình nuôi cấy đã được dán nhãn thích hợp

- Thêm 4 ml môi trường mới vào, bảo quản trong tủ nuôi cấy điều kiện 370C, CO2 5%

- Cung cấp dinh dưỡng cho các mảng nhỏ nuôi cấy (subconfluent cultures) sau 3 hoặc 4 ngày bằng cách loại bỏ môi trường cũ và thay môi trường mới, 370C

- Chuyển qua lần nuôi cấy tiếp theo khi môi trường nghèo

chất dinh dưỡng

Trang 15

NỘI DUNG

1 CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN

2 CẤY CHUYỂN TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO

Trang 16

CẤY CHUYỂN TRONG NUÔI CẤY

HUYỀN PHÙ TẾ BÀO

 Nuôi cấy huyền phù tế bào là

phương thức nuôi cấy các tế

bào trong môi trường lỏng

trong bình nuôi có dung tích

phù hợp và lắc nhẹ nhàng

 Cấy chuyển các dung dịch

huyền phù ít phức tap hơn cấy

chuyển nuôi cấy lớp đơn do

không cần thiết phải tách

chúng bằng enzyme trước khi

khi cấy chuyển

Trang 17

 Máy khuấy từ, giá đựng bình

 Hóa chất và trang thiết bị để xác định

kết quả và đếm tổng số tế bào

17

Trang 18

HUYỀN PHÙ TẾ BÀOCÁC BƯỚC THỰC HIỆN

 Cung cấp dinh dưỡng cho tế bào 2-3 ngày cho đến khi các tế bào

nuôi cấy kết tụ.

 Lấy nhẹ nhàng dung dịch huyền phù từ buồng ủ, tránh làm phân tán các tế bào đã ổn định ở đáy bình.

 Loại bỏ khoảng 1/3 môi trường từ bình và thay thế bằng môi

trường đã được làm ấm 37 0 C với cùng một lượng thể tích Nếu các tế bào sinh trưởng nhanh chóng, thêm vào bình 10% môi

trường để duy trì mật độ 1 × 10 6 tế bào /ml Nhẹ nhàng lắc bình để làm phân tán các tế bào.

 Đặt bình vào buồng ủ:

Vmt <15ml: đặt bình nằm ngang

Trang 19

HUYỀN PHÙ TẾ BÀO

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

 Trong những ngày nuôi cấy không cung cấp dinh dưỡng, kiểm tra tế bào thông qua quá trình làm vẩn đục bình và quan sát sự thay đổi màu sắc trong môi trường để phát hiện sự sinh trưởng phát triển các tế bào là tốt

 Khi các tế bào nuôi cấy kết tụ (~2.5 × 10 2cell/ml) sẽ cấy

chuyển như sau:

 Lấy bình từ buồng ủ và lắc bình cho tới khi các tế bào tách rời nhau trong môi trường

 Lấy 1/2 thể tích tế bào huyền phù và chuyển sang một bình mới

 Cung cấp dinh dưỡng cho mỗi bình 7-10 ml môi trường đã được làm ấm và tiếp tục đưa vào buồng ủ

19

Trang 20

NỘI DUNG

Trang 21

ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO

 Đông lạnh tế bào động vật là sử dụng môi trường đông lạnh, nhiệt

độ thấp (-80 0 C, -196 0 C) để lưu giữ các tế bào động vật phục vụ cho nghiên cứu và ứng dụng.

 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình đông lạnh gồm:

- Tốc độ đông lạnh

- Kỹ thuật đông lạnh

- Chất bảo quản lạnh

- Môi trường dinh dưỡng

- Nhiệt độ bảo quản

- Đặc trưng của tế bào đông lạnh….

21

Trang 22

Quy trình bảo quản đông lạnh

 Chuẩn bị

Môi trường này thường là môi trường dinh dưỡng, bổ sung khoảng 20-90 % huyết thanh và khoảng 5-10 % chất bảo quản lạnh ( DMSO, Glycerol…)

 Bảo quản

 Chuyển dịch huyền phù tế bào nuôi cấy đang ở pha log vào ống ly tâm, tiến hành ly tâm ở nhiệt độ 2 - 80C với tốc độ khoảng 1000 v/p trong 5 phút

 Trộn tế bào vào môi trường đông lạnh để tạo dạng huyền phù, mật

độ thích hợp khoảng 107 tế bào/ml

Trang 23

23

 Ghi nhãn, dùng giấy nến, bao gói và các ống đông lạnh có

huyền phù vào tủ đông lạnh -800C trong một vài giờ, và chuyển vào giữ trong bình chứa Nitơ lỏng

Trang 24

NỘI DUNG

Trang 25

GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO

 Mục đích: Khôi phục lại trạng thái hoạt động, đặc điểm,

tính chất của tế bào trong nuôi cấy tế bào động vật.

- Nếu quá trình giải đông chậm, các tế bào bị tổn thương hoặc bị chết nhiều, ảnh hưởng đến kết quả nuôi cấy.

- Nếu giải đông càng nhanh, đúng kỹ thuật, chất lượng

tế bào càng tốt.

25

Trang 26

 Lấy ống tế bào đông lạnh từ

trong bình Ni tơ lỏng, đặt ngay

vào bình ổn nhiệt có lắc ở 37oC.

 Chuyển dịch huyền phù tế bào

trong ống đông lạnh sang ống ly

Trang 27

 Ly tâm trong 5 phút với tốc độ

1000 vòng/phút

 Bổ sung 5 - 6ml môi trường

dung dịch đã làm ấm

 Chuyển sang bình nuôi, ủ ở

37 o C trong điều kiện nồng độ

CO 2 5 %.

 Sau 24h thì kiểm tra kết quả

nuôi cấy, bỏ môi trường cũ và

bổ sung 5 - 6ml môi trường mới

đã làm ấm và tiếp tục nuôi cấy

27

Trang 28

NỘI DUNG

Trang 30

XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO

Cấu tạo buồng đếm hồng cầu:

Trang 31

 Thuốc nhuộm trypan blue

Trypan (C14H16N2) là một thuốc

nhuộm sống được sử dụng để xác

định sức sống của tế bào, thuộc loại

thuốc nhuộm diazo dye

31

Trang 32

 Màng tế bào của những tế

bào sống có khả năng thấm

chọn lọc, ngăn không cho

trypan blue xâm nhâp vào

tế bào → không bắt màu

 Đối với những tế bào chết

hay mô chết, màng tế bào

không có khả năng thấm

chọn lọc, trypan blue có thể

vượt qua màng → bắt màu

xanh

Trang 33

 Ethanol 70 % (v/v)

0.4% (w/v) được chuẩn bị trong HBSS

33

Trang 34

Các bước thực hiện:

Trang 35

 Chuẩn bị buồng đếm hồng cầu:

- Làm sạch lá kính đậy và buồng đếm hồng cầu bằng cồn 70 %.

- Làm ướt mép của lá kính đậy (lamen) và ấn thành

đường rãnh trên buồng đếm hồng cầu

35

Trang 36

- Đối với các tế bào phát triển trong nuôi cấy lớp đơn, tách

tế bào từ bề mặt của đĩa bằng cách sử dụng trypsin.

- Pha loãng tế bào cần thiết để thu được huyền phù đồng nhất hoặc phân tán một số cụm tế bào

Trang 37

 Nạp buồng đếm hồng cầu

- Sử dụng một pipet Pasteur

vô trùng để chuyển huyền phù

tế bào tới cạnh buồng đếm.

- Giữ đầu pipet dưới lá kính

đậy và nạp đầy huyền phù vào

buồng đếm

37

Trang 38

 Đếm tế bào

- Để các tế bào ổn định một vài phút trước khi bắt đầu đếm

- Loại bỏ chất lỏng dư thừa

- Xem tiêu bản trên kính hiển vi với độ phóng đại 100 x

- Sử dụng máy đếm cầm tay để đếm tế bào ở bốn góc và ô

vuông trung tâm

Trang 39

 Tính tổng số lượng tế bào

- Xác định số tế bào/ ml sử dụng công thức sau:

Tế bào/ml = (số lượng trung bình tế bào ở mỗi ô vuông)

x (hệ số pha loãng) x 104

Tổng số tế bào = (tế bào/ml) x (tổng thể tích ban đầu của

huyền phù tế bào)

39

Trang 40

- Thêm 0,5ml thuốc nhuộm trypan

blue 0,4%; 0,3ml HBSS; 0,1 ml

huyền phù tế bào vào 1ống nhỏ

- Trộn thật kỹ và để yên trước khi

Trang 42

NỘI DUNG

Trang 43

CHUẨN BỊ TẾ BÀO CHO VẬN CHUYỂN

Các bước thực hiện:

 Loại bỏ môi trường cũ trong

bình nuôi, cho môi trường mới

Trang 44

CHUẨN BỊ TẾ BÀO CHO VẬN CHUYỂN

Vận chuyển đông lạnh

 Lấy các lọ có chứa tế bào

đông lạnh ra khỏi tủ nitơ lỏng

 Đặt lên băng khô trong thùng

cách nhiệt

Trang 45

- Cấy chuyển các tế bào lớp đơn hay huyền phù tế bào sang môi trường

mới nhằm cung cấp chất dinh dưỡng và không gian cho các dòng tế bào phát triển liên tục

- Đông lạnh tế bào nuôi cấy ngăn cản sự thay đổi do trôi dạt di truyền

và tránh mất mẫu nuôi cấy do lão hóa, hay vô tình làm nhiễm mẫu

- Giải đông nhằm khôi phục lại trạng thái hoạt động, đặc điểm, tính

chất của tế bào trong nuôi cấy tế bào động vật

- Đếm số lượng tế bào để xây dựng đường cong sinh trưởng, phục vụ

cho cấy chuyển tế bào

- Việc thực hiện tốt hay không tốt các kỹ thuật trên quyết định đến sự thành công hay thất bại của quá trình nuôi cấy, muốn thành công đòi hỏi người thực hiện cần phải có những đức tính: cẩn thận, tỉ mỉ, say

mê với công việc…

III- KẾT LUẬN

45

Trang 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO

(Khuất Hữu Thanh)

(Phan Kim Ngọc, Phạm Văn phúc )

culture - Current Protocols in Cell Biology

(1998), Contributed by Mary C Phelan

Trang 47

47

Tiêu đề	Kỹ Thuật Cấy Nuôi Cấy Tế Bào Động Vật
Tác giả	Lê Văn Vẻ, Vũ Thị Huế, Sa Thu Giang, Lê Thị Xuân, Vũ Thị Hường, Hoàng Văn Phúc, Phạm Thị Sang, Đoàn Hữu Thanh
Người hướng dẫn	TS. Nguyễn Hữu Đức
Trường học	Trường Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội
Chuyên ngành	Công Nghệ Sinh Học
Thể loại	Đồ Án Tốt Nghiệp
Năm xuất bản	2011
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	47
Dung lượng	1,58 MB