Phân biệt ba loại thịt heo, bò cừu bằng phương pháp multiplex PCR

Phân biệt ba loại thịt heo, bò cừu bằng phương pháp multiplex PCR

******  ******

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÕNG

KEO LÁ TRÀM (Acacia auriculiformis)

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Niên khóa: 2003-2007

Sinh viên:Trần Thị Thanh Hương

******  ******

SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÕNG

KEO LÁ TRÀM (Acacia auriculiformis)

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

TS VƯƠNG ĐÌNH TUẤN TRẦN THỊ THANH HƯƠNG Niên khóa: 2003-2007

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007

LỜI CẢM ƠN

Con xin cảm ơn Ba Má cùng các anh chị trong gia đình đã nuôi dạy con đến ngày khôn lớn và cho con ăn học thành tài

 Chân thành cảm ơn!

Trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

Phân viện nghiên cứu khoa học kĩ thuật lâm nghiệp Nam bộ

Trung Tâm Công nghệ sinh học TP Hồ Chí Minh

Đã tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành luận án tốt nghiệp đúng tiến

Xin chân thành tri ân!

Sv: TRẦN THỊ THANH HƯƠNG

 Địa điểm nghiên cứu

Phân viện nghiên cứu khoa học kĩ thuật lâm nghiệp Nam Bộ

Trung tâm Công nghệ sinh học TP Hồ Chí Minh

 Mục đích nghiên cứu

-Xác định được chỉ thị ADN phù hợp cho nghiên cứu đa đạng di truyền Keo lá

tràm (Acacia auriculiformis) Từ đó xác định được mối quan hệ di truyền giữa các

cá thể thu thập từ những xuất xứ khác nhau, có liên hệ đến tính trạng sinh trưởng nhanh của các cá thể, góp phần phục vụ công tác chọn giống theo hướng chất lượng

cao

 Yêu cầu

- Xác định các cặp mồi để đánh giá đa dạng di truyền các dòng Keo lá tràm

- Tìm hiểu mối quan hệ di truyền của các dòng cây Keo lá tràm ở Việt Nam

 Phương pháp nghiên cứu

- Sử dụng kĩ thuật PCR để khuếch đại DNA ly trích từ mẫu lá của 100dòng Keo

lá tràm thu được với 9cặp mồi

 Kết quả

- Bước đầu thanh lọc được một số cặp mồi SSR được sử dụng cho phân tích đa dạng di truyền Và có sự khác nhau về trọng lượng các bands của các cá thể phân tích và có sự biến động di truyền giữa các cá thể

 Kết luận

- Thí nghiệm đã thanh lọc đƣợc một số cặp mồi (Am 341, Am 326 và Am 770)

có thể cho hiệu quả phân tích đa dạng di truyền Keo lá tràm khá tốt

MỤC LỤC

ĐỀ MỤC TRANG

TRANG TỰA ii

LỜI CẢM ƠN iii

TÓM TẮT iv

MỤC LỤC v

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH SÁCH CÁC HÌNH ix

DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ x

Phần 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu và mục đích nghiên cứu của đề tài 2

1.4 Giới hạn của đề tài 2

Phần 2 TỔNG QUAN 4

2.1 Giới thiệu về đa dạng sinh học 4

2.1.1 Định nghĩa 4

2.1.2 Ý nghĩa của đa dạng sinh học 4

2.1.3 Các phân mức về đa dạng sinh học 4

2.1.3.1 Sự đa dạng về hệ sinh thái 4

2.1.3.2 Đa dạng loài 5

2.1.3.3 Đa dạng về di truyền 6

2.2 Một số DNA marker sử dụng nghiên cứu sự đa dạng di truyền 7

2.2.1 Phân loại 7

2.2.2 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) 8

2.2.3 Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) 9

2.2.4 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) 10

2.2.5 SSR (Microsatellite) 10

2.3 Kỹ thuật Microsatellite 11

2.3.1 Khái niệm về Microsatellite 11

2.3.2 Tính chất 12

2.3.3 Sự phát triển của primer Microsatellite 13

2.3.4 Giới hạn của Microsatellite 14

2.3.5 Các loại Microsatellite 15

2.3.6 Cơ chế hình thành và vai trò của Microsatellite 15

2.3.6.1 Cơ chế hình thành Microsatellite 15

2.3.6.2 Vai trò của Microsatellite 17

2.3.7 Các phương pháp phát hiện Microsatellite 18

2.3.7.1 Phương pháp lai 18

2.3.7.2 Phương pháp PCR 19

2.4 Polymerase Chain Reaction (PCR) 19

2.4.1 Khái niệm 19

2.4.2 Thành phần và vai trò của các chất trong phản ứng PCR 20

2.4.4 Ứng dụng của kỹ thuật PCR 23

2.4.5 Ưu và nhược điểm của kỹ thuật PCR 23

2.5 Quy trình ly trích DNA thực vật 23

2.5.1 Định lượng DNA bằng phương pháp quang phổ 25

2.5.2 Định tính DNA ly trích bằng phương pháp điện di 26

2.6 Tổng quan về cây Keo lá tràm (Acacia auriculiformis) 28

2.6.1 Vài nét về chi Keo (Acacia) 28

2.6.1.1 Đặc điểm sinh học của các loài Keo 28

2.6.1.2 Công dụng của các loài Keo (Acacia) 30

2.6.2 Vài nét về cây Keo lá tràm (Acacia auriculiformis A Cunn ex Benth) 32

2.6.2.1 Các đặc điểm sinh học và sinh thái 33

2.6.2.2 Công dụng và tiềm năng gây trồng 35

Phần 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 36

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 36

3.1.1 Thời gian thực hiện 36

3.1.2 Địa điểm thực hiện 36

3.2 Vật liệu thí nghiệm 36

3.3 Phương pháp thí nghiệm 36

3.4 Thiết bị và dụng cụ 37

3.5 Ly trích DNA 37

3.5.1 Hóa chất 37

3.5.2 Quy trình ly trích DNA 38

3.5.3 Kiểm tra sản phẩm DNA ly trích 40

3.6.1 Qui trình phản ứng PCR 40

3.6.2 Điện di sản phẩm PCR 42

Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44

4.1 Quá trình ly trích 44

4.2 Phản ứng PCR 44

Phần 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48

5.1 Kết luận 48

5.2 Đề nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC

 CTAB: Cetyltrimethylammonium bromide

 DNA: Deoxyribonucleic acid

 dNTP: Deoxynucleotide triphosphate

 EDTA: Ethylene diaminetetra acetic acid

 EtBt: Ethidium bromide

 Kb: kilobases

 mM: milimolar (milimol/lite)

 PCR: Polymerase chain reaction

 RNA: Ribonucleic acid

 RNase: Ribonuclease

 SSR: Single sequence repeat

 Ta : Annealing temperature (nhiệt độ bắt cặp)

 TAE: Tris-glacial acetic acid- ethylenne diamine tetra acetic acid

 TE: Tris-EDTA (ethylenne diamine tetra acetic acid)

 Tm: Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy)

 U: Đơn vị hoạt tính của Taq

 UV: Ultra Violet

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1: Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân 16

Hình 2.2: Cơ chế trƣợt lỗi trong quá trình sao mã 16

Hình 2.3:Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR 20

Hình 2.4: Hình thái lá các loài Keo(Acacia) 29

Hình2.5:Hình thái một số loài Keo 30

Hình 2.6 Keo lá tràm 33

DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ

Bảng 2.1: Các loại marker DNA (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2005) 8

Bảng 2.2: Sự phân tách các đoạn DNA trong gel agarose 27

Bảng 2.3: Sự phân tách các đoạn DNA trong gel polyacrylamide 27

Bảng 2.4:Các ancaloit trong các loài Keo (Alexander Shulgin TiHKAL) 32

Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng trong quá trình ly trích DNA 38

Bảng 3.2: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 41

Bảng 3.3: Trình tự các SSR’Primer sử dụng 41

Sơ đồ 3.1: Quá trình ly trích mẫu DNA 39

Phần 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay cùng với sự phát triển của đời sống, kinh tế, xã hội, nhiều sản phẩm làm từ các chất liệu như nhựa, nhôm, hợp kim,…,đã ra đời với nhiều công dụng tiện lợi phục vụ cho đời sống tất bật của xã hội loài người trong giai đoạn phát triển vũ bão Tuy nhiên các sản phẩm này vẫn không thể nào thay thế được hoàn toàn sự hiện diện của các sản phẩm được làm từ gỗ như: bàn ghế, cửa, kệ, tủ, hàng thủ công mỹ nghệ, tập sách vở…trong các gia đình, công sở, nhà hàng, khách sạn, phòng triển lãm, khu trưng bày, trường học,…Do các sản phẩm làm từ gỗ mang lại sang trọng, ấm cúng, gần gũi với thiên nhiên cho không gian sử dụng, và chúng còn

có thể tái chế Vậy mà thực tế cho thấy nguồn nguyên liệu gỗ ngày càng suy kiệt, giảm chất lượng do sự khai thác bừa bãi, nạn phá rừng của con người, thiên tai lũ lụt, hạn hán, cháy rừng, sự ô nhiễm môi trường

Keo lá tràm hay còn gọi Keo bông vàng, là loại cây mọc nhanh có xuất xứ từ Australia, Papua, New Guinea và Indonesia,…(Turnbull,1986) Được du nhập vào Việt Nam từ thập niên 60 của thế kỉ XX, với mục đích chủ yếu là cung cấp nguồn

nguyên liệu cho sản xuất giấy, làm đồ trang trí nội thất, làm than củi,

(http://snnptnt.thanhhoa.gov.vn) Tại Việt Nam hiện nay, Keo lá tràm được trồng phổ biến ở nhiều địa phương, tập trung chủ yếu ở các tỉnh miền Trung và vùng Đông Nam Bộ Keo lá tràm đóng góp một cách có ý nghĩa trong ngành công nghiệp sản xuất giấy, nghề chế tác hàng thủ công mỹ nghệ và cũng như đời sống của nông dân trồng rừng (Bùi Việt Hải,1998) Vì vậy việc chọn và tạo giống Keo lá tràm chất lượng cao với năng suất cao, chống chịu sâu bệnh là một nhu cầu hết sức cấp thiết đặt ra cho ngành lâm nghiệp Việc nghiên cứu chọn giống Keo cũng đã được triển khai từ hàng chục năm nay ở Viện Khoa học lâm nghiệp nhưng biện pháp chủ yếu

là nhập hạt giống chất lượng cao, khảo nghiệm và chọn giống theo phương pháp cổ điển của các dòng cây trội Việc nghiên cứu chọn giống Keo sử dụng chỉ thị phân tử

hoặc trên các cơ sở kỹ thuật cao hầu như chưa có nhiều Các phương pháp chọn giống cổ điển tuy đã góp phần hình thành nên những giống vật nuôi đa dạng, nhưng

do chỉ tiêu chọn thuộc về hình thái, chủ yếu về kiểu hình và chỉ tiêu sinh hóa thường không ổn định và chịu ảnh hưởng rất mạnh bởi môi trường Sử dụng chỉ thị phân tử (DNA marker) để chọn giống sẽ bỏ qua các biến động không di truyền đồng thời theo dõi được các biến động di truyền không thể hiện ra kiểu hình Hiểu biết về cấu trúc di truyền phân tử sẽ giúp chúng ta có cơ sở vững chắc trong việc sử dụng nguồn tài nguyên thực vật một cách có hiệu quả hơn để cải thiện giống cây trồng, phục vụ tốt hơn công tác quản lí và bảo tồn đa dạng sinh học, rút ngắn thời gian của quá trình chọn, tạo giống phục vụ cho công tác trồng rừng

Nhằm góp phần đánh giá tính đa dạng di truyền của các dòng Keo lá tràm

(Acacia auriculiformis) ở Việt Nam, đề tài “Đánh giá tính đa dạng di truyền của các dòng Keo lá tràm (Acacia auriculiformis)” được thực hiện do sự phân công của bộ

môn Công Nghệ Sinh Học và sự hướng dẫn chính của TS Vương Đình Tuấn

1.2 Mục đích nghiên cứu

-Xác định được chỉ thị ADN phù hợp cho nghiên cứu đa đạng di truyền Keo

lá tràm (Acacia auriculiformis) Tưd đó xác định được mối quan hệ di truyền giữa

các cá thể thu thập từ những xuất xứ khác nhau, có liên hệ đến tính trạng sinh trưởng nhanh của các cá thể, góp phần phục vụ công tác chọn giống theo hướng chất lượng cao

1.3 Yêu cầu

- Xác định các cặp mồi để đánh giá đa dạng di truyền các dòng Keo lá tràm

- Tìm hiểu mối quan hệ di truyền của các dòng cây Keo lá tràm ở Việt Nam

1.4 Giới hạn của đề tài

Do quỹ thời gian và kinh phí còn hạn chế nên chúng tôi mới chỉ dừng lại ở việc thanh lọc các cặp mồi SSR để tìm ra những cặp mồi thích hợp cho những nghiên cứu tiếp theo trong việc hoàn thiện đánh giá đa dạng di truyền Keo lá tràm

Và đề tài chỉ thực hiện trên một số mẫu nghiên cứu thu thập được ở Trạm thực

nghiệm lâm nghiệp Bàu Bàng(Bình Dương) của Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam

2.1.2 Ý nghĩa của đa dạng sinh học

Sự đa dạng của sinh vật trong thiên nhiên chứa dựng vẻ đẹp vô tận, đó chính

là nguồn cảm hứng sáng tạo và cũng là nguồn kiến thức phong phú của nhân loại

Sự đa dạng sinh học cung cấp cho con người nguồn thức ăn phong phú và đa dạng chủng loại; cung cấp nguồn hàng hoá và nguyên vật liệu phong phú và cần thiết cho nông nghiệp, cho dược học, cho khoa học công nghệ Đa dạng sinh học là nguồn tạo ra năng suất và tính bền vững trong nông nghiệp Ngoài ra đa dạng sinh học giúp duy trì các dịch vụ sinh thái quan trọng từ đó tạo cơ sở ổn định kinh tế và các hệ thống chính trị, xã hội và làm giàu chất lượng cuộc sống của chúng ta

2.1.3 Các phân mức về đa dạng sinh học

2.1.3.1 Sự đa dạng về hệ sinh thái

Đây là sự đa dạng bao trùm và cao nhất của đa dạng sinh học

Hệ sinh thái là một cộng đồng gồm các loài sinh vật sống trong một điều kiện nhất định và mối quan hệ tương hỗ giữa các sinh vật đó với các nhân tố môi trường

Hệ sinh thái bao gồm các nhân tố vô sinh và hữu sinh

Sự đa dạng hệ sinh thái thể hiện bằng sự khác nhau giữa các quần xã sinh vật Quần xã này được tạo nên do các cơ thể sống và mối liên hệ giữa chúng với nhau và với các điều kiện sống (đất, nước, khí hậu, địa hình) (OTA, 1987; FAO, 1990)

Vậy hệ sinh thái càng khác nhau thì tính đa dạng sinh học càng cao Điều kiện môi trường càng khác nhau thì hệ sinh thái nơi đó càng đa dạng

2.1.3.2 Đa dạng loài

Sự đa dạng loài được thể hiện bằng số lượng loài khác nhau cùng sống trong một vùng nhất định Loài được xác định theo cấu tạo hình thái của loài hoặc theo phân loại sinh học(http://www.nea.gov.vn)

Theo cấu tạo hình thái của loài: sự đa dạng loài xác định theo nhóm cá thể có những hình thái, sinh lý hoặc hoá sinh đặc trưng, khác biệt với các nhóm khác Thường được vận dụng để định danh loài, đặt tên khoa học cho những mẫu vật mới

Phân loại sinh học loài: sự đa dạng loài xác định theo nhóm cá thể có khả năng giao phối với nhau tạo con lai hữu thụ, không giao phối sinh sản với các nhóm khác Cách này được sử dụng để nghiên cứu quá trình tiến hoá khảo sát mối quan hệ

Vì vậy nghiên cứu về phân loại học để xác định loài của một nhóm loài và định loài của những mẫu vật mới chưa được biết đến, nhằm tạo cơ sở xây dựng và bảo vệ sự đa dạng loài là rất cần thiết

2.1.3.3 Đa dạng về di truyền

Đa dạng di truyền là phân mức cơ bản nhất trong đa dạng sinh học

Đa dạng di truyền thể hiện qua sự khác nhau của tất cả các gen di truyền của tất cả các cá thể thực vật, động vật, nấm, và vi sinh vật Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gen giữa các cá thể tồn tại trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau (http://www.nea.gov.vn/html/DDDT)

Đa dạng di truyền tạo nên sự khác biệt giữa các cá thể trong quần thể.Xét cho cùng, đa dạng di truyền chính là sự biến dị của sự tổ hợp trình tự của bốn cặp bazơ cơ bản, thành phần của axit nucleic, tạo thành mã di truyền Nghiên cứu về đa dạng di truyền là các nghiên cứu cơ bản và chính xác nhất sự khác biệt về loài Sự

đa dạng về mặt di truyền trong loài chịu ảnh hưởng bởi tập tính sinh sản của các cá thể trong quần thể Các cá thể trong một quần thể thường có bộ gene khác nhau Sự

đa dạng về bộ gene này là do các cá thể có các gene khác nhau, dù chỉ là rất ít (Lâm

Vỹ Nguyên, 2006)

Những hình thái khác nhau của gene được thể hiện bằng những alleles và những khác biệt do sự đột biến Những alleles khác nhau của một gene có thể ảnh hưởng đến sự phát triển và đặc điểm sinh lý của mỗi cá thể theo cách khác nhau

Những sự khác biệt về gene trong di truyền học tăng dần khi con cái nhận đầy đủ tổ hợp gene và nhiễm sắc thể của bố mẹ thông qua sự tái tổ hợp của các gene trong quá trình sinh sản Các gene trao đổi trong quá trình giảm phân và một tổ hợp mới được thiết lập khi nhiễm sắc thể của cả bố và mẹ kết hợp thành một tổ hợp thống nhất mới cho con cái

Tổng các gene và alleles trong một quần thể là vốn gene của quần thể và những tổ hợp của các alleles mà mỗi cá thể có được gọi là kiểu gen – kiểu di truyền (genotype) Kiểu hình (phenotype) của mỗi cá thể được biểu hiện bởi các đặc điểm

về hình thái, sinh lý, hoá sinh và được đặc trưng bởi các kiểu di truyền trong từng môi trường nhất định

Số lượng khác biệt nhau về gene trong một quần thể được xác định bởi số gene trong vốn gene đó, thường mỗi gene có nhiều hơn một allele (các gene đa hình) và số các alleles cho mỗi một gene đa hình Sự tồn tại của các gene đa hình cho phép các cá thể trong quần thể có thể có kiểu gene dị hợp tử, có nghĩa là cá thể nhận được những alleles khác nhau từ các gene của mỗi bố mẹ Sự khác biệt về gene cho phép các loài thích ứng được với sự thay đổi của môi trường

2.2 Một số DNA marker sử dụng nghiên cứu sự đa dạng di truyền

2.2.1 Phân loại

Về bản chất, bất kỳ chuỗi mã DNA nào được dùng để phân biệt hai cá thể, hai dòng hoặc hai giống khác nhau đều có thể xem như một DNA marker Những marker có tính chất như vậy rất cần thiết vì số lượng của chúng lớn hơn rất nhiều so với các marker hình thái, marker ở dạng protein (isoenzyme) (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2005)

Dựa vào kỹ thuật thực hiện các DNA marker có thể chia làm hai nhóm (Bài giảng CNSH cây trồng, Phạm Thành Hổ):

- Marker dựa trên cơ sở lai DNA: RFLP

- Marker dựa trên sự khuếch đại DNA bằng kỹ thuật PCR: ALP, AFLP, SSR, SSCP, RAPD

Dựa trên kiểu hình có thể chia DNA marker thành hai nhóm (CNSH cây trồng, Phạm Thành Hổ):

- Marker đồng trội: Những marker có thể phân biệt được cá thể đồng hợp

tử và cá thể dị hợp tử Bao gồm marker allozyme, Microsatellite, RFLP

- Marker trội: Những marker không thể phân biệt những cá thể đồng hợp

tử và dị hợp tử Bao gồm RAPD, AFLP

Bảng 2.1 : Các loại marker DNA (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2005)

SSR Simple Sequence Repeat (Microsatellite)

2.2.2 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)

Ngay từ klhi ra đời, RFLP một chỉ thị phân tử rất hữu dụng trong việc đánh

giá đa dạng di truyền RFLP được định nghĩa là tính đa hình chiều dài các phân

đoạn cắt giới hạn, biểu hiện sự khác nhau về kích thước các phân đoạn được tạo ra khi cắt DNA bằng các enzyme cắt giới hạn (restriction enzyme-RE) khi có sự thay đổi trình tự trên DNA bộ nhân hoặc trong các bào quan khác (Wayne Powell và ctv,1996)

Ngày nay, RFLP là kỹ thuật phân tích đa dạng di truyền được sử dụng phổ biến nhất Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme cắt hạn chế (RE) đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gene DNA bộ gene sẽ được cắt bằng các enzyme cắt giới hạn, chạy điện di qua gel agarose, thấm qua màng lai và lai với một mẫu dò DNA (được đánh dấu phóng xạ) liên kết với một

locus đặc biệt Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau (Wayne Powell và ctv,1996)

RFLP có ưu điểm là marker đồng trội cho phép phân biệt được cá thể đồng hợp và dị hợp Do kích thước DNA khảo sát trong RFLP lớn vì vậy số lượng marker tạo ra nhiều đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu Tuy nhiên do qui trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm đối với sức khoẻ người nghiên cứu (do phải sử dụng phóng xạ đánh dấu), DNA yêu cầu có chất lượng cao đã làm hạn chế việc sử dụng

kỹ thuật này

Cùng với sự phát triển kỹ thuật PCR, kỹ thuật RFLP trở nên đơn giản hơn Một cặp mồi oligonucleotide có thể dùng khuếch đại một vùng DNA cần khảo sát, sau đó đoạn DNA được khuếch đại được cắt bằng các restriction enzyme, điện di và phân tích trên gel nhuộm ethidium bromide hoặc bạc PCR-RFLP bỏ qua bước lai phóng xạ nên giá thành rẻ hơn và ít nguy hiểm hơn phương pháp RFLP

2.2.3 Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP)

AFLP được định nghĩa là sự đa hình các đoạn cắt khuếch đại, là kỹ thuật kết hợp giữa RFLP và PCR AFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gene, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR AFLP có thể dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả những dòng đẳng gene Sự khác nhau trong chiều dài các đoạn khuếch đại có thể do những thay đổi của các base trong vùng trình tự mồi, hoặc thêm, mất đoạn ở giữa hai vị trí cắt (

Powell et al, 1996; Winfield et al, 1998)

Thông thường, trong AFLP sử dụng một cặp restriction enzyme gồm một enzyme cắt thường xuyên và một enzyme cắt không thường xuyên Enzyme cắt thường xuyên tạo ra những trình tự nhỏ và enzyme cắt không thường xuyên sẽ nhằm hạn chế số lượng các đoạn cắt Cặp enzyme thường được dùng nhất là EcoRI

- MseI Sau khi cắt bằng cặp enzyme này, một trình tự nối mạch đôi (adaptor) sẽ được gắn vào hai đầu đoạn DNA cắt bằng enzyme ligase Đoạn adaptor gồm 2 phần: phần trình tự lõi và phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme Mồi của phản

ứng PCR được thiết kế dựa trên trình tự adaptor và chứa một trình tự chọn lọc khoảng vài nucleotide Chỉ những phân đoạn DNA nào chứa cả trình tự adaptor và trình tự nucleotide chọn lọc mới được khuếch đại, chính trình tự chọn lọc sẽ làm

giảm sự xuất hiện sản phẩm PCR và làm đơn giản quá trình phân tích.( Matthes et al., 1998; Karp et al., 1997)

AFLP nhanh, không phức tạp như RFLP nhưng vẫn khảo sát được toàn bộ gene Kỹ thuật này đòi hỏi ít lượng DNA ban đầu Tuy nhiên, thông tin di truyền phải được biết rõ để chuẩn bị primer tương ứng, và AFLP là một marker trội, điều này làm hạn chế phân biệt cá thể đồng hợp và dị hợp

2.2.4 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA)

Là phương pháp xác định sự đa hình về kích thước các đoạn DNA sau khi thực hiện PCR mẫu DNA thí nghiệm Kỹ thuật cho phép phát hiện thể đa hình mà không cần biết trước thứ tự các nucleotide bằng cách dùng các primer tổng hợp, đơn, ngắn, dãy mã được thiết kế ngẫu nhiên để thực hiện PCR Sau khi bắt cặp tại các vị trí chuyên biệt trên sợi DNA, primer tiến hành sự khuếch đại để tạo ra các đoạn có kích thước khác nhau, có khi lên tới 2 kb Các đoạn với kích thước khác nhau này được nhận biết bằng điện di Một primer có thể tạo nên sự đa hình DNA giữa các cá thể và các đoạn đa hình này có thể được dùng như những marker để xác định sự đa dạng di truyền RAPD được xem như một phương pháp tạo sự đa hình DNA nhanh và hữu hiệu Các bộ kit primer dùng cho RAPD đã được thương mại hóa trên thị trường và các primer cũng rất dễ được tổng hợp Về trang thiết bị chỉ cần có máy PCR và hệ thống điện di Cần quan tâm đến yếu tố nồng độ DNA, điều kiện thí nghiệm, chương trình chạy PCR và cần lựa chọn primer thích hợp cho sự đa hình cao (Harris,1999)

2.2.5 SSR (Microsatellite)

Rải rác ở những vị trí khác nhau trên bộ gene eukaryote là những vùng có tính biến dị cao Những vùng này có chứa các trình tự DNA gọi là VNTR (variable number tandem repeat) còn gọi là các tiểu vệ tinh Các VNTR này đặc trưng bởi số

lần lặp lại của trình tự lõi (đơn vị trình tự) DNA như: (AC)n, (AG)n, (AT)n, (TAT)n, (TCT)n, (CAG)n … Do số lần lặp lại của mỗi microsatellite là khác nhau ở mỗi cá thể nên tính đa hình tạo ra khi sử dụng phương pháp này là rất cao

Dựa trên trình tự DNA, microsatellite được bảo tồn ở các cá thể cùng loài cho phép chúng ta thiết kế mồi để khuếch đại trình tự lặp lại trong toàn bộ kiểu gene, trình tự mồi sử dụng trình tự đặc hiệu ở hai đầu locus microsatellite Kích thước các đoạn DNA được khuếch đại thường từ 100 - 200 bp Kết quả tạo ra các đoạn DNA có chiều dài khác nhau phân tách trên gel polyacrylamide

Xác định trình tự đặc hiệu hai đầu locus microsatellite là bước đầu tiên rất quan trọng trong việc phân tích kỹ thuật này Do đó, việc sử dụng microsatellite gặp phải nhược điểm lớn là phải xác định trình tự đặc hiệu cho mỗi locus đa hình Ưu điểm lớn nhất của microsatellite là có tính đa hình cao và là một marker đồng trội

2.3 Kỹ thuật Microsatellite

2.3.1 Khái niệm về Microsatellite

Microsatellite (SSR marker): Một dạng của VNTR (variable number of tandem repeats) là chuỗi mã di truyền lặp lại rất đơn giản thường xảy ra ngẫu nhiên trên hầu hết genome thực vật (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang,2005), là một đoạn DNA được mô tả đặc điểm bởi sự xảy ra của số lượng bản copy biến thiên (từ một vài bản lên đến 30 hay nhiều hơn) của dãy trong vòng 5 hoặc số bases ít hơn (gọi là đơn vị lặp lại) Một microsatellite điển hình có đơn vị lặp lại AC, xảy ra ở khoảng 100.000 vị trí khác nhau trong bộ genome động vật điển hình Ở bất kì một vị trí nào (locus), thường xuyên có khoảng 5 – 7 “alleles” khác nhau, mà mỗi alleles có thể nhận biết tuỳ thuộc vào số đơn vị lặp lại Những alleles này có thể phát hiện bởi PCR , sử dụng primers được thiết kế từ một dãy đơn và cũng có trên cả mặt kia của microsatellite Khi sản phẩm PCR được chạy trên gel điện di, alleles được ghi nhận khác biệt về độ dài trong giá trị đến kích cỡ của đơn vị lặp lại,

Microsatellite là một marker DNA chuẩn, chúng dễ dàng được phát hiện bằng PCR và chúng có khuynh hướng xác định vị trí bằng nhau từ đầu đến cuối của genome Hàng ngàn SSR đã được lập bản đồ trong nhiều loài khác nhau

Tóm lại, microsatellite ngày nay trở thành một thuật ngữ chung nhất để miêu

tả các trình tự lặp lại ngắn và ngẫu nhiên, thay vì sử dụng các thuật ngữ STR (short tandem repeats) hay VNTR (variable number of tandem repeats) (Edward; 1991) Microsatellite bao gồm các đoạn lặp lại ngắn từ 2 - 6 bp và kích thước tại mỗi locus

là 20 - 100 bp Microsatellite được tìm thấy trong tất cả cơ thể sống, đặc biệt là ở những cơ thể sống có bộ gen lớn và phân bố đều trên genome

Microsatellite có tính đa hình rất cao, là những codominant-al hay al đồng trội (bao gồm 2 loại: al đồng hợp và al dị hợp), nó có các tính chất cần thiết cho một marker Tần số đột biến từ 104 - 5.10-6, tuân theo định luật Mendel Vị trí của microsatellite trên nhiễm sắc thể có thể được xác định bằng PCR từ một lượng DNA rất nhỏ Xác định microsatellite PCR trên một loài nào đó thì có thể áp dụng trên những loài khác có quan hệ họ hàng

2.3.2 Tính chất

Những markers này thường hiện diện với mức độ cao của hiện tượng đa hình, đặc biệt khi số lần lặp lại lớn hơn hoặc bằng 10 Trình tự được lặp lại thường đơn giản, bao gồm 2, 3 hoặc 4 nucleotides (tương ứng với việc lặp lại di-, tri-, và tetranucleotide), và có thể được lặp lại từ 10 đến 100 lần Sự lặp lại của nucleotide

CA xảy ra rất thường xuyên trong bộ gene người và các loài khác, và được hiện diện trong khoảng vài ngàn bases pair Như vậy có sự xuất hiện thường xuyên của nhiều alleles tại vị trí microsatellite, kiểu gene trong phả hệ thường cung cấp đầy đủ thông tin về di truyền, trong đó alleles đặc thù của tổ tiên có thể được nhận biết dễ dàng Bằng cách này, microsatellite là marker lý tưởng để xác định nguồn gốc, nghiên cứu di truyền quần thể và bản đồ tái tổ hợp Nó còn là marker phân tử dùng

để cung cấp đầu mối về những alleles có mối quan hệ gần nhau hơn

Microsatellite thường thay đổi với tỉ lệ đột biến tăng dần so với vùng trung tính khác của DNA Tỉ lệ đột biến cao này có thể được giải thích bởi sự bắt cặp sai trong bộ phận trượt (slipped strand mispairing - sự giữ không đúng mục tiêu) trong suốt quá trình sao chép DNA trên một chuỗi đơn xoắn kép Sự đột biến cũng xảy ra suốt quá trình tái tổ hợp trong quá trình giảm phân Một vài lỗi sai mục tiêu được sửa bởi cơ chế đọc và sửa trong nhân, thế nhưng một vài đột biến có thể không được sửa chữa Kích thước của đơn vị lặp lại, số lần lặp lại và sự hiện diện của sự lặp lại khác nhau là tất cả các yếu tố, cũng như là tính thường xuyên của sự dịch mã trong khu vực của DNA lặp lại Sự gián đoạn của microsatellites, có thể do đột biến,

có thể là nguyên nhân trong việc giảm sự đa hình Tuy nhiên, cơ chế tương tự này thỉnh thoảng có thể dẫn đến sự khuếch đại không chính xác của microsatellites; nếu

sự sai mục tiêu xảy ra sớm trong suốt quá trình PCR, thì chiều dài không chính xác của microsatellites có thể được khuếch đại

2.3.3 Sự phát triển của primer Microsatellite

Primer của microsatellite được phát triển bởi việc tạo dòng ngẫu nhiên một đoạn DNA từ những giống loài trọng tâm Những đoạn này được chèn vào plasmid hoặc phage vector, và được chuyển tiếp vào vi khuẩn Escheria coli Khuẩn lạc sau

đó phát triển và được chụp lên phim với những trình tự nucleotide được đánh dấu huỳnh quang được lai với trình tự lặp lại của microsatellite, nếu nó có hiện diện trên đoạn DNA Nếu dòng dương tính có thể thu được từ quy trình này, đoạn DNA được đọc trình tự và primers PCR sẽ được chọn từ vùng trình tự liên kết như vùng để xác định vị trí đặc trưng Quy trình này liên quan đến những thử nghiệm thành công, khi trình tự lặp lại của microsatellites phải được dự đoán trước và primers được thu nhận ngẩu nhiên có thể không biểu hiện tính đa hình có ý nghĩa Vị trí microsatellite được trải xuyên suốt genome và có thể được thu nhận từ sự thoái hoá DNA chung của những mẫu cũ hơn, khi đó là tất cả những chất nền cần thiết và hợp lí để khuếch đại thông qua PCR

Primer microsatellite đặc trưng cho một loài sẽ giúp phát hiện sự đa hình ở những vị trí tương đồng (cùng locus trên mỗi al) đối với từng cá thể trong loài Điều

này có thể thực hiện được là nhờ trình tự microsatellite và trình tự của vùng flanking- vùng nằm ở 2 bên trình tự microsatellite để thiết kế primer- được bảo tồn trong quá trình di truyền của loài Vùng flanking rất quan trọng vì nó giúp phát hiện trình tự microsatellite đặc trưng ở mỗi locus trên nhiễm sắc thể

2.3.4 Giới hạn của Microsatellite

Microsatellite được chứng tỏ là marker phân tử hữu hiệu, đặc biệt trong nghiên cứu quần thể, thế nhưng chúng không phải không có hạn chế Microsatellite được phát triển cho những chủng đặc trưng có thể được ứng dụng thường xuyên với những chủng có mối quan hệ họ hàng gần nhau, tuy nhiên tỉ tệ phần trăm vị trí di truyền được khuếch đại thành công có thể bị giảm bởi sự gia tăng khoảng cách di truyền

Điểm đột biến trong vị trí bắt cặp của primer trong một loài nào đó có thể dẩn đến sự cố alleles không giá trị(null alleles), nơi mà primer microsatellite không thể đáp ứng để khuếch đại trong thí nghiệm PCR Sự phân kì trong trình tự ở vùng liên kết có thể dẫn đến sự bắt cặp kém của primer, đặc biệt ở vùng 3’ nơi mà sự kéo dài bắt đầu; sự khuếch đại ưu tiên của vị trí alleles đặc thù do sự cạnh tranh tự nhiên của PCR có thể dẫn đến việc cá thể dị hợp tử được ghi nhận từ đồng hợp tử (bộ

phận không có giá trị) ( M J Hayden and P J Sharp, 2001) Sự thất bại của phản

ứng PCR có thể thu nhận kết quả khi sự sai khác ở vị trí đặc thù được khuếch đại

Tuy nhiên, ảnh hưởng sai khác của quần thể nhỏ và khả năng của sự liên kết giới tính cũng cần được xem xét để không đưa ra giá trị sai của alleles không giá trị

do sự tăng tính đồng hình trong phân tích quần thể Sự khác nhau trong kích thước allele cũng không phản ánh sự khác nhau thật sự Đột biến có thể có từ sự thêm vào hay mất đi của bases và toàn bộ microsatellite có thể chịu sự nén chặt về chiều dài

Tỉ lệ đột biến thì không có tiêu chuẩn để đánh giá Vùng trung tính của một số vùng microsatellite còn đang nghi vấn, có lẽ do sự biến thiên tính trạng số lượng hoặc sự

cố trong vùng exon của genes dưới sự chọn lọc

Khi sử dụng microsatellite để so sánh loài, vị trí đồng hình có thể dễ dàng khuếch đại trong những loài có quan hệ, thế nhưng số vị trí khuếch đại thành công

trong suốt phản ứng PCR có thể giảm do sự tăng khoảng cách di truyền giữa các loài nghi vấn Đột biến trong alleles microsatellite có thể bị ảnh hưởng xấu trong trường hợp có một đoạn alleles lớn hơn chứa nhiều bases hơn, và do đó có thể được dịch sai trong quá trình phiên mã DNA Một alleles nhỏ hơn tham gia vào việc làm tăng kích thước, trong khi một alleles lớn hơn tham gia để làm giảm kích thước, khi

mà chúng có thể là nguyên nhân cho sự giới hạn trên về kích thước; sự ép buộc này

đã được xác định nhưng giá trị khẳng định là chưa chuyên biệt Nếu có một sự khác biệt lớn về kích cỡ giữa alleles của cá thể, điều đó có thể làm tăng sự không bền vững trong sự tái tổ hợp ở quá trình giảm phân

Trong tế bào khối u, nơi mà sự kiểm soát trên phiên mã bị phá hủy, microsatellite có thể tăng thêm hay mất đi thường xuyên ở tỉ lệ đặc biệt cao trong mỗi chu kỳ nguyên phân Do đó một dòng tế bào khối u có thể chỉ ra những đặc

điểm khác biệt di truyền từ những mô kí chủ đó

2.3.5 Các loại Microsatellite

Căn cứ vào cấu tạo của đơn vị lặp lại (2-6 lần) chúng ta có :

Mononucleotide SSR (A) AAAAAAAAAAA Dinucleotide SSR (GT)6 GTGTGTGTGTGT Trinucleotide SSR (CTG)4 CTGCTGCTGCTG Tetranucleotide SSR (ACTC)4 ACTCACTCACTCACTC Trinucleotide SSR xuất hiện ít hơn dinucleotide SSR khoảng 10 lần, và

tetranucleotide SSR còn hiếm hơn nữa (Ma và ctv., 1996)

2.3.6 Cơ chế hình thành và vai trò của Microsatellite

2.3.6.1 Cơ chế hình thành Microsatellite

Cơ chế đột biến hình thành microsatellite vẫn chưa được hiểu biết một cách đầy đủ Di truyền học và các nghiên cứu khác cho rằng cơ chế xuất hiện và hình thành microsatellite là do hai quá trình: quá trình bắt chéo lỗi trong quá trình giảm

phân (unequal crossing- over during meiosis) hoặc quá trình trƣợt lỗi trong sao mã (replication slippage) Và quá trình trƣợt lỗi trong sao mã đƣợc coi là nguyên nhân chủ yếu trong việc hình thành các microsatellite, nó xảy ra trên mạch chậm (lagging strand) Quá trình này liên quan đến quá trình trƣợt lỗi của enzyme polymerase trên phân tử DNA mới tổng hợp từ đó tạo ra một chỗ phình nhất thời có thể bị loại bỏ trong quá trình sửa lỗi hoặc có thể kéo dài thêm ở mạch đối diện tạo thành một đoạn lặp lại dài hơn

Hình 2.1: Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân

Hình 2.2: Cơ chế trƣợt lỗi trong quá trình sao mã

2.3.6.2 Vai trò của Microsatellite

Rất nhiều microsatellite đã được tìm thấy ở vùng phía trên của các vùng khởi

đầu sao mã của vùng mang mã Chức năng rõ rệt của những vùng như vậy vẫn còn

chưa rõ ràng, mặc dù người ta tìm thấy chúng tồn tại giữa các vùng exon và có liên quan tới các bệnh di truyền

Microsatellite được dùng như một marker di truyền để nghiên cứu về di truyền quần thể, quan hệ tiến hóa, lập bản đồ gen Tuy nhiên có rất nhiều chứng cứ cho rằng trình tự microsatellite cũng đóng vai trò là yếu tố mang mã hoặc nhân tố điều hòa Microsatellite được tìm thấy khắp nơi ở phần trước vùng khởi đầu sao mã của vùng mang mã, và một số đã được tìm thấy có quan hệ với vùng mã hoá Số lượng khác nhau của các đoạn lặp lại của microsatellite ở vùng mã hoá có quan hệ với sự biểu hiện của gene và chức năng của gene

Ở một số trường hợp, sự thay đổi (mất hoặc thêm) các đơn vị lặp lại của microsatellite cũng làm thay đổi chức năng hoạt động của promotor Vị trí của microsatellite gần hay xa promotor cũng làm hoạt động của promotor thay đổi Vùng điều khiển có chứa microsatellite hoạt động như một nhân tố thúc đẩy quá trình phiên mã và những đột biến mất đoạn microsatellite đã làm giảm chức năng của gen

Microsatellite cũng liên kết với các protein bám mà các protein này có chức năng bám dính vào các trình tự khởi động của gene, khi trình tự này được giải phóng thì gen được khởi động và sao mã Điều này chỉ ra rằng microsatellite hoạt động như một yếu tố điều hòa trong quá trình sao mã, ảnh hưởng đến quá trình sao

mã thông qua ảnh hưởng đến protein bám Rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng ảnh hưởng thúc đẩy của microsatellite và protein bám dính của nó là một chức năng của các đoạn lặp lại trong một vùng microsatellite đặc biệt nào đó Như một trình tự mang mã, microsatellite đã được tìm thấy biểu hiện ở rất nhiều protein và sự khác nhau về số lần lặp lại của các trình tự trong microsatellite có thể dẫn đến sự khác

nhau về chức năng của protein và hoạt động của gen, do đó có thể ảnh hưởng đến chức năng sinh lý cũng như sự phát triển của cơ thể

Một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng có sự ảnh hưởng của chiều dài khác nhau của microsatellite đến hình thái và sự phát triển ở mức độ cơ quan được tổng kết lại như một yếu tố chức năng của hệ gen Những tính chất đặc biệt của microsatellite như sự đột biến điểm dẫn đến những giả thiết cho rằng microsatellite

có thể là một nguồn chủ yếu tạo nên sự đa dạng về di truyền số lượng và quá trình tiến hóa thích nghi (Kashi và ctv., 1997) Nó cho phép một quần thể có thể khôi phục lại nguồn đa dạng di truyền đã bị mất trong quá trình chọn lọc, nó hoạt động như một “núm điều chỉnh” mà qua đó những gen đặc biệt có thể điều chỉnh nhanh chóng các phản ứng thay đổi ít hay nhiều trong quá trình đòi hỏi của tiến hóa (King

và ctv., 1997) Do vậy microsatellite là một nguồn rất quan trọng trong việc nghiên cứu đa dạng di truyền và làm cơ sở cho sự thay đổi của tiến hóa

2.3.7 Các phương pháp phát hiện Microsatellite

Có 2 phương pháp để phát hiện microsatellite: phương pháp lai và phương pháp PCR

2.3.7.1 Phương pháp lai

Phương pháp lai phân tử cho phép xác định chính xác kiểu microsatellite bằng cách chuyển qua màng lai, cùng một lúc có thể phát hiện nhiều kiểu microsatellite bằng các mẫu dò khác nhau Tuy nhiên xác định chiều dài của chúng còn bị hạn chế

Trong phương pháp lai có hai cách: phương pháp phát hiện nhờ đồng vị phóng xạ và phương pháp nhuộm bạc

 Phương pháp phát hiện nhờ đồng vị phóng xạ

Phương pháp hiệu quả và được dùng đầu tiên là đồng vị phóng xạ Người ta

có thể đánh dấu vào một đầu của primer (end-labelling) hoặc đánh dấu và trộn lẫn một trong bốn thành phần nucleotide A, T, G, C (incorporation-labelling) Nhưng

ngày nay phương pháp dùng đồng vị phóng xạ rất ít được sử dụng vì nguy hiểm đến sức khỏe con người và đòi hỏi việc xử lí chất thải tốn kém

 Phương pháp nhuộm bạc (phát hiện không dùng phóng xạ)

Phương pháp này rẻ, không hại, nhưng độ nhạy cao, đòi hỏi một số kỹ thuật rắc rối khi nhuộm

2.3.7.2 Phương pháp PCR

Phương pháp PCR sử dụng màu huỳnh quang để đánh dấu primer forward và

sử dụng máy giải trình tự tự động

Phương pháp này được phát triển cùng với sự phát triển của màng giải trình

tự nucleotide để phát hiện sản phẩm PCR được đánh dấu bởi một chất nhuộm huỳnh quang (end-labelling primer hoặc incorporation) Khi kích thích bởi tia laser, các chất nhuộm màu này giải phóng ra một tín hiệu mà máy tính có thể phát hiện được bằng cách so sánh sự di chuyển của sản phẩm PCR với DNA chuẩn, chúng ta có thể

có kích thước chính xác của đoạn DNA quan tâm

Chất huỳnh quang này được gắn vào một đầu 5’ của cặp mồi, 40 ng mồi loại này đủ dùng cho 10.000 phản ứng PCR

Phương pháp này có hiệu quả rất cao và đang được sử dụng phổ biến trên các phòng thí nghiệm trên thế giới Người ta có thể đánh dấu bằng 3 loại chất nhuộm huỳnh quang khác nhau, trong cùng một phản ứng PCR và chạy cùng một giếng điện di, kể cả kích thước các đoạn bằng nhau nhưng chúng ta vẫn có thể xác định được nhờ màu huỳnh quang khác nhau

Kết quả được thể hiện trên máy tính, nhờ đó chúng ta có thể xác định được chính xác kích thước của al, loại trừ những băng lặp lại (stuter DNA) hoặc thêm một nucleotide A…

2.4 Polymerase Chain Reaction (PCR)

2.4.1 Khái niệm

Kỹ thuật PCR được phát minh vào năm 1985 bởi nhà khoa học Mỹ Mullis và cộng sự Phát minh này đã đem đến cho Mullis giải Nobel Hóa học năm 1993

Đây là phương pháp nhằm khuếch đại một đoạn phân tử DNA nào đó một

cách đặc hiệu in vitro nhờ sự xúc tác của enzyme Taq polymerase từ một lượng

DNA mẫu rất nhỏ Đây là một kỹ thuật trong sinh học phân tử để tạo dòng DNA rất đơn giản và hiệu quả Bằng kỹ thuật PCR, hàng triệu đoạn DNA đặc hiệu và đồng nhất sẽ được thu nhận từ DNA mẫu

Hình 2.3:Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR 2.4.2 Thành phần và vai trò của các chất trong phản ứng PCR

 Mẫu DNA:

Mẫu DNA được ly trích từ nhiều bộ phận khác nhau của đối tượng nghiên cứu bằng nhiều phương pháp khác nhau Đối với DNA thực vật thường được ly trích từ mô lá, DNA động vật được ly trích từ máu, lông, mô …

Trong kỹ thuật PCR, yêu cầu về độ tinh sạch của DNA mẫu không cần cao Tuy nhiên để thu được kết quả tốt nhất nên sử dụng DNA mẫu thực sự tinh khiết

Số lượng DNA cần cho một phản ứng PCR khoảng 5-10 ng DNA thuần khiết Nồng độ DNA có thể xác định được nhờ sự đo OD (mật độ quang) ở độ dài sóng 260nm Khi DNA tinh khiết, lượng DNA được tính theo công thức :

- 1 OD260nm = 50 ng/ l (đối với DNA sợi kép)

- 1 OD260nm = 40 ng/ l (đối với DNA sợi đơn)

 Primer (mồi):

Là một đoạn acid nucleid có trình tự liên kết đặc hiệu với đoạn DNA cần khuếch đại Phản ứng PCR sử dụng một cặp primer đặc hiệu bao gồm F-primer (mồi xuôi) và R-primer (mồi ngược)

Cặp primer quyết định sự thành công của kỹ thuật PCR Nếu primer được thiết kế đúng thì đoạn DNA đích sẽ được khuếch đại chính xác

 dNTP (dATP, dCTP, dTTP, dGTP):

Nồng độ dNTPs thường được sử dụng là 20 - 200 μM Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh" Bên cạnh đó, sự cân bằng trong thành phần các dNTPs cũng ảnh hưởng đến phản ứng PCR dATP, dCTP, dTTP, dGTP được sử dụng với nồng độ như nhau Sự mất cân bằng trong thành phần các dNTPs sẽ làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase

Nồng độ dNTPs thích hợp nhất cho một phản ứng PCR còn phụ thuộc vào nồng độ Mg2+, nồng độ primer, số lượng chu kỳ của phản ứng và chiều dài của sản phẩm được khuếch đại Vì thế, nồng độ dNTPs tối ưu cho từng phản ứng phải được xác định qua thực nghiệm

 Dung dịch buffer:

Tạo môi trường thuận thích hợp nhất để Taq polymerase hoạt động

 Taq polymerase: