CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH ppt _ HÓA PHÂN TÍCH

Trắc nghiệm, bài giảng pptx các môn chuyên ngành Y dược hay nhất có tại “tài liệu ngành Y dược hay nhất”; https://123doc.net/users/home/user_home.php?use_id=7046916. Slide bài giảng môn hóa phân tích ppt dành cho sinh viên chuyên ngành Y dược. Trong bộ sưu tập có trắc nghiệm kèm đáp án chi tiết các môn, giúp sinh viên tự ôn tập và học tập tốt môn hóa phân tích bậc cao đẳng đại học ngành Y dược và các ngành khác

Bài giảng pptx các môn ngành Y dược hay nhất có tại “tài liệu ngành dược hay nhất” ;

https://123doc.net/users/home/user_home.php?

use_id=7046916

- Ảnh hượng của môi trường mẫu;

- Hàm lượng chất phân tích quá nhỏ;

- Nhiều chất có tích chất hóa học và vật lý khá giống nhau,

⇒ Khó + Định lượng chính xác;

+ Định lượng riêng từng chất;

⇒ Cần + Tách loại tạp chất và làm giàu chất phân tích;

+ Sử dụng một kỹ thuật gọi là sắc ký để tách các chất ra

khỏi nhau để định lượng;

Do đó, trong phần này chúng ta chỉ đề cập đến hai phương pháp là:

- Các phương pháp tách sắc ký;

1.1.1 Lịch sử phát triển

- Năm 1903, M C Txvet đã tiền hành tách các chất có tính chất giống nhau là α-chlorophyl, β -chlorophyl, α-xatophyl,

β-xatophyl, thành các giải màu khác nhau và Txvet gọi là “Chromatography”.

+ “Chroma”: màu và “Graphy”: ghi.

- Năm 1931, Vinterstin và Ledere đã tách được carotin;

- Năm 1941, Martin và Synge đã phát triển sắc ký giấy và đưa ra lý thuyết đĩa để giải thích các quá trình sắc ký Đồng

thời nghiên cứu tách ancaloit từ các cây thuốc để bào chế dược phẩm;

- Từ năm 1952, những máy sắc ký ra đời cũng như ngành máy tích và hàng loạt các kỹ thuật mới phát triển: GC-MS,

LC-MS.

3

1.1 Khái niệm chung

5

1.1 Khái niệm chung

1.1.2 Quá trình tách sắc ký và định nghĩa

b Định nghĩa

Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục các cấu tử chất phân tích lên 2 pha: một pha thường đứng yên,

có khả năng hấp thu chất phân tích – gọi là pha tĩnh Một pha di chuyển qua pha tĩnh – gọi là pha động Do các cấu tử chất

phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.

Quá trình sắc ký khác cơ bản với các quá trình tách khác ở 2 điểm:

- Sự phân bố chất phân tích lên 2 pha lặp đi lặp lại nhiều lần;

- Pha động đi qua pha tĩnh.

6

Cao C tiến hành sắc ký cột silica gel

pha thường cỡ hạt 0,040-0,063 mm

• Khối lượng cao C: 45 g

• Khối lượng silica gel: 700 g

• Đường kính cột: 7 cm

• Dung môi ổn định cột: petroleum

ether Lọ hứng 100 mL

Proton

số 3

HO 3 4 5 6 7

Chất ra khỏi cột

1.1 Khái niệm chung

1.1.3 Phân loại các phương pháp sắc ký

c Phân loại theo hệ pha

12 Hình 1.1 Phân loại các phương pháp sắc ký

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

SẮC KÝ LỎNG (LC) SẮC KÝ KHÍ (GC)

1.1.3 Phân loại các phương pháp sắc ký

c Phân loại theo cơ chế tách

Cơ chế tách nói lên bản chất liên kết của các chất phân tích với pha tĩnh, không cần phân biệt về hệ pha, có 04 loại cơ

1.1 Khái niệm chung

1.1.3 Phân loại các phương pháp sắc ký

 Sắc ký phân bố lỏng-lỏng (L-L):

- Phân biệt giữa sắc ký phân bố L-L và sự phân bố thông thường là ở chỗ: + Sự phân bố L-L còn gọi là sắc ký

chiết;

+ Sự phân bố nói chung là sự phân chia chất phân tích vào 2 pha không xét tới trạng thái của nó.

- Sự khác nhau cơ bản giữa sắc ký phân bố L-L và SKHP:

+ Sắc ký phân bố L-L có đường đẳng nhiệt tuyến tính ở khoảng nhiệt độ lớn, phương pháp có độ nhạy cao;

+ Pha tĩnh không được bền vững, hiện tượng trôi mất pha tĩnh làm cho độ lặp lại bị giảm.

14

1.1.3 Phân loại các phương pháp sắc ký

 Sắc ký Ion (Trao đổi ion)

- Pha tĩnh là chất rắn có khả năng trao đổi ion của nó với các ion của chất phân tích trong pha động;

- Lực liên kết giữa ion chất phân tích và pha tĩnh là liên kết tĩnh điên, phụ thuộc nhiều vào điện tích của ion chất phân

tích, pH của dung dịch và bán kính Hydrat hóa của ion chất phân tích.

15

1.1 Khái niệm chung

1.1.3 Phân loại các phương pháp sắc ký

 Sắc ký rây phân tử

- Pha tĩnh là chất rắn có diện tích bề mặt lớn, xốp, có những đường đi trong lòng chất rắn – mao quản có kích thước

cỡ phân tử.

- Các phân tử chất phân tích thấm vào chất rắn đó ở mức độ khác nhau tùy theo kích thước của chúng.

- Các phân tử có kích thước lớn không đi sâu vào pha tĩnh sẽ rửa giải nhanh; có kích thước bé đi sâu vào pha tĩnh sẽ

rửa giải chậm.

- Thời gian lưu của các chất tỉ lệ nghịch với kích thước phân tử của chúng

16

1.1.3 Phân loại các phương pháp sắc ký

c Phân loại theo cách hình thành sắc đồ

- Phân tích tiền lưu

- Phân tích thế đẩy

- Phân tích rửa giải

17

1.1 Khái niệm chung

1.1.4 Các lực liên kết trong hệ sắc ký

Trong hệ sắc ký có 3 thành phần chủ yếu:

Chất phân tích

Pha tĩnh (PhT) Pha động (PhĐ)

⇒ Chất phân tích tại sao lại lưu giữ trên PhT ?

⇒ Tại sao chất phân tích đã giữ trên PhT rồi lai đi vào PhĐ ?

⇒ Tương tác giữa 3 thành phần này như thế nào mà các chất phân tích phân bố vào PhT ở mức độ khác nhau ?

Như vậy để trả lời câu hỏi này chính là do bản chất của các thành phần trong hệ sắc ký và các lực liên kết khác nhau.

18

1.1.4 Các lực liên kết trong hệ sắc ký

a Lực liên kết ion

- Trên PhT, xét phân tử R–SO3H

R–SO3H  R–SO3 – + H + ; R–SO3 – + M +  R–SO3M

Trung tâm hoạt động ion Chất phân tích

⇒ Tương tác này là tương tác tĩnh điện – gọi là liên kết ion.

- Tương tự trong PhĐ cũng tồn tại các trung tâm hoạt động ion

⇒ Tương tác với chất phân tích và PhĐ;

- PhT có các trung tâm cation thì lưu giữ anion và ngược lại.

- Các phương pháp sắc ký thường gặp có tham gia liên kết ion được gọi là “Sắc ký ion”, “Sắc ký cặp ion”. 19

1.1 Khái niệm chung

1.1.4 Các lực liên kết trong hệ sắc ký

b Lực phân cực

- Trong phân tử chất phân tích, chất rửa giải trong pha động và các phân tử trên pha tĩnh có các trung tâm phân cực

⇒ Các trung tâm này liên kết với nhau bằng lực liên kết phân cực.

- Sự phân cực và sự chênh lệch về độ phân cực này thường là nhỏ Nhưng nó cũng là yếu tố quan trong về độ bền

liên kết khác nhau

⇒ Sự phân chia trong các phép tách sắc ký.

c Lực Van-de-van (lực phân tán)

- Lực này bản chất điện, tuy nhiên không có cực điện trong hệ;

- Do tương tác phân tán của các phân tử chứa mạnh hydro cacbon. 20

1.1.4 Các lực liên kết trong hệ sắc ký

d Lực tương tác đặc biệt

- Lực tương tác đặc biệt là do tạo bởi các liên kết hydro và liên kết cho nhận;

- Sự hình thành liên kết hydro thường xảy ra với các nguyên tố có độ âm điện cao như O, N, F, ;

- Năng lượng liên kết giảm dân theo thứ tự sau:

F H F > O H O > N H N > C H C

21

1.2 Các đại lượng đặc trưng

1.2.1 Hệ số phân bố

- Cấu tử A phân bố giữa 2 pha động – tĩnh, khi cân bằng thiết lập,

AS  AM S: pha tĩnh; M: pha động

⇒ Hệ số phân bố giữa 2 pha (KD): KD = [AS] / [AM]

Trong đó, [AS], [AM] là nồng độ cấu tử A trong pha tĩnh và pha động.

- Cân bằng trong sắc ký là cân bằng động (*) , có dạng cân bằng sau:

+ Cân bằng Lỏng – Lỏng (L – L); + Cân bằng Lỏng – Khí (L – K);

+ Cân bằng Lỏng – Rắn (L – R) + Cân bằng Rắn – Khí (R – K);

Xét ở đĩa thứ n có sự phân bố A ở 2 pha, nhưng do pha động di chuyển nên A lại đi xuống đĩa n+1 và xuất hiện cân

Xác định KD

- Để xác định KD thì cân bằng phải thiết lập nhanh, vì vậy

⇒ + Pha tính phải mỏng

+ Hệ số khuếch tan của A trong pha tĩnh lớn;

+ Hệ số khuếch tan của A trong pha động nhỏ;

- Xác định KD bằng phương pháp tĩnh, tức là đo nổng độ của A trong pha động và pha tĩnh sau khi cân bằng như sau:

Trong đó, M là lượng A ban đầu (g); M1 là lượng A còn lại sau tiếp xúc (g); V là thể tích pha động (mL); m là lượng chất hấp

1.2 Các đại lượng đặc trưng

1.2.2 Sự liên hệ giữa tốc độ di chuyển của A và KD

- Gọi fA là phần thời gian của chất A ở pha động, ta có:

Chia tử và mẫu cho [A]m Vm:

Trong đó, k’A là hệ số dung tích

- Tốc độ tuyến tính của A trong pha động: uA = u fA = u / (1 + k’A)

Trong đó, u là tốc độ tuyến tính của pha động (cm/s)

⇒ KDA hay k’A càng lớn thì chất A di chuyển càng chậm và ngược lại. 24

1.2.3 Thời gian lưu (tRA) và thời gian lưu hiệu chỉnh (t’RA)

- tRA: là thời gian tính từ lúc bơm mẫu vào đầu cột tời khi píc đạt giá trị cực đại.

Trong đó, L là chiều dài cột (cm).

- tm là thời gian A không lưu giữ trên cột (thời gian chết): tm = L / u

⇒

- tRA ’: là thời gian không tính đến thời gian chết, tức là:

tRA ’ = tRA - tm = tm kA’ ⇒

25

1.2 Các đại lượng đặc trưng

1.2.4 Thể tích lưu (VRA) và thể tích lưu hiệu chỉnh (V’RA)

- VRA: là thể tích của dung dịch rửa giải tính từ khi bắt đầu bơm mẫu vào cột tời khi píc đạt giá trị cực đại.

Gọi F là tốc độ chảy của pha động (mL/phút), VRA và Vm được tính như sau:

VRA = tRA F và Vm = tm F ⇒ VRA = Vm (1 + k’)

- V’RA: là thể tích lưu đã loại đi thể tích trống của cột.

⇒ V’RA = VRA - Vm = Vm k’ = KDA Vs

- Thể tích lưu riêng (Vg): là thể tích đặc trưng riêng cho A, là thể tích dung dịch rửa giải để rửa A trong một đơn vị thể

tích pha tĩnh

⇒ Vg = V’RA / Vs = KDA.

26

1.2.5 Hệ số tách (α) – gọi là hệ số lưu giữ tương đối

- α đặc trưng cho khả năng tách 2 chất A và B bằng phương pháp sắc ký Được xác định qua công thức sau:

α = KDA / KDB = k’A / k’B

- Điều kiện để tách A và B là α ≠ 1.

⇒ Hệ số phân bố của A và B giữa pha tĩnh và động phải khác nhau.

- Tỷ số hai hệ số phân bố cũng chính bằng tỷ số thể tích lưu riêng hay tỷ số thời gian lưu riêng của A và B Vậy có thể

xác định:

α = KDA / KDB = k’A / k’B = t’RA / t’RB = V’RA / V’RB

27

1.2 Các đại lượng đặc trưng

1.2.6 Sắc đồ

- Sắc đồ là đường biểu diễn

sự phụ thuộc của diện tích (S)

hoặc chiều cao (h) tín hiệu đo

(độ hấp thu quang, độ dẫn, tần

số xung, ) liên quan đến nồng

độ chất phân tích vào thời gian.

- Tín hiệu này được gọi là

1.2.7 Đĩa lý thuyết (n) và cách xác định n bằng thực nghiệm

- n là một phần của cột mà ở đó cân bằng phân bố A từ pha động vào pha tĩnh và ngược lại được thiết lập.

- Theo Martin và Synge cân bằng được thiết lập nhanh chóng, tức thời Tuy nhiên:

+ Không giải thíc được hiện tượng giãn

rộng của vùng mẫu;

+ Pic sắc ký không cân đối.

- Xác định n:

+ Giả sử píc tuân theo hàm Gauss;

+ Gọi σ là độ lệch chuẩn của t (hay V) ⇒σ ∼1/

-2 σ +2 σ

tRA, VRA

Hình ??? Xác định n từ thực nghiệm

1.2 Các đại lượng đặc trưng

1.2.7 Đĩa lý thuyết (n) và cách xác định n bằng thực nghiệm

+ Đối với cột sắc ký, khi n càng lớn thì pic càng hẹp ⇒ tRA ∼ n

- Mặt khác, ta có: W = 4 σ hay σ = W / 4.

Vậy, số đĩa lý thuyết được xác định như sau:

Nếu n càng lớn độ phân giải càng tốt.

- Xác định H (chiều cao đĩa lý thuyết):

H = L / n

Nếu H càng nhỏ số đĩa lý thuyết càng lớn, độ phân giải càng tốt. 30

1.2.8 Độ phân giải, cách làm tăng độ phân giải

- Độ phân giải (R): R nói lên khả năng tách các cấu tử ra khỏi nhau trong một quá trình tách sắc ký R được xác định

+ Thay đổi cấu trúc của cột: tăng L; kích hạt nhồi nhỏ, giảm φ cột,

+ Dựa vào vận hành: tối ưu hóa pha động, giảm mẫu, giảm t o C, 31

1.3 Nội dung của thuyết dòng khuếch tán trong sắc ký

Mặc dù, đã đưa ra khái niệm về n và H nhưng:

+ Không giải thích được hiện tượng giãn rộng của vùng mẫu;

+ Pic sắc ký không cân đối

Vì vậy, Van Deemter đã phát triển và đưa ra “Thuyết dòng khuếch tán trong sắc ký”.

Khi quá trình sắc ký diễn ra, có 03 loại khuếch tán quyết định sự di chuyển của chất tan xuất hiện, gồm:

- Khuếch tán xoáy (H1);

- Khuếch tán dài (H2);

- Khuếch tán do chuyển khối (H3).

32

+ Hx: là đại lượng đặc trưng cho khuếch tán xoáy phụ thuộc vào:

- Độ đồng đều của hạt hồi;

1.3 Nội dung của thuyết dòng khuếch tán trong sắc ký

b Khuếch tán phân tử trong các pha L và pha K

Hiện tượng các chất phân tích có

xu thế di chuyển về 2 phía của cột

và tốc độ của pha động và do vậy,

dẫn đến sự sự khuếch tán dài (dọc) và được xác định qua biểu thức:

H2 = 2 γ Dm / u

Trong đó,

+ Dm: Hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động;

+ u: Tốc độ di chuyển thẳng của dòng pha động;

+ γ: Hệ số khúc khuỷu, phụ thuộc vào hình dáng của hạt và khoảng cách giữa các hạt chất nhồi (độ khít đặc). 34

c Sự khuếch tán do chuyển khối

Các cấu tử có khối lượng phân tử

CS = K dS 2 / DS + K: hệ số; + dS: chiều dầy của pha tĩnh;

+ DS: hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha tĩnh.

35

1.3 Nội dung của thuyết dòng khuếch tán trong sắc ký

c Sự khuếch tán do chuyển khối

- Cm đặc trưng cho chuyển khối trên pha động Giá trị Cm được tính qua biểu thức:

Cm = β dp 2 / Dm

+ β: hệ số thực nghiệm, có giá trị từ 0,5 đến 1;

+ dp: chiều dầy của pha động;

+ Dm: hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động.

c Sự khuếch tán do chuyển khối

- Để tính toán chiều cao đĩa

cực tiểu (Hmin), lấy đạo hàm

1.4 Các phương pháp định lượng trong phương pháp tách

1.4.1 Phương pháp nội chuẩn (Internal Standard)

Tiêu chuẩn chọn chất chuẩn nội:

+ Tinh khiết;

+ Có cấu trúc hóa học tương tự với chất phân tích;

+ Không có mặt trong mẫu;

+ Thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất cần phân tích;

+ Có nồng độ tương tự.

a Chuẩn hóa đơn giản (bao gồm 6 bước)

1 Chuẩn bị 2 mẫu chuẩn: DD1: chất nội chuẩn; DD2: chất phân tích;

2 Phân tích 2 mẫu chuẩn (chạy mẫu); 38

1.4.1 Phương pháp nội chuẩn (Internal Standard)

3 Tính toán hệ số đáp ứng (Response Factor)

SIS, CIS: Diện tích, nồng độ của chất nội chuẩn;

SXS , CxS: Diện tích, nồng độ chuẩn của chất phân tích.

4 Thêm chất chuẩn nội có nồng độ biết trước vào mẫu thật;

5 Phân tích mẫu thật và chất chuẩn nội (ở bước 4);

6 Tính toán nồng độ chất cần phân tích:

39

1.4 Các phương pháp định lượng trong phương pháp tách

1.4.1 Phương pháp nội chuẩn (Internal Standard)

b Chuẩn hóa nhiều mức

1 Chuẩn bị một dãy mẫu chuẩn chứa nồng độ chất phân tích khác nhau (biết trước) và nồng độ chất chuẩn nội như

nhau ;

2 Phân tích dãy mẫu chuẩn;

3 Thiết lập đường chuẩn;

4 Thêm một nồng độ tương tự chất chuẩn nội vào mẫu phân tích;

5 Phân tích mẫu thật;

6 Tính toán nồng độ của dung dịch phân tích bằng phương pháp nội suy.

40

1.4.2 Phương pháp ngoại chuẩn (External Standard)

Điều kiện thực hiện:

- Điều kiện sắc ký không thay đổi;

- Thể tích mẫu không đổi.

a Chuẩn hóa đơn giản

Hoàn toàn tương tự như phương pháp thêm chuẩn.

b Chuẩn hóa nhiều mức

Hoàn toàn tương tự như phương pháp đường chuẩn.

41

(High Performance Liquid Chromatograph – HPLC)

+ Áp suất cao ⇒“Sắc ký lỏng áp suất cao”.

+ Chiều dài cột ngắn, đặc biệt là kích thước hạt nhỏ (cỡ vài µm, nm) và là sự phát triển PP điện di mao quản ⇒

Hiệu quả tách cao.

⇒“Sắc ký hiệu năng suất cao”.

42

HPLC bao gồm nhiều PP., trong đó có 2 PP (kỹ thuật) chính sau:

2.1 Sắc ký lỏng pha liên kết

2.1.1 Pha tĩnh

- Pha tĩnh thường là silicagen Nó có một số đặc tính sau:

+ Xốp – bề mặt gồ ghề – có nhiều mao quản ⇒ S bề mặt lớn.

- Ngoài ra cón có các nhóm như silanol, ankylxilan, ankyl ( R – phân cực, ít phân cực hay không phân cực) ⇒ Có khả

năng tách sắc ký tốt.

Nhóm silanol Dẫn xuất clorosilan Dẫn chất siloxan – R

43

(High Performance Liquid Chromatograph)

2.1 Sắc ký lỏng pha liên kết

2.1.1 Pha tĩnh

Đối với pha tĩnh thường sử dụng 2 loại sắc ký sau:

a Sắc ký pha thường

- Pha tĩnh: thường dùng là silicagen để tách các hợp chất không phân cực hoặc phân cực ít.

- Pha động: sử dụng dung môi không phân cực (n-hexan, toluen, ).

- Hoặc silicagen gắn các nhóm ankyl ít C mang các nhóm phân cực cũng được gọi là sắc ký pha thường.

44

2.1 Sắc ký lỏng pha liên kết

2.1.1 Pha tĩnh

b Sắc ký pha đảo

- Pha tĩnh: là silicagen gắn gốc ankyl không phân cực – C8 hoặc C18;

để tách các hợp chất không phân, ít phân cực và phân cực.

- Pha động: sử dụng dung môi phân cực (nước, metanol, axetonitril)

- Nhiều công trình đã sử dụng sắc ký pha đảo trong HPLC để phân tích các chất phân tích.

45

(High Performance Liquid Chromatograph)