nhiễm nấm mốc và aflatoxin tự nhiên

Sự nhiễm nấm mốc và aflatoxin tự nhiên trên một số giống ngô, lạc trồng ở một số tỉnh và khả năng phòng trừ bằng các chủng Aspergillus aflavus không sinh độc tố

Vì thế việc nghiên cứu để nâng cao chất lượng nông sản là một vấn đề được các

tổ chức quốc tế cũng như các cơ quan khoa học về lương thực thực phẩm củathế giới đặc biệt quan tâm Việc nâng cao chất lượng nông sản bao gồm các kĩthuật bảo quản gìn giữ các giá trị dinh dưỡng của chúng, ngăn chặn các chất độchại nhiễm trên các nông sản đó đồng thời chế biến chúng thành những thựcphẩm có giá trị dinh dưỡng cao

Nước ta là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, là điều kiện thuận lợi chonấm mốc phát triển Do các hoạt động hết sức mạnh mẽ của các vi sinh vật cóhại đã gây ra tổn thất lớn cho nông sản ở giai đoạn sau thu hoạch, trong đó tổnthất gây nên do nấm mốc chiếm một phần đáng kể Ngoài việc gây tổn thất vềlượng cho nông sản nấm mốc còn sinh ra các độc tố đặc biệt nguy hiểm với sứckhoẻ con người và động vật kinh tế Nấm mốc phát triển trên lương thực khôngnhững sử dụng các chất dinh dưỡng của hạt: Protein, glucid, lipit và các vitamin,

chúng còn tiết ra các độc tố Độc tố aflatoxin do Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus và Aspergillus moninus tạo ra là độc tố nguy hiểm nhất và thường

nhiễm trên nông sản, gây độc cho người và gia súc, như gây tác dụng cấp tính,gây tổn thương gan (ung thư gan…), gây quái thai, gây đột biến, …thậm chí vớiliều lượng cao có thể dẫn tới tử vong

Trên thế giới hiện nay, việc nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và độc tốnấm trên lương thực, thực phẩm là vấn đề quan trọng nhằm bảo vệ sức khoẻ conngười và các động vật kinh tế Do vậy, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu vềmức độ nhiễm nấm mốc và các độc tố mốc, các biện pháp phòng trừ độc tố mốc

trên lương thực, thực phẩm Giới hạn về mức nhiễm aflatoxin đã là một trongnhững tiêu chuẩn của an toàn vệ sinh thực phẩm

ở nước ta hiện nay, công tác vệ sinh an toàn lương thực, thực phẩm đã cónhững tiến bộ rõ rệt và ngày càng được chú ý Từ những năm 1970 NguyễnPhùng Tiến và cộng sự [17] đã nghiên cứu mức nhiễm nấm mốc trên thóc ở khobảo quản lương thực miền Bắc Việt Nam và một số lương thực như: Đậu, đỗ,lạc…Đặng Hồng Miên [16] cũng đã nghiên cứu sự nhiễm nấm mốc và aflatoxintrên lạc Nguyễn Thuỳ Châu và cộng sự – 1996 [1] đã nghiên cứu tình hìnhnhiễm độc tố nấm ngô: aflatoxịn, fumonixin, Ochotoxin A, deoxynivalenol vànivalenol…và các biện pháp phòng trừ

Những kết quả nghiên cứu của PGS.TS: Nguyễn Thuỳ Châu đã cho thấyngô Việt Nam đã nhiễm nhiều loại mycotoxin, trong đó aflatoxin đã nhiễm ởmức độ cao Nguyễn Thị Thanh Trà cũng đã khảo sát sự nhiễm nấm mốc

Aspergillus flavus và aflatoxin trên một số giống ngô lai và ngô địa phương ở

vùng Gia Lâm, Hà Nội và phụ cận

Để tìm hiểu thêm về mức nhiễm nấm mốc và aflatoxin trên một số giốngngô và biện pháp phòng trừ, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Sự nhiễm nấm mốc và aflatoxin tự nhiên trên một số giống ngô, lạc trồng ở một số tỉnh và khả năng phòng trừ bằng các

chủng Aspergillus aflavus không sinh độc tố”

1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu:

1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu:

+ Xác định được sự nhiễm nấm mốc tự nhiên và hàm lượng aflatoxin trênmột số giống ngô, lạc ở một số tỉnh

+ Thăm dò khả năng phòng chống aflatoxin bằng các chủng Aspergillus flavus không sinh độc tố.

1.2.2 Nội dung nghiên cứu:

+ Khảo sát sự nhiễm nấm mốc trong một số mẫu ngô và lạc ở một số tỉnh.+ Xác định hàm lượng aflatoxin trong một số mẫu ngô

+ Phân lập và phân loại các chủng Aspergillus flavus

+ Nuôi cấy các chủng Aspergillus flavus đã phân lập để kiểm tra khả năng

sinh aflatoxin

+ Thử nghiệm phương pháp phòng chống aflatoxin bằng các chủng

Aspergillus flavus và các loại nấm khác không sinh độc tố.

PHẦN II:

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

nhiễm các loại nấm ngoài đồng như Alternaria, Cladosporium, Helminthosporium, và Furarium.

Tất cả các nấm mốc ngoài đồng đòi hỏi độ ẩm cao ở hạt để phát triển Độ

ẩm ở trạng thái cân bằng với độ ẩm tương đối 90% hay hơn nữa (ở các hạt ngũcốc giàu tinh bột, 20%-21% độ ẩm, trọng lượng ẩm cơ bản) là điều kiện chonấm phát triển Các nấm mốc ngoài đồng có thể sống qua nhiều năm ở hạt khô,nhưng chết tương đối nhanh ở các hạt có độ ẩm ở trạng thái cân bằng với độ ẩmtương đối trên 70%, ở các hạt ngũ cốc giàu tinh bột, điều này có nghĩa độ ẩmtrên 14% Những bằng chúng gần đây nhất đã cho thấy rằng sự phối hợp đúngđắn của độ ẩm, nhiệt độ và thời gian bảo quản, có thể hạn chế hoàn toàn cácnấm ngoài đồng ở các hạt đại mạch giống mà không bị nhiễm các nấm mốc bảoquản

Tóm lại, các nấm mốc ngoài đồng có thể ảnh hưởng đến bề ngoài và chấtlượng của hạt Thông thường, tổn thất gây nên do nấm mốc ngoài đồng xảy ratrước thu hoạch có thể phát hiện bằng phương pháp giám định thông thường, và

nó không tiếp tục tăng lên trong quá trình bảo quản

2.1.2 Hệ nấm mốc bảo quản:

Theo Christensen [22] các nấm mốc bảo quản gồm mười hai loài

Aspergillus, trong đó có năm loài phổ biến Một số loài Penicillium, các loài riêng lẻ của Sporendonema và một số loài nấm men cũng có thể có ở giai đoạn

này Những loài này có khả năng phát triển ở các hạt lương thực có độ ẩm cânbằng với độ ẩm tương đối 70% - 90% Đa số các nấm này thường ở trên cácnguyên liệu giàu các chất hữu cơ và vô cơ, đặc biệt trên các rau quả thối rữa, cácsản phẩm thực phẩm Chúng xuất hiện ở khắp mọi nơi trên thế giới và nhiễmtrên tất cả các hạt lương thực và hạt giống

Các nấm mốc bảo quản phát triển nhanh trên hạt ở khoảng 300 – 320C vàtốc độ phát triển của chúng giảm khi nhiệt độ giảm Một vài chủng của nhóm

A.glaucus phát triển chậm ở nhiệt độ 100-150C Một vài loài Penicillium yêu cầu

độ ẩm cao hơn Một vài loài Aspergillus đề kháng với khô cạn, nó có thể phát

triển ở vài độ dưới điểm đóng băng

2.2 Đại cương về độc tố nấm:

Độc tố nấm còn gọi là mycotoxin là nhóm hợp chất có cấu trúc đa dạng,

có khối lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi chất thứ cấp của các nấmmốc và gây ngộ độc với động vật có vú, cá và gia cầm [37] Sự sinh trưởng vàphát triển của nó phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện sinh thái (Morrau 1974) [15].Những điều kiện đó là vùng sinh thái, khí hậu nhiệt độ, độ ẩm của không khí,lượng nước có trong cơ chất… Sự sản sinh độc tố nấm mốc là kết quả của tácđộng qua lại của kiểu gen (genotype) và điều kiện phát triển của chúng(Scheoedes và Ashworth) Độc tố nấm là sản phẩm phụ tiết ra trong quá trìnhchuyển hoá Quá trình trao đổ chất gồm 2 giai đoạn: trao đổi chất sơ cấp và traođổi chất thứ cấp

Quá trình trao đổi chất sơ cấp được hiểu là các phản ứng tạo thành chấtcần thiết đảm bảo sự sống và sự phát triển của tế bào còn trao đổi chất thứ cấp làquá trình tạo thành các chất mà vai trò sinh lý của chúng chưa được rõ, chưa thậtcần thiết cho sự tồn tại của chính tế bào đó Quá trình trao đổi chất sơ cấp của tếbào là căn bản giống nhau ở các thế hệ thống sống, nhưng quá trình trao đổi chất

thứ cấp thì phụ thuộc khá chặt chẽ vào đặc tính của mỗi loài, mỗi chủng nấmmốc Thông thường quá trình này thường xảy ra vào cuối giai đoạn phát triểncủa tế bào nấm mốc Các độc tố nấm mốc được tổng hợp từ nhiều đường chuyểnhoá khác nhau, cụ thể như sau:

+ Dẫn xuất của đường glucoza

+ Dẫn xuất của các axitamin

+ Dẫn xuất của polyxetoacid

+ Dẫn xuất của terpenteichthecen

+ Các dẫn xuất của mevelonat kết hợp với axitamin

Cho đến nay, trên 300 loại độc tố nấm đã được phát hiện và nghiên cứu.Một loại độc tố có thể do nhiều loài nấm khác nhau sản sinh và một loài nấm cóthể đồng thời sản sinh nhiều loại đốc tố Điều đáng chú ý là có 20 loạimycotoxin có trong thực phẩm ở mức độ nghiêm trọng thường liên quan đến an

toàn thực phẩm và được tạo bởi năm chi nấm: Aspergillus, Penicillium, Furarium, Alternaria và Claviceps.

Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2),sterimatocystin, axit cyclopianzoic

Các độc tố của Fusarium: deoxynivalenol, nivalenol, zearalenon, T-2

toxin

Các độc tố của Penicillium: Patulin, ochratoxin A, citrinin, penitrem A, và

axit cyclopianzoic toxin, diacetocyscirpenol, fumonisin và moniliformin

Các độc tố của Alternaria: axit tenuazoic, alternarion, methyl ether

alternarion

Các độc tố của Claviceps: Các alkaloit Ergot [21].

Mặc dù độc tính của những loài nấm lớn nhất định đã được biết tới từ lâu,nhưng khả năng gây độc cho con người từ các sản phẩm độc của các nấm mốcchưa được thừa nhận, cho mãi đến năm 1850, khi sự liên quan giữa việc ăn phải

lúa mạch đen nhiễm Claviceps purpurea và các đặc tính lâm sàng của bệnh

Ergot đã được phát hiện Vấn đề này được tiếp tục bằng các báo cáo về các độc

tố nấm mốc khác đã ảnh hưởng đến con người như xác định các hội chứng liên

quan đến việc ăn phải bánh mì nhiễm Furarium graminearum, sự nhận biết bệnh

do nấm mốc Stachybotris và những nghiên cứu liên quan đến bệnh giảm bạch

cầu độc tố thực phẩm (ATA), và sự ăn phải các hạt lương thực để qua mùa đông

nhiễm Fusarium poae và Fuarium sporotrichioides ở nước Nga trong chiến

tranh thế giới lần thứ hai

Những số liệu có giá trị về mycotoxin và các bệnh do mycotoxin đã thunhận từ lĩnh vực thú y học Các nghiên cứu trên động vật thực nghiệm cho thấyđộc tính của mycotoxin rất lớn Hầu hết các sản phẩm thực vật có thể là cơ chấtcho sự phát triển của nấm mốc và sự tạo mycotoxin tiếp theo Vì thế nó tạo khảnăng không những cho sự nhiễm trực tiếp mà còn là nguồn mang mycotoxin vàosữa thịt

2.3 Độc tố aflatoxin:

Trong số các mycotoxin thì Aflatoxin là độc tố được phát hiện sớm nhất

và được nghiên cứu đầy đủ nhất về mọi phương diện [28] Aflatoxin thường

được tạo bởi hai loài nấm quen biết là Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus.

2.3.1 Tính chất hoá lý:

Các Aflatoxin gồm 4 hợp chất của nhóm bis-furanocoumarin, là sản phẩm

trao đổi chất tạo bởi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus, được đặt

tên là B1, B2, G1, G2 Các Aflatoxin thường nhiễm trên các sản phẩm thực vật.Bốn chất được phân biệt trên cơ sỏ màu phát quang của chúng B là chữ viết tắtcủa Blue (màu xanh nước biển) và chữ G là chữ viết tắt của Green (màu xanh lácây) Aflatoxin B1, B2 trong sữa bò được chuyển hoá được gọi là aflatoxin M1 vàaflatoxin M2 (M là một chữ viết tắt của Milk) Trong bốn loại aflatoxin thìaflatoxin B1 thường được tìm thấy ở nồng độ cao nhất, tiếp theo là G1, trong khi

đó B2 và G2 tồn tại ở nồng độ thấp hơn

Công thức cấu tạo của một số aflatoxin và các trao đổi chất liên quan đếnaflatoxin B1 và G1 và aflatoxin B2 và G2 là dẫn xuất của dihydro của các hợpchất mẹ Các aflatoxin M1và M2 là các chất trao đổi hydroxylat hoá của B1, B2

phải theo thứ tự, chúng có công thức cấu tạo như sau:

OCH 3

O O

O O

O O

O O

O O

O O

O O

Aflatoxin G

2

Các aflatoxin phát quang mạnh dưới ánh sáng cực tím sóng dài Điều nàycho phép phát hiện các hợp chất này ở nồng độ cực kì thấp (0,5 ng hay thấp hơntrên một vết ở sắc kí bản mỏng) Nó cung cấp điểm cơ bản về mặt thực hành chotất cả các phương pháp hoá lý cho việc phát hiện và định lượng Nồng độaflatoxin M1 0,02mg/l có thể được phát hiện trong sữa lỏng

Các aflatoxin được hoà tan trong các dung môi phân cực nhẹ nhưclorofom và metanol và đặc biệt ở dimethylsulfoit (dung môi thường được sửdụng như phương tiện trong việc áp dụng các aflatoxin vào các động vật thựcnghiệm) Tính tan của aflatoxin trong nước dao động từ 10-20mg/l

Aflatoxin tinh khiết rất bền vững ở nhiệt độ cao, khi được làm nóng trongkhông khí Tuy nhiên nó tương đối không bền khi để dưới không khí và dưới tiacực tím ở phiến sắc kí bản mỏng, và đặc biệt khi hoà tan ở các dung môi có độphân cực cao Các aflatoxin trong các dung môi clorofom và benzen bền vữngtrong nhiều năm nếu được giữ trong chỗ tối và lạnh Các aflatoxin ít hoặc không

bị phá huỷ dưới điều kiện nấu bình thường và làm nóng khi thanh trùng Tuynhiên lạc rang đã giảm đặc biệt lượng các aflatoxin và nó có thể bị phá huỷ hoàntoàn bằng việc xử lý mạnh bằng amoniac hay hypochlorit Claude Moneau vàcộng sự [15] khi nghiên cứu tính chất của aflatoxin đã đưa ra những kết quảsau:

Bảng 1: Tính chất hoá lý của các aflatoxin.

M2 293 Tím

Ghi chú: * Kết quả của Joun send

** Kết quả của Stub bjield

Sự có mặt của vòng lacton ở phân tử aflatoxin làm chúng nhạy cảm vớiviệc thuỷ phân trong môi trường kiềm, đặc tính này là quan trọng trong bất kìquá trình chế biến thực phẩm vì quá trình xử lý kiềm làm giảm hàm lượngaflatoxin của các sản phẩm, mặc dầu sự có mặt của protein, pH và thời gian xử

lý có thể thay đổi các kết quả Tuy nhiên nếu xử lý kiềm là nhẹ thì việc axit hoá

sẽ làm phản ứng ngược trở lại để tạo aflatoxin ban đầu [51]

2.3.2 Các phương pháp phân tích:

2.3.2.1 Các phương pháp sinh học:

Phương pháp thử sinh học dùng vịt con một ngày tuổi để xác định sự cómặt của aflatoxin nghi ngờ trong thực phẩm Phương pháp thử trên bào thai gàvới liều 0,1 - 0,2 ỡg aflatoxin B1 được áp dụng vào màng trứng Vận tốc gâychết được ghi lại trong thời gian 23 ngày cấy vào trứng Một vài phương phápthử sinh học khác đã được triển khai như dùng vi khuẩn, tôm biển để thử.Những mô tả chi tiết có thể tìm thấy trong báo cáo Goldlatt và Ciegler và cộng

và kinh tế hơn, nhưng làm sạch kém hơn cũng đã được triển khai Việc định tính

và định lượng các aflatoxin có thể thực hiện bằng kỹ thuật sắc kí bản mỏng, sắc

kí lỏng hiệu cao năng (HPLC) và ELISA

2.3.3 Sự tạo aflatoxin do các nấm mốc:

Khả năng tạo aflatoxin thường được thấy ở hai chủng của hai loài

Aspergillus flavus Link và A.parasiticus speare Trong những năm gần đây người ta đã phát hiện khả năng tạo aflatoxin ở A.nomimus.

Các chủng tạo ra aflatoxin của Aspergillus flavus là rất phổ biến và thường

được phân lập từ các nguyên liệu khác nhau Bảng 2 cho thấy tỷ lệ cao (từ 20% đến

98%) các chủng phân lập của Aspergillus flavus có khả năng tạo aflatoxin.

Các nghiên cứu sâu hơn trong những điều kiện khống chế chính xác chothấy độ ẩm ở cân bằng với độ ẳm tương đối 85% (hay hoạt tính nước aw = 0,85)

là giới hạn dưới của sự phát triển của Aspergillus flavus ở tinh bột , các loại hạt

[49]

Bảng 2: Các chủng tạo aflatoxin của Aspergillus flavus phân l p tập từ ừ

b n lo i h t c c:ốn loại hạt cốc: ại hạt cốc: ại hạt cốc: ốn loại hạt cốc:

PHẦN TRĂM CHỦNG PHÂN LẬP TẠO AFLATOXIN (%)

SẢN LƯỢNG TẠO AFLATOXIN CỰC ĐẠI (μG/KG)G/KG)

Lạc 100 98 3.300

Hạt bông 59 81 3.200

Gạo 127 20 1.100

Lúa 63 24 3.300

( Số liệu của Schroder và Boller 1976)

Các nhiệt độ cực tiểu tối thích và cực đại cho sự tạo aflatoxin là 120-270C

và 400 - 420C theo thứ tự Northolt đã nghiên cứu tác dụng của hoạt tính nước và

nhiệt độ lên sự phát triển và sự tạo aflatoxin của A.parasiticus và đi đến kết luận

rằng các lượng không thể phát hiện được của aflatoxin B1 đã được tạo ở giá trị

aw dưới 0,83 và nhiệt độ dưới 100C [43]

2.3.4 Sự nhiễm aflatoxin ở các ngũ cốc ở ngoài đồng:

Lạc có thể bị nhiễm Aspergillus flavus trước thu hoạch nhưng dễ bị nhiễm

nhanh hơn sau khi cây lạc được nhổ lên và làm khô sơ bộ trước khi củ lạc đượclấy ra khỏi cây Thời gian sau thu hoạch là thời gian nhiễm độc cao đối với sựtạo aflatoxin Các côn trùng gây thương tổn cho hạt cũng là yếu tố đối với sự

nhiễm Aspergillus flavus.

Sự gây thương tổn cho côn trùng cho ngô ở ngoài đồng cũng có thể đi

kèm hoạc tiếp theo sự nhiễm Aspergillus flavus và sự tạo aflatoxin trước thu

hoạch Aflatoxin cũng nhiễm nặng trên bông lúa mạch ở Ấn Độ [51]

2.3.5 Sự nhiễm aflatoxin trong thực phẩm:

Mặc dầu các aflatoxin đã được tìm thấy ở các thực phẩm khác nhau,nhưng hầu hết sự nhiễm tập trung ở lạc và các hạt có dầu khác, bao gồm hạtbông, ngô, hạt giẻ Braxin

Các điều tra của Mỹ với trên 1500 mẫu ngô thu hoạch ở vụ mùa của cácnăm 1969-1970, chủ yếu từ các nguồn thương mại, đã cho thấy rằng từ 2-3%mẫu nhiễm aflatoxin B1 và G1 ở khoảng từ 3-37 ỡg/Kg Trong nghiên cứu tiếptheo 60 mẫu từ đông - nam của Mỹ aflatoxin B1 đã tìm thấy trong 21 mẫu ở mức

từ 6-308 ỡg/Kg ở thời kỳ 1969-1970 Ở một số bang đông nam của mỹ,aflatoxin đã nhiễm với tần số cao ở ngô ngoài đồng Ở một số mẫu ngoài đồng,mức nhiễm aflatoxin B1 dao động từ vài nghìn ỡg/Kg hay cao hơn hầu hết sựnhiễm ở ngoài đồng đã liên quan đến tổn thất gây lên do côn trùng Ở Thái Lan,35% mẫu ngô nhiễm aflatoxin B1(mức trung bình 400 ỡg/Kg), trong khi 40%nhiễm aflatoxin B1(mức trung bình 133 ỡg/Kg) đã tìm thấy ở Uganda và 97% ởđảo Sebu ở Philippin , trung bình là 213 ỡg/Kg Hàm lượng aflatoxin ở các mẫungô ở gia đình đã liên quan đến sự bùng nổ của bệnh gan độc tố gây cấp tính ởtây - bắc của Ấn Độ [48]

Theo Goto và công sự [33] -85% số mẫu ngô thu thập từ các kho bảoquản trong mùa mưa năm 1984-1985 ở Thái Lan đã nhiễm aflatoxin B1 vớilượng 6,30-1310 ppb và 0,6-767 ppb, theo thứ tự

Ở Việt Nam Nguyễn Phùng Tiến [18] cũng đã nghiên cứu mức nhiễmnấm mốc trên ngô và đã cho thấy trên 38 mẫu bảo quản trong kho lương thựccủa thị xã Thanh Hoá của tỉnh Thanh Hoá đã nhiễm các nấm mốc thuộc các chi

sau: Aspergillus, Penicillium, Rhiopus, Cladosporium, Sporotrichum, Mucor, Saccharomyces, Trichoderma, Geotrichum Tuy nhiên chưa có số liệu về việc

nghiên cứu mức nhiễm các mycotoxin trên ngô trong công trình nghiên cứu này

Đậu Ngọc Hào và các cộng sự [7;9] đã nghiên cứu mức nhiễm nấm mốc

và aflatoxin trên ngô của các tỉnh Sơn La và Thanh Hoá Kết quả phân tích của

24 mẫu ngô hạt và 24 mẫu ngô bột cho thấy các mẫu này đã nhiễm A.flavus với tần số cao, từ 50-80% Các loài khác như A.glacus, A.fumigatus và A.candidus cũng nhiễm với tỷ lệ khá cao Loài A.ochraceus đã phát hiện thấy ở tỷ lệ thấp Các loài của chi Fusarium đã nhiễm với tần xuất là 15% Kết quả nghiên cứu

mức nhiễm aflatoxin những mẫu ngô trên đã cho thấy là 33% số mẫu ngô hạt đãnhiễm aflatoxin B1 từ 10 - 40ppb, 8,3% số mẫu nhiễm aflatoxin B2 từ 10-20ppb,72% số mẫu ngô bột đã nhiêm aflatoxin B1 từ 25-250ppb, 9,5% số mẫu ngônhiêm aflatoxin B2 từ 10 - 20ppb (kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thuỳ Châu)

2.3.6 Độc tính của aflatoxin.

2.3.6.1 Tác động lên tế bào:

Khả năng gây ung thư của các aflatoxin đã được Wogan nghiên cứu [51]

và được IARC đánh giá lại [50] Ở mức độ tế bào việc cho uống aflatoxin vớiliều khác nhau đã nhanh chóng ức chế rõ ràng enzym AND và ARN polymeraza

ở gan, các đáp ứng tương tự đã được quan sát ở việc nuôi cấy các tế bào người

và động vật Quá trình sinh tổng hợp protein cũng bị hỏng, đặc biệt trong điềukiện khi mà quá trình sinh tổng hợp chịu ảnh hưởng mạnh bằng sự biến đổi quátrình sinh tổng hợp ARN thông tin Dường như là sự ức chế polymeraza là hậuquả gián tiếp của hoạt tính mẫu bị hỏng của nhiêm sắc thể, do tương tác giữanhiêm sắc thể - toxin Sự tương tác giữa aflatoxin hay một số các dẫn xuất của

nó với ARN hay thành phần khác của nhiễm sắc thể là sự nhận xét như sự việcban đầu ở hàng loạt quan sát của các phản ứng

Bằng chứng khác sự tác động của aflatoxin lên lưới nội bào(Endoplasmicreticulum) và do đó thay đổi sự gắn polysome vào màng tế bàochất Krustev và các cộng sự [9] đã nghiên cứu những biến đổi về mặt siêu cấutrúc và hình thái bệnh học của mô gan của chuột đực liên quan đến tác dụng củaliều đơn độc aflatoxin B1 [40].

Với liều nhiễm 6 ỡg aflatoxin B1/100g trọng lượng cơ thể trên con chuộtđực, những biến đổi về mặt hình thái của tế bào gan được đặc trưng bởi sự phân

ly của các thành phần hạt và sợi của nhân, sự vón nhiễm sắc thể ở ngoại biêncủa nhân, một vài sự biến dạng của màng nhân, làm giảm khoảng không xungquang nhân và các giọt mỡ nhỏ ở một vài nhân Lưới nội bào xung quang nhân

ít được nhìn thấy và mất sự tạo hạt của các ribosome của chúng Từ các bộ phậnkhác, đặc biệt lý thú là các lysome, rất nhiều, không chỉ ở các tế bào gan mà còn

ở các tế bào Kupfer Hoạt tính photphataza axit cũng giảm rõ rệt.[40]

tình trạng sức khoẻ, thành phần dinh dưỡng thức ăn, môi trường sống… Cácaflatoxin khác nhau độc tính gây ngộ độc cũng khác nhau.

- Gây tổn thương gan

Aflatoxin tồn tại trong cơ thể tuỳ thuộc mức độ đồng hoá, dị hoá nhanhhay chậm của cơ thể mà quyết định vị trí tổn thương tại các tiểu thuỳ gan

- Mức độ ảnh hưởng có liên quan đến quá trình chuyển hoá từ aflatoxinthành aflatoxicol tại gan

Bảng 3: Lượng aflatoxin và tổn thương gan

- Gây ung thư

Lancaster và cộng sự (1961) đã tiến hành gây ung thư gan cho chuột, nhờ

bổ xung thức ăn nhiễm nấm mốc hoặc thức ăn nhiễm aflatoxin B1 Ngoài

- Gây ung thư

Lancaster và cộng sự (1961) đã tiến hành sau ung thư gan cho chuột, nhờ

bổ sung thức ăn nhiễm aflatoxin B1 Ngoài ra bổ sung bằng khô lạc nhiễm

Aspergillus flavus cũng gây được ung thư cho chuột.

Theo Wogan (1977) [50] thì độc tính gây ung thư của aflatoxin ở các loàikhác nhau thì khác nhau

Bảng 4: Đ c tính gây ung th c a aflatoxin các lo i ư của aflatoxin ở các loài động vật khác nhau ủa aflatoxin ở các loài động vật khác nhau ở các loài động vật khác nhau ài động vật khác nhau đ ng v t khác nhau ập từ

(MG/KGTA)

THỜI GIAN THEO DÕI (THÁNG)

TỶ LỆ UNG THƯ

Theo Wogan và Newberme (1988) với liều 0.015ppm trong thức ăn

đã gây tỷ lệ ung thư cao cho chuột bạch Nếu bổ sung 0,4mg aflatoxin B1 vàothức ăn mỗi ngày và kéo dài trong 24 tuần sau đó nghỉ 82 tuần thì vẫn phát hiệnthấy nhiều u gan ở chuột lang

Bảng 5: M i quan h gi a t l ung th c a chu t lang v i lốn loại hạt cốc: ệ giữa tỷ lệ ung thư của chuột lang với lượng và ữa tỷ lệ ung thư của chuột lang với lượng và ỷ lệ ung thư của chuột lang với lượng và ệ giữa tỷ lệ ung thư của chuột lang với lượng và ư của aflatoxin ở các loài động vật khác nhau ủa aflatoxin ở các loài động vật khác nhau ới lượng và ư của aflatoxin ở các loài động vật khác nhau ợng vàng vài động vật khác nhau

th i gian lây nhi m aflatoxin:ời gian lây nhiễm aflatoxin: ễm aflatoxin:

- Tính gây quái thai:

Những thí nghiệm của Elis và Dipaolo (1976) đã chứng minh rằng việctiêm aflatoxin B1 vào chuột theo đường ổ bụng với liều 4mg/kg thể trọng gâycho thai chuột bị tật hoặc bị chết

- Tính gây đột biến:

Aflatoxin B1 gây ra sự khác thường ở nhiễm sắc thể: Các đoạn nhiễm sắcthể có các cầu nối ở đôi chỗ, các cầu cromatit, sự đứt đoạn cromatit, sự đứt đoạnAND ở các tế bào động vật và thực vật (Ong,1975) Aflatoxin gây đột biến gen

ở các vi khuẩn nghiên cứu, khi hoạt hoá bằng các chế phẩm Microsom từ ganchuột và từ gan người(Wong và Hsiter, 1976) Tuy nhiên không quan sát thấytác dụng gây đột biến ở chuột cái bị nhiễm aflatoxin theo đường ổ bụng với liều5mg/Kg thể trọng (Leonard và CS, 1975)

2.3.6.3 Tác động ở người

Nhiều nghiên cứu về các vùng dân cư ở các nước khác nhau trên thế

giới cho thấy: Các nồng độ aflatoxin thực tế ở thức ăn có liên quan đến tai biếnung thư gan ở những vùng đó

Bảng 6: M i quan h t l ung th gan v i s h p th aflatoxin v oốn loại hạt cốc: ệ giữa tỷ lệ ung thư của chuột lang với lượng và ỷ lệ ung thư của chuột lang với lượng và ệ giữa tỷ lệ ung thư của chuột lang với lượng và ư của aflatoxin ở các loài động vật khác nhau ới lượng và ự hấp thụ aflatoxin vào ấp thụ aflatoxin vào ụ aflatoxin vào ài động vật khác nhau trong c th ơ thể ể.

(TỶ LỆ NGƯỜI CHẾT/10 5 NGƯỜI)

đã ăn ngô bị nhiễm aflatoxin ở mức 15 ỡg/kg có dấu hiệu ngộ độc và trên 100người đã bị chết

Nói chung các chất này tác động lên gan theo trình tự như sau: đầu tiên làhoại tử nhu mô gan, tăng sinh biểu mô, sau đó là xâm nhiễm tế bào lympho đểnhằm chống đỡ tạm thời, rồi tiến đến sơ gan, nếu thời gian kéo dài sẽ ddẫntớiung thư gan Nhưng bản chất aflatoxin không gây ung thư mà do nó gắn vào mộtenzym dẫn đến ung thư, khả năng này phụ thuộc vào sự tồn tại của nhândihydrouran và phần 5 lacton chứa nó, do đó nó đổi phần tận cùng difuran quantrọng trong tính độc và tính gây độc Chính vì vậy mà aflatoxin B1 bao giờ cũnggây ung thư mạnh hơn B2 và G2 (do B2 không có nối đôi nên kém độc hơn)

2.3.7 Giới hạn aflatoxin cho phép sử dụng:

Giới hạn aflatoxin hiện thời thiết lập bởi cơ quan quản lý thực phẩm và thuốc (ỡg/kg,ppb) (Park 1992 a ) (FDA) [3].

Các thực phẩm cho người, trừ sữa 20

Các thức ăn gia súc (Trừ các loại liệt kê

dưới đây)

20

Thức ăn từ bột bông (dùng cho bò trưỏng

thành, lợn và các khẩu phần thức ăn của

gia súc)

100

Ngô cho lợn sắp thịt (finislin swine) 100

Ngô cho thức ăn gia súc của trâu bò thịt 100

2.4 Vấn đề khử nhiễm các mycotoxin:

Sự ô nhiễm aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn gia súc có thể gây nguyhiểm đến sức khoẻ của con người và động vật, các nhà khoa học đã cố gắng tìmkiếm các phương pháp để loại trừ hay phá huỷ các aflatoxin trong các sản phẩm

bị nhiễm Phương pháp giải quyết tốt nhất để kiềm chế aflatoxin là phòng ngừa.Tuy nhiên sự nhiễm aflatoxin đôi khi là không thể tránh được, và nếu sự phòngngừa thất bại, những phương pháp khác phải được xem xét tới Các kỹ thuậtdùng để khử aflatoxin trong các mặt hàng khác nhau bao gồm loại trừ bằngphương pháp vật lý hay sinh học và hoá học

2.4.1 Vấn đề phòng ngừa:

Ở thuật ngữ rộng, vấn đề phòng ngừa sự nhiễm Aspergillus sản sinh

aflatoxin có thể là đưa ra những biện pháp kiềm chế có lợi và có hiệu quả nhất

Nó có thể làm giảm số lớn những tổn thất lương thực do nấm mốc gây hại Đángtiếc là những biện pháp như vậy là rất khó thực hiện trong thực tế vì nó phụthuộc vào điều kiện khí hậu và các thay đổi cần thiết trong thực tiễn bảo quản vàthực tiễn nông nghiệp Các thực nghiệm với lạc đã tiến hành ở Tây Phi chứng

minh ảnh hưởng của thực tiễn nông nghiệp về sự nhiễm Aspergillus sản sinh

aflatoxin Thậm chí những phương pháp nông nghiệp tiến bộ đã cho thấy một

thực tiễn là sự nhiễm Aspergillus sản sinh aflatoxin trong lạc ở mức độ thấp là

không thể tránh được

2.4.2 Giảm hàm lượng aflatoxin bằng phương pháp sinh học:

Nhiều hoá chất có thể phá huỷ aflatoxin tinh khiết hay aflatoxin trong cácnguyên liệu tự nhiễm tự nhiên như: chlorin, ozon, axit hydrochloric … Đángtiếc, các hoá chất này mặc dầu chúng phá huỷ các aflatoxin nhưng lại làm giảmđáng kể giá trị dinh dưỡng của nguyên liệu xử lý và tạo nên các sản phẩm độchay các sản phẩm có tác dụng phụ không mong muốn Do vậy, việc sử dụng cácchủng không có hại cho con người và thực phẩm mà lại có khả năng giảm sự tạođộc tố hoặc ức chế hoàn toàn việc tạo độc tố là biện pháp lý tưởng Những

nghiên cứu để xác định các chủng đối kháng với các chi nấm mốc Aspergillus, Fusarium, Rhizoctonia, Alternaria, Claviceps…đã và đang tiếp tục trong nhiều

năm Biện pháp phòng trừ nấm mốc độc bằng các chủng đối kháng căn cứ vàonhững đặc điểm di truyền học (trao đổi chất, tự phân đôi nhân, đột biến, tiếtenzym có tác dụng thuỷ phân …) tính cạnh tranh sinh thái (nguồn dinh dưỡng,điều kiện nhiệt độ và độ ẩm …)

Một số chủng nấm mốc và vi khuẩn có khả năng giảm sự tạo độc tố thìngoài việc đảm bảo tính an toàn không độc hại đối với con người và thực phẩmđược xử lý, đôi khi cần phải thoả mãn một số yêu cầu khác, chẳng hạn với

Stretoroccus lactis đòi hỏi nuôi trên môi trường dinh dưỡng đặc biệt, nên không

thích hợp đối với việc xử lý trên ngũ cốc và thực phẩm

Gần đây các nhà khoa học đã tìm thấy một số chủng B.subtilis sản sinh

iturin A Iturin A có khả năng ức chế rất mạnh mẽ sự phát triển của các nấm sảnsinh aflatoxin và quá trình tổng hợp aflatoxin của chúng Do vậy, người ta sửdụng iturin A trong việc ngăn chặn aflatoxin trên ngũ cốc và các loại hạt

Các nhà khoa học ở Nhật Bản đã tìm ra một số chủng B.subtilis có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Aspergillus flavus sản sinh aflatoxin và quá

trình tổng hợp aflatoxin của chúng Các nhà khoa học ở Thái Lan cũng tìm ra 32chủng vi khuẩn và 7 chủng nấm men được phân lập từ ngô và đất trồng ngô có

hoạt tính ức chế sự phát triển của nấm Aspergillus flavus sản sinh aflatoxin và quá trình tổng hợp aflatoxin Sự cộng sinh của các loài nấm khác (Aspegillus flavus, Aspergillus niger, Tricoderma, Rhizotonia … không sinh độc tố) cũng kìm hãm sự phát triển và khả năng tạo độc tố của nấm mốc Aspergillus flavus

[38]

Các giải pháp về di truyền học đã nghiên cứu các chủng đề kháng thínghiệm và ngoài đồng cho thấy sự khác nhau lớn ở các chủng loại ngô có khả

năng đề kháng với Aspergillus flavus và tạo aflatoxin của nó Mọi lớp vỏ không

thấm được của hạt bông gọi là hạt cứng đã được Lillehoj [41] thông báo là có xu

hướng ít cho phép Aspergillus flavus phát triển trên nó và tạo aflatoxin ít hơn

các hạt giống không có lớp vỏ cứng này

2.4.3 Biện pháp phân tách vật lý:

Vì biện pháp phòng ngừa khó thực hiện trong thực tế, cho nên cần tìmnhững biện pháp kiềm chế khác có được các thực phẩm và thức ăn gia súckhông có aflatoxin có thể ăn được Các phương pháp sử dụng rộng rãi nhất baogồm loại trừ chọn lọc các phần bị nhiễm của sản phẩm Nói rộng ra vấn đề này

là khả năng áp dụng phụ thuộc chủ yếu vào tính chất vật lý của sản phẩm Cácquy trình phân loại dựa trên các đặc tính như mầu và kích thước của hạt…đãđược sử dụng thành công đối với lạc ăn những phương pháp này dựa trên sựđịnh vị aflatoxin ở phần tương đối nhỏ của các hạt, với sự thiếu hụt rất dễ nhận

ra ở kích thước và hình dạng của hạt

Tuy nhiên do cái gọi là tổn thất “lột vỏ” thì những biện pháp này khôngthể nói là có hiệu quả 100% Những biện pháp tương tự dựa trên sự phát quang

đã được đề xuất đối với hạt dẻ và hạt bông [24]

2.4.4 Các quy trình chiết xuất bằng dung môi:

Việc chiết xuất aflatoxin bằng dung môi có một số thuận tiện:

- Aflatoxin có thể được loại trừ hoàn toàn một cách cơ bản trong điều kiệnthuận lợi

- Ít có khả năng tạo từ aflatoxin những sản phẩm khác có hoạt tính sinh lý

đa dạng

- Việc chiết xuất có thể tiến hành với việc thu hồi dung môi mà không bịmất mát dinh dưỡng trong nhiều trường hợp

Những điều bất lợi:

- Cần phải có thiết bị chiết xuất dung môi đặc biệt

- Sẽ chiết xuất luôn một số thành phần hoà tan cùng aflatoxin

- Giá thành của việc chiết xuất cao

- Có thể bị mất mùi của sản phẩm xử lý

Để tìm được dung môi có thể thích hợp cho tất cả các sản phẩm là mộtnhiệm vụ khó Các yếu tố khác như giá của dung môi và hiệu xuất thu hồi chúngcũng là vấn đề Thêm nữa là độc tính của dung môi và dư lượng của chúng vàcuối cùng là tính an toàn của quá trình xử lý vì tính dễ cháy, dễ nổ điểm sôi củadung môi

Các aflatoxin có thể được chiết xuất bằng các dung môi nhưcloroform/nước, axeton/nước Những hệ dung môi này chỉ loại trừ aflatoxin đơnđộc mà không loại trừ dầu Còn các nhóm dung môi như hydrocacbon dầuhoả/nước loại trừ chủ yếu dầu nhưng cũng có khả năng loại trừ aflatoxin

Những kết quả có nhiều hứa hẹn nhất đã thu được bằng việc dùng hệthống chiết xuất bao gồm hỗn hợp hexan- metanol, hexan- etanol, hexan-etanol-nước, hexan – axeton – nước Hệ thống bao gồm 54% axeton, 44% hexan và 2%nước (tính theo khối lượng) đã tìm thấy một trong những hệ thống thành côngnhất có thể đồng thời loại trừ dầu từ các bánh ép khô của lạc gồm 12 -15% dầu,

dư lượng lipit gần bằng 1% và mức aflatoxin thấp hơn 40 ỡg/kg

2.4.5 Các phương pháp khử độc tố bằng hoá chất:

Nhiều hoá chất có thể phá huỷ aflatoxin tinh khiết hay aflatoxin trong cácnguyên liệu nhiễm tự nhiên những hoá chất này bao gồm: chlorin, ozon, axit

hydrrochloric, peroxit benzoic, amoniac, natri hydrrochlorit và etanolamin Cáchoá chất dùng cho việc khử độc tố aflatoxin phải thoả mãn các tiêu chuẩn sau:

- Phải phá huỷ hay khử aflatoxin

- Nó phải không được tạo hay giải phóng ra bất kỳ các dư lượng độchay gây ung thư ở sản phẩm cuối cùng

- Phải phá huỷ các bào tử và sợi nấm mà dưới điều kiện thuận lợi, chúng

có thể tái nhiễm lại ở sản phẩm

- Phải giữ được giá trị dinh dưỡng và tính ăn được của nguyên liệu ban đầu.Đáng tiếc, nhiều hoá chất khảo sát đã không thoả mãn tất cả những tiêuchuẩn trên Mặc dù chúng phá huỷ các aflatoxin nhưng lại làm giảm đáng kể giátrị dinh dưỡng của nguyên liệu xử lý và tạo nên các sản phẩm độc hay các sảnphẩm có các tác dụng phụ không mong muốn

Một số quá trình xử lý bằng hoá chất có hiệu quả trong việc phá huỷaflatoxin thoả mãn những tiêu chuẩn trên Những hoá chất này bao gồmhydrogen peroxit hay những chất oxy hoá tương tự, canxihydroxit,canxihydroxit/formaldehyt, natrihydroxit, natrihypochlorit, dimetylamin haymetylamin và amoniac Trong số này, hydrogen peroxit, natri hydroxit và natrihydroclorit dường như có khả năng trong việc khử aflatoxin từ các sản phẩmgiàu protein hay các sản phẩm dùng cho người ăn, trong khi đó dimetylamin,metylamin hay amoniac có thể áp dụng cho việc khử độc tố các hạt có dầu hay ngô

Việc xử lý aflatoxin trên ngô và khô lạc bằng amoniac đã được áp dụngrộng rãi trong việc xử lý thức ăn nhiễm aflatoxin ở nhiều nước Về cơ chế ởnhiệt độ cao, có thể trong điều kiện áp suất xảy ra sự thoái biến aflatoxin B1 bởiamoniac

2.5 Vấn đề phòng chống nấm mốc cho lương thực trong quá trình bảo quản:

Để phòng chống nấm mốc và độc tố người ta đã áp dụng những biện phápkhác nhau Để phòng chống nấm mốc người ta áp dụng:

- Làm khô bằng nhiệt: làm khô tự nhiên (phơi dưới ánh nắng mặt trời).Sấy khô (than, điện) làm cho cơ chất đạt lượng nước cho phép Ví dụ: ngô cầnlàm khô tới ≤13% trước khi bảo quản Phần lớn các loại nấm mốc phát triển tốt

ở hàm lượng nước trong cơ chất 18-25%

- Chiếu xạ: chiếu xạ tia cực tím, tia ở với mục đích tiêu diệt các loại vikhuẩn, nấm mốc để làm giảm sự thiệt hại do chúng gây ra, các tia này làm biếnđổi các cấu trúc chủ yếu của các axit amin, axit nucleotit, protein, làm tác độngchuyển hoá tế bào, tác dụng diệt nấm, vi khuẩn Phần lớn các loài nấm mốc đều

bị diệt ở liều 4,5 kGy (1kGy =100 krad = 1kj/kg)

- Sử dụng các loại khí: Methylbromid ở liều 129 mg/l/h hoặc 40mg/l/h

có thể diệt được nhiều loài nấm mốc Khí ozon ở liều 10mg/m3 không khí đượctiếp xúc liên tục trong nhiều ngày có thể ngăn cản sự phát triển của nấm mốc.Khí CO2 được ứng dụng trong bảo quản lương thực trong túi PE kín có thểchống được nấm mốc

- Hoá học: được ứng dụng và nghiên cứu do tính chất an toàn của một

số hoá chất, đặc biệt là axit hữu cơ: axit sorbic, axit propionic, axit acetic, axitbenzoic, các muối Na và Ca của chúng như canxi propionat hay natriropi, ở liều

1 - 3% các axit hoặc muối của axit trên có thể ức chế sự phát triển của nấm mốctrong thời gian dài Một số hợp chất hữu cơ khác thiosulfit, Na2SO3, KHSO2,NaHSO3, Na2S2O5, thiabendazon diphing, tinh dầu thực vật (tinh dầu cam ở liều0,2%) có thể ức chế đựoc nhiều loài nấm mốc, mentho liều 1,1%, một số tinhdầu khác: tinh dầu hôi, tinh dầu được chiết từ cây tỏi có tác dụng ức chế nấmmốc

- Sinh học: dùng các loại lá cây có sẵn trong thiên nhiên để chống nấmmốc trong thực phẩm VD: dùng lá cây xoan hoặc lá hoa cúc vàng để xông vì cảhai loại lá cây này đều có tinh dầu, axit formic Đó là những chất sát khuẩn,kháng khuẩn Khi xông bằng hai loại lá này thì ngô có độ ẩm 10-13%, có thểkéo dài thời gian bảo quản 30 ngày

- Vô hoạt hay mất hoạt tính bằng phương pháp vật lý: ít có hiệu quả vìaflatoxin có thể chịu được nhiệt độ >100-105 0C Nếu chiếu xạ 10KGy thì sẽ gâyảnh hưởng tới nguyên liệu Dùng hấp ướt (autoclave) 1,5at trong 60 phút nhưnglại có ít giá trị ứng dụng trong thực tế.

- Phương pháp hấp thụ: các chất hấp thụ như silicagel, axit nhân silic,than hoạt tính … có tác dụng rất tốt để hấp thụ aflatoxin trong quá trình tiêu hoá,các aflatoxin được hấp thụ sẽ được thải ra ngoài qua phân

Làm mất hoạt tính bằng các hợp chất oxy hoá khử Na2SO4, NaHSO3 1%hoặc 2% có tác dụng vô hoạt aflatoxin Hiện nay người ta sử dụng NH3 ở dạngkhí nén được bơm tuần hoàn vào các thùng chứa ngô bằng thép (Metal silo)hoặc trong các túi P.E có thể chứa tới 20-30 tấn ngô Ngô có hàm lượngaflatoxin 750ppb sau 13 ngày xử lý, với 1,5 % NH3 ở nhiệt độ 320C dã làm giảmxuống còn 7ppb

PHẦN III:

VẬT LIỆU VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu:

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu:

Trong quá trình nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và độc tốaflatoxin, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm trên 30 mẫu ngô, bao gồm:

21 mẫu ngô được lấy tại các hộ nông dân ở các huyện khác nhautỉnh Nghệ An

7 mẫu ngô được lấy tại một số cửa hàng ở thị trường Nghệ An và

Hà Nội, 4 mẫu được lấy tại thị trường Đồng Nai

4 mẫu lạc lấy tại các hộ nông dân ở các huyện khác nhau tỉnh Nghệ

An và 15 mẫu lấy tại thị trường Đồng Nai

3.1.2 Các môi trường PDA:

* Môi trường thạch khoai tây (PDA): 200 g khoai tây gọt vỏ, tháihạt lựu và đun sôi 10 phút với 4.500 ml nước Sau đó lọc qua lớp vải mỏng,thu được dịch chiết khoai tây

1000 ml dịch chiết khoai tây

3.1.4 Các hóa chất dùng cho phân tích độc tố aflatoxin B 1

 NaCL tinh khiết (Trung Quốc)

 Silicagel 60 F245, Merck, Cộng hòa liên bang Đức, cho sắc kí lớp mỏng

 NaSO3 khan (Trung Quốc)

 NaHCLO, Nhà máy hóa chất Việt Trì

 H2O2 Công ty dược phẩm Hà Nội

 Các dung môi cloroform, hexan, aceton, axetat chì (Trung Quốc)

 Nước cất (Viện công nghệ sau thu hoạch)

 Các chuẩn độc tố aflatoxin B1 (Sigma)

 3.1.5 Dụng cụ thí nghiệm:

 Buồng sắc kí lớp mỏng (chromatography tank), Thụy Sĩ

 Đèn cực tím sóng dài 254 nm, 366 nm, Camag, Thụy Sĩ

 Bản mỏng cho sắc ký 20x20 cm, Đức

 Phễu chiết phân tách pha dung môi, Trung Quốc

 Máy nghiền đồng thể polytron

 ống hút 0,2 ml và 0,1 ml, Trung Quốc

 Máy lắc, máy xay

 Bình phun dung dịch lỏng có quả roa

 Giấy lọc Whatman N01, chemapoli, Tiệp Khắc.

 Kính hiển vi olympus có gắn máy chụp ảnh, Nhật

 Tủ cấy vô trùng tự động,

 Tủ cấy vô trùng tự động, Sanyo, Nhật Bản

 Máy có chân không quay, Đức

 Hộp petri, bình tam giác, ống đong 50ml, 100ml…

3.2 Phương pháp:

3.2.1 Phương pháp lấy mẫu cho phân tích độc tố aflatoxin:

Tiến hành lấy mẫu theo phương pháp lấy mẫu của FAO [32]

Cách lấy mẫu ngô bắp: lấy khoảng 50 hạt mỗi giống, ở 3 vị trí của bắpđầu, giữa, cuối, sau đó trộn đều, dàn mỏng thành hình vuông hay chữ nhật Lấytheo kiểu đường chéo đến khi nào được 50 hạt thì dừng

Cách lấy mẫu lạc: Lạc được lấy từ các hộ nông dân trong tình trạng đãphơi khô và bảo quản trong các bao, lấy 1kg làm đại diện cho mỗi mẫu Mỗi đạidiện của từng mẫu trôn đều rồi chia tư Từ một phần tư mẫu lại tiêp tục chia tưcho tới khi được 100 làm mẫu phân tích

Đối với các mẫu ngô thu thập từ các chợ, khối hạt ngô được trộn đều lấy1kg làm đại diện Một đại diện được xay nhỏ, trộn đều rồi chia tư, một phần từ

đó lại được trộn đều và chia tư lấy 100g làm mẫu phân tích

3.2.2 Phương pháp xác định mức độ nhiễm nấm mốc bên trong hạt ngô; lạc.

Mức độ nhiễm này được tính bằng phần trăm hạt bị nhiễm từ bên trong

hạt lương thục, được tiến hành theo phương pháp phát hiện hệ nấm mốc bêntrong hạt lương thực của Christensen [22] Khử trùng hệ nấm mốc bên ngoài hạtbằng dung dịch H2O2 5% trong 6 - 7 phút (Có thể rửa bằng dung dịch NaClO 3%hoặc AgCl 1% trong 4 phút), lắc mạnh và đều sau đó rửa lại mẫu bằng nước cất

vô trùng 5-6 lần Để ráo hạt và đặt hạt vào hộp petri có môi trường PDA đặc đểphân lập các loại nấm mốc Mỗi đĩa đặt 10 hạt, thí nghiệm nhắc lại 3 lần Đặt

đĩa đã cấy vào tủ ấm 300 C, sau 72 giờ lấy ra quan sát Cho tiếp vào tủ ấm theodõi 7 - 8 ngày Đem ra đọc kết quả.

3.2.3 Phương pháp làm tiêu bản soi nấm mốc:

Dựa trên những đặc điểm hình dạng, kích thước của nấm mốc để phânloại sơ bộ các loài nấm mốc khác nhau

Nhỏ một giọt cồn: nước theo tỷ lệ 2:1 lên lam kính, dùng que cấy mốc,lấy mốc trong ống thạch nghiêng Rửa tiêu bản bằng dung dịch cồn nước trên,nhỏ một giọt xanh metylen, đậy lá kính lên, để khô, tiến hành soi kính

3.2.4 Phân loại các loài nấm mốc:

Các bào tử được tạo hỗn dịch trong nước và hỗn dịch này được phaloãng bằng nước cất tinh khiết theo các bậc: 1:10 Một ml từ hai hay ba độ phaloãng được chọn, tùy theo mật độ của hỗn dịch ban đầu, được cho vào các hộppetri Sau đó đun tan chảy thạch, đợi nguội đến gần 450 C rồi phân vào các hộpnày, sau đó quay vòng hộp petri để trộn đều các bào tử được pha loãng Để vào

tủ ấm 300 C, việc phân lập được tiến hành từ những hộp có số lượng khuẩn lạcgiới hạn riêng biệt đồng đều

Để phân loại đến loài của chi Aspergillus, là chi nấm hay gặp nhất,

chúng tôi sử dụng tài liệu của Raper và Fennell [44]

3.2.5 Phương pháp phân tích aflatoxin:

Chúng tôi tiến hành phân tích aflatoxin bằng phương pháp sắc kí bảnmỏng do Doronina và Maksimenko[29] mô tả Dựa trên cơ sở của phương pháp

CB (AOAC)[20] có cải tiến gồm những giai đoạn sau: 25g mẫu được say mịntrên máy xay cà phê, chiết xuất aflatoxin bằng hỗn hợp aceton (100ml) và dungdịch NaCL 10% (50ml) Mẫu được nghiền trên máy nghiền đồng thể Polytron.Lọc qua giấy lọc Whatman N0 1 Lấy 50ml dịch lọc và tủa bằng Pb(CH3COO)2

10% (50ml) để loại bỏ protein, lọc qua giấy lọc Whatman N0 1 80ml dịch lọcđược chuyển vào phễu chiết để chiết xuất bằng hai pha lỏng – lỏng với 40mlhexan (2lần) Lớp nước axeton được chiết xuất với 40ml cloroform (3lần), loại

bỏ lớp nước axeton Lớp cloroform có aflatoxin được giữ lại Làm bay hơi toàn

bộ lượng cloroform có aflatoxin ở máy cất quay cô chân không Phần cặn đượchòa tan vào 100 ỡl cloroform, giữ ở 40C cho đến lúc tiến hành định tính và địnhlượng aflatoxin

Quy trình chiết tách aflatoxin được biểu thị qua sơ đồ sau

100 ml chlorofoom

25 g Mẫu ngô( lạc) Nghiền nhỏ Ngâm 24 h(trong tủ tối)

trên chlorofoom

Lấy pha trên cho v o ài động vật khác nhau bình cầu

Cất quay( cô chân không) lấy 3ml cặn

ống nhót, để bay hơi lấy cặn

Bọc giấy bạc bảo quản lạnh 40C

Na

2 SO

4 khan

Nhắc lại 2 lần

Nhắc

lại 3 lần

a) Định tính aflatoxin:

Dùng bơm tiêm vi lượng (microsyring) nhỏ trên sắc ký lớp mỏng 2ỡl, 6ỡl

và 2 lần 10ỡl mẫu phân tích Các vết nhỏ của dung dịch được chấm vào phiếnmỏng cách đường thẳng mép 2cm (từ mép dưới của phiến mỏng) và 1,5 – 2cm

từ mỗi cạnh bên Việc chấm phải thực hiện ở những phần nhỏ sao cho các vếtnhỏ không có đường kính quá 5 mm trên đường bắt đầu Nhỏ 2, 6, 10ỡl chuẩnaflatoxin B1 với nồng độ 0,71 ng/ỡl trên cùng một phiến bản mỏng Nhỏ 5ỡlchuẩn aflatoxin B1 vào cùng một vết của mẫu phân tích (10ỡl) như chuẩn trong.

Hệ dung môi dùng cho sắc ký bản mỏng một chiều là: cloroform : aceton 9:1

Giới hạn độ phát hiện của phương pháp là 4 ỡg aflatoxin/kg sản phẩm, hệ

số dao động là 0,3 – 5,0

Phát hiện aflatoxin bằng cách phát hiện sự phát quang của phiến lớp mỏng

ở buồng tối dưới đèn cực tím sóng dài (độ phát xạ cực đại 365nm) Phát hiệnbằng mắt thường trên sắc ký đồ của mẫu chiết cường độ phát quang của các vết

có giá trị Rf bằng với chuẩn Chọn phần tương ứng thích hợp của mẫu phân tíchcho việc định lượng của aflatoxin

Thử xác minh aflatoxin:

Thử với axit vô cơ : Phun lên bản mỏng dung dịch axit H2SO4 trongnước, tỷ lệ 1: 2 Nếu như màu phát quang của các vết của mẫu chiết khôngchuyển sang màu vàng như ở mẫu chuẩn, tức là không có aflatoxin trong mẫuthử Nhưng nếu màu phát quang của các vết của mẫu thử aflatoxin ứng với độ diđộng sắc ký cũng chuyển thành màu vàng, điều đó có thể xem như là cóaflatoxin trong mẫu thử

Ở góc dưới bên trái, 1,2 và 3 cm cách mép và 1,5cm từ mép dưới của bảnmỏng, nhỏ 2, 4, 6 ỡl theo thứ tự dung dịch chuẩn aflatoxin.

Nhỏ 6ỡl dung dịch chuẩn lên phía bên phải góc trên, 1,5cm cách mépphiến mỏng

Thực hiện sắc ký bản mỏng ở hệ dung môi cloroform : aceton (9:1) Sosánh cường độ phát quang của các chuẩn aflatoxin khác nhau trên phiến mỏngvới vết của mẫu thử Bằng mắt thường định lượng aflatoxin ở vết của mẫu thử(nanogram) theo công thức sau:

kg g M V V V

m V V V

6 4 2

5 3 1



C là nồng độ aflatoxin B1 ở mẫu thực phẩm phõn tớch ng/g (ppb)

V1 là thể tích hỗn hợp nước – axeton (ml)

V2 là thể tích hỗn hợp nước – axeton lấy cho phân tích (ml)

V3 là thể tích hỗn hợp nước – axeton và acetate – chỡ (ml)

V4 là thể tớch dịch lọc sau khi làm sạch bằng acetate – chỡ (ml)

V5 là thể tích dung dịch chiết đó bay hơi làm sạch ở chloroform trước khilàm sắc ký bản mỏng (àl)

V6 là thể tớch dung dịch chiết chấm vào bản mỏng (àl)

m là lượng aflatoxin ở vết chuẩn trên phiến mỏng (ng)

M là trọng lượng sản phẩm lấy để phân tích (g)

3.2.6 Quy trỡnh nuụi cấy nấm mốc Aspergillus flavus cho việc nghiờn cứu khả năng tạo aflatoxin:

Các mẫu ngô đó được xác định là không có aflatoxin (theo phương pháp3.2.5) Cân 25g ngô cho vào bỡnh tam giỏc, chộn với 3ml nước cất, lắc thật đều,khử trùng 1 atm trong 30 phỳt