Kỹ thuật nhân sinh khối nấm isaria sp3 trên môi trường rắn và khả năng phòng trừ sâu hại cây trồng của chúng luận văn tốt nghiệp đại học

Trên cơ sở điều tra thiên nhiên, lợi dụngnhững vi sinh vật có ích với con người như các loài ký sinh thiên địch tự nhiên và caohơn nữa là nhân nhanh một số nguồn vi sinh vật hoặc là sản

NGUYỄN THỊ CHUNG

KỸ THUẬT NHÂN SINH KHỐI NẤM Isaria sp3.

TRÊN MÔI TRƯỜNG RẮN VÀ KHẢ NĂNG PHÒNG

TRỪ SÂU HẠI CÂY TRỒNG CỦA CHÚNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KỸ SƯ NGÀNH NÔNG HỌC

VINH -12 2010

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA NÔNG LÂM NGƯ

KỸ THUẬT NHÂN SINH KHỐI NẤM Isaria sp3.

TRÊN MÔI TRƯỜNG RẮN VÀ KHẢ NĂNG PHÒNG

TRỪ SÂU HẠI CÂY TRỒNG CỦA CHÚNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KỸ SƯ NGÀNH NÔNG HỌC

Người thực hiện: Nguyễn Thị Chung Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Thị Thanh

VINH - 12.2010

Lời cam đoan!

Thực tập tốt nghiệp là thời gian để người sinh viên có điều kiện rèn luyệntính tự lực, độc lập trong suy nghĩ, bổ sung những kiến thức mới mẻ từ thực tiễn,nâng cao trình độ lí luận chuyên môn Tiếp tục rèn luyện đạo đức, tác phong,quan điểm phục vụ của người cán bộ khoa học kĩ thuật

Để hoàn thành luận văn này tôi xin cam đoan:

1 Trong quá trình nghiên cứu, bản thân luôn nhiệt tình với công việc

2 Số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưađược ai công bố trong bất công trình nghiên cứu nào khác

3 Kết quả nghiên cứu có được do chính bản thân thực hiện nghiên cứudưới sự giúp đỡ tận tình của cô hướng dẫn: ThS Nguyễn Thị Thanh

4 Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này đã được cảm ơn vàcác thông tin trích dẫn trong khóa luận đã được chỉ rõ nguồn gốc

Vinh, Ngày 30 tháng 12 năm 2010

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Chung

Lời cảm ơn!

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp: “Kỹ thuật nhân sinh khối nấm

Isaria sp3 trên môi trường rắn và khả năng phòng trừ sâu hại cây trồng của

chúng” tôi luôn nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo trong khoa

Nông Lâm ngư, Trường Đại học Vinh, các nhà khoa học, chính quyền địa phươngnơi thu mẫu và bạn bè gần xa

Hoàn thành luận văn này cho phép tôi bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS.

Nguyễn Thị Thanh đã nhiệt tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề

tài Đặc biệt cô luôn động viên khuyến khích và mang đến cho tôi niềm tin, lòngsay mê nghiên cứu khoa học

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ phòng thí nghiệm

tổ bảo vệ thực vật, khoa Nông Lâm Ngư đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thànhtốt khóa luận này

Để hoàn thành được khóa luận này, tôi còn nhận được sự động viên, hỗtrợ rất lớn về vật chất và tinh thần của gia đình, bạn bè Tôi xin trân trọng biết ơnnhững tình cảm cao quý đó

Xin chân thành cảm ơn!

Vinh, ngày 30 tháng 12 năm 2010

Tác giả

Nguyễn Thị Chung

MỤC LỤC

Lời cam đoani

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Các chữ cái viết tắt v

Danh mục các bảng số liệu vi

Danh mục các ảnh và hình, đồ thị của đề tài vii

MỞ ĐẦU 1

1 Tầm quan trọng và ý nghĩa của việc nghiên cứu đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 3

3 Đối tượng, phạm vi và nội dung nghiên cứu 3

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4

CHƯƠNG I.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Cơ sở khoa học của đề tài 5

1.1.1 Nấm ký sinh côn trùng 5

1.1.1.1 Phương thức xâm nhập của nấm vào cơ thể côn trùng 6

1.1.1.2 Sự xâm nhiễm và phát triển của nấm trong cơ thể côn trùng 6

1.1.1.3 Cơ chế tác động của nấm ký sinh côn trùng lên sâu hại 9

1.1.1.4 Triệu chứng bên ngoài bị nhiễm nấm ký sinh côn trùng 12

1.1.2 Giả thuyết khoa học 13

1.1.3 Cơ sở thực tiễn của đề tài 14

1.2 Những nghiên cứu trong và ngoài nước về nấm ký sinh côn trùng và công nghệ sản xuất thuốc vi nấm diệt côn trùng 16

1.2.1 Những nghiên cứu trên thế giới 16

1.2.2 Những nghiên cứu ở Việt Nam 21

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 26

2.1.1 Thời gian nghiên cứu 26

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 26

2.2 Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu 26

2.2.1 Vật liệu nghiên cứu 26

2.2.2 Hoá chất, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 26

2.3 Phương pháp nghiên cứu 27

2.3.1 Phương pháp phân lập và nhân nuôi nấm trên môi trường PDA 27

2.3.2 Phương pháp nhân sinh khối nấm trên các môi trường rắn 28

2.3.3 Phương pháp đếm nồng độ bào tử 29

2.3.4 Phương pháp bảo quản chế phẩm 30

2.3.5 Phương pháp sử dụng chế phẩm để phòng trừ sâu hại 30

2.3.6 Phương pháp bố trí, phân tích và xử lý số liệu 31

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Khả năng sinh trưởng, phát triển và hình thành bào tử của nấm Isaria sp3. trên môi trường PDA và trên các môi trường rắn 33

3.1.1 Khả năng sinh trưởng của nấm Isaria sp3 trên môi trường PDA 33

3.1.2 Khả năng sinh trưởng của nấm Isaria sp3 trên môi trường rắn 36

3.2 Kỹ thuật sản xuất chế phẩm nấm Isaria sp3 trên môi trường rắn 41

3.3 Bước đầu thử nghiệm khả năng phòng trừ của chế phẩm từ nấm Isaria sp3. trên một số đối tượng sâu hại 43

3.3.1 Hiệu lực phòng trừ của chế phẩm Isaria sp3 đối với sâu khoang hại lạc trong phòng thí nghiệm 43

3.3.2 Hiệu lực phòng trừ của chế phẩm Isaria sp3 đối với rệp hại lạc trong phòng thí nghiệm 48

3.3.3 Hiệu lực phòng trừ rệp của chế phẩm nấm Isaria sp3 ngoài đồng ruộng 53

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

1 Kết luận 55

2 Kiến nghị 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

1 Tài liệu tiếng Việt 57

2 Tài liệu nước ngoài 59

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG SỐ LIỆU

Bảng 3.1 Khả năng tăng trưởng đường kính và độ dày khuẩn lạc nấm

Isaria sp3 trên môi trường PDA 36

Bảng 3.2 Nồng độ bào tử của nấm Isaria sp3 trên môi trường PDA 36 Bảng 3.3 Khả năng bao phủ bề mặt môi trường rắn của nấm Isaria sp3.

theo thời gian theo dõi 57Bảng 3.4 Nồng độ bào tử ở các môi trường rắn theo thời gian nuôi cấy 39

Bảng 3.5 Nồng độ bào tử của chế phẩm nấm Isaria sp3 theo 2 cách bảo

quản khô và tươi 42

Bảng 3.6 Hiệu quả phòng trừ sâu khoang của chế phẩm nấm Isaria sp3.

Bảng 3.10 Hiệu quả phòng trừ và tỷ lệ rệp mọc nấm Isaria sp3 sau khi

phun chế phẩm ở ngoài đồng ruộng 53

DANH MỤC CÁC ẢNH VÀ HÌNH, ĐỒ THỊ CỦA ĐỀ TÀI

1 DANH MỤC CÁC ẢNH

Ảnh 3.1 Đặc điểm hình thái của nấm Isaria sp3 trên môi trường PDA 35

Ảnh 3.2 Khả năng sinh trưởng của nấm Isaria sp3 trên các môi trường rắn 38

Ảnh 3.3 Sâu khoang bị nhiễm nấm Isaria sp3 47

Ảnh 3.4 Rệp bị nhiễm nấm Isaria sp3 ở trong phòng thí nghiệm 52

Ảnh 3.5 Rệp bị nhiễm nấm Isaria sp3 ở ngoài đồng ruộng 54

2 DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 Chu trình phát triển của bào tử nấm ký sinh trong cơ thể ký chủ 11

Hình 1.2 Cơ chế xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng 12

Hình 3.1 Đường kính khuẩn lạc nấm Isaria sp3 trên môi trường PDA 35

Hình 3.2 Độ dày khuẩn lạc của nấm Isaria sp3 trên môi trường PDA 35

Hình 3.3 Khả năng bao phủ bề mặt môi trường của nấm Isaria sp3 ở 4 công thức thí nghiệm theo thời gian nuôi cấy 38

Hình 3.4 Nồng độ bào tử của nấm Isaria sp3 trên các môi trường rắn 40

Hình 3.5 Nồng độ bào tử của chế phẩm nấm Isaria sp3 sau các tháng bảo quản bằng hai phương pháp 43

Hình 3 6 Hiệu quả phòng trừ sâu khoang của chế phẩm nấm Isaria sp3 44

Hình 3.7 Tỷ lệ sâu khoang bị nhiễm nấm Isaria sp3 sau khi phun chế phẩm nấm Isaria sp3 trong phòng thí nghiệm 46

Hình 3.8 Hiệu quả phòng trừ rệp trong phòng thí nghiệm của chế phẩm nấm Isaria sp3 49

Hình 3.9 Tỷ lệ rệp mọc nấm sau khi xử lý chế phẩm nấm Isaria sp3 trong phòng thí nghiệm 52

Hình 3.10 Hiệu quả phòng trừ rệp hại lạc và tỷ lệ rệp mọc nấm sau khi phun chế phẩm nấm Isaria sp3 ngoài đồng ruộng 54

MỞ ĐẦU

1 Tầm quan trọng và ý nghĩa của việc nghiên cứu đề tài

Việt Nam là nước sản xuất nông nghiệp, nằm trong vùng nhiệt đới ẩm giómùa Đây là điều kiện thuận lợi cho sản xuất nông nghiệp nhưng đồng thời cũng

là điều kiện rất thuận lợi cho sâu, bệnh hại phát triển

Trong những năm gần đây, ở nước ta trên nhiều vùng trồng rau, lúa, lạc, đậu

đỗ, bông, đã xuất hiện nhiều loại sâu hại nguy hiểm, chúng đã gây tổn thất lớnđến năng suất và sản lượng cây trồng Ðể bảo vệ mùa màng, người nông dân

đã sử dụng thuốc hoá học có độ độc cao và tăng số lần phun để phòng trừngay khi dịch sâu hại xảy ra mới có thể đạt kết quả Ðây là vấn đề nghiêm trọng đòihỏi các nhà khoa học nói chung và các nhà bảo vệ thực vật nói riêng cần nghiên cứu

và xem xét một cách đầy đủ, bởi thuốc hoá học tuy dập tắt được nạn dịch ngay, songthuốc hoá học là con dao hai lưỡi, nó đã phá huỷ môi trường sống và trực tiếp làm ảnhhưởng đến sức khoẻ người dân, làm mất đi một số nguồn sinh vật có lợi cho con ngườinhư chim chóc, tôm, cá, và cả những ký sinh thiên địch như bọ rùa, ong ký sinh, nấm,virút, tuyến trùng Bảo vệ môi trường sống, bảo vệ cây xanh, bảo vệ thiên nhiên lànhiệm vụ của mọi người và đặc biệt là đối với các nhà bảo vệ thực vật

Xu hướng hiện nay là sử dụng biện pháp quản lý tổng hợp dịch hại cây trồng(IPM) và IPM-B trong phòng trừ sâu hại Trên cơ sở điều tra thiên nhiên, lợi dụngnhững vi sinh vật có ích với con người như các loài ký sinh thiên địch tự nhiên và caohơn nữa là nhân nhanh một số nguồn vi sinh vật hoặc là sản xuất hàng loạt các chếphẩm sinh học như nấm côn trùng, vi khuẩn, virút, tuyến trùng và các nấm đối kháng,các xạ khuẩn để bổ sung cho đồng ruộng, dần dần hạn chế một phần các loại thuốc trừsâu hoá học để chuyển công tác bảo vệ thực vật sang hướng mới mang tính chất tiến

bộ, tích cực là phòng trừ tổng hợp dựa trên các yếu tố sinh học sâu bệnh hại và sinhthái học quần thể Đây là hướng đi mới đầy triển vọng đã được nghiên cứu và ứngdụng ở nhiều nước trên thế giới

Nấm ký sinh côn trùng - Entomology pathogennic fungi (EPF) không chỉ lànhóm có tính đa dạng sinh học cao, nguồn lợi tài nguyên quý giá mà còn có vaitrò rất quan trọng trong phòng trừ sâu hại cây trồng và trong y dược

Nấm côn trùng đã được phát hiện cách đây 150 năm và cho đến nay trên thếgiới có khoảng 700 loài EPF đã được xác định và mô tả (Kunimi, 2004) Trong

đó ở Thái Lan đã phát hiện được hơn 400 loài nấm ký sinh côn trùng (Morakot,2003) (Dẫn theo Trần Ngọc Lân, 2007) [17] Hiện nay có nhiều nước trên thếgiới đã nghiên cứu và ứng dụng nấm ký sinh côn trùng vào trong sản xuất để tiêudiệt sâu hại cho kết quả rất tốt như Mỹ, Brazil, Thái Lan,…

Hiện nay việc nghiên cứu và ứng dụng nấm ký sinh côn trùng vào thực tiễn sảnxuất ở nước ta còn nhiều hạn chế, các nghiên cứu mới chỉ tập trung vào một số ít nấm

ký sinh côn trùng ở trong hệ sinh thái nông nghiệp vùng nhiệt đới Hiện nay mới chỉ

có hai loại chế phẩm sinh học dùng để phòng trừ sâu hại được sản xuất từ hai loài nấm

Beauveria bassiana và Metarhizium anisoplie của viện bảo vệ thưc vật

Loài nấm ký sinh côn trùng Isaria là một loại nấm phát triển nhanh, có số lượng bào tử nhiều, dễ phân lập Nấm ký sinh côn trùng Isaria sp3 thu thập được

ở Vườn quốc gia Pù Mát được đánh giá là rất khả quan trong việc ứng dụng đểphòng trừ sâu hại trong thực tiễn Loài nấm này đã được nghiên cứu và ứng dụngvào phòng trừ một số đối tượng sâu hại (thuộc bộ Lepidoptera, Diptera, Coleoptera,Hymenoptera,…) ở một số nước trên thế giới như Trung Quốc, Hoa Kỳ,Brazin, và cho kết quả rất khả quan nhưng ở Việt Nam thì chưa có một côngtrình nghiên cứu nào về loài nấm này để ứng dụng trong thực tiễn [30, 36, 40].Nghiên cứu góp phần làm cơ sở dẫn liệu cho việc xây dựng và áp dụng quy

trình sản xuất và sử dụng chế phẩm sinh học từ nấm Isaria sp3 để phòng trừ một

số đối tượng sâu hại cây trồng, hướng tới một nền nông nghiệp bền vững

Xuất phát từ vấn đề cấp thiết này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Kỹ

thuật nhân sinh khối nấm Isaria sp3 trên môi trường rắn và khả năng phòng

trừ sâu hại cây trồng của chúng”.

2 Mục đích nghiên cứu

- Theo dõi khả năng phát triển của nấm Isaria sp3 trên môi trường PDA,

xác định thời gian phát sinh bào tử và thời gian cấy chuyển để nhân sinh khốihiệu quả nhất

- Nhân sinh khối nấm Isaria sp3 trên các môi trường rắn khác nhau, xác

định môi trường phù hợp nhất cho nấm phát triển và cho số lượng bào tử nhiềunhất Xây dựng biện pháp nhân nhanh sinh khối một cách đơn giản nhất để có thểchuyển giao cho nông dân sản xuất theo quy mô nông hộ

- Xây dựng biện pháp sinh học từ việc sử dụng chế phẩm từ nấm Isaria sp3.

để phòng trừ một số đối tượng sâu hại cây trồng

- Xác định hiệu quả phòng trừ của chế phẩm từ nấm Isaria sp3 trên một số đối tượng sâu hại, chọn đối tượng mà chế phẩm nấm Isaria sp3 có hiệu quả

phòng trừ tốt nhất để tiến hành ngoài đồng ruộng

3 Đối tượng, phạm vi và nội dung nghiên cứu

3.1 Đối tượng nghiên cứu

- Nấm Isaria sp3.: thuộc chi Isaria, bộ Hypocreales, ngành Ascomycota tronggiới nấm

3.2 Phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu về đặc điểm hình thái, khả năng sinh trưởng và phát sinh bào

tử của nấm Isaria sp3 trên môi trường PDA, trên môi trường lỏng và trên các môi trường rắn khác nhau; Hiệu lực phòng trừ của chế phẩm từ nấm Isaria sp3.

trên một số đối tượng sâu hại như sâu khoang hại lạc, rệp hại lạc

3.3 Nội dung nghiên cứu

(i) Nghiên cứu khả năng sinh trưởng, phát triển của nấm Isaria sp3 trên môi

trường PDA và môi trường rắn

(ii) Nghiên cứu kỹ thuật sản xuất chế phẩm từ nấm Isaria sp3 và các

phương pháp bảo quản chế phẩm

(iii) Nghiên cứu hiệu lực phòng trừ của chế phẩm từ nấm Isaria sp3 trên

rệp và sâu khoang hại lạc

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Từ kết quả bước đầu của đề tài, cung cấp các dẫn liệu về việc nhân sinh khối

nấm Isaria sp3 trên các môi trường rắn ở điều kiện nhiệt độ phòng, từ đó phổ biến

kỹ thuật để bà con có thể tự sản xuất chế phẩm theo quy mô hộ nông dân

Sử dụng và đánh giá khả năng phòng trừ của chế phẩm tạo ra từ nấm Isaria

sp3 trên một số đối tượng sâu hại, từ đó cung cấp các dẫn liệu để có biện phápứng dụng rộng rãi ngoài thực tiễn mang lại hiệu quả cao

Tăng cường khả năng ứng dụng biện pháp sinh học vào đồng ruộng, làmcân bằng mối quan hệ thiên địch, dịch hại đồng thời bảo vệ sức khoẻ con người,vật nuôi và không gây ô nhiễm môi trường

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cơ sở khoa học của đề tài

1.1.1 Nấm ký sinh côn trùng

Tổ chức Đấu tranh sinh học thể giới đã định nghĩa: “Phòng trừ sinh học làviệc sử dụng những sinh vật sống hay các sản phẩm hoạt động sống của chúngnhằm ngăn ngừa hoặc làm giảm bớt tác hại do các sinh vật gây ra” (IOBC, 1971)(dẫn theo Phạm Văn Lầm, 1995) [9] Khái niệm “Nấm ký sinh côn trùng -Entomology pathogenic fungi (EPF)” hay “Nấm côn trùng - Insect fungi” đượccác nhà khoa học sử dụng như các thuật ngữ đồng nghĩa, đề cập về nhóm sinh vật(nấm) ký sinh gây bệnh cho côn trùng

Theo Evans (1998) [33], nấm ký sinh côn trùng được chia thành 4 nhóm: (1) Ký sinh trong là nấm ký sinh trong các nội quan, khoang cơ thể của côntrùng ký chủ

(2) Ký sinh ngoài là nấm phát triển ở tầng cuticun ngoài vỏ cơ thể của côntrùng và gây bệnh hại cho côn trùng

(3) Nấm mọc trên côn trùng là nấm trực tiếp hoặc gián tiếp chứng minhchúng ký sinh trên côn trùng

(4) Cộng sinh là hiện tượng cả nấm và côn trùng cùng mang lại lợi ích chonhau trong mối quan hệ cùng chung sống

Nấm ký sinh côn trùng còn được chia thành ký sinh sơ cấp (primerypathogen) và ký sinh thứ cấp (secondery pathogen) (Carruthes, 1997)[26]

Nấm ký sinh sơ cấp thường nhiễm vào ký chủ côn trùng khoẻ mạnh, gâybệnh và sau đó giết chết côn trùng Trong khi đó, nấm ký sinh thứ cấp chỉ có thể

ký sinh trên những côn trùng bị yếu hoặc côn trùng bị thương Các mầm bệnh kýsinh trên côn trùng trưởng thành hoặc côn trùng bị bệnh được gọi là ký sinh cơhội hoặc ký sinh không chuyên tính; loại ký sinh này có thể nhiễm vào ký chủ

thông qua sự xâm nhập qua lớp cuticun vỏ cơ thể của côn trùng Các ký sinh trêncôn trùng bị thương gọi là bệnh lây qua vết thương, chỉ có thể xâm nhập vào côntrùng qua vết thương

1.1.1.1 Phương thức xâm nhập của nấm vào cơ thể côn trùng

Nấm gây bệnh cho côn trùng xâm nhập vào cơ thể vật chủ hầu hết khôngphải qua đường miệng mà chủ yếu qua lớp vỏ cơ thể, tức là phải có sự tiếp xúccủa nguồn nấm với bề mặt cơ thể vật chủ Bào tử nấm bám vào bên trong cơ thểcôn trùng qua lớp kitin Để vượt qua lớp biểu bì ngoài là nhờ áp lực cơ giới, cònqua lớp biểu bì trong là do hoạt động men của nấm (Evlakhova, 1974) (dẫn theoPhạm Văn Lầm, 1995) [9] Nấm tiết ra các loại men làm mềm lớp vỏ kitin và tạothành một lỗ thủng tại nơi bào tử mọc mầm, qua lỗ thủng đó mầm của bào tửxâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng Vì nấm có khả năng xâm nhập vào bêntrong cơ thể côn trùng qua lớp vỏ cơ thể nên nấm có thể ký sinh được côn trùngchích hút và ký sinh được qua những pha phát triển mà các sinh vật phác không

ký sinh được như trứng, nhộng

Nấm có thể xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng qua đường miệng và

từ miệng bào tử tới ruột và qua thành ruột xâm nhiễm vào các tế bào nội quan đểgây bệnh Xâm nhập kiểu này chủ yếu là bào tử của các loài nấm ở nước trongmột số trường hợp tìm thấy rất nhiều bào tử nấm ở ruột côn trùng Dưới tác độngcủa các độc tố nấm tiết ra có thể dẫn đến hiện tượng ngừng nhu động ruột của vậtchủ Bào tử nấm có thể xâm nhập qua lỗ thở hoặc cơ quan sinh dục để vào bêntrong cơ thể côn trùng, những trường hợp này rất ít [16]

1.1.1.2 Sự xâm nhiễm và phát triển của nấm trong cơ thể côn trùng

Nấm ký sinh côn trùng có thể xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng qua conđường hô hấp, tiêu hoá hoặc cơ quan sinh dục, nhưng phần lớn là qua vỏ cuticuncủa chúng Tức là phải có sự tiếp xúc của bào tử nấm và bề mặt cơ thể vật chủ.Bào tử nấm bám vào cơ thể vật chủ, khi đủ điều kiện ẩm độ bào tử mọc mầm vàxâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớp kitin

Các bộ côn trùng dễ bị nhiễm nấm bao gồm: Coleoptera, Diptera,Homoptera, Hymenoptora và Lepidoptera Việc các loài côn trùng bị nấm xâmnhiễm là một cơ sở chứng tỏ mối quan hệ bền chặt giữa côn trùng và thực vật.Nấm xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng qua 3 giai đoạn chính:

 Giai đoạn xâm nhập:

Bào tử sau khi phát triển hoàn thiện thì lộ ra khỏi bề mặt của cơ thể vật chủ

đã bị nhiễm nấm Bào tử phát tán ra ngoài môi trường, chờ cơ hội gặp vật chủthích hợp để ký sinh

Trong điều kiện phù hợp và gặp được vật chủ thích hợp thì bào tử sẽ bámchặt vào lớp vỏ côn trùng để bắt đầu giai đoạn ký sinh

Tính từ khi bào tử nấm mọc mầm đến lúc hoàn thành việc xâm nhập vào trongxoang cơ thể côn trùng Bào tử nấm sau khi mọc mầm phát sinh mầm bệnh, nó giảiphóng các enzim ngoại bào tương ứng với các thành phần chính của lớp vỏ cuticuncủa côn trùng để phân huỷ lớp vỏ này như: Protease, chitinase, lipase, aminopeptidase,carboxypeptidase A, esterase, N - axetylglucosaminidase, cenlulase Các enzim này đượctạo ra một cách nhanh chóng, liên tục và với mức độ khác nhau giữa các loài và thậmchí ngay trong một loài

Enzim protease và chitinase hình thành trên cơ thể côn trùng, tham gia phân huỷlớp da côn trùng (cuticula) và lớp biểu bì (thành phần chính là protein) Lipase,cenlulase và các enzim khác cũng là những enzim có vai trò không kém phần quantrọng Nhưng quan trọng hơn cả vẫn là enzim phân huỷ protein (protease) và kitin(chitinase) của côn trùng Hai enzim này có liên quan trực tiếp đến hiệu lực tiêu diệtcôn trùng của nấm ký sinh côn trùng (Dẫn theo Hà Thị Quyến và cs, 2005; Tạ KimChỉnh và cs, 2005; Charley A.K et al., 1991; Janet Jennifer et al., 2006; Lerger R.J etal., 1986) [4, 6, 28, 37, 41]

Giai đoạn phát triển của nấm trong cơ thể côn trùng cho đến khi côn trùng chết:

Giai đoạn phát triển của nấm trong cơ thể côn trùng là giai đoạn sống kýsinh của nấm Trong xoang cơ thể côn trùng nấm tiếp tục phát triển, hình thành

rất nhiều sợi nấm ngắn Khi hệ sợi nấm được hình thành trong cơ thể, nó phântán khắp cơ thể theo dịch máu, phá huỷ các tế bào máu và làm giảm tốc độ lưuthông máu Toàn bộ các bộ phận nội quan bị xâm nhập Nấm thường xâm nhậpvào khí quản làm suy yếu hô hấp Hoạt động của côn trùng trở nên chậm chạp vàphản ứng kém với các tác nhân kích thích bên ngoài Kết quả là vật chủ mất khảnăng kiểm soát hoạt động sống và dẫn đến chết (Dẫn theo Phạm Văn Lầm, 2000;David Pramer, 1965) [10, 29].

 Giai đoạn sinh trưởng của nấm sau khi vật chủ chết:

Giai đoạn sinh trưởng của nấm sau khi vật chủ chết là giai đoạn sống hoạisinh của nấm ký sinh Xác côn trùng chết là nguồn dinh dưỡng có giá trị cho các

vi sinh vật Thông thường, các bộ phận bên trong cơ thể côn trùng sẽ bị phân huỷbởi vi khuẩn hoại sinh Trên bề mặt ngoài của cơ thể côn trùng, các nấm hoại

sinh như Aspergillus spp., Penicillium spp và Fusarium spp định cư ở lớp biểu

bì và cạnh tranh với vi khuẩn ở bên trong cơ thể côn trùng Do nấm côn trùng cókhả năng sản xuất ra các chất có hoạt tính như thuốc kháng sinh ức chế hoạt độngcủa vi khuẩn và nấm hoại sinh khác nên chúng có thể cạnh tranh với các sinh vậtnày để tồn tại và phát triển, làm cho xác vật chủ không bị phân huỷ

Sau khi nấm côn trùng đã sử dụng cạn kiệt nguồn dinh dưỡng bên trong cơ thểcôn trùng, nó chuyển sang giai đoạn hình thành bào tử Trong điều kiện môi trườngthích hợp, sợi nấm sinh trưởng ra ngoài tạo ra các cấu trúc sinh sản và phát tán cácbào tử sang các ký chủ mới Trong điều kiện môi trường không thích hợp, hầu hếtcác loài nấm kí sinh côn trùng có thể tạo ra dạng bào tử nghỉ như chlamydospore,zygospore và cospore hoặc tạo ra dạng bào tử hữu tính như ascospore Những dạngbào tử này cho phép nấm qua đông hoặc chống chịu lại với các điều kiện bất thuận.(David Pramer et al., 1965; Dobie et al., 1984; Leger et al., 1986) [26, 31, 41]

Ở giai đoạn xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng, nấm sử dụng cácenzim ngoại bào để phân huỷ lớp vỏ citicun Khác với giai đoạn này, ở giaiđoạn nấm đâm xuyên, mọc thành sợi ra bên ngoài nó sử dụng toàn bộ tác động

cơ học Sau đó các bào tử được hình thành trên lớp sợi nấm ở bề mặt cơ thể

vật chủ Nhiều côn trùng bị bao bọc toàn bộ bên ngoài bởi hệ sợi nấm và cácbào tử, vì vậy mà rất khó hoặc không thể xác định được các vật chủ (Dẫn theoJanet Jennifer et al., 2006) [37].

Các nấm gây bệnh cho côn trùng chỉ sinh trưởng phát triển để hoàn thànhmột chu kì sống của chúng: Từ mọc mầm bào tử đến hình thành bào tử mới Nấmgây bệnh côn trùng có thể là chuyên tính hẹp, chỉ ký sinh một vật chủ hoặc mộtgiai đoạn nhất định của vật chủ Nhưng nhiều trường hợp chúng là ký sinh cótính chuyên hoá thức ăn rộng, có thể ký sinh nhiều loại côn trùng thuộc cácgiống, họ, bộ khác nhau

Khi bào tử tiếp xúc với côn trùng để chuẩn bị xâm nhập, cơ thể côn trùng sẽxảy ra một sự kháng cự hay phòng thủ hoặc có một hệ thống miễn dịch để chốnglại sự xâm nhiễm Nếu như các enzym của nấm chiến thắng được sự phòng thủcủa côn trùng thì quá trình xâm nhiễm coi như đã thành công

Tỷ lệ nảy mầm và xâm nhập vào da của côn trùng cho thấy có sự liên quan vớitính độc của nấm và sự nhảy cảm của vật chủ Nghiên cứu này cho thấy sự quan sát

ở các giai đoạn khác nhau của chu trình lây nhiễm và giải thích rõ hơn tầm quantrọng của việc nắm bắt được đặc điểm của các giai đoạn để lựa chọn chủng nấmthích hợp cho việc sử dụng biện pháp phòng trừ sinh học đối với côn trùng [31]

1.1.1.3 Cơ chế tác động của nấm ký sinh côn trùng lên sâu hại

Quần thể côn trùng gây hại có thể bị giảm một cách đột ngột vì bị nấm ký sinhcôn trùng tấn công Nấm ký sinh côn trùng có khả năng xâm nhiễm trực tiếp xuyênqua lớp vỏ cơ thể của côn trùng Một số lượng các bào tử nấm sau khi được phát tán

ra khỏi bề mặt của xác côn trùng đã bị nhiễm nấm lại tiếp tục một chu trình mớixuyên suốt trong quần thể

Một chu trình trong suốt vòng đời của nấm phải trải qua 6 pha

 Pha 1: Tìm ký chủ

Bào tử sau khi phát triển hoàn thiện thì lộ ra khỏi bề mặt của cơ thể vật chủ

đã bị nhiễm nấm Bào tử phát tán ra ngoài môi trường, chờ cơ hội gặp vật chủthích hợp để ký sinh

 Pha 2: Xâm nhập ký chủ

Trong điều kiện phù hợp và gặp được vật chủ thích hợp thì bào tử sẽ bámchặt vào lớp vỏ côn trùng để bắt đầu giai đoạn ký sinh

 Pha 3: Bào tử nảy mầm

Khi ở trong điều kiện môi trường thích hợp, gặp được vật chủ thì bào tử bắtđầu nảy mầm ngay trên bề mặt lớp vỏ côn trùng

 Pha 4: Xâm nhiễm vào cơ thể ký chủ

Sau khi nảy mầm dưới dạng các ống mầm, bào tử dùng đĩa bám của mìnhxâm nhập vào cơ thể côn trùng bằng cách phá vỡ tầng cuticun bên ngoài lớp vỏcôn trùng bằng sự kết hợp giữa sức ép cơ học và tiết các enzym phá vỡ tầng cutin

và phát triển vào bên trong

 Pha 5: Sinh trưởng trong ký chủ

Sau khi phá vỡ được lớp vỏ tế bào, các cành sợi nấm phát triển và lan rộngvào cơ thể Sử dụng các chất protein, lipit,… trong cơ thể côn trùng biến thànhchất dinh dưỡng nuôi các sợi nấm Nấm dùng tế bào chất của vật chủ làm nguồnthức ăn, làm cho vật chủ yếu dần và dẫn đến chết Các sợi nấm phát triển mạnhtạo thành một mạng lưới bao phủ khắp cơ thể côn trùng

 Pha 6: Phát tán bào tử

Sau khi đã ăn hết khắp cơ thể côn trùng, lúc này bào tử đã phát triển hoànthiện và được phóng ra bên ngoài, trên bề mặt các sợi nấm Lúc này đã có thểquan sát bào tử ở bên ngoài Sau đó bào tử lại được phát tán vào môi trường đểtiếp tục một chu trình mới

Khi bào tử tiếp xúc với côn trùng để chuẩn bị xâm nhập, cơ thể côn trùng sẽxảy ra một sự kháng cự hay phòng thủ hoặc có một hệ thống miễn dịch để chốnglại sự xâm nhiễm Nếu như các enzym của nấm chiến thắng được sự phòng thủcủa côn trùng thì quá trình xâm nhiễm coi như đã thành công

Pha 4 được xem là quan trọng nhất, để đánh giá sự xâm nhiễm của nấm vào

cơ thể côn trùng Quá trình ở pha 4 diễn ra theo trình tự như sau: Sau khi bào tửnấm nảy mầm dưới dạng các ống mầm và ở cuối có một giác bám dạng đĩa bám

chặt vào lớp vỏ côn trùng Lúc này cơ thể côn trùng xảy ra một cơ chế miễn dịch

để kháng cự lại sự xâm nhiễm của nấm Hệ thống miễn dịch của ký chủ côn trùngtiết ra các hợp chất đối kháng như quinine và melanine

Hình 1.1 Chu trình phát triển của bào tử nấm ký sinh trong cơ thể ký chủ(Nguồn: Bruce L Parker, Scott Costa, Margaret Skinner, 2004) [25].Các chế phẩm từ nấm được sản xuất bao gồm bào tử nấm và các giá thể.Khi phun, những bào tử nấm dính vào cơ thể côn trùng, khoảng 24 giờ sau gặpđiều kiện thuận lợi sẽ nảy mầm và mọc thành sợi nấm xuyên qua lớp vỏ kitin củachúng Bào tử nấm phát triển ngay trong cơ thể côn trùng cho đến khi xuất hiệncác tế bào nấm đầu tiên rồi tiếp tục phân nhánh tạo nên một mạng sợi nấm chằngchịt Chính trong quá trình bào tử nảy mầm đã tiết ra một phức hệ enzym ngoạibào phân giải kitin, protein và lipit Đồng thời, nấm tiết ra độc tố làm các tế bào

bị phân huỷ, côn trùng bị tê liệt rồi chết Nấm vẫn tiếp tục phát triển trên xác côntrùng, sợi nấm chui qua lớp vỏ kitin, hình thành một lớp bào tử xanh (Ma), trắng(Bb) như hiện tượng của bệnh tằm vôi Sau đó bào tử nấm tiếp tục lây lan, pháttán sang các con côn trùng khác và thực hiện những chu trình mới Mỗi chu trìnhthường kéo dài và kết thúc trong vòng 7 - 10 ngày

1.1.1.4 Triệu chứng bên ngoài bị nhiễm nấm ký sinh côn trùng

Những cá thể sâu bị nhiễm nấm thường có các vệt chấm đen xuất hiện trên bềmặt, có thể tại nơi bào tử nấm bám vào và mọc mầm xâm nhiễm vào bên trong cơthể vật chủ

Khi bị bệnh do nấm, sâu hại ngừng hoạt động khoảng 2 - 3 ngày trước thờiđiểm phát triển hoàn toàn của nấm trong cơ thể vật chủ

Những cá thể sâu hại bị nhiễm nấm côn trùng thường có màu hồng nhạt,một số loài nấm có thể làm cho sâu bệnh trở nên màu vàng nhạt, xanh lá cây,hoặc nâu Cơ thể sâu bị bệnh ngày càng trở nên hoá cứng

Cơ thể côn trùng bị chết do nấm côn trùng không bao giờ bị tan nát màthường giữ nguyên hình dạng như khi còn sống Toàn bộ bên trong cơ thể sâuchết bệnh chứa đầy sợi nấm Sau đó các sợi nâm nầy mọc ra ngoài qua vỏ cơ thể

và bao phủ toàn bộ mặt ngoài của cơ thể sâu chết bệnh Đây là đặc điểm rất đặctrưng đẻ phân biệt sâu chết bệnh do nấm côn trùng với các bệnh khác (Dẫn theoPhạm Văn Lầm, 2000) [10]

Thomas M B., Read A F (2007) [42] nêu sơ đồ xâm nhiễm của nấm kýsinh côn trùng vào cơ thể vật chủ (Hình 1.2)

Hình 1.2 Cơ chế xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng(Nguồn: Matt B Thomas và Andrew F Read, 2007) [42]

Theo Thomas M B., Read A F., chu kỳ phát triển của nấm ký sinh côn

trùng, như nấm Beauveria bassiana và Metarhizium anisopliae gồm các giai

đoạn: Bào tử đính tiếp xúc với tầng cuticun của lớp vỏ vật chủ, bào tử nảy mầm

và sinh sản hình thành vòi và giác bám (cấu trúc cơ quan xâm nhập)

Sự xâm nhập của bào tử đính là sự tổ hợp của sức ép cơ học và sự tác độngcủa enzim phân giải tầng cuticun Quá trình sinh trưởng bên trong xoang máu cơthể vật chủ và sự sinh sản của bào tử đính làm vật chủ bị chết Tầng cuticun của

vỏ cơ thể vật chủ là tầng chống chịu đầu tiên trong việc bảo vệ chống lại sự xâmnhiễm của nấm và có vai trò quyết định đến tính chuyên hoá đặc hiệu của nấm.Nếu nấm phá vỡ được tầng cuticun thì sự xâm nhiễm thành công, sau đó phụthuộc vào khả năng chiến thắng được phản ứng miễn dịch bẩm sinh của côntrùng của nấm Các loài côn trùng có thể phản ứng lại sự xâm nhiễm này của nấmbằng cả hai phương thức là tế bào và thể dịch Sự hình thành hoạt động miễn dịchcàng sớm ở điểm phân giải bào tử đính trong suốt quá trình xâm nhập Các loàinấm nói chung đều có hai phương thức để chiến thắng các phản ứng tụ vệ của vậtchủ: Sự phát triển của các dạng sinh trưởng giai đoạn tiềm ẩn là sự nguỵ tranghữu hiệu từ các phản ứng tự vệ của vật chủ và sự sẩnn xuất ra các chất miễn dịchphân hoá thuận nghịch của bộ phận ức chế hệ thống bảo vệ

1.1.2 Giả thuyết khoa học

 Câu hỏi nghiên cứu

Đề tài nghiên cứu nhằm trả lời các câu sau:

(1) Đặc điểm hình thái và sự sinh trưởng, phát triển và khả năng hình thành

bào tử của nấm Isaria sp3 trên môi trường PDA như thế nào?

(2) Khả năng sinh trưởng, phát triển và khả năng phát sinh bào tử của nấm

Isaria sp3 trên các môi trường rắn khác nhau, môi trường nào thì thu được sinh

khối lớn nhất và có số lượng bào tử lớn nhất?

(3) Phương pháp tạo thành chế phẩm nấm Isaria sp3., bảo quản chế phẩm

như thế nào thì hiệu quả nhất?

(4) Hiệu quả phòng trừ của chế phẩm nấm Isaria sp3 đối với một số đối

tượng sâu hại (sâu khoang, rệp,…) như thế nào?

 Giả thuyết nghiên cứu

- Nấm Isaria sp3 sinh trưởng, phát triển và cho số lượng bào tử rất tốt trên

môi trường PDA

- Trên các loại môi trường rắn dùng để nhân sinh khối thì môi trường được

phối trộn theo tỷ lệ 5gạo + 4cám + 2 nước + 1 trấu nấm Isaria sp3 thu được sinh

khối nhanh nhất và có số lượng bào tử nhiều nhất

Chế phẩm từ nấm Isaria sp3 bảo quản bằng cách sấy khô ở nhiệt độ 35

-38oC sau đó nghiền bột mịn và đóng bao bảo quản là tốt nhất

1.1.3 Cơ sở thực tiễn của đề tài

Các công trình nghiên cứu về nấm ký sinh côn trùng đã và đang được cácnhà khoa học trên thế giới và ở Việt Nam tiến hành nghiên cứu Việc nghiên cứu

về nấm ký sinh côn trùng đã mang lại nhiều kết quả rất khả quan và đang đượcứng dụng trong thực tiễn rất có hiệu quả

Biện pháp nhân nuôi nhanh nấm ký sinh côn trùng trên các môi trường rắn đểtạo sinh khối nấm, tạo ra các chế phẩm phục vụ cho việc ứng dụng trong thực tiễn(phòng trừ các đối tương sâu, bệnh hại cây trồng) là hướng đi còn khá mới lạ nhưnghứa hẹn một sự phát triển mạnh mẽ trong tương lai, vì nó có rất nhiều ưu điểm nhưkhông ảnh hưởng đến sức khoẻ con người, không làm mất cân bằng sinh học, nấm

ký sinh côn trùng có tính chuyên hoá cao đối với vật chủ do đó không gây ảnhhưởng đến hệ thiên địch,…

Trên thế giới cũng đã có nhiều công trình nghiên cứu về nấm ký sinh côntrùng và việc ứng dụng của chúng trong phòng trừ sâu hại cây trồng

Vào năm 1878, Metschnhikov đã phát hiện và phân lập được nấm xanh

Entomophthora anisopliae trên sâu non bọ cánh cứng hại lúa mỳ, về sau này đổi tên là Metarhizium anosopliae Tác giả đã tìm ra con sâu mang bệnh nấm và nghiên cứu

môi trường để nhân nuôi chúng rồi thử lại bằng cách sử dụng bào tử thuần khiếtgây bệnh trên ấu trùng và dạng trưởng thành của sâu non bọ đầu dài hại củ cải

đường, ông nhận thấy có hiệu quả Ông đã sản xuất dạng bào tử thuần rồi trộn với chấtbột nền và đưa ra đồng ruộng để diệt sâu non và trưởng thành bọ đầu dài hại củ cảiđường, hiệu quả đạt được 55 - 80% sau 14 ngày thử nghiệm [15].

Sự phát hiện của Agostino Bassi (1895) về loại nấm gây bệnh tằm vôi, bệnh

đã làm thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho ngành công nghiệp tơ lụa của Italia, đó là

nấm Beauveria bassiana (nấm bạch cương) Nghiên cứu của ông đã cho thấy rằng

nấm được nhân lên rất nhanh trong cơ thể tằm và bệnh tằm vôi là bệnh truyềnnhiễm, di chuyển một cách tự nhiên trực tiếp từ ấu trùng bị bệnh sang ấu trùng khoẻmạnh hoặc cơ thể bị nhiễm qua thức ăn Sau công bố của Bassi thì ngày càng cónhiều công trình nghiên cứu sử dụng nấm để trừ côn trùng gây hại

Các nghiên cứu của Samson và Romach (1985) chỉ ra rằng, các loài thuộc

giống Aschersonoa trong đó có loài A aleyrodis co thể sử dụng để kiểm soát loài

Trialeurodis vaporariorum thuộc họ Coccoidea, bộ Homoptera Mặt khác tác giả

này còn nghiên cứu về khả năng sử dụng chế phẩm từ nấm A aleyrodis ở nồng

độ cao (1013 bào tử/ml) có thể hoàn toàn tiêu diệt được loài T vaporariorum trên

cây bầu bí Ngoài ra, các công trình nghiên cứu của Evans và Hywel - Jones(1997); Evans (1998) [32; 33] đưa ra triển vọng sử dụng các loài thuộc giống

Aschersonia như là thiên địch tự nhiên của các loài côn trùng thuộc họ Aleyrodiidae và Coccoidae.

Ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu về sử dụng nấm ký sinh côn trùng đểphòng trừ sâu xanh bướm trắng, sâu tơ, bọ nhảy,… hại rau cải và bắp cải đã đượctiến hành như: Nghiên cứu của Phạm Thị Thuỳ, Ngô Tự Thành (2005) [13] về đặc

điểm sinh học và hiệu lực diệt trừ sâu hại của nấm Metarhizium anosopliae Sorokin,

nghiên cứu này đã sử dụng loại nấm này để phòng trừ sâu tơ, sâu xanh bướm trắng,

bọ xít đen, mối nhà

Năm 2006, Lê Thuỳ Quyên với đề tài “nghiên cứu công nghệ sản xuất nấm

Metarhizium anosopliae Sorok để phòng trừ sâu hại cây trồng” đã được công bố

và đạt giải Vifotec 2006 Chế phẩm nấm Metarhizium từ nghiên cứu diệt trừ

được các loài sâu xanh bướm trắng ăn su hào, bắp cải, sâu khoang ăn lá cà chua,

… cho kết quả diệt trừ sâu trên 70%

Cuối năm 2006, khi dịch rầy nâu bùng phát khắp nơi tai Đồng Bằng Sông CửuLong gây ra bệnh vàng lùn - lùn xoắn lá, dịch rầy nâu bùng phát đã làm giảm năngsuất đáng kể của người dân trồng lúa, trường đại học Cần Thơ đã đưa ra quy trìnhsản xuất chế phẩm nấm xanh từ môi trường hạt gạo tẻ do chính nông dân sản xuất đểphun xịt phòng trừ rầy nâu gây hại lúa mang lại hiệu quả rất khả quan

Đây là những “bước nhảy” trong nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng ở nước

ta, tạo tiền đề thuận lợi cho những nghiên cứu tiếp theo sau này

1.2 Những nghiên cứu trong và ngoài nước về nấm ký sinh côn trùng và công nghệ sản xuất thuốc vi nấm diệt côn trùng

1.2.1 Những nghiên cứu trên thế giới

Năm 1709, sau những phát hiện đầu tiên của Balisneri về nấm gây bệnh trêncôn trùng cũng là lúc ra đời ngành nghiên cứu bệnh lý côn trùng Nhưng đến thế kỷXVIII mới có những ghi chép ban đầu về nấm côn trùng và tác giả đã khẳng địnhnấm côn trùng là vi sinh vật gây bệnh đầu tiên được chứng minh về khả năng lantruyền từ ký chủ này sang ký chủ khác (Dẫn theo Phạm Thị Thùy, 2004) [15] Các nghiên cứu từ thế kỷ XVIII cho đến nay đã đưa ra nhiều bằng chứngchứng tỏ côn trùng bị nhiều loài nầm gây hại Trên cơ sở đó, các nghiên cứu chủyếu tập trung vào vai trò của nấm trong việc gây bệnh cho một số đối tượng sâuhại để ứng dụng vào việc phòng trừ dịch hại cây trồng

Agostino Bassi (1773-1856), người Italia, được coi là “ông tổ” của bệnh lýcôn trùng với công trình nghiên cứu về nấm bạch cương ở tằm vào năm 1835(Dẫn theo Phạm Thị Thùy, 2004) [15] Ông nghiên cứu về bệnh tằm vôi

“Muscardine”, đây là bệnh làm thiệt hại kinh tế nghiêm trọng trong ngành côngnghiệp tơ lụa ở Italia Năm 1835, Bassi đã xác định được nguyên nhân của bệnh

“Muscardine” ở tằm là do nấm bạch cương (Beauveria bassiana) Nấm bạch

cương đã được nhân lên ở trong và trên cơ thể tằm và bệnh tằm vôi là bệnh

truyền nhiễm, di chuyển một cách tự nhiên trực tiếp từ ấu trùng bị bệnh sang ấutrùng khoẻ mạnh hoặc cơ thể bị nhiễm qua thức ăn Ông đã gợi mở ra việc dùng

vi sinh vật để diệt sâu hại

Beauveria bassiana là vi sinh vật đầu tiên được xác định như là một tác

nhân gây bệnh cho côn trùng (tằm dâu) Loài nấm này được đặt tên là Beauveria

bassiana để ghi nhớ người đã phát hiện ra nó Thuật ngữ “muscardine” được hiểu

là nấm ký sinh côn trùng hay là một nguyên nhân gây bệnh bởi nấm [28] Saucông bố của Bassi thì ngày càng có nhiều công trình nghiên cứu sử dụng nấm trừcôn trùng gây hại

Những công trình nghiên cứu phát hiện về nấm xuất hiện trên côn trùng củaOduen (1837), cho biết nấm trắng Muscardin không chỉ có riêng trên tằm mà còn

có thể dùng để phòng trừ những loài côn trùng gây hại khác [15]

Vào năm 1878, Metschnhikov đã phát hiện và phân lập được nấm xanh

Metarhizium anisopliae, tác giả đã tìm ra con sâu mang bệnh nấm và nghiên cứu

môi trường nuôi cấy để nhân nuôi chúng rồi thử lại bằng cách sử dụng bào tửnấm thuần khiết gây bệnh trên ấu trùng và trưởng thành của sâu non bọ đầu dàihại củ cải đường, ông nhận thấy có hiệu quả Ông đã sản xuất bào tử nấm

Metarhizium anisopliae dạng thuần khiết rồi trộn với chất bột nền và đưa ra đồng

ruộng để diệt sâu non và trưởng thành bọ dài hại củ cải đường (Bothinoderes

punctiventris), hiệu quả đạt 55 - 80% sau 10 - 14 ngày thử nghiệm.

Tiếp sau đó nhà bác học Snoi cũng đã tiến hành một loạt thí nghiệm với nấm

trắng Beauveria globuliera để gây bệnh trên bọ xít (Bliscus lencoptera Say) hại lúa

mỳ Các nhà khoa học trường đại học Tổng hợp Kanzac đã thiết lập trạm tuyên

truyền để phổ biến vai trò của nấm Beauveria với việc lây bệnh côn trùng, họ đã gửi

500 kiện nấm Beauveria đến các trang trại để phòng trừ sâ hại củ cải đường

Những thí nghiệm của Louis Pasteur về nấm bạch cương trên tằm đã mởđường cho việc mở đường cho việc nghiên cứu dùng nấm trừ sâu hại ChínhPasteur (1874) đã đề xuất tìm kiếm nấm côn trùng thích hợp để trừ rệp hại rễ nhoPhylloxera (Weiser, 1966) Trong suốt 5 năm liền từ năm 1885 - 1890, tại trung

tâm nuôi tằm ở Pháp, ông đã phát hiện vi sinh vật gây bệnh tằm vôi là nấm

Beauveria bassiana và vi khuẩn Bacillus thuringiensis Sau đó ông đã nghiên cứu

để tìm ra các biện pháp phòng trừ [15]

Ilya Metchnikoff (1845-1916) [28], năm 1879 ông đã tiến hành nghiên cứu dùng

nấm Metrhizium anisopliae để trừ bọ hung hại lúa mì, xuất bản một bản mô tả sự nhiễm tự nhiên của con bọ da trên lúa mì do nấm màu xanh (Metarrhizzium

anisopliae Metchnikoff) và mô tả phương pháp bố trí thí nghiệm cho việc thử nghiệm

khả năng kiểm soát côn trùng bằng nấm ký sinh Thí nghiệm của Metchnikoff thànhcông trên đồng ruộng đã khuyến khích nhiều nhà nghiên cứu về nấm cũng như các visinh vật khác để trừ sâu hại (dẫn theo Phạm Văn Lầm, 2000) [10]

Ở Philippin, theo điều tra của các nhà khoa học về tình hình phổ biến của

hai loại nấm Zoophthora radiccans và Eryniablunckii tại vùng cao nguyên

Baguio, hiện tượng nhộng và sâu non nhiễm nấm trên đồng ruộng được ghi nhận

từ 6 tuần đến 7 tuần sau khi trồng theo thứ tự là trên 90% sâu non và 70% nhộng

bị nhiễm nấm Nấm Eryniablunckii là tác nhân chính gây chết sâu tơ trong

khoảng thời gian từ tháng 11/1989 - tháng 1/1991 (Charnley et al., 1991) [28]

Ở Jamaica Alam (1990) cho biết thành phần nấm bệnh sâu tơ gồm Beauveria

bassiana (trên sâu non và trên nhộng), Hirsutella sp (trên sâu non) và Paecilomyces

sp (trên nhộng) Nấm ký sinh côn trùng phát triển mạnh trong mùa mưa Nguồn

nấm Beauveria được sản xuất thành chế phẩm thử nghiệm đạt hiệu quả cao ngoài

đồng, tuy nhiên tỷ lệ sâu chết trong lô xử lý chỉ đạt 12,5 - 54,5% và trong lô đốichứng là 10,7 - 46,9% không khác biệt nhiều Tác giả cho rằng có thể trong thờigian xử lý thuốc, gió tương đối mạnh đã di chuyển thuốc đến những lô không xử

lý kế cận Dù vậy, kết quả sử dụng nấm bệnh tại chỗ như Beauveria để phòng trừ

sâu tơ đã mở ra phương hướng phòng trừ sinh học sâu tơ trong tương lai [2].Trong khoảng 40 năm trở lại đây nhiều nghiên cứu cho thấy rằng sử dụng

nấm Metarhizium sp một cách hợp lý trong biện pháp phòng trừ tổng hợp đã mang lại hiệu quả cao Tại Malaysia, nấm xanh Metarhizium anisopliae đã được

nghiên cứu để phòng trừ mối đất đạt hiệu quả 64,75% sau 14 ngày Tại

Philippines, đã nghiên cứu sử dụng nấm xanh để diệt rầy nâu hại lúa đạt hiệu lực

60% sau 10 ngày Tại Úc, năm 1991 Milner đã nghiên cứu nấm Metarhizium

anisopliae để phòng trừ bọ hung hại mía đạt hiệu quả 68% Tại Nhật Bản, năm 1988

một số nhà khoa học đã sử dụng nấm xanh để phòng trừ dòi hại rễ củ cải đạt hiệuquả trên 70%, sau 10 ngày (Phạm Thị Thùy, 2004) [21]

Đến năm 1987, trên thế giới đã mô tả được hơn 750 loài nấm gây bệnh hạicôn trùng trong tổng số 100.000 loài nấm (Pavlyuskin, 1987) Hiện nay, theođánh giá của David Hawksworth, trong tự nhiên có khoảng 1,5 triệu loài nấm kýsinh côn trùng đang chờ các nhà khoa học khám phá (Janet Jennier Luangsa-ard

và nnk, 2006) (dẫn theo Trần Ngọc Lân và nnk, 2007) [17] Tuy nhiên, cácnghiên cứu mới chỉ tập trung vào một số ít nấm ký sinh côn trùng ở trong hệ sinhthái nông nghiệp vùng nhiệt đới

Nấm Isaria farinosa (Paecilomyces farinosus) là một chủng nấm ký sinh côn

trùng Người ta đã tiến hành phân tích các thành phần có trong loài nấm này và tiếnhành nuôi cấy trên các môi trường trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau (thay đổi

nhiệt độ và ánh sáng) để theo dõi khả năng phát triển của nấm Isaria farinosa [35] Loài nấm Isaria được nghiên cứu và cho thấy loại nấm này có độc tính

mạnh mẽ đối với côn trùng, trên ấu trùng của bộ Lipidoptera, Coleoptera, Bộ

Cánh màng,… chất chuyển hóa của Isaria farinosa có tác động của antisenescence,

antitumor và những chất khác như auxin và cytokinin (Kouetal, 1996; Wangetal,1996; An, 2003) Người ta còn dùng loại nấm này để điều chế các thuốc chốngung thư và có tác dụng chống oxy hoá trong cơ thể người [46]

Năm 2009, Universidade Estadual Paulista (Unesp) đã tiến hành thử nghiệm phun

chế phẩm tạo ra từ nấm Isaria farinosa lên đối tượng ruồi trưởng thành và nhộng ruồi ở

ba mức nồng độ là 106, 107, 108/ml cho kết quả rất khả quan Trong đó, ở mức nồng độ

108 bào tử/ml cho tỷ lệ ruồi chết đạt cao nhất, trên 60% đối với nhộng và 56,6% đối vớiruồi trưởng thành

Tình hình sản xuất thuốc vi nấm trên thế giới: Từ những năm 80 của thế kỷtrước (1880 - 1886), Metschnhikov cùng học trò của mình là Isac Craxinstic đã

nghiên cứu hàng loạt môi trường nuôi cấy nấm M anisopliae và đã sản xuất thử

hàng nghìn kilogam nấm để tách bào tử thuần khiết, sau đó dùng bào tử thuầncủa nấm trộn với đất bột và đem tung ra đồng ruộng, theo tác giả thì sau 10 - 14ngày thí nghiệm cả sâu non và dạng trưởng thành của bọ xít đầu dài hại củ cảiđường chết với tỷ lệ 55 - 80%

Cũng trong thời gian đó ở Mỹ người ta đã sử dụng nấm để phòng trừ sâu hạilúa mì Năm 1888, Snoi đã tiến hành một loạt thí nghiệm với nấm Muscardin

(Beauveria bassiana) để phòng trừ bọ xít hại lúa mì có kết quả khả quan.

Vấn đề được nghiên cứu nhiều nhất là thành phần dinh dưỡng cũng nhưphương pháp nuôi cấy nấm côn trùng Để nhận được lượng sinh khối và bào tử

nấm, Dangar và cs đã nuôi cấy nấm M anisopliae trên vài môi trường và đã xác

định được môi trường Czapek - Dox là phù hợp nhất Các tác giả cũng nhận thấytrong các loại ngũ cốc sử dụng làm nguồn cacbon thì gạo là phù hợp nhất Basto Cruz

và cs khi nuôi nấm M anisopliae để sản xuất chế phẩm nhận thấy, trên môi trường

gạo cho số lượng bào tử hình thành nhiều gấp 3 lần và thời gian hình thành bào

tử cũng nhanh hơn so với môi trường đậu tương ngâm Các tác giả còn sử dụngcác loại cám, trấu, nước dừa và cùi dừa để sản xuất ra sinh khối nấm

Metarhizium anisopliae.

Nuôi cấy nấm để sản xuất ra thuốc trừ sâu sinh học còn phụ thuộc rất nhiềuvào chủng gốc mới phân lập và nguyên liệu làm môi trường Mặc dù thuốc vi nấmđược sản xuất từ các nước khác nhau nhưng đều cho hiệu quả diệt côn trùng cao.Trên cơ sở công nghệ sinh học, nhiều phòng thí nghiệm sinh học trên thế giới đãnghiên cứu và chế tạo ra các loại thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ vi nấm Phổ biến

nhất là các dạng thuốc trừ sâu từ nấm trắng Beauveria bassiana và nấm xanh

Metarhizium anisopliae, Metarhizium flavoviride Nấm Aschersonia được chế thành

thuốc để trừ bọ phấn

1.2.2 Những nghiên cứu ở Việt Nam

Việt Nam là nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, có nguồn đa dạng sinhhọc cao, nhưng việc nghiên cứu về nấm ký sinh côn trùng cũng như khả năngphòng trừ của chúng để ứng dụng trong thực tiễn đang còn nhiều hạn chế

Tại Việt Nam, việc nghiên cứu sản xuất và ứng dụng các chế phẩm vi nấmgây bệnh côn trùng ở một số Viện và các Trung tâm khoa học đã được tiến hành

từ những năm 70 của thế kỷ XX Đến những năm 90, công nghệ sản xuất thànhchế phẩm phòng trừ một số sâu hại cây trồng như sâu xanh bướm trắng, sâu tơhại rau, sâu đo hại đay, rầy nâu hại lúa, châu chấu hại ngô - mía, bọ xít hạinhãn, vải, sùng hại mía, sâu róm hại thông và bọ hại dừa, đã dần được hoànthiện Đến nay, các chế phẩm phòng trừ dịch hại được sản xuất từ Bb và Ma củaViện Bảo vệ thực vật Việt Nam với tên thương mại là Boverit và Mat đã trở nênrất quen thuộc và đáng tin cậy với bà con nông dân Tuy nhiên ở nước ta, đến nay

mới chỉ tập trung nghiên cứu và ứng dụng hai loài nấm là Beauveria bassiana và

Các công trìch nghiên cứu và sử dụng hai loài nấm trên để phòng trừ sâu hại

đã và đang được ứng dụng rộng rãi và tiếp tục nghiên cứu

Ở Hưng Yên, năm 1993 đã sử dụng nấm xanh để phòng trừ sâu đo chỉ sau 7 - 10ngày hiệu quả khoảng 70 - 89% Tại Tiền Giang, Sóc Trăng, Bạc Liêu đã sử dụng

Metarhizium anisopliae để phòng trừ rầy nâu, bọ xít, sâu cắn gié bọ cánh cứng hại dừa

đạt hiệu quả cao Tại Cần Thơ, từ năm 2005 - 2007 đã sử dụng nấm Metarhizium

anisopliae để phòng trị sâu ăn tạp, rầy mềm đạt hiệu quả khá cao trên 70% sau 7-12

ngày (Trần Văn Hai et al., 2006) [21]

Vụ hè thu năm 2003, tại Hà Tĩnh, sử dụng Beauveria và Metarhizium với

nồng độ 5 x 108 bào tử/ ml để phòng trừ sâu xanh đục quả đậu xanh 123 cho tỷ lệ

chết là 69,8% đối với Beauveria và 71,7% đối với Metarhizium Sử dụng hai loại

nấm trên để phòng trừ sâu khoang và sâu keo da láng ăn đậu tương DT84 cho tỷ

lệ chết là 61,1% đối với Beauveria và 68% đối với Metarhizium (Phạm Thị Thuỳ

và nnk, 2005) [14] Sử dụng nấm Metarhizium để phòng trừ bọ cánh cứng hại dừa

Brontispa sp Ở Hải Phòng năm 2004, cho tỷ lệ chết ở pha sâu non là 76,5% - 85,8%

sau 30 ngày phun và ở pha trưởng thành trong điều kiện nhiệt độ trung bình là31,1oC, độ ẩm 78,5 - 89,6% sau 10 ngày thử nghiệm và 85,4 - 95,4% sau 30 ngày thínghiệm (Phạm Thị Thuỳ và nnk, 2005) [13]

Kết quả điều tra từ tháng 7 năm 2007 đến tháng 5 năm 2008 của Trần NgọcLân và nnk đã thu thập được 690 mẫu nấm ký sinh côn trùng ở VQG Pù Mát -Nghệ An Định loại xác định được 63 loài thuộc 17 giống, 3 bộ nấm ký sinh côn

trùng Trong các giống thu thập được, giống Aschersonia có nhiều loài nhất là 16

loài với 163 mẫu, chiếm 23,62% trong tổng số mẫu thu thập được Giống

Hypocrella có 7 loài với 64 mẫu chiếm 9,28% trong tổng mẫu thu thập Hai

giống này ký sinh chủ yếu trên rầy, rệp thuộc bộ Homoptera Các giống khác có

số loài giao động từ 1 đến 6 loài [17]

Nghiên cứu đặc tính sinh học và hiệu lực diệt côn trùng có hại của nấm

Metarhizium anisopliae Sorokin (Phạm Thị Thuỳ, Ngô Tự Thành, 2005) cho kết

quả như sau: Đối với sâu tơ, sau 8 ngày phun ở 2 nồng độ 2 x 108 bào tử/ ml và 4 x

108 bào tử/ ml tỷ lệ sâu chết đạt lần lượt là 72,2% và 83,4% Đối với sâu xanh bướmtrắng, tỷ lệ sâu chết đạt thấp hơn, sau 12 ngày phun với nồng độ 3 x 108 bào tử/ ml,tỷ lệ sâu chết đạt 61,8% còn với nồng độ 6 x 108 bào tử/ml thì tỷ lệ chết là 70,3%

Đối với mối nhà, nấm Metarhizium anisopliae cho hiệu lực phòng trừ rất cao, tỷ lệ

mối chết đạt 100% sau 7 ngày xử lý ở nồng độ 5 x 108 bào tử/ml [13]

Nguyễn Xuân Thanh, Phạm Thị Thuỳ, nghiên cứu năm 2005 cho biết chế

phẩm nấm Metarhizium anosopliae có khả năng phát triển và ký sinh gây bệnh

trên rệp sáp hại rễ cây cà phê rất tốt trong điều kiện tự nhiên ở Daklak Thí

nghiệm ở nồng độ dịch bào tử nấm 108 bào tử/ml, phun lên hỗn hợp phân hữu cơxốp bán quanh gốc và giữ ẩm, hiệu quả trừ rệp sau phun 45 ngày đạt 90%, sau 12tháng đạt trên 70% [8].

Theo kết quả điều tra thực tế ngoài đông ruộng tại ruộng rau cải và cải bắp

thuộc xã Mai Dịch - Từ Liêm - Hà Nội cho thấy tỷ lệ nhiễm nấm Metarhizium tự

nhiên trên sâu tơ là 5,5 - 6,6%, sâu xanh bướm trắng là 12,5 - 14,5% Trong điều

kiện phòng thí nghiệm, dịch bào tử nấm Metarhizium có hiệu quả diệt sâu tơ là

83,4% sau 8 ngày phun, sâu xanh bướm trắng là 70,3% sau 12 ngày phun, bọ xítđen là 69,2% sau 15 ngày phun và mối nhà là 100% sau 7 ngày thí nghiệm.Trong điều kiện chậu vại, sâu tơ là 60 - 76% sau 12 ngày xử lý, (Phạm Thị Thuỳ và

nnk, 2005) [11] Sử dụng nấm Metarhizium để phòng trừ mối nhà Coptotermes

formosanus Shizaki cho tỷ lệ chết là 88% ở hàm lượng chế phẩm 0,005; 92% ở hàm

lượng 0,01; 96% ở hàm lượng 0,02 trong điều kiện phòng thí nghiệm rắc trên mặtđất cho tỷ lệ chết là 86,9% ở hàm lượng 0,005; 91,3% ở hàm lượng 0,01; 96% ởhàm lượng 0,02 (Trịnh Văn Hạnh và nnk, 2005) [19]

Nấm Metarhizium được dùng để phòng trừ bọ nhảy ở nồng độ trong điều kiện

phòng thí nghiệm cho tỷ lệ chết và mọc nấm theo mức tăng của nồng độ và thời gian

xử lý Ở nồng độ 3% bào tử/ml tác giả thu được 22,22% số bọ nhảy bị chết và16,05% số bọ nhảy mọc nấm sau 7 ngày phun Nồng độ 5% bào tử/ml có 30,86% số

bọ nhảy chết và 23,46% bọ nhảy mọc nấm Nồng độ 7% bào tử/ml cho tỷ lệ chết là

33,33% với tỷ lệ mọc nấm là 25,93% Tác giả Đinh Thị Hiền xử lý nấm Metarhizium

sp trên sâu non bọ nhảy thu được kết quả khả quan hơn rất nhiều so với trưởngthành: Nồng độ 3% bào tử/ml cho tỷ lệ chết là 62,96%, tỷ lệ mọc nấm là 42,42%;nồng độ 7% bào tử/ml cho tỷ lệ chết là 70,37%, tỷ lệ mọc nấm là 62,96% [2] Bên

cạnh đó Đinh Thị Hiền còn dùng nấm Metarhizium sp để phòng trừ sâu tơ trong

điều kiện nhiệt độ phòng bán tự nhiên trung bình là 22,5oC, ẩm độ trung bình là82,5%RH cho kết quả rất khả quan Nồng độ 2 x 108 bào tử/ml cho tỷ lệ chết 50%,tỷ lệ mọc nấm là 20,99% Nồng độ 4 x 108 bào tử/ml có tỷ lệ chết là 66,67%, tỷ lệ

mọc nấm là 30,77% Nồng độ 6 x 108 bào tử/ml cho tỷ lệ chết là 71,79%, tỷ lệ mọcnấm là 39,74% Tất cả các số liệu trên đều theo dõi trong 7 ngày [2].

Phan Văn Khang (2007) sử dụng Metarhizium sp phòng trừ sâu tơ cho tỷ lệ

chết 66,67% và tỷ lệ mọc nấm là 33,33% ở nồng độ 8 x 108 bào tử/ml sau 7 ngày

theo dõi Trường đại học Cần Thơ đã đưa ra 3 loại nấm Metarhizium, Paecilomyces,

Verticillium vào nuôi cấy và chế thành chế phẩm sinh học phun trên cây trồng để

diệt trừ côn trùng gây hại Sau 2 năm thử nghiêm, nấm Metarhizium cho kết quả:

diệt được từ 50% trở lên đối với ấu trùng sâu ăn tạp trên hoa màu; 80% rầy mềm

trên bí, dưa; 80% bộ cánh cứng phá hại trên dừa Nấm Paecilomyces và Vertcillium

diệt được 70% ấu trùng sâu bệnh gây hại nhiều loại cây trồng

Vào cuối năm 2006, khi dịch rầy nâu bùng phát khắp nơi tại Đồng BằngSông Cửu Long, gây ra bệnh vàng lùn - lùn xoắn lá đã làm giảm thiệt hại đếnnăng xuất đáng kể của người dân trồng lúa, dịch rầy nâu bùng phát, trong thờigian này Tổ Phòng trừ Sinh học của Bộ môn Bảo vệ Thực vật Trường Đại họcCần Thơ đã được Dự án Nâng cao Chất lượng Cây trồng Vật nuôi của Tỉnh SócTrăng hỗ trợ kinh phí, và kết hợp với Chi cục Bảo Vệ Thực Vật Sóc Trăng đã cảitiến và đưa ra quy trình sản xuất chế phẩm nấm xanh từ gạo do chính nông dânsản xuất để phun xịt phòng trị rầy nâu gây hại lúa Với diện tích phun xịt hơn 500

ha đã giảm mật độ đáng kể của rầy nâu trên ruộng lúa

Ngoài ra nấm Metarhizium anosopliae còn được ứng dụng trong phòng trừ

bọ xít hại cây trồng Sau 10 ngày thí nghiệm ở nồng độ 9 x 109 bào tử/ml, tỷ lệ bọxít non hại nhãn vải chết đạt 72,5%, bọ xít xanh hại lúa chết đạt 53,2% và bọ xítđen hại lúa chết 43,8% (Đàm Thị Hân, Phạm Thị Thuỳ, 2007) [1]

Mới đây nhất, trung tâm nghiên cứu phòng trừ mối đã cho ra đời ba chế phẩm

Metavina 90DP, Metavina 10DP và Metavina 80LS từ Metarhizium cùng thực hiện

một mục tiêu chung là diệt trừ mối tận gốc mà không gây độc hại, giá thành lại rẻ sovới các phương pháp trước đây, đó là ứng dụng các kết quả nghiên cứu của nấm

Metarhizium đối với mối Các chế phẩm phòng phòng trừ dịch hại được sản xuất từ

Bb và Ma của Viện Bảo vệ thực vât Việt Nam với tên thương mại là Boverit và Mat

đã dần trở nên quen thuộc và đáng tin cậy với bà con nông dân

Có thể nói, việc nghiên cứu và sử dụng nấm ký sinh côn trùng trong phòngtrừ sâu hại cây trồng vẫn là hướng nghiên cứu khá mới lạ và ít được quan tâm ở

nước ta Các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở một số nấm như Beauveria,

Metarhizium và Paecilomyces Mặc dù vậy, những kết quả nghiên cứu đó đóng

vai trò rất lớn, đã mở ra một hướng đi mới trong công tác diệt trừ côn trùng gâyhại, bảo vệ được cây trồng mà thực sự “thân thiện với môi trường”

Hiện nay trong tự nhiên không chỉ có hai loại nấm Beauveria, Metarhizium

mới có khả năng phòng trừ sâu hại, còn rất nhiều các loài nấm ký sinh côn trùngkhác có thể sử dụng trong phòng trừ côn trùng gây hại mà chúng ta chưa biết đến

hoặc chưa quan tâm nghiên cứu, như các loài thuộc giống Akanthomyces,

Aschersonia, Beauveria, Hirsutella, Isaria, Paecilomyces, [17] Cho đến nay, mới

chỉ có một số công trình nghiên cứu đánh giá nguồn lợi nấm ký sinh côn trùng ởVườn Quốc gia Pù Mát (Nghệ An) cũng như sử dụng các loài nấm ký sinh côn trùngtrong phòng trừ sâu hại của Trần Ngọc Lân (2007) [17]

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.1.1 Thời gian nghiên cứu

Đề tài được tiến hành nghiên cứu từ tháng 2/2010 đến tháng 11/2010

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

- Địa điểm thu thập mẫu nấm: Vườn quốc gia Pù Mát

- Địa điểm thu thập sâu hại: Nghi Lộc, Hưng Đông, Hưng Nguyên

- Địa điểm phân lập, nhân nuôi nấm ký sinh côn trùng: Phòng thí nghiệmcông nghệ nấm ký sinh côn trùng, tổ Bảo vệ thực vật, khoa Nông Lâm Ngư

- Địa điểm tiến hành các thí nghiệm sử dụng chế phẩm từ nấm Isaria sp3.

để phòng trừ sâu hại được tiến hành tại phòng thí nghiệm và trên ruộng lạc của

xã Nghi Ân

2.2 Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu

2.2.1 Vật liệu nghiên cứu

- Gạo tẻ, cám gạo, cám ngô, bột mì, trấu.

- Sâu khoang, rệp hại lạc.

2.2.2 Hoá chất, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

- Thiết bị: Kính hiển vi, kính soi nổi, tủ hấp, tủ sấy, tủ định ôn, máy đếmhồng cầu,…

- Dụng cụ điều tra: túi đựng mẫu, hộp đựng mẫu, vợt

- Dụng cụ trong phòng: Đĩa petri, que cấy, hộp nhựa, chậu nhựa,

- Hoá chất: cồn 96o, tween 80,…

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp phân lập và nhân nuôi nấm trên môi trường PDA

Sau khi thu thập về thì tiến hành phân loại sơ bộ loài Các loài được địnhdựa vào đặc điểm hình thái bên ngoài, màu sắc, cấu trúc của dạng sinh sản vôtính và sinh sản hữu tính Cũng có thể phân loại theo côn trùng bị nhiễm nấm.Tiến hành quan sát bào tử để định dạng chính xác Dựa vào cấu trúc bào tử (kíchthước và hình dạng), quả thể, sợi nấm và màu sắc ở bên ngoài

Phân lập nấm ký sinh côn trùng theo phương pháp của Goettel và Inglis

(1997), nhân nuôi sơ cấp chủng nấm Isaria sp3 trên môi trường PDA theo

phương pháp của Janet Jennifer Luangsa-ard và cs (2006) [37]

* Chuẩn bị môi trường PDA:

Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) được chuẩn bị trong phòng thínghiệm Môi trường PDA gồm các thành phần sau:

Khoai tây (Potato): 200 gamDextrose (Glucoze): 20 gamAgar: 15 gam

Cho dung dịch đó vào nồi và đun sôi để hoà tan agar và đường Cho dung dịch

đó vào các bình thuỷ tinh, đậy nút bông và hấp tiệt trùng ở 121oC trong 20 phút

* Đổ môi trường PDA ra các đĩa petri

Các đĩa petri đã được rửa sạch, hấp tiệt trùng (121oC - 20 phút) và sấy khô,

đổ môi trường PDA trong điều kiện ấm nóng (không nên đổ khi môi trường nóng

quá hoặc đã nguội) Môi trường PDA được đổ vào các đĩa petri đã được sấy khô, độdày môi trường 4 - 5 mm Đổ xong đậy nắp đĩa, để nguội đông.

* Phân lập nấm

Từ mẫu nấm gốc đã thu thập được tiến hành phân lập trên môi trường PDA.Mỗi đĩa môi trường tiến hành cấy 3 - 5 điểm

* Nhân nuôi nấm trên môi trường PDA

Từ các đĩa petri đã được phân lập thành công tiến hành cấy chuyển sangnhiều đĩa môi trường PDA để theo dõi khả năng sinh trưởng, phát sinh bào tử vàlàm nguyên liệu để nhân nhanh sinh khối trên các môi trường rắn

Mỗi đĩa petri tiến hành cấy 5 điểm đều nhau Các thao tác được tiến hành mộtcách vô trùng và được tiến hành trong buồng cấy vô trùng Các đĩa đã được cấy nấmđược nuôi trong tủ BOD ở nhiệt độ 24oC, ẩm độ 80%RH

2.3.2 Phương pháp nhân sinh khối nấm trên các môi trường rắn

Tiến hành nhân sinh khối nấm trên các môi trường rắn theo 4 công thức sau: Công thức 1 (CT1): hạt gạo tẻ

Công thức 2 (CT2): 5gạo + 4 cám + 2 nước+ 1 trấu

Công thức 3 (CT3): 2 bột mì + 4cám + 2nước + 1 trấu

Công thức 4 (CT4): 2bột ngô + 4 cám + 2nước + 1trấu

Gạo ở các công thức được đãi sạch và ngâm trong 2 giờ Các thành phầnkhác được làm sạch sẽ không bị lẫn tạp

Các công thức được cho vào bình thuỷ tinh, được đậy nắp kín, với 200g môitrường/bình Mỗi công thức tiến hành lặp lại 4 lần

Các bình môi trường được hấp trong 60 phút ở điều kiện 121oC, sau khihấp môi trường xong lấy ra để nguội

Tiến hành cấy chuyển nấm Isaria sp3 từ đĩa petri sang các bình môi trường

rắn theo tỷ lệ tương ứng là 1: 5 Tất cả các thao tác kỹ thuật được tiến hành trongbuồng cấy vô trùng

Các bình môi trường đã được cấy nấm được chuyển sang các giá để (đãđược vệ sinh sạch sẽ) và nuôi theo điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm Để tăng

độ xốp của môi trường, hàng ngày lắc các bình môi trường một lần, sau khichuyển nấm và theo dõi sự phát triển của nấm.

Cần chú ý các thao tác cấy chuyển phải được tiến hành nhanh gọn, các dụng

cụ phục vụ cho việc cấy chuyển, nhân sinh khối phải đảm bảo vô trùng

2.3.3 Phương pháp đếm nồng độ bào tử

Sử dụng buồng đếm hồng cầu để đếm nồng độ bào tử

* Cấu tạo buồng đếm hồng cầu: Buồng đếm hồng cầu là 1 lam kính dày(kích thước 7cm x 3cm x 0,5cm), có hai trường đếm Có 4 rãnh ngang và 1 rãnhdọc, có 225 ô vuông lớn Trong đó có 25 ô lớn chính giữa được chia thành các ôvuông nhỏ (1 ô lớn có 16 ô nhỏ) Kích thước của mỗi ô nhỏ như sau: mỗi cạnhbằng 1/20 mm và sâu 1/10 mm Vậy thể tích của 1 ô vuông nhỏ là 1/20 x 1/20 x1/10 = 1/4000 (mm3)

* Phương pháp đếm:

Đối với môi trường PDA: Lấy khuẩn lạc của nấm cho vào 1 cốc đong nhỏ cùngvới 10 ml nước cất hai lần Dùng đũa thuỷ tinh khuấy đều cho các bào tử hoà tan trongnước Mỗi lần đếm nồng độ bào tử cắt khuẩn lạc có đường kính 20 mm để đo

Đối với môi trường lỏng lắc: Bơm 1ml dung dịch nấm vào một cốc đongnhỏ cùng với 10ml nước cất và quấy đều

Đối với môi trường rắn: Lấy 10 gam hỗn hợp cả cơ chất môi trường và nấm,cho vào cốc đong nhỏ với 10 ml nước cất và quấy đều

Sau đó dùng tấm lưới lọc Nhật Bản lọc hỗn hợp vừa pha chế để đảm bảo chỉ cóbào tử lọt qua Nhỏ vào dịch lọc 1 - 2 giọt Tween 80 vào khuấy đều, có tác dụng giúp

ổn định các bào tử trong dịch lọc giúp cho việc đếm bào tử được dễ dàng hơn

* Sử dụng buồng đếm

Bước 1: Nhỏ một giọt bào tử đã pha loãng lên mỗi trường của buồng đếm,giọt dung dịch nấm vừa đủ để phủ kín ô vuông trên buồng đếm, đặt la men lên.Bước 2: Đặt buồng đếm lên kính hiển vi với vật kính có độ phóng đại nhỏnhất, điều chỉnh kính để thấy được trường đếm thứ nhất Sau đó đưa về vật kính

20 x 40 để thấy rõ các bào tử trong các ô vuông Chỉnh kính để thấy được các ôvuông lớn ở giữa có chứa các ô vuông nhỏ

Bước 3: Đếm số lượng bào tử trong năm ô vuông lớn (mỗi ô vuông lớn có chứa

16 ô vuông nhỏ) nằm trên đường chéo của 25 ô vuông lớn ở trường đếm thứ nhất.Tiếp tục điều chỉnh kính về phía trường đếm thứ hai và làm tương tự đếm sốlượng bào tử trong 5 ô vuông lớn ở trường đếm thứ hai

* Phương pháp tính nồng độ bào tử:

Cách tính nồng độ bào tử nấm (Lomer C H và Lomer C J., 1998) [40]

- Tính số lượng bào tử trong 5 ô vuông lớn ở mỗi trường đếm (sốbào tử là a và b) và tính trung bình bào tử của 2 lần đếm: X = (a + b)/2

- Cho 0,1µl của dịch bào tử vào 25 ô vuông:

Nồng độ bào tử trong 1ml (c) = X.5.104

- Với n là hệ số pha loãng của dịch bào tử ban đầu Vậy nồng độ bào

tử trong dịch nấm gốc là C = c x n (bào tử/ml)

2.3.4 Phương pháp bảo quản chế phẩm

Chế phẩm được bảo quản theo hai cách sau:

- Để nguyên chế phẩm nấm trong bình và để bảo quản trong phòng

- Bảo quản bằng phương pháp sấy khô chế phẩm ở nhiệt độ 35oC - 40oC đếnkhi khối lượng không đổi và cất giữ chế phẩm ở nơi khô ráo

2.3.5 Phương pháp sử dụng chế phẩm để phòng trừ sâu hại

Sau khi nấm trên các môi trường rắn cho lượng bào tối đa có thể dùng đểđiều chế thành các chế phẩm để phòng trừ các đối tượng sâu hại theo mục đích.Chế phẩm có thể ở dạng bột mịn hoặc dạng dịch lỏng

* Chế phẩm dạng dịch lỏng

Sau khi nhân xong sinh khối nấm, tiến hành pha chế phẩm thành dạng dịchlỏng để phun Xác định nồng độ bào tử cần thiết dùng để phun (phương pháp làmtương tự như phương pháp đếm nồng độ bào tử đã trình bày ở trên) Pha dịch bào