Đề cương ôn tập Vi sinh vật môi trường

Khi đổ môi trường vào đĩa phải để miệng bình sâu vào giữa đĩa rồi đổ 1 lớp mỏng, tránh để môi trường dính trên thành bình=> tránh khuẩn lạc mọc lên thành bình và tránh vi sinh vật b[r]

ĐỀ CƯƠNG ÔN TẬP VI SINH VẬT MÔI TRƯỜNG

GV: Nguyễn Ngọc Tâm Huyên

4 Nhóm lấy nước thải vs E.Coli

5 Nhóm lấy mẫu đất phân giải Cellulose

Bước thực hành:

I Khử trùng đĩa Peptri

II Chuẩn bị 40 ống nước cất

III Chuẩn bị môi trường LactoBroth

IV Lấy mẫu đất dưới gốc cây, nước thải động vật máu nóng, cơm nguội

V Pha loãng dung dịch đất

VI Cấy dung dịch dất qua Gauss

VII Chuẩn bị môi trường Czapek

VIII Pha loãng nước thải

IX Cấy lên môi trường Lacto Broth

X Pha loãng dung dịch tinh bột

XI Cấy lên môi trường Czapek

Chi tiết thực hiện

Cách khử trùng đĩa peptri:

1 Dùng cồn khử trùng đĩa peptri

2 Gói đĩa peptri bang giấy báo

3 Đem khử trùng khô trong lò sấy 160oC trong vòng 2 giờ

Chuẩn bị các ống nước cất

1 Cho 9ml nước cất vào ống nghiệm,

2 Sau đó dùng Bông mỡ làm nút đóng kín miệng

3 Gói giấy báo 3-4 (7 đẹp) ống nghiệm/1 tờ

4 Đặt lên khay ống nghiệm hoặc đặt vào cốc

Sau đem khử trùng ẩm chúng với Lacto-Broth

Chuẩn bị môi trường Lacto-Broth

Môi trường Lacto-Broth là môi trường tăng sinh: Giàu chất dinh dưỡng cho phép các Vi sinh vật tổn thương, già yếu, mới sinh, non phục hồi chức năng dinh dưỡngtạo thành thế hệ mới

Vì vậy trong môi trường này sẽ có nhiều vi sinh vật cùng phát triển sinh trưởngBước :

 Pha mt LB theo hướng dẫn, dùng cân vi lượng để cân hóa chất (tốt nhất phảitrong phòng kín không có gió, chỉ 1 người thực hiện, để cân chính xác vì cânrất dễ sai số khi có tác động bên ngoài)

 Cho ống durham vào phần miệng ống úp ngược xuống để nhận biết ecoli bằng khí CO2 sinh ra trong ống durham, dung dịch chuyển màu, có huyền phù > ống dương tính (trong 2 ngày là có hiện tượng)

 Thêm 5ml mt LB (có thể nhiều hơn 1 tí, chủ yếu mt LB phải ngập qua ống durham)

 Gói bông ống nghiêm và gói giấy

Cách hấp:

 Đóng công tắc ( bật lên) , chỉnh nhiệt độ ( 121oC), chỉnh thời gian (25’p)

 Sau khi đạt đủ thời gian cài trước- nồi hấp báo chuông- ngắt công tắc, đợi cho áp suất trong nồi ấp giảm xuống từ từ=> tuyệt đối không mở van xả khí ngay vì sẽ làm thay đổi áp suất đột ngột làm nứt các dụng cụ thủy tinh bên trong……

 Đợi áp suất giảm xuống phân nửa sau đó mở từ từ van xả khí, dùng gắp mang lồng hấp ra ngoài

Lấy mẫu đất dưới gốc cây, nước thải động vật máu nóng, cơm nguội:

o Có ecoli (ecoli sống trong mt động vật máu nóng)

o Không lấy mẫu nước thải đầy chai (???)

 Cơm nguội:

o Lấy cơm đã qua 2-3 ngày (lên men) có nhiều vsv phân giải tinh bột

Cách đổ môi trường:

Nguyên tắc đổ môi trường vừa khử trùng vào đĩa peptri:

Sát trùng môi trường và tay trước khi đổ môi trường.(Cồn 700)

Cầm đĩa peptri ( 2 ngón cái và trỏ đặt sát mép đĩa, 3 ngón còn lại đặt dưới đáy đĩa)

Hơ đĩa peptri trên ngọn lửa đèn cồn=>tránh vi khuẩn tràn vào khi mở nắp ra.Thao tác hơ: hơ 1 vòng xung quanh thành đĩa peptri, sau đó hơ từ mép ngón trỏ sang mép ngón cái

Mở nắp bằng 2 ngón trên và cho dung dịch môi trường vào

Mọi thao tác trong phạm vi ngọn lửa đèn cồn 15cm.

Khi đổ môi trường vào đĩa phải để miệng bình sâu vào giữa đĩa rồi đổ 1 lớp mỏng, tránh để môi trường dính trên thành bình=> tránh khuẩn lạc mọc lên thành bình và tránh vi sinh vật bên ngoài sinh trưởng

Đợi môi trường đông lại và úp ngược đĩa=> Để tránh hơi nước trên nắp peptri rơi xuống làm biến đổi môi trường, kín đĩa nhằm tránh vi sinh vật ngoại lại

Sau đó mang đi hấp và khử bằng tia cực tím=> Tia UV xuyên qua màng tế bào làm bất hoạt vi sinh vật thay đổi AND và gây chết VSV

Chuẩn bị dung dịch VSV Đất để cấy vào môi trường Gause:

Chuẩn bị >40 ống nước cất(20 ống cho Lactobroth, 10 ống cho Gauss, 10ống cho tinh bột) mỗi ống 9 ml, bịt nút bông , gói báo (ghi tên môi trường)mang đi hấp chung với 2 bình tam giác môi trường

-Sau khi hấp xong lấy nước đất xóc đều or dùng máy khuấy từ, sau đó mang

đi pha loãng với nước cất

-Ghi số lên ống nghiệm từ 10-1 tới 10-10

Cách pha loãng: sát trùng mặt bàn và tay với cồn 70oC

Mọi thao tác phải thực hiện trong phạm vi 15cm cách ngọn lửa đèn cồn.Hút 1ml dung dịch nước thải bằng micro-pipet bơm vào ống nghiệm 10-1 ,xóc đều ống và hút 1ml sang ống 10-2, tương tự đến ống số 10-10=> sau mỗilần hút Nồng độ dung dịch giảm 10 lần, tức số lượng VSV giảm 10 lần ( đểtránh sai số phải xóc đều mẫu trước khi rút VSV)

Thao tác cấy sang môi trường thạch đĩa Gauss ( lỏng sang rắn):

Để phân lập vi sinh vật phân giải Cellulose

Sát trùng mặt bàn và tay, mọi thao tác cách ngọn lửa đèn cồn

Dùng micropitet hút 0.1 ml dung dịch mới pha loãng bơm vào đĩa peptrichứa môi trường Gauss Thực hiện từ nồng độ nhỏ ( 10-10 )tới nồng độ lớn

(10-1)=>thao tác từ nồng độ nhỏ tới nồng độ lớn để lượng vi sinh vật mang

từ nồng độ nhỏ sang nồng độ lớn hơn là không đáng kể, đồng thời giảm sai

số, tránh việc thay đầu tiếp micropipet sau mỗi lần hút

Hơ đĩa peptri sau đó bơm 0.1 ml dung dịch chứa VSV vào đĩa đóng nắp lạiKhử trùng que trang tam giác ( khử trùng 1 lần đầu) Áp lên nắp đĩa peptri

để làm nguội que , làm bốc hơi nước trên nắp đĩa,…… Áp nhẹ que lênmép thạch đĩa để kiểm tra nhiệt độ (nếu có tiếng xèo nghĩa là que còn nóng)sau đó trang đều dung dịch cấy lên bề mặt đĩa peptri=> làm các vi sinh vậtphân bố rời rạc dễ quan sát

Chú ý từ môi trường lỏng sang rắn cấy 1 lượng dung dịch là 0.1ml vì điệntích bề mặt thạch đĩa nhỏ nên cấy 1 lượng vừa đủ để khi vừa trang xong thì

bề mặt sẽ khô tạm thời, TB VSV dính vào đĩa dễ đếm, có thể lật ngược lạingay

Chuẩn bị môi trường Czapek:

Tương tự như với môi trường Gauss pH từ 6- 6.5

Thay saccarose= tinh bột (20 g)

Nước cất 500ml ban đầu+ 500 cho sau => Hóa chất không dính lên thành bình

pH từ 6-6.5 điều chỉnh bằng H2SO4/ NaOH 10%

Argar chia làm 2 lần (10 g) => Đảm bảo môi trường cấy đặc (Cho vào sau cùng)

Chia làm 2 bình Tam giác (Argar 10, 10g), sau đó dùng nút bông mỡ bịt kín, Gói báo quanh miệng (dễ lấy sau khi hấp + ghi tên môi trường trên giấy tránh nhầm lẫn)

Cho vào nồi hấp khử trùng ẩm (121oC , 1 atm , (25 đến 30) phút – trong đó 5 phút đầu để tăng nhiệt độ lên), thời gian cũng phụ thuộc vào máy khử trùng ẩm

Chuẩn bị mẫu nước thải:

Pha loãng mẫu nước thải (20 ống từ nồng độ 10-1 –> 10-20 ) tuân theo quy tắc pha loãng trên

Các bước cấy mẫu nước thải lên Lacto Broth tương tự như với môi trường Gauss Các bước pha mẫu tinh bột và cấy lên Czapek là tương tự.

Các bước chuẩn bị môi trường Gauss:

Nuôi cấy vi sinh vật phân giải Cellulose

Cân các thành phần môi trường từ KNO3 đến FeSO4.7H2O

Cho vào 500 ml nước cất , khuấy từ

Riêng chú ý tinh bột thay bằng CMC (là một mạch cắt ngắn của Cellulose) 5g/ lít.Cho CMC từ từ vào vì CMC là một chất khó tan

Argar (làm giá thể) chia làm 2 phần mỗi phần 10g

Sau khi hòa tan các thành phần rồi cho Argar, tiếp theo thêm vào 500ml

5 Xác định dương tính E.coli trên lactobroth

6 Đánh dấu mt dương tính vào bảng mt LB

7 lấy Mẫu đất cây họ đậu + Mẫu đất cây hoa màu

8 Pha loãng, đồng thời 2 dd đất

9 Đưa Đất hoa màu=> Pikovkaia,

10.Đất cây họ đậu => Ashby

11.Cấy từ LB sang BGBL

Chuẩn bị đĩa peptri:

Sát trùng cồn và khử trùng khô như trên

Pha môi trường BGBL:

Môi trường BGBL là môi trường tăng sinh chọn lọc chỉ cho phép vi khuẩn gram

âm phát triển (E.Coli) Do có muối mật bò

Ủ ở 42oC để chọn lọc các nhóm VSV chịu nhiệt( trong đó có E.Coli)

Cân các hóa chất như giáo trình trang 31

Cho 5-6 ml vào ống nghiệm có chứa ống Durham

Dùng nút bông bịt kín

Sau đó mang đi khử trùng ẩm

Làm ống nhiệm nước cất:

Tương tự như ở buổi 1

Cả môi trường và nước cất đều đem đi khử trùng ẩm

Quan sát và xác định dương tính trên môi trường LactoBroth:

Tiêu chuẩn xác định dương tính

1 Sinh khí trong ống Durham (C02)

2 Dung dịch huyền phù (tế bào vi sinh vật)

3 Dung dịch chuyển màu

Dựa trên 3 dấu hiệu trên lần lượt đọc kết quả và điền vào mẫu bảng và đánh dấu

các ống dương tính để cấy tiếp sang môi trường BGBL

Lấy mẫu đất cây họ đậu và mẫu đất cây hoa màu:

Quy tắc lấy như lấy mẫu đất gốc cây ở buổi 1

Pha loãng 2 mẫu đất

Pha loãng 2 mẫu đất vào các ống nồng độ khác nhau

Cấy mẫu đất cây hoa màu vào môi trường Pikovkaia (đổ mt?)

Cách đổ Ashby: cho ½ hóa chất tránh dư môi trường

Cấy mẫu đất cây họ đậu vào môi trường Ashby(đổ mt?)

Quy tắc cấy như buổi 1

Cấy từ Lacto Broth sang BGBL:

Nguyên tắc cấy từ loãng sang đặc

Kiểm tra độ khít của vòng trên que cấy

Dùng que cấy vòng khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn (1/3 ngọn lửa, góc 45o), Lắc đều trước khi cấy mẫu

Cho que cấy vào LB lấy một vòng nước cấy sang môi trường BGBL và ghi nồng

độ tương ứng

Đem ủ ở 420C sau 48h đọc kết quả xác định dương tính

Buổi 3:

Nội dung thực hành:

1 Đọc kết quả cấy của mt lactobroth sang BGBL42oC

2 Đánh dấu mt dương tính vào bảng mt BGBL

3 Cấy từ mt BGBL sang mt EMB ,ủ 37oC

4 Xem các mẫu nấm men, vi khuẩn, nấm men, (xạ khuẩn) bằng kính hiển vi điện tử

Chi tiết thực hiện:

1.Đọc kết quả của môi trường BGBL

Cách đọc ống dương tính trên BGBL tương tự như trên Lactobroth gồm 3 dấu hiệu

1 Sinh khí trong ống Durham (C02)

2 Dung dịch huyền phù (tế bào vi sinh vật)

3 Dung dịch chuyển màu

2.Đánh dấu ống dương tính điền tiếp vào bảng

\

Nồng độ(M)

Số ống Lacto Brothdương tính (Ống)

Dùng que cấy vòng( thao tác tương tự) cấy tương ứng từ BGBL sang EMB thao tác trong phạm vi ngọn lửa đèn cồn.

Các đường cấy không được trùng khít lên nhau, không cấy giao nhau, không được làm vỡ thạch

Mỗi đĩa cấy 1 nồng độ, nếu nồng độ đó có nhiều mẫu dương tính thì chia thạch đĩa làm các phần khác nhau

Sau đó đem đi ủ ở 37oC

4.Quan sát khuẩn lạc Xạ khuẩn, Vi khuẩn, Vi nấm trên môi trường thạch đĩa:

 Xạ khuẩn : Là những sợi khuẩn có sợi khuẩn ti nhỏ hơn vi nấm có những vòng tròn đồng tâm bề mặt thô ráp xù xì, không phát triển tốt như vi nấm

 Vi nấm: là loại khuẩn lạc lớn nhất,những sợi khuẩn ti nhiều mọc tua tủa bông gòn, hệ sợi khuẩn ti rất lớn

 Vi khuẩn: bề mặt trơn bóng ướt nhẹp, có 1 số mẫu vi khuẩn kéo dài  vi khuẩn đang di chuyển để tìm nguồn thức ăn, đối với các mẫu chuyển màu 

vi khuẩn đang quá trình sinh sản tạo bào tử

Đặc điểm nhận dạng của VK phân giải P trong Pikovkaia:

Khuẩn lạc có chấm màu trắng đục, nhầy, có khi có màu vàng( không cần phân biệt màu vàng hay trắng) , xung quanh tạo vòng trong suốt khuẩn lạctiết axit (hoặc CO2 )phân giải Ca3(PO4)2 tạo muối

Số ống BGBL dươngtính (Ống)

 Đọc kết quả cấy của mt BGBL sang EMB

 Đánh dấu mt dương tính vào bảng mt EMB

 Tra bảng và tính toán số lương ecoli tối đa có thể trong mẫu ban đầu theo bảng MPN để đánh giá lượng hữu cơ và vsv trong nước dùng cho người đang sử dụng.

Số lượng các ống có sinh khí

Số lượngVSV có thểcó/ 100ml

95% các giới hạn tin tưởng

Vậy số lượng VSV có thể có trong mẫu ban đầu nhiều nhất là 3.1010

Thành phần số lượng VSV nói lên điều gì?

Số lượng E.coli nói lên môi trường bị ô nhiểm chất hữu cơ gây bệnh đường ruột

Câu hỏi:

Vì sao từng môi trường thay đổi nhiệt độ ủ:

Chức năng của từng loại môi trường và nhóm VSV chiếm ưu thế:

Gauss: nôi cấy xạ khuẩn có khả năng phân giải Cellulose

Xạ khuẩn chiếm ưu thế

Czapek : Nuôi cấy VSV phân giải tinh bột

Vi nấm chiếm ưu thế

Ashby: dùng để xác định VSV cố định nito sống tự do trong đất

Vi khuẩn chiếm ưu thế

Pikovkaia: dùng để xác định nhóm VSV phân giải hợp chất P khó tan

Vi khuẩn P chiếm ưu thế

Phân biệt hình thái các loại VSV trên kính hiển vi:

Có những sợi khuẩn ti, có hoặc không có vách ngăn, từ cuống tạo thành bọng sinh

ra dây bào tử, gần nhất là bào tử non , càng xa thì bào tử già và rụng khỏi bọng rơi vãi vào môi trường tạo thành bào tử trần, gặp điều kiện thuận lợi sẽ tiếp tục nảy mầm thành sợi nấm mới

+Bào tử túi

+Xạ khuẩn :

Bao gồm khuẩn ti cơ chất và khuẩn ti khí sinh:

Khuẩn ti cơ chất đâm chìm vào môi trường để lấy cơ chất

Khuẩn thi khí sinh rơi tạo thành bào tử trần

Thể bình

Túi Bọng  Bình

Quan sát vi sinh vật dưới kính hiển vi:Mẫu 1:

Hình vẽ

Hình thực tế

Mẫu 2:

Hình vẽ

Hình thực tế

Mẫu 3:

Hình vẽ

Hình thực tế

Mẫu 4:Hình vẽ

Hình thực tế

Mẫu 5:Hình vẽ

Hình thực tế

Mẫu 6:Hình vẽ:

Hình thực tế

<Không chụp được vì thay đổi>

Mẫu 7:

Hình vẽ:

Hình thực tế