chọn giống dựa trên chỉ thị phân tử ( MAS)

Cơ sở của MAS ( chỉ thị phân tử) Molecular Markers ãTất cả cơ quan sống được hình thành từ các tế bào ãCác tế bào sống được điều khiển bằng vật liệu di truyền gọi là DNA

MARKER-ASSISTED BREEDING-MAS Công cụ mới trong chọn giống

cây trồng

Bert Collard & David Mackill

Plant Breeding, Genetics and Biotechnology (PBGB) Division, IRRI

bcycollard@hotmail.com & d.mackill@cgiar.org

• Cơ sở của MAS ( chỉ thị phân tử) Molecular

Markers

• Tất cả cơ quan sống được hình thành từ các tế

bào

• Các tế bào sống được điều khiển bằng vật liệu di

truyền gọi là DNA

• Phân tử DNA được tạo thành chuỗi dài chứa các

N ( Adenin [A]; Ctosin [C]; Guanine [G] và Thymine [T]

• Chỉ mỗi phần nhỏ của chuỗi DNA tạo thành các

gen

• Gen mang mã di truyền cho các protein

• Phân còn lại chủ yếu của DNA không mã hóa

• Các vật liệu di truyền tổ chức bên trong các NST ( ví dụ

cây Arabidopsis thaliana có 5 NST)

• Tập hợp bộ nhiễm sắc thể gọi là genome

• Trong 1 cá thể lưỡng bộ ( NST theo các cặp) có 2 allel

của một gen, mỗi allel có nguồn từ một bố mẹ

• Chỉ thị phân tử không xem xét như các gen bình thường

khi chúng không có ảnh hưởng sinh học mà xem xét như các mốc điểm trong genome.

• Chúng có thể nhận biết trình tự DNA truyền đạt di

truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác

• Chúng dựa vào kiểm tra DNA phản ảnh được chỉ thị

hình thái

• DNA là cơ sở nhanạ biết các tính trạng quan sát được,

chỉ thị hóa sinh là cơ sở gen tạo ra protein

• Số marker này có thể dò tìm toàn bộ genome và tìm số

lượng biến dị di truyền mỗi marker tìm ra trong một

quần thể

• Thông tin cung cấo cho nhà tạo giống phụ thuộc vào

marker sử dụng, mỗi marker có ưu và nhược điểm riêng

• Có các lại chỉ thị phân tử khác nhau

– Chiều dài đoạn giới hạn đa hình- Restriction

fragment length polymorphisms (RFLPs):

– Hình thái phóng đại ngẫu nhiên-Random amplified

polymorphic DNA (RAPDs):

– Hình thái chiều dài đoạn phóng đại- Amplified

fragment length polymorphisms (AFLPs):

– Lặp lại chuỗi đơn giản- Simple sequence repeats

(SSRs) or microsatellites:

– Đa hình nucleotide đơn (SNPs) Single nucleotide

polymorphisms

3 MỘT VÍ DỤ NGHIÊN CỨU CỦA IRRI

4 NHỮNG THỰC TẾ SỬ DỤNG MAS

SECTION 1

MARKER ASSISTED SELECTION (MAS):

THEORY AND PRACTICE

Định nghĩa:

Chọn lọc dựa trên chỉ thị phân tử

(Marker assisted selection- MAS) là

sử dụng chỉ thị DNA liên kết chặt với locus mục tiêu để thay cho chọn lọc đánh giá kiểu hình

Giả định: chỉ thị DNA (DNA markers) có

thể dự đoán kiểu hình đáng tin cậy

Recipient

Chọn giống truyền thống CONVENTIONAL PLANT BREEDING

Salinity screening in phytotron Bacterial blight screening Phosphorus deficiency plot

Những tiến bộ của MAS

 Simpler method compared to phenotypic

screening

 Đặc biệt với những tính trạng khó đánh giá thanh lọc

 Có thể tiết kiệm thời gian và nguồn lực

 Selection at seedling stage

 Rất quan trọng với một số tính trạng như chất lượng

hạt

 Có thể chọn lọc sớm, trước khi gieo trồng, có thể

chọn ngay ở thế hệ phân ly F2 hoặc F3

 Increased reliability

 Không bị ảnh hưởng của môi trường

 Có thể phân biệt giữa đồng hợp và dị hợp và chọn lcọ

từng cây

Lợi ích tiềm năng của MAS

(1) LEAF TISSUE SAMPLING

Những vấn đề cần quan tâm khi sử dụng DNA markers in plant breeding

 Kỹ thuật đơn giản

Markers must be tightly-linked to target loci!

• Ideally markers should be <5 cM from a gene or QTL

• Sử dụng cặp marker hai đầu cải thiện mức độ tin cậy

nhưng tăng thời gian và chi phí

Marker A

QTL

5 cM

RELIABILITY FOR SELECTION

Using marker A only:

Markers must be polymorphic

DNA extractions

DNA EXTRACTIONS

LEAF SAMPLING

Porcelain grinding plates

High throughput DNA extractions “Geno-Grinder”

Mortar and pestles

Wheat seedling tissue sampling in

Southern Queensland, Australia.

PCR-based DNA markers

• Nhân bằng Polymerase Chain Reaction

• Markers thông dụng với kỹ thuật đơn giản và tiết kiệm

GEL ELECTROPHORESIS

PCR

PCR Buffer + MgCl 2 + dNTPS +

Taq +

Primers + DNA template

THERMAL CYCLING

Agarose gel electrophoresis

http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/agardna.html

UV light

UV transilluminator

UV light

UV transilluminator

Acrylamide gel electrophoresis 1

Acrylamide gel electrophoresis 2

2.1 Marker-assisted backcrossing (MAB)

( Lai trở lại dự trên chỉ thị phân tử)

• MAB có một số tiến bộ hơn lại lại truyền thống :

– Chọn lọc các locus mục têu rất hiệu quả

– Tối thiểu hoá những liên kết kéo theo

– Lấy lại nhanh kiểu gen của bố qua chọn lọc chu kỳ

1 2 3 4

Target locus

1 2 3 4

RECOMBINANT SELECTION

1 2 3 4

BACKGROUND SELECTION

TARGET LOCUS SELECTION

Chọn lọc trực tiếp locus mục tiêu Chọn lọc lấy lại nền di truyền ( bao gồm cả

tính trạng khác)

2.2 Pyramiding ( Quy tụ gen)

• Được sử dụng rộng rãi nhất là quy tụ

một số gen chống bệnh với các chủng đặc thù

• Các phương pháp truyền thống rất khó

quy tụ được một số gen

• Phát triển giống chống bệnh bền vững

với một số chủng khác nhau

Select F2 plants that have

Gene A and Gene B

Genotypes

P1: AAbb P2: aaBB

F1: AaBb

Quá trình tổ hợp một số gen, thường sử dụng nguồn gen từ

2 bố mẹ khác nhau đưa vao 1 kiểu gen

2.3 MAS những thế hệ đầu

• MAS thực hiện ở F2 hoặc F3 stage

• Các cây có genes/QTLs mong muốn được

chọn và các allel tổ hợp với trạng thái

MAS for 1 QTL – 75% loại bỏ ¾ kiểu gen không mong muốn

MAS for 2 QTLs – 94% loại bỏ 15/16 kiểu gen không mong muốn

P1 x P2 F1

Plants planted in rows for individual plant selection

space-Families grown

in progeny rows for selection.

Preliminary yield trials Select single plants.

Further yield trials

Multi-location testing, licensing, seed

increase and cultivar release

P1 x P2 F1

on local needs

F6

F7 F5

F8 – F12 Multi-location testing, licensing, seed increase and cultivar release

Only desirable F3 lines planted

in field

Lợi ích: những thế hệ sau chỉ tập trung vào

2.4 Tiếp cận phối hợp

chọn lọc kiểu hình và MAS cho hiệu quả

cao hơn

1 Để nhận được tối đa nguồn di truyền (khi một

số QTLs không được nhận biết từ mapping)

2 Mức tái tổ hợp giữa marker và QTL (Cách nói

khác là marker không tin cậy 100%)

3 Giảm kích thước quần thể với các tính trạng

nhận biết bằng marker rẻ hơn đánh giá kiểu hình

References:

Any questions

SECTION 3 IRRI MAS CASE STUDY

3 Marker-assisted backcrossing for

submergence tolerance

David Mackill, Reycel Mighirang-Rodrigez, Varoy Pamplona,

CN Neeraja, Sigrid Heuer, Iftekhar Khandakar, Darlene

Sanchez, Endang Septiningsih & Abdel Ismail

Photo by Abdel Ismail

Abiotic stresses are major constraints

to rice production in SE Asia

• Rice is often grown in unfavourable

• High priority at IRRI

• Sources of tolerance for all traits in germplasm and

major QTLs and tightly-linked DNA markers have been

identified for several traits

‘Giống thích nghi rộng-Mega varieties’

• Nhiều giống lúa trồng phổ biến

phạm vi rộng, giống thích nghi

rộng - “Mega varieties”

– Nông dân rất ưa chuộng

• Hiện có nhiều giống địa phương

chống chịu bất thuận phi sinh

học (abiotic stress tolerance )

• Nhưng nông dân bắt buộc phải

Chiến lược lai trở lại Backcrossing strategy

• Chiến lược lai trở lại để tổ hợp genes/QTLs vào trong

một giống thích nghi rộng ‘mega varieties’

• Sử dụng marker DNA cho chương trìnhlai lại hiệu quả

hơn – marker assisted backcrossing (MAB)

Conventional backcrossing

P1

DonorElite cultivar

Desirable trait e.g disease resistance

Chọn lọc con cái BC1 giống RP

Discard ~50% BC1 Lặp lại đến BC6

Lấy lại genome của bố mẹ lai lại Ngoài lai lại còn yêu cầu một số tính trạng liên quan khác

MAB: mức thứ nhất 1ST của chọn lọc tập trung ở locus mục tiêu

FOREGROUND SELECTION

DONOR CHROMOSOME

TARGET LOCUS

nhiều nhiếu lai lại

• Những gen không mong muốn của

donor ảnh hưởng đến giống mới

Ribaut, J.-M & Hoisington, D 1998 Marker-assisted selection:

new tools and strategies Trends Plant Sci 3, 236-239.

MAB: Mức hai 2NDchọn lọc tái tổ hợp LEVEL OF SELECTION - RECOMBINANT SELECTION

• Yêu cầu quần thể lớn

– Phụ thuộc vào khoảng cách flanking

markers và target locus)

• Quan trọng khi donor là một

giống địa phương

RECOMBINANT SELECTION

1 2 3 4

Step 1 – select target locus

Step 2 –Chọn lọc bên này hay bên kia của locus mục tiêu BC1

OR

BC2

Step 4 – Chọn lọc bên này hay bên kia của locus mục tiêu

Step 3 – select target locus again

* Marker locus is fixed for recurrent parent (i.e homozygous) so does not need to be selected for in BC2

MAB: 3RD LEVEL OF SELECTION -

BACKGROUND SELECTION chọn lọc lấy lại nền di truyền

Chọn lọc lấy lại nền di truyền

Background selection

Percentage of RP genome after backcrossing

Lấy lại di truyền nhân khi

Quan tâm: mặc dù trung bình lấy lại 75% ở BC1,

nhưng một số các thể có thể nhiều hoặc ít hơn

Donor

Recurrent

parent

Breeding for submergence tolerance

• Large areas of rainfed lowland

rice have short-term

submergence (eastern India to

SE Asia); > 10 m ha

• Even favorable areas have

short-term flooding problems in

Screening for submergence tolerance

A major QTL on chrom 9 for

submergence tolerance – Sub1 QTL

RZ422

C985

RG570 RG451 RZ404

Sub-1(t)

1200 850

900

OPH7950 OPQ1600

Xu and Mackill (1996) Mol Breed 2: 219

Make the backcrosses

Pre-germinate the F1 seeds and seed

them in the seedboxes

Seeding BC1F1s

Collect the leaf samples - 10 days after

transplanting for marker analysis

Genotyping to select the BC1F1 plants with a desired character for crosses

Hạt cây BC2F2 đã tăng chịu

ngập

Selection for Swarna+Sub1

Khung thời gian để tăng cường chịu

ngập cho giống thích nghi rộng

Có thể cần đến BC3F2

• Name of process: “variety enhancement”

(by D Mackill)

• Process also called “line

conversion”

(Ribaut et al

2002)

Mackill et al 2006 QTLs in rice breeding: examples for abiotic stresses Paper presented

at the Fifth International Rice Genetics Symposium.

Ribaut et al 2002 Ribaut, J.-M., C Jiang & D Hoisington, 2002 Simulation experiments on efficiencies of gene introgression by backcrossing Crop Sci 42: 557–565.

Swarna có Sub1

Bản đồ kiểu gen của Swarna-Sub1

Dòng BC3F2 xấp xỉ 2.9 MB của DNA donor

Average length=0.2mm Average length=0.2mm Average width=2.3mm Average width=2.2mm Amylose content (%)=25

Gel temperature=HI/I

Gel consistency=98

Amylose content (%)=25 Gel temperature=I

Gel consistency=92

Locus IBf ở đầu NST số 9 :

Ức chế sọc nâu trên hạt

Những vấn đề cần quan tâm khi

– Reducing marker data points (MDP)

– Strategies for 2 or more genes/QTLs

SECTION 4

CURRENT STATUS OF MAS: OBSTACLES AND

CHALLENGES

Current status of molecular breeding

Some possible reasons to explain the

low impact of MAS in crop

improvement

• Resources (equipment) not available

• Markers may not be cost-effective

• Accuracy of QTL mapping studies

• QTL effects may depend on genetic background

or be influenced by environmental conditions

• Lack of marker polymorphism in breeding

material

• Poor integration of molecular genetics and

conventional breeding

Cost - a major obstacle

• Cost-efficiency has rarely been

calculated but MAS is more

expensive for most traits

– Exceptions include quality traits

How much does MAS cost?

Institute Country Crop Cost estimate

per sample*

(US$)

Reference

Uni Guelph Canada Bean 2.74 Yu et al (2000)

CIMMYT Mexico Maize 1.24–2.26 Dreher et al (2003)

Uni Adelaide Australia Wheat 1.46 Kuchel et al (2005)

Uni Kentucky, Uni

(2001)

*cost includes labour

Yu et al 2000 Plant Breed 119, 411-415; Dreher et al 2003 Mol Breed 11, 221-234; Kuchel et al 2005 Mol

Breed 16, 67-78; and Van Sanford et al 2001 Crop Sci 41, 638-644.

How much does MAS cost at IRRI?

Consumables:

• Genome mapping lab (GML) ESTIMATE

– USD $0.26 per sample (minimum costs)

– Breakdown of costs: DNA extraction: 19.1%; PCR:

61.6%; Gel electrophoresis: 19.2%

– Estimate excludes delivery fees, gloves, paper tissue,

electricity, water, waste disposal and no re-runs

• GAMMA Lab estimate = USD $0.86 per sample

Labour:

– USD $0.06 per sample (Research Technician)

– USD $0.65 per sample (Postdoctoral Research Fellow)

TOTAL: USD $0.32/sample (RT); USD $0.91/sample (PDF)

USD $640 to screen 2000 plants with a

single marker for one population

Cost of MAS in context: Example 1:

Early generation MAS

Cost of MAS in context: Example 2

Cost of MAS in context Example 1: Pedigree selection

A closer look at the examples of

MAS indicates one common

Reliability of QTL mapping is

critical to the success of MAS

• Reliable phenotypic data critical!

– Multiple replications and environments

• Confirmation of QTL results in independent

populations

• “Marker validation” must be performed

– Testing reliability for markers to predict phenotype– Testing level of polymorphism of markers

• Effects of genetic background need to be

determined

Recommended references:

Young (1999) A cautiously optimistic vision for marker-assisted breeding Mol Breeding 5: 505-510.

**Holland, J B 2004 Implementation of molecular markers for quantitative traits in breeding programs - challenges

and opportunities Proceedings of the 4th International Crop Sci Congress., Brisbane, Australia.

Breeders’ QTL mapping ‘checklist’

1 What is the population size used for QTL mapping?

2 How reliable is the phenotypic data?

– Heritability estimates will be useful – Level of replication

3 Any confirmation of QTL results?

4 Have effects of genetic background been tested?

5 Are markers polymorphic in breeders’ material?

6 How useful are the markers for predicting phenotype?

Has this been evaluated?

factors include:

Integration of molecular biology and

plant breeding is often lacking

• Large ‘gaps’ remain between marker

development and plant breeding

– QTL mapping/marker development have been

separated from breeding– Effective transfer of data or information between

research institute and breeding station may not occur

• Essential concepts in may not be understood

by molecular biologists and breeders (and

other disciplines)

Advanced backcross QTL analysis

Tanksley & Nelson (1996) Advanced backcross QTL analysis: a method for the simultaneous discovery and

transfer of valuable QTLs from unadapted germplasm into elite breeding lines Theor Appl Genet 92: 191-203 Toojinda et al (1998) Introgression of quantitative trait loci (QTLs) determining stripe rust resistance in barley: an

• Data management

Future of MAS in rice?

• Most important staple for many

developing countries

• Model crop species

– Enormous amount of research in molecular

genetics and genomics which has provided

development and MAS

• Costs of MAS are prohibitive so

available funding will largely determine the extent to which markers are used in breeding

Food for thought

• Do we need to use DNA markers for plant breeding?

• Which traits are the highest

priority for marker development?

• When does molecular breeding give an important advantage over conventional breeding, and how can we exploit this?

• How can we further minimize

costs and increase efficiency?