Nghiên cứu chỉ thị phân tử SSR (simple sequence repeats) trong chọn giống lúa

luận văn

Bộ giáo dục và đào tạo

trường đại học nông nghiệp i

-

phạm thị thuý

nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử SSR

(Simple sequence repeats) trong chọn giống lúa

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thục và ch−a từng đ−ợc sử dụng để bảo vệ một học vị nào Mọi sự giúp

đỡ cho việc thực hiện luận văn này đ4 đ−ợc cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đ4 đ−ợc chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Phạm Thị Thuý

lời cám ơn

Trước hết tôi xin chân thành cám ơn các thầy cô trong Ban giám hiệu, Khoa Sau đại học, Khoa Nông học, Bộ môn Công nghệ sinh học & Phương pháp thí nghiệm, Bộ môn Di truyền và Chọn giống Cây trồng - Trường Đại học Nông nghiệp 1 Hà Nội cùng tập thể cán bộ Bộ môn Di truyền và Công nghệ Lúa lai, Bộ môn Sinh học Phân tử - Viện Di truyền Nông nghiệp đ4 tạo mọi điều kiện thuận lợi, động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập cũng như hoàn thành luận văn

Đặc biệt tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Tiến sĩ Phạm Ngọc Lương, người thầy trực tiếp hướng dẫn, truyền thụ kiến thức khoa học, động viên về tinh thần, giúp đỡ để tôi thực hiện và hoàn thành đề tài này Đồng thời với tất cả lòng kính trọng, tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo Tiến sĩ Phan Hữu Tôn, đ4 tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức, tài liệu giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Tôi xin vô cùng biết ơn bố, mẹ, chồng con và những người thân trong gia đình, là nguồn động viên khích lệ, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Tôi xin chân thành cám ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 09 năm 2006 Tác giả luận văn

Phạm Thị Thuý

Mục lục

2.4 Một số chỉ thị phân tử ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền

2.5 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền sử dụng chỉ thị phân tử SSR

3 Đối tượng, vật liệu, địa điểm, nội dung và phương pháp nghiên cứu 44

4.1 Kết quả đánh giá một số đặc điểm nông sinh học của các dòng,

4.2 Kết quả nghiên cứu đa hình ADN lúa bằng chỉ thị phân tử SSR 57

4.2.2 KÕt qu¶ ph¶n øng PCR 58 4.2.3 KÕt qu¶ ®iÖn di s¶n phÈm PCR trªn gel polyacrylamide, ph©n tÝch ®a

h×nh vÒ mèi quan hÖ di truyÒn gi÷a 15 dßng, gièng lóa nghiªn cøu 60 4.3 Nghiªn cøu −u thÕ lai thùc vµ mèi t−¬ng quan gi÷a kho¶ng c¸ch di

truyÒn víi −u thÕ lai con lai F1 cña c¸c tæ hîp lai gi÷a Indica/

Japonica vµ Indica/ Javanica ë mét sè tÝnh tr¹ng c¬ b¶n 66 4.3.1 Ưu thế lai tính trạng chiều cao cây và chiều dài b«ng của c¸c con

lai F1 ë c¸c tæ hîp lai gi÷a Indica/ Japonica vµ Indica/ Javanica 67 4.3.2 Ưu thế lai tính trạng sè h¹t ch¾c trªn b«ng vµ sè b«ng trªn khãm

của con lai F1 ë c¸c tæ hîp lai gi÷a Indica/ Japonica vµ Indica/

4.3.3 Ưu thế lai tính trạng khèi l−îng ngh×n h¹t vµ n¨ng suÊt lý thuyÕt

của con lai F1 ë c¸c tæ hîp lai gi÷a Indica/ Japonica vµ Indica/

Danh mục các chữ viết tắt

ADN: Acid deoxyribonucleic

ARN: Acid ribonucleic

AFLP: Đa hình độ dài các đoạn đ−ợc nhân chọn lọc (Amplified

Fragment Lengh Polymorphisms) CTAB: Cetyl Trimethyl Amonium Bromid

TBE: Tris- borate - EDTA

−TL: −u thế lai

Các giống lúa:

CPX: Chiêm Phú xuyên NT: Nếp tan

KNT: Khẩu nua tẩu Plẩu: Plẩu la

KRN: KhÈu ruéc n−¬ng Tan: Tan do

KD18: Khang d©n 18 Tra: Tra lÌng

1 Mở đầu

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Lúa gạo có tầm quan trọng sống còn đối với hơn một nửa dân số thế giới, nhu cầu lương thực của thế giới phải tăng gấp đôi vào những năm đầu thế kỷ 21,

do đó cần phải tăng nhanh sản lượng lúa [23] Một trong những biện pháp quan trọng nhất là phải tạo ra giống lúa có năng suất cao, vì vậy mục tiêu của các nhà khoa học trên thế giới đ4 tập trung nghiên cứu sử dụng ưu thế lai ở lúa được xem

là hướng giải quyết có hiệu quả nhất Trung quốc là một nước đi tiên phong trong lĩnh vực nghiên cứu và đưa vào sản xuất thành công thành tựu khoa học

kỹ thuật về lúa lai Mỗi năm ở nước này có khoảng 17 triệu ha ruộng trồng lúa lai, chiếm trên 50% diện tích trồng lúa và 60% sản lượng lúa của cả nước, năng suất bình quân tăng từ 20%-30% so với lúa thuần [3]

Việt Nam hiện nay là một trong những nước đứng thứ hai trên thế giới

về sử dụng ưu thế lai ở lúa, chương trình nghiên cứu lúa lai của quốc gia thực

sự trở thành một chiến lược quan trọng nhằm tăng năng suất lúa Lúa lai đ4 có một vị trí quan trọng không thể thiếu được trong cơ cấu giống ở miền Bắc Cho đến năm 2004 diện tích gieo trồng lúa lai là 621.382 ha, năng suất lúa lai bình quân tăng từ 1,5 tấn đến 2 tấn/ha so với lúa thuần [13], [21]

Để nâng cao năng suất, cải thiện chất lượng lúa thường tiến hành lai hữu tính giữa các dòng giống bố mẹ có mức độ xa nhau nhất định về mặt di truyền Các dòng giống khác nhau nhiều về tính trạng nông sinh học, kiểu gen hay kiểu hình Để đánh giá sự khác nhau này theo phương pháp truyền thống

là dựa vào độ lớn sai khác của các tính trạng nông sinh học quan trọng Sự đa dạng di truyền ADN là rất lớn cho nên nó có thể dễ dàng phân biệt được sự khác nhau giữa các dòng giống Sự khác biệt về di truyền là cơ sở tạo nên ưu thế lai, ở một chừng mực nào đó, khi bố mẹ sử dụng để lai có khoảng cách di

truyền càng xa nhau thì sự biểu hiện ưu thế lai càng cao Để làm được điều này thì việc nghiên cứu, đánh giá đa dạng nguồn gen lúa cũng như việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền giữa các dòng, giống lúa là rất cần thiết

Nhằm khắc phục những trở ngại mà phương pháp chọn giống truyền thống rất khó giải quyết, kỹ thuật chỉ thị phân tử như RFLP, AFLP, RAPD, SSR là những công cụ tỏ ra hữu hiệu để nghiên cứu đa hình của các giống, cho phép ta xác định được khoảng cách di truyền một cách nhanh chóng và chính xác

Trong số các chỉ thị phân tử thì chỉ thị SSR được đánh giá là có nhiều

ưu điểm so với các chỉ thị khác, có khả năng cho đa hình cao, có bản chất

đồng trội, di truyền theo quy luật Menden Sử dụng chỉ thị này trong phân tích

di truyền rất đơn giản, không cần dùng đồng vị phóng xạ, rất chính xác, ít tốn kém, có thể xác định đa hình giữa các dòng giống, các cá thể và là một trong những chỉ thị có nhiều triển vọng trong chương trình chọn giống

Xuất phát từ những mục tiêu trên, chúng tôi tiến hành đề tài: "Nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử SSR (Simple Sequence Repeats) trong chọn

1.2.2 Yêu cầu

- Sử dụng phương pháp SSR để đánh giá đa dạng di truyền giữa 15 dòng, giống lúa trên cơ sở phân tích ADN, xác định khoảng cách di truyền, vẽ biểu đồ biểu hiện mối quan hệ này

- Tiến hành lai giữa hai phân loài phụ Indica/ Japonica, Indica/ Javanica, đánh giá ưu thế lai, xác định mối tương quan giữa khoảng cách di truyền và ưu thế lai ở một số tính trạng nông sinh học quan trọng

1.3 ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

1.3.1 ý nghĩa khoa học

Đề tài nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị SSR, trên cơ sở phân tích ADN đ4 xác định được khoảng cách di truyền giữa các dòng, giống lúa Đề tài nghiên cứu ưu thế lai của các con lai F1 thuộc các phân loài phụ Indica/ Japonica, Indica/ Javanica, mối tương quan giữa khoảng cách di truyền và ưu thế lai của chúng ở một số tính trạng cơ bản, vì vậy đề tài cung cấp thêm số liệu và thông tin khoa học cho các nhà nghiên cứu khoa học tham khảo

1.3.2 ý nghĩa thực tiễn

Kết quả của đề tài đóng góp một số thông tin cần thiết trong chương trình chọn tạo giống lúa siêu cao sản, khai thác sử dụng nguồn gen thuộc các phân loài phụ, tìm được những con lai có khả năng kết hợp tốt có thể sử dụng trong chọn giống lúa

2 Tổng quan tài liệu

2.1 Ưu thế lai ở lúa

Cho đến nay việc khai thác ưu thế lai đ4 làm tăng một cách đáng kể sản lượng của nhiều loại cây trồng trong đó có lúa ý tưởng về khai thác ưu thế lai

ở lúa được Jones công bố vào năm 1926, Anonymous (1977), Li (1977) và Yuan (1980) [16]

Ưu thế lai (ưTL) là hiện tượng khi con lai F1 thể hiện vượt hơn bố mẹ

về những đặc điểm riêng biệt Con lai sinh ra tỏ ra hơn hẳn bố mẹ về sức sống, khả năng sinh trưởng, sinh sản, khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trường, khả năng thích nghi, năng suất và chất lượng hạt…

Ưu thế lai ở lúa là một hiện tượng sinh học tổng hợp thể hiện các ưu việt theo nhiều tính trạng ở con lai F1 khi lai các dạng bố mẹ được phân biệt theo nguồn gốc, độ xa cách di truyền, sinh thái… Sự thể hiện ưu việt của tính trạng ở F1 phải đem lại lợi ích cho tiến hoá, đem lại lợi ích cho tạo giống Tạo giống ưu thế lai là con đường nhanh và có hiệu quả, có thể tập hợp được nhiều tính trạng mong muốn (năng suất, chín sớm, chất lượng…) vào một kiểu gen thông qua một đời lai

2.1.1 Cở sở khoa học của ưu thế lai ở lúa

thế lai có được là do những kiểu tương tác khác giữa các gen cùng và khác alen kiểm soát các tính trạng tạo ra Giữa các gen khác nhau phải có sự tương tác nhất định [17] Cơ sở di truyền của hiện tượng ưu thế lai còn nhiều tranh c4i, song một số giả thuyết đ4 được nêu ra trong thế kỷ 20 để giải thích hiện tượng ưu thế lai bởi một số hiệu quả tương tác sau:

* Tương tác giữa các alen cùng locus gen - hiệu qủa trội, siêu trội

Theo giả thuyết tính trội thì các alen trội được tích luỹ và thể hiện lấn át các alen lặn gây hiệu quả xấu Có nghĩa là gen trội át chế tác động gây hại của gen lặn tương ứng cùng locus trên nhiễm sắc thể (NST) tương đồng (AA , Aa

> aa) Dẫn tới con lai F1 có ưu thế hơn bố mẹ, tức là con lai F1 đ4 khắc phục những khiếm khuyết ở các dòng bố mẹ

Giả thuyết siêu trội cho rằng nhiều tính trạng có lợi cho sự sinh trưởng

là do gen trội kiểm soát còn các gen lặn tương ứng thì có tác dụng ngược lại Tính dị hợp tử của một alen ở một vị trí nhất định sẽ sản sinh ra các vật chất

có ảnh hưởng đến sức sống vượt xa của loại mang alen đồng hợp tử và do tác dụng tương hỗ giữa các alen khác nhau trên cùng vị trí Con lai F1 thu được mức độ dị hợp tử nào đó về các gen Cơ thể có kiểu gen Aa sẽ có sức sống cao hơn hẳn cơ thể mang kiểu gen AA và aa (AA < Aa > aa) Hiệu ứng siêu trội xảy ra do tương tác giữa các alen tạo ra ưu thế lai ở con lai hơn hẳn hiện tượng hiệu ứng của các alen của cả bố và mẹ

* Tương tác giữa các alen khác locus

Các nhân tố di truyền riêng rẽ (các alen trội) ở cả hai bố mẹ có thể không, hoặc cho hiệu quả yếu hoặc cộng tính lên sự biểu hiện kiểu hình của tính trạng, sự cùng tồn tại của chúng ở F1 tạo nên hiệu quả tương tác bổ xung giữa các gen, kết quả thu được thể hiện tính trạng ưu thế hơn so với bố mẹ Trong tương tác khác locus còn thể hiện hoạt động của gen này có thể bị phụ thuộc vào gen kia Trường hợp một gen ở trạng thái lặn có thể gây ức chế thể hiện kiểu hình của các gen khác Gen lặn này tồn tại ở bố mẹ, song ở con lai

F1 nó được “lấp trống” bởi alen trội, do đó hiệu quả ức chế không xảy ra, kết quả là thể hiện của tính trạng ở F1 có ưu thế hơn so với bố mẹ

được tăng cường

Có thể giữa hai con lai F1 có các gen trong nhân giống nhau nhưng ưu thế lai lại thể hiện khác nhau là do bào chất giữa chúng khác nhau Ưu thế lai không chỉ được kiểm soát bởi những gen trong nhân mà còn bởi những gen ở

tế bào chất Một số nghiên cứu cho thấy một số tổ hợp lai F1 có ưu thế lai không giống nhau giữa lai thuận và lai nghịch Lúa lai được phát triển do sự kết hợp của cùng một kiểu gen nhân với các nền tế bào chất khác nhau sẽ biểu hiện cho ưu thế lai khác ở F1 [23], [32] Tuy nhiên việc quyết định ưu thế lai ở lúa thì vai trò gen nhân là lớn hơn gen tế bào chất Những mối tương tác giữa các gen không alen trong nhân - tế bào chất có quan hệ chặt chẽ với khả năng kết hợp riêng

2.1.1.2 Cơ sở hoá sinh

ở góc độ hoá sinh, biểu hiện siêu trội có thể giải thích theo giả thiết về liều lượng và tạo ra sản phẩm mới ở con lai Theo giả thiết về liều lượng enzym ta có dạng Aa- cho mức liều lượng tối ưu, dạng aa - thiếu hụt, dạng AA

- dư thừa, từ đó dẫn tới con lai F1 (Aa) có ưu thế hơn các bố mẹ (AA, aa) Sự biểu hiện kiểu hình là do kết quả của một loạt các mối tương tác do các cơ chế hoá sinh xảy ra dưới sự kiểm soát bởi các nhân tố di truyền Những nghiên

cứu hoá sinh liên quan đến ưu thế lai về mặt năng suất bao gồm hoạt tính amylose và α - amylose hàm lượng ARN ở rễ non, khả năng tổng hợp axit amin ở rễ, khả năng hút và tổng hợp các chất dinh dưỡng, sự quang hợp và sự thoát hơi nước của bông, hàm lượng đường hoà tan, hàm lượng ni tơ tổng số, khả năng mẩy hạt, cơ sở isozym của ưu thế lai là hàm lượng nucleohistone ở cây lúa lai

2.1.2 Biểu hiện ưu thế lai ở lúa

Trong công tác chọn giống ưu thế lai được biểu hiện theo nghĩa rộng, tất cả những biểu hiện dương tính làm cho con lai F1 có ưu thế về một hay vài

đặc tính đối với các dạng bố mẹ của chúng Trong di truyền học, ưu thế lai

được phân thành ưu thế lai thực, ưu thế lai trung bình, ưu thế lai chuẩn về các tính trạng như sinh dưỡng, sinh sản và thích ứng ưu thế lai biểu hiện đầy đủ nhất ở thế hệ thứ nhất của con lai và giảm dần ở các đời sau do dị hợp tử giống Nhìn chung, nếu con lai F1 có biểu hiện tăng lên so với bố mẹ ở một số tính trạng nhất định được gọi là ưu thế lai dương và nếu có biểu hiện giảm đi thì được gọi là ưu thế lai âm

* Sự biểu hiện ưu thế lai về tính trạng chiều cao cây

Chiều cao cây thường được các nhà chọn giống quan tâm vì nó quyết

định rất lớn đến khả năng thích ứng của chúng ở những điều kiện khác nhau như: khả năng đẻ nhánh, chịu úng, chịu thâm canh đặc biệt là khả năng chống

đổ Guliaep (1975) đ4 kết luận có 4 gen kiểm tra tính trạng chiều cao cây, trong đó tính lùn có khi được kiểm tra bởi một cặp gen lặn, có khi bởi hai cặp

và đa số trường hợp được kiểm tra bởi 8 gen lặn là: Sd1, Sd2, Sd3 … Sd8 Vì vậy phải cải tạo giống lúa lùn và nửa lùn do gen lặn trong nhân điều khiển Bằng phương pháp lai hữu tính, lai tạo ra những giống lúa có dạng hình cây cải tiến, cứng cây, chịu thâm canh đ4 làm nên cuộc cách mạng xanh lần thứ nhất ở lúa

* Sự biểu hiện ưu thế lai về tính trạng thời gian sinh trưởng

Thời gian sinh trưởng của lúa cùng với điều kiện môi trường như ánh sáng, nhiệt độ, nước, phân bón… quyết định thời gian tích luỹ tạo ra năng suất, chất lượng Một số nghiên cứu gần đây cho thấy cả tính cộng và không cộng đều rất quan trọng trong việc hình thành tính trạng thời gian sinh trưởng

* Sự biểu hiện ưu thế lai về tính trạng bông và cấu trúc bông

Bông lúa là một tính trạng mà người sản xuất quan tâm hơn cả vì nó quyết định năng suất ưu thế lai về đặc tính bông lúa di truyền theo hiệu ứng cộng do gen lặn trong nhân điều khiển Các tác giả còn cho biết tính trạng chiều dài bông do hai gen trội là P12 và P16 điều khiển nằm trên nhiễm sắc thể số 2 và số 6 quy định và chúng thường liên kết với tính trạng chiều dài lá đòng

ảnh hưởng trực tiếp lên cấu trúc bông còn có số gié cấp 1 trên bông Tính trạng này do gen nfb8 nằm trên nhiễm sắc thể số 8 kiểm soát, điều khiển tính trạng mật độ hạt trên bông do 3 gen lặn sd2sd6sd8, vì vậy cần phải chọn cả

bố và mẹ có tính trạng hạt xếp xít [23]

* Sự biểu hiện ưu thế lai về tính trạng dạng hạt và chất lượng gạo

Có hai hình dạng hạt là hạt dài và hạt bầu Tính trạng dạng hạt gạo bầu

do gen trội trong nhân điều khiển (Chao, 1928) Các giống thuộc loài phụ Javanica, Japonica thường hạt gạo có dạng hạt bầu Chất lượng gạo cũng là một chỉ tiêu quan trọng, độ dẻo cơm là do hàm lượng aminoza trong gạo quyết

định Nếu hàm lượng aminoza lớn hơn 25% cơm cứng, thấp hơn 20% cơm bị dính ướt, thường trong khoảng 22 - 24% là tốt nhất Muốn có con lai có chất lượng gạo tốt, độ dẻo vừa phải cần chọn bố mẹ có hàm lượng aminoza trung bình khoảng 22 - 24%

* Sự biểu hiện ưu thế lai về khả năng chống chịu

Các nghiên cứu thực tiễn của sản xuất đều cho thấy, lúa lai có khả năng chống chịu những điều kiện bất lợi của thời tiết tốt hơn lúa thuần Việc tạo ra

con lai F1 có tính chịu hạn, chịu rét, chịu phèn… đ4 và đang thu được nhiều kết quả triển vọng [15] Tạo được giống có khả năng chống chịu sâu bệnh có nhiều ý nghĩa quan trọng: tiết kiệm chi phí cho sản xuất, tăng hiệu quả kinh

tế, đảm bảo vệ sinh môi trường do không phải dùng thuốc trừ sâu bệnh hoá học Hiện nay Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Bảo vệ thực vật, Viện lúa

đồng bằng sông Cửu Long, Trường Đại học Nông nghiệp 1 và các cơ quan nghiên cứu khác đang đi theo hướng chọn tạo những giống lúa lai kháng bệnh

đạo ôn, bạc lá và rầy nâu

2.1.3 Đánh giá khả năng cho ưu thế lai

Như đ4 nói ở trên ưu thế lai là một hiện tượng sinh lý và di truyền rất phức tạp, ưTL ở các loại cây trồng thường được biểu hiện thông qua các tính trạng số lượng Để định lượng mức độ thể hiện ưu thế lai thường được phân ra các trường hợp:

1/ ưu thế lai thực (Hb) - giá trị trung bình của F1 vượt hơn (về chiều dương hoặc chiều âm) dạng bố, mẹ tốt nhất theo tính trạng nghiên cứu

2/ ưu thế lai trung bình (Hm) - giá trị trung bình của F1 vượt hơn giá trị trung bình của cả hai bố mẹ

3/ ưu thế lai chuẩn (Hs) - giá trị trung bình của F1 vượt hơn giá trị của một giống chuẩn (giống đối chứng) nào đó đem so sánh [22]

Các nhà chọn giống, nói đến năng suất của con lai so với những dạng

bố mẹ tốt nhất thì ưu thế lai thực là chỉ số được quan tâm hơn cả Sự thể hiện

ưu việt tính trạng (được đánh giá theo các định lượng trên) ở con lai F1 phải

đem lại lợi ích cho tiến hoá và cho tạo giống ở những điều kiện sinh thái và canh tác xác định

Khả năng kết hợp là khả năng cho ưu thế lai cao ở con lai F1 khi lai giữa các dạng bố mẹ Khả năng kết hợp cũng phản ánh sự hoạt động tương tác giữa các gen trội lặn cùng locus hoặc khác locus dưới tác động của điều kiện sống, vì

vậy việc đánh giá khả năng kết hợp thực chất là xác định tác động của gen trong những điều kiện nhất định Khả năng kết hợp được biểu thị bằng hai giá trị sau: Khả năng kết hợp chung và khả năng kết hợp riêng [5], [22] Khả năng kết hợp chung được biểu hiện bằng giá trị trung bình của cây lai cao so với bố mẹ ở tất cả các tổ hợp lai do hiệu ứng cộng tính gây lên Khả năng kết hợp riêng được biểu hiện bằng sự hơn hẳn của giá trị trung bình của con lai F1 so với bố mẹ của một

tổ hợp lai cụ thể nào đó Khả năng kết hợp riêng được xác định bởi các yếu tố tính trội, tính siêu trội và điều kiện ngoại cảnh Một số tác giả còn cho rằng khả năng kết hợp chung chịu ảnh hưởng của hiệu ứng cộng tính, còn khả năng kết hợp riêng chịu ảnh hưởng của hiệu ứng gen không cộng tính đó là tính trội hay át chế Vì vậy khi chọn bố mẹ cần quan tâm đến tính đa dạng di truyền cũng như

đến tính trạng bổ sung Để tạo ra một tổ hợp lai tốt cần chọn hai bố mẹ có khả năng kết hợp chung và khả năng kết hợp riêng đều phải tốt đồng thời dựa vào đây phần nào có thể dự đoán được ưu thế lai của con lai F1

ưu điểm của việc khai thác ưu thế lai trong các chương trình chọn tạo giống lúa:

+ ở con lai F1, để có thể kết hợp một cách có hiệu quả giữa kiểu gen với môi trường và chức năng sinh lý thì chúng ta nên lai hai bố mẹ bổ sung tính trạng cho nhau và không tương đồng về cấu tạo di truyền Chính vì thế nên việc gây tạo một tổ hợp có ưu thế lai cao hoặc thậm chí có năng suất vượt trần là một công việc có thể làm được

+ Con lai F1 trong một mức độ nào đó cũng sẽ có khả năng chống chịu bệnh và dịch hại, do đó tiềm năng cho năng suất cao có thể dễ dàng được kết hợp với khả năng đa chống chịu

+ So sánh với các giống lúa thuần, các con lai F1 có cơ sở di truyền rộng hơn, thích nghi tốt hơn với các điều kiện ngoại cảnh khác nhau và có sức chống chịu cao hơn với các điều kiện bất lợi Như vậy một tổ hợp lai tốt nhất

có thể trồng và phân bố rộng r4i hơn so với các giống lúa truyền thống

+ Sự xuất hiện ưu thế lai ở một chừng mực nào đó có thể do các nhân tố giới tính ở cả hai bố mẹ quy định

2.1.4 Tình hình nghiên cứu, phát triển lúa lai trong và ngoài nước

Trong lúc dân số ngày một tăng nhanh, sản lượng lương thực khó đáp ứng nổi nhu cầu của nhân loại Việc nâng cao năng suất lúa đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng đòi hỏi các nhà khoa học phải tập trung nghiên cứu, chọn tạo

được các giống lúa có năng suất cao, chất lượng tốt chống chịu với sâu bệnh

và các điều kiện ngoại cảnh bất thuận Xu thế làm tăng tiềm năng năng suất của lúa trên toàn cầu trong thế kỷ 21 là sử dụng ưu thế lai kết hợp với công nghệ sinh học Các nước có dân số đông nhất thế giới như Trung Quốc, ấn Độ

đ4 chọn công nghệ này làm giải pháp giải quyết vấn đề an toàn lương thực cho quốc gia của họ

Lúa lai hệ ba dòng được phát hiện và sử dụng sớm nhất trong lịch sử nghiên cứu và phát triển lúa lai Để khai thác ưu thế lai hệ ba dòng, người ta phải sử dụng dòng CMS làm dòng mẹ, dòng B để duy trì và sản xuất dòng CMS và dòng R là dòng cho phấn để sản xuất hạt lai F1 Trong hệ thống này, cùng một lúc phải duy trì 3 loại dòng A, B, R và phải tiến hành thụ phấn chéo hai lần do đó hệ thống này cồng kềnh và tốn kém Mặt khác giữa các dòng bất dục CMS sự sai khác về mặt di truyền không lớn do nguồn gốc hình thành, chúng ít đa dạng về mặt di truyền nên khả năng chống chịu kém, tốn nhiều thời gian lai thử, tìm dòng phục hồi

Trên cơ sở phát hiện ra hai vật liệu di truyền mới ở lúa Đó là dòng bất dục đực nhân nhạy cảm với thời gian chiếu sáng PGMS (Photoperiodic Genic Male Sterility) và dòng bất dục đực nhân nhạy cảm với nhiệt độ TGMS (Thermo-Sensitive Genic Male Sterility) Yuan Long Ping đ4 đề ra chương trình tạo giống lúa lai không cần sử dụng dòng duy trì bất dục đực

B Giống đó được gọi là hệ thống lúa lai hai dòng và Trung Quốc đ4 nghiên

cứu thành công lúa lai hệ hai dòng Năng suất lúa lai hệ hai dòng tăng trên 10% so với lúa lai hệ ba dòng Và cũng theo thông báo của tác giả diện tích trồng lúa lai hệ hai dòng ở Trung Quốc hiện đang thay thế dần diện tích trồng lúa lai hệ ba dòng Từ năm 1976 - 1994 lúa lai đ4 giúp Trung Quốc tăng tổng sản lượng lúa Do đó Trung Quốc vẫn có thể nuôi sống được trên

1 tỷ người mà vẫn đảm bảo được vấn đề an ninh lương thực quốc gia, trong tình trạng diện tích trồng trọt ngày càng giảm [64] Năm 2003, diện tích lúa lai đạt 15 triệu ha/ 28 triệu ha lúa, với năng suất bình quân 7 tấn/ ha, tăng hơn năng suất lúa thuần 1,4 tấn/ ha [61]

Việc sử dụng ưTL của con lai Japonica/ Javanica là một phương pháp

có hiệu quả để tăng năng suất lúa Japonica, trong khi đó phẩm chất hạt của nó vẫn giữ được những đặc điểm của lúa Japonica Gây tạo lúa lai Indica/ Javanica có thể đóng vai trò tương tự trong việc cải tiến chất lượng hạt cũng như tăng năng suất lúa Indica Lúa lai Indica/ Japonica có tiềm năng năng suất cao nhất ở cả nguồn gen ẩn Theo lý thuyết, năng suất của nó có thể trội hơn 30% so với giống lúa lai khác tốt nhất hiện nay [16]

Thông qua chương trình cải tiến các tính trạng hình thái và khai thác ưu thế lai giữa hai loài phụ (Indica/ Japonica) đ4 nhận được một số giống lai siêu năng suất Thực chất khi nghiên cứu về cơ sở khoa học để tạo giống ưu thế lai (di truyền và sinh lý) nhiều nhà khoa học đ4 công bố: trong quá trình tái tổ hợp gen, để tạo ra các tổ hợp gen mới có ưu thế hơn hẳn các dòng giống bố

mẹ của chúng cần phải lựa chọn các dòng bố, mẹ có sự sai khác về mặt di truyền tương đối lớn Chúng ta khó có thể nhận được thể tái tổ hợp cho ưu thế lai cao thực hiện phép lai giữa hai cơ thể cùng loài phụ Xác suất để nhận các New Plant Type (NPT) đa phần nằm trong các phép lai giữa hai loài phụ Indica/ Japonica bởi lẽ kiểu hình, kiểu gen của hai loài phụ này khác nhau tương đối xa do vậy tạo ra con lai có sức sống cao và hài hòa được kiểu hình của hai loài phụ

Kết quả nghiên cứu của Xiao Guaying, Yuan L.P và cs tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Lúa lai Quốc gia, Changsha, Trung Quốc, đ4 giới thiệu các tính trạng nông sinh học và ưu thế lai của các giống thuộc loài phụ Javanica

và các giống lai giữa Indica và Japonica Các giống thuộc loài phụ Javanica

có bông dài, hạt bầu, đẻ nhánh yếu, thời gian sinh trưởng dài và có chiều cao cây cao hơn khi gieo cấy tại Changsha Kết quả nghiên cứu cho thấy tạo giống lúa lai siêu năng suất là nhờ lai giữa hai loài phụ Các con lai Indica/ Javanica

có ưu thế lai dương về chiều cao cây, chiều dài bông, số hoa trên bông, số hạt trên bông, năng suất lý thuyết trên một hécta (Hoàng Tuyết Minh, 2005) [16]

Viện nghiên cứu lúa Quốc tế IRRI nghiên cứu lúa lai trở lại từ năm

1979, năm 1980 một số chương trình Quốc gia hợp tác với IRRI trong nghiên cứu về lúa lai Năm 1987 IRRI lai tạo thành công những dòng bố mẹ lúa lai nhiệt đới Năm 1994 giống lúa lai nhiệt đới có sử dụng dòng bố mẹ từ IRRI đ4

được chọn tạo Và cũng tại đây, những năm cuối thế kỷ 20, nhiều nghiên cứu tập trung vào cải tiến mức ưu thế lai ở lúa từ 15-20% lên trên 40% Chủ yếu đi theo hướng nghiên cứu ưu thế lai giữa các dòng Indica/ Indica; Indica/Japonica nhiệt đới (Javanica) Kết quả cho thấy mức độ thể hiện ưu thế lai giữa nhóm Indica/ Indica tăng 10-15% so với giống Indica tốt nhất hiện đang trồng Cải tiến mức ưu thế lai vượt trên 40% chủ yếu giữa nhóm lai Indica/ tropical Japonica Các tổ hợp lai này thích ứng hơn với điều kiện khí hậu nhiệt đới và cho năng suất cao hơn, có kiểu hạt dài của Indica và có chất lượng hạt tốt hơn Các tổ hợp lai giữa Indica và Javanica ngoài ưu điểm cho năng suất cao còn có chất lượng gạo cao (hạt dài, trong, thơm ) Theo Virk P.S và cs (2003), mối quan hệ di truyền giữa các dòng bố mẹ có tầm quan trọng để nâng cao ưu thế lai ở lúa Theo Qifa Z và cs (2003), khi tiến hành lai giữa giống Indica của Trung Quốc có năng suất cao (Teqing,) với giống Japonica (Lemont - nhập nội từ Mỹ, giống IR64 - từ IRRI), kết quả cả hai tổ hợp lai đều có ưu thế lai trung bình cao về năng suất Tác giả Yuan L.P

(2003) cho rằng, mức độ thể hiện ưu thế lai ở lúa theo thứ tự Indica/ Japonica

> Indica/ Javanica > Japonica/ Javanica > Indica/ Indica > Japonica/ Japonica Và tổ hợp lai giữa Indica/ Japonica năng suất tăng hơn 30% so với giống Indica đại diện tốt nhất [44], [61]

Từ năm 2000 Trung Quốc bắt đầu xuất hiện các giống lúa năng suất siêu cao và là quốc gia thành công nhất về lúa năng suất siêu cao Năm 2001 các giống lúa siêu cao đạt năng suất bình quân 9,2 tấn/ha trên diện tích 1,2 triệu ha Năm 2005 diện tích trồng các giống lúa năng suất siêu cao tổng cộng

là 7,47 triệu ha, năng suất đạt 12 tấn/ ha/ vụ, năng suất tăng 10% so với những giống lúa lai tốt nhất đang trồng Hiện nay nước này có hàng chục giống lúa lai đạt năng suất như vậy (Nguyễn Trí Hoàn, 2005) [9] Trường Đại học Triết Giang (Trung Quốc) đ4 tạo được giống lúa có năng suất 17,1 tấn/ ha/ vụ (tổ hợp Peiải 64S/ 9311) và hiện nay đ4 được công nhận là giống quốc gia và

được trồng khá rộng r4i ở nước này [12] Thành công trong việc sản suất lúa lai không chỉ ở Trung Quốc mà nó còn lan rộng ra nhiều nước trên thế giới như: ấn Độ, Việt Nam, Philippine, Malaysia…

Malaysia, nước mong muốn đi đầu trong lĩnh vực công nghệ sinh học,

đ4 ký thoả thuận liên kết nghiên cứu lúa lai giữa công ty Yayasan Tuanku Sirajuddin với trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Lúa lai Quốc gia Trung Quốc Theo dự tính với việc nghiên cứu lúa lai thành công, năng suất lúa sẽ tăng 20% từ mức năng suất bình quân trong cả nước hiện nay là 4,5 tấn thóc/ha/vụ [2]

Chương trình lúa lai của ấn Độ tập trung đầu tư rất lớn cho nghiên cứu

để tạo ra các tổ hợp lúa lai của riêng mình Đến nay ấn Độ đ4 công nhận và cho mở rộng vào sản xuất đại trà 20 tổ hợp lúa lai có năng suất cao, chất lượng tốt Diện tích gieo cấy lúa lai của ấn Độ hiện nay là 650.000 ha, năng suất bình quân 5,5 tấn/ ha

ở Mỹ, lúa lai được trồng đại trà vào năm 2000, đến năm 2004, diện tích lúa lai đ4 lên tới 43.000 ha (chiếm 2% diện tích trồng lúa của Mỹ), năng suất cao hơn giống lúa thuần 15 - 30% Mỹ là nước đầu tiên trên thế giới áp dụng máy bay lên thẳng để thụ phấn cho lúa lai Gạo lúa lai đ4 được bán trên 20 nghìn siêu thị ở Mỹ Thành tựu mới nhất về nghiên cứu lúa lai gần đây, sử dụng những gen có lợi từ lúa hoang, Trung Quốc hợp tác với Trường Đại học Cornell Mỹ đ4 nghiên cứu phát triển 2 nhóm gen tăng năng suất Mỗi gen làm tăng năng suất 18%, một trong hai gen trên đ4 được đưa vào dòng bố Q611 (Nguyễn Trí Hoàn, 2005) [9]

Việt Nam bắt đầu nghiên cứu lúa lai từ những năm đầu thập kỷ 80 nhưng phải tới năm 1990 chương trình phát triển và nghiên cứu lúa lai ở Việt Nam mới thực sự hình thành và phát triển Điều đó thể hiện rõ qua việc diện tích lúa lai tăng rất nhanh ở Đồng Bằng, Trung Du và các tỉnh Miền Núi Phía Bắc Năm 1990 mới gieo cấy được 10 ha, năm 1992 đạt 5000 ha, năm 1998 đ4 tăng lên 200.000 ha, năm 2001 đạt 480.000 ha, năng suất 62 tạ/ ha và sản lượng đạt khoảng 600.000 tấn [4] và đến năm 2004 diện tích đ4 lên tới 621.382 ha, năng suất lúa lai bình quân đạt khoảng 60 - 65 tạ/ ha [21] Việc nghiên cứu và sử dụng ưu thế lai trong sản xuất lúa tại Việt Nam đánh dấu một mốc quan trọng trong nghề trồng lúa Lúa lai đ4 trở thành một nhân tố quan trọng góp phần tăng năng suất và sản lượng lúa không những với các tỉnh phía Bắc mà còn phát triển rất tốt tại các tỉnh miền Trung và Tây nguyên

Theo phát biểu của Phó Thủ tướng Nguyễn Công Tạn trong những năm tới diện tích lúa lai sẽ phấn đấu đạt 1 triệu hecta/ năm [26]

Hướng nghiên cứu khai thác ưu thế lai giữa hai loài phụ Indica/ Japonica, Indica/ Javanica trong nước cũng thu được những kết quả đáng khích lệ Các cơ quan nghiên cứu trong nước đ4 tạo ra một số dòng giống có năng suất siêu cao như: MT508-1, SL1-SL21… Một số giống, tổ hợp lúa lai

được chọn tạo trong nước cho năng suất cao như Việt lai 24, TH3/4, VL20, TH3-3… [3] Tuy vậy những giống lúa lai đang được trồng ở nước ta chủ yếu

là những giống nhập nội từ Trung Quốc, chưa hoàn toàn thích ứng với điều kiện sinh thái ở Việt Nam và còn nhiều hạn chế khác như về tính thích nghi và khả năng chống chịu sâu bệnh [9], [22], [23] Cho nên vấn đề cần chọn tạo những giống, tổ hợp lúa lai cho năng suất cao, chống chịu sâu bệnh và điều kiện bất lợi của môi trường là hết sức cần thiết trong giai đoạn hiện nay

2.2 Đa dạng sinh học

2.2.1 Đa dạng sinh học (Biology diversity)

Theo quỹ quốc tế về bảo tồn thiên nhiên (WWF), (1989): Đa dạng sinh học là toàn bộ các dạng sống trên trái đất, là hàng triệu loài thực vật, động vật

và vi sinh vật, là những gen lưu động trong loài và là những hệ sinh thái vô cùng phức tạp cùng tồn tại trong môi trường [4] Vì vậy đa dạng sinh học phải

được xét trong các mức độ sau:

+ Đa dạng sinh học ở cấp loài là bao gồm toàn bộ sinh vật sống trên trái

đất như: Động vật, thực vật, vi sinh vật và cả những loài nấm

+ Đa dạng sinh học ở mức độ gen là sự khác biệt về gen giữa các loài, các quần thể sống cách ly nhau về mặt địa lý cũng như giữa các cá thể sống chung trong một quần thể

+ Đa dạng sinh học bao gồm cả sự khác biệt giữa các quần x4 mà trong

đó các loài sinh sống, giữa các hệ sinh thái nơi mà các loài cũng như quần x4 sinh vật tồn tại và cả sự khác biệt về mối tương tác giữa chúng với nhau

2.2.2 Đa dạng di truyền (Genetic diversity)

Đa dạng di truyền là sự thể hiện phong phú ở mức độ gen Thường thì các loài sinh vật đều có sự đa dạng di truyền vì ở mỗi loài sinh vật đều có số lượng NST khác nhau nên các cá thể có các gen khác nhau (dù chỉ là rất ít)

Trong quá trình sinh sản hữu tính, sự đa dạng di truyền của các quần thể sẽ tăng lên do kết quả tái tổ hợp hoặc đột biến [17] Các gen đa hình là nguyên nhân dẫn đến sự tồn tại các kiểu gen dị hợp trong quần thể Sự khác biệt về kiểu gen của các cá thể trong quần thể cho phép các quần thể này thích nghi hơn quần thể khác khi chịu những thay đổi của môi trường

Tính đa dạng di truyền là cơ sở để tạo nên ưu thế lai Trong một chừng mực nhất định, nếu tính đa dạng di truyền giữa bố và mẹ càng lớn thì ưu thế lai càng cao ở đây tính đa dạng di truyền chủ yếu là do:

* Cả hai bố mẹ có họ hàng xa, như các loài hoặc loài phụ khác nhau

* Cả hai bố mẹ đều bắt nguồn từ một vùng địa lý xa nhau

* Cả hai bố mẹ thuộc kiểu sinh thái khác nhau, như lúa chín sớm, lúa chín trung bình và lúa chín muộn hoặc lúa nước hay lúa cạn

Hiện tượng bổ sung các tính trạng tốt của cả hai giống bố mẹ thường thấy trong các tổ hợp lai hiện nay được sử dụng rộng r4i trong sản xuất nông nghiệp Điều này làm cho các tính trạng toàn diện của con lai trở lên ưu việt sơ với bố mẹ chúng và tỏ rõ ưu thế lai cao Khả năng tổ hợp chung của bố mẹ

có tác động lớn tới năng suất của lúa lai, do đó cần chọn bố mẹ có trị số cao

về khả năng tổ hợp như khả năng đẻ nhánh, số bông trên một cây, số hạt chắc trên mỗi bông, khối lượng 1000 hạt… và cần chọn bố mẹ có trị số thấp về tỷ

lệ hạt lép, chiều cao cây Lúa lai được trồng để khai thác tính ưu việt của con lai, chọn bố mẹ lai chủ yếu dựa vào tham số di truyền tổng quát của chúng Con lai thể hiện hệ số di truyền cao có nghĩa là phần lớn nó được di truyền từ

bố mẹ và ít chịu ảnh hưởng của môi trường Cho dù các tính trạng bổ sung, khả năng tổ hợp hay hệ số di truyền thì những nhân tố này không thể tách rời nhau, mà gắn bó chặt chẽ với nhau Tính đa dạng di truyền giữa hai bố mẹ chắc chắn được phản ánh qua các tính trạng của chúng, và tính trạng khác nhau của chúng cũng là một biểu hiện của tính đa dạng di truyền Vì thế tính

đa dạng di truyền là quan trọng nhất và chỉ có tính đa dạng di truyền lớn mới

có thể tạo cho con lai có chức năng sinh lý khoẻ dẫn đến ưu thế lai Trên cơ sở các dữ liệu về đa dạng di truyền, người ta có thể phân tích được mối quan hệ phát sinh chủng loại và sự tiến hoá, phát hiện loài mới, cũng như áp dụng trong chọn tạo giống, chẩn đoán ưu thế lai

2.2.3 Hiện tượng đa hình (Polymophism)

Thuật ngữ hiện tượng đa hình thường để chỉ tính biến dị bên trong của một quần thể nào đó Theo một định nghĩa đơn giản đó là sự có mặt của những kiểu hình khác nhau rõ ràng bên trong một quần thể thống nhất giao phối được với nhau

2.2.4 ý nghĩa nghiên cứu đa dạng di truyền

Đa dạng di truyền rất cần thiết cho sự tồn tại của các loài, các quần x4

tự nhiên Sự đa dạng di truyền là nhân tố giúp cho sinh vật duy trì được nòi giống, kháng với các loài dịch bệnh và thích nghi với những thay đổi của môi trường Ngoài ra sự đa dạng di truyền còn là cơ sở tạo nên ưu thế lai Khi chọn cặp lai dựa vào mức độ tương đồng ADN, các nhà chọn giống phân tử đề nghị nên chọn những cặp bố mẹ có mức độ giống từ 40 - 70%, nếu >70% thì khó tạo ra những tổ hợp lai có giá trị và ngược lại nếu chọn bố mẹ có mức độ giống nhau thấp <40% thì quá trình lai khó thành công Tuy chỉ thị ADN

đóng vai trò quan trọng để chọn cặp lai, nhưng khi phân tích cần phải quan tâm tới loại chỉ thị ADN nào đ4 được sử dụng và các điều kiện liên quan khác [19] Trong quá trình chọn bố mẹ, cần phải nắm vững nguồn gốc của chúng để tạo ra những giống cây trồng có năng suất chất lượng tốt hơn hẳn bố mẹ, phục

vụ cho lợi ích của con người

2.3 Khái niệm về chỉ thị di truyền

Chỉ thị di truyền là bất kỳ một đặc tính nào có thể đo đếm được về mặt hình thái, sinh hoá hoặc phân tử, có thể di truyền theo quy luật Menden Được dùng để nhận biết, phân biệt sự khác biệt giữa các sinh vật hoặc dựa vào đó nhận biết những tính trạng khác nhau

Chỉ thị di truyền là một đặc điểm hay một thuộc tính có thể đo đếm

được và có khả năng di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác Theo Paterson, một đặc điểm được coi là chỉ thị di truyền nhất thiết phải đảm bảo hai tiêu chuẩn: 1/ phải khác biệt giữa bố và mẹ; 2/ phải được truyền lại chính xác cho thế hệ sau [51]

Các nhà nghiên cứu di truyền và chọn giống rất quan tâm đến chỉ thị di truyền vì những chỉ thị di truyền rất có ích trong việc nghiên cứu sự thừa kế những dấu hiệu di truyền và những biến đổi của chúng trong quần thể, đặc biệt là những chỉ thị liên quan đến tính trạng nông sinh học có lợi cho con người Chỉ thị di truyền cho phép phát hiện sự sai khác về mặt thông tin di truyền giữa hai hay nhiều cá thể Sự sai khác giữa các NST của hai cá thể có thể được phát hiện bằng nhiều loại chỉ thị như: chỉ thị hình thái, chỉ thị sinh hoá và chỉ thị phân tử ADN Những chỉ thị này từ lâu đ4 là những công cụ hữu hiệu trong chương trình chọn giống

2.3.1 Chỉ thị hình thái

Chỉ thị hình thái là loại chỉ thị có thể nhìn thấy hoặc đo đếm được, khả năng ứng dụng hạn chế Việc sử dụng các đặc điểm hình thái trong phân loại sinh vật được sử dụng từ rất sớm Những tính trạng hình thái được

sử dụng như là một chỉ thị di truyền là những tính trạng do một locus gen quy định và sự thể hiện của chúng không bị ảnh hưởng của nhân tố môi trường Chỉ thị hình thái dễ dàng nhận biết được và thường biểu hiện ở dạng trội lặn Năm 1928 Kato và cs bằng chỉ thị hình thái đ4 chia lúa trồng thành hai loài phụ Indica và Japonica Sau này cũng bằng chỉ thị hình thái Morinaga (1954) chia thêm một loài phụ thứ ba Javanica Tuy nhiên, việc

sử dụng các chỉ tiêu hình thái trong phân tích đa dạng di truyền cũng có những hạn chế nhất định: Số lượng các chỉ tiêu hình thái là có hạn, chúng

bị ảnh hưởng bởi quá trình tương tác gen và các nhân tố môi trường, các chỉ tiêu hình thái chỉ thể hiện ở những giai đoạn nhất định của quá trình phát

triển cá thể [5] Vì thế cho đến nay các nhà chọn giống ít sử dụng loại chỉ tiêu này mà chuyển sang sử dụng các chỉ tiêu sinh hoá

2.3.2 Chỉ thị sinh hoá

Chỉ thị sinh hoá là loại chỉ thị có bản chất là đa hình Protein, bao gồm chỉ thị Isozym và các loại Protein dự trữ, chúng có thể di chuyển với tốc độ khác nhau trong trường điện di một chiều hay hai chiều tạo ra những đặc điểm

đặc trưng trên gel điện di và có thể hiển thị bằng phương pháp nhuộm Phân tích Isozym là phương pháp đánh giá nhanh vì cùng một lúc có thể phân tích

được nhiều mẫu và khối lượng cho mỗi mẫu phân tích cần rất ít, thích hợp cho việc nghiên cứu phục vụ phân loại Vấn đề là phải chọn hệ Isozym nào để có

sự phân biệt rõ giữa các loài hay các giống Những chỉ thị sinh hoá chỉ thể hiện ở những giai đoạn nhất định của quá trình phát triển cá thể tuỳ thuộc vào cơ chế phức tạp của sự đóng mở gen Cơ chế này cũng được điều khiển bởi vật chất di truyền là ADN Bất kỳ một protein nào có mặt trong cơ thể sinh vật dù

ở giai đoạn nào của sự phát triển cá thể thì cũng chỉ là sản phẩm của gen thông qua dòng thông tin di truyền từ ADN- ARN - Protein Tuy nhiên do có

số lượng không nhiều và biểu hiện của chúng phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cá thể, nên các chỉ thị Protein và Isozym hạn chế về mặt ứng dụng

2.3.3 Chỉ thị phân tử ADN

2.3.3.1 Các chỉ thị phân tử ADN

Chỉ thị phân tử ADN là những chỉ thị có bản chất đa hình ADN Nó có thể là những đoạn gen có sẵn hay dưới dạng thông tin về trình tự được lưu giữ trong các tệp dữ liệu của máy tính (ví dụ như trình tự các mồi STS, RAPD và AFLP) Chỉ thị phân tử có thể là một gen hoặc một đoạn ADN có vị trí xác

định trên NST và cũng di truyền theo quy luật Menden Chỉ thị phân tử ADN

được chia làm ba loại chính:

- Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN: Đa hình độ dài các đoạn cắt hạn chế - Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP)

- Chỉ thị dựa trên nguyên tắc nhân bội ADN bằng PCR:

+ Đa hình các đoạn ADN được nhân ngẫu nhiên - Randomly Amplified Polymorphic DNA (RADP)

+ Đa hình độ dài các đoạn nhân chọn lọc - Amplified Fragment Length Polymorphisms (AFLP)

- Chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại (Repeatitive sequences):

+ Tiểu vệ tinh (Minisatellite)

+ Đa hình các đoạn lặp lại đơn giản - Simple Sequence Repeats (SSR) hay còn gọi là chỉ thị vi vệ tinh (Microsatellite)

Trong những năm gần đây việc nghiên cứu hệ gen trên rất nhiều loại cây trồng sử dụng các chỉ thị phân tử được phát triển nhanh chóng Người ta

đ4 thiết lập được bản đồ chi tiết về các chỉ thị ADN liên kết với nhiều gen quy

định các tính trạng nông sinh học khác nhau trên cơ sở đó đ4 tiến hành chọn lọc gián tiếp dựa trên các chỉ thị phân tử này, đây được gọi là phương pháp chọn lọc dựa vào chỉ thị ADN - Marker-Assisted Selection (MAS) [25] Với ý

đồ sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết với các gen mong muốn trong chọn tạo giống mới Nhờ vào ưu điểm tuyệt đối của chỉ thị phân tử như tìm và phát hiện những cá thể có chứa một gen nhất định nào đó trong quần thể đang phân ly, trên cơ sở tìm sự có mặt của một đoạn ADN đánh dấu nào đó liên kết chặt với gen đó chứ không phải dựa vào kiểu hình của nó, giúp cho nhà chọn giống phân biệt được sự sai khác rất nhỏ giữa hai cá thể sinh vật có họ hàng gần nhau, tăng được hiệu quả và độ chính xác của chọn lọc đặc biệt đối với những tính trạng khó biểu hiện ra kiểu hình, là công cụ hữu hiệu để khẳng định quyền tác giả đối với các loại giống cây trồng, vật nuôi

2.3.3.2 ứng dụng của chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng

Từ lâu, các nhà chọn giống đ4 quan tâm đến các chỉ thị hình thái liên kết với một số tính trạng nông học quan trọng và sử dụng chúng như một phương tiện hữu ích trong quy trình chọn tạo giống mới Giá trị thực tiễn của chỉ thị hình thái trong chọn giống gặp nhiều hạn chế Từ năm 1983, chỉ thị phân tử đ4 trở thành công cụ đắc lực hỗ trợ phương pháp truyền thống trong việc chọn giống cây trồng Tanksley khi lập bản đồ đa gen đ4 nêu ra những ưu thế của chỉ thị phân tử so với chỉ thị hình thái như sau:

1/ Kiểu gen của các locut chỉ thị phân tử có thể được xác định tại bất kỳ giai đoạn nào và ở bất cứ mức độ nào: tế bào, mô hay toàn bộ cơ thể, trong khi kiểu hình của phần lớn các chỉ thị hình thái chỉ có thể phân biệt được trong những giai đoạn nhất định và thường ở mức độ toàn bộ cơ thể

2/ Số lượng các chỉ thị phân tử ADN là cực lỳ lớn, trong khi đó số lượng các chỉ thị hình thái rất hạn chế

3/ Các alen khác nhau của chỉ thị phân tử thường không liên kết với các hiệu ứng có hại, trong khi việc đánh giá các chỉ thị hình thái thường hay đi kèm với những hiệu ứng kiểu hình không mong muốn

4/ Các alen của các chỉ thị phần lớn là đồng trội, vì thế cho phép phân biệt mọi kiểu gen ở bất kỳ thế hệ phân ly nào, còn các alen của các chỉ thị hình thái thường tương tác theo kiểu trội-lặn, do đó bị hạn chế sử dụng trong nhiều tổ hợp lai

5/ Đối với chỉ thị hình thái, các hiệu ứng lấn át thường làm sai lệch việc

đánh giá các thể phân ly ở trong cùng một quần thể phân ly, còn đối với chỉ thị phân tử, hiệu ứng lấn át hoặc cộng tính rất hiếm gặp (Lưu Ngọc Huyền, 2002) [10]

Ngày nay, phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử là một phương tiện hữu hiệu trợ giúp đắc lực cho chọn giống truyền thống nhằm khắc phục những trở ngại mà công tác chọn giống truyền thống rất khó giải quyết Sự

phát triển của công nghệ chỉ thị phân tử đ4 giải phóng các nhà chọn giống khỏi một lượng lớn công việc khi phải chọn lọc, phát hiện một lượng ít ỏi những cá thể quan tâm trong số vô vàn những cá thể khác nhờ việc xác định

sự có mặt hay vắng mặt của những chỉ thị liên kết với những alen đặc hiệu mà không cần đánh giá kiểu hình Phương pháp này còn có thể giúp ta chọn lọc những cá thể mang những tổ hợp gen cần thiết và loại bỏ các nhiễu do các tương tác trong cùng alen hay giữa các alen gây ra - những tương tác này thường không thể phát hiện bằng các phân tích kiểu hình Chọn giống nhờ chỉ thị đặc biệt hiệu quả trong trường hợp cần đưa gen lặn hoặc thậm chí đưa cùng lúc nhiều gen khác nhau vào một nền gen ưu việt Chỉ thị phân tử cho phép các nhà tạo giống nhận dạng chính xác các gen quan tâm ở bất cứ bộ phận nào của cây ở giai đoạn sớm mà không bị ảnh hưởng bởi điều kiện môi trường và thời gian lại được rút ngắn Hiện nay có nhiều giống mới được tạo bằng phương pháp này (Huang và cs, 1997) đ4 tạo được giống lúa mang 4 gen kháng bệnh bạc lá, Zheng và cs (1995) đ4 tạo được giống lúa mang 3 gen kháng bệnh đạo ôn [1] Các dòng chọn lọc có tính chịu hạn, chịu lạnh, muối đ4 được chứng minh sự sai khác di truyền ở mức độ phân tử (Bùi Bá Bổng, 2002), (Nguyễn Thị Kim Liên, 2003) [4], [15] Các kết quả này sẽ là tiền đề cho các nghiên cứu chọn tạo giống lúa mới dưới sự trợ giúp của chỉ thị phân tử

Các nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử để xác định khoảng cách di truyền giữa các dòng bố mẹ trong tập đoàn các giống lúa thuộc 3 loài phụ (Indica, Japonica, Javanica) đ4 được tập trung nghiên cứu mạnh mẽ ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới Mục tiêu của các nghiên cứu này nhằm đánh giá sự đồng dạng và sai khác về di truyền giữa các cá thể chọn làm bố mẹ với mục đích chọn tạo ra các bố mẹ có sự khác biệt đủ lớn về mặt di truyền nhưng vẫn có khả năng tạo tổ hợp lai để cho thế hệ con có tính dị hợp cao, có ưu thế lai lớn, mở rộng nền di truyền [29] Khắc phục những điểm yếu chính của chọn tạo giống theo phương pháp truyền thống là tốn kém nhân công và đòi

hỏi thời gian dài Việc sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống lúa có thể nhanh chóng xác định được sự đa dạng di truyền của các vật liệu, đồng thời giúp các nhà chọn giống lựa chọn bố mẹ của tổ hợp lai cho ưu thế lai cao thay vì phải lai hàng nghìn cặp rồi đánh giá, chọn lọc, lai thử lại, đánh giá và khảo nghiệm để tìm ra tổ hợp mong muốn theo phương pháp truyền thống

Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đ4 phân tích cặn kẽ một

số mô hình MAS Theo một số mô hình thì cần phải tiến hành lai trải qua 4 thế hệ, chứ không cần phải đến 6 - 8 thế hệ ngay cả khi quần thể chọn giống

có kích thước nhỏ và các dữ liệu về chỉ thị phân tử bị hạn chế Trong một số trường hợp, các nhà chọn giống đôi khi chỉ cần lai trở lại 3 thế hệ là có thể đạt

được mục tiêu của mình [37] Điều này chứng tỏ công nghệ chỉ thị có lợi thế khi ứng dụng trong chọn tạo giống lúa

2.4 Một số chỉ thị phân tử ứng dụng trong nghiên cứu

đa dạng di truyền thực vật

2.4.1 Đa hình độ dài các đoạn cắt hạn chế (RFLP)

Chỉ thị này được các nhà di truyền học lần đầu tiên giới thiệu trong nghiên cứu lập bản đồ các gen liên quan đến bệnh ở người RFLP là kỹ thuật nhận dạng ADN bằng cách lai axit nucleic Bản chất của kỹ thuật này là dựa trên sự phân cắt ADN bằng các enzym cắt giới hạn (Restriction enzymes) và

kỹ thuật lai ADN với mẫu dò RFLP là kỹ thuật tạo nên các đoạn cắt khác nhau phân biệt được bằng điện di đồ, các đoạn cắt còn được gọi là các “dấu vân tay” đặc trưng cho từng phân tử ADN Xử lý các mẫu ADN khác nhau bằng cùng một cặp enzym giới hạn, nếu các bộ gen có cấu trúc khác nhau sẽ tạo nên số lượng đoạn cắt ADN có chiều dài khác nhau còn những bộ gen nào hoàn toàn giống nhau tạo nên các đoạn cắt giống nhau ở thực vật, chỉ thị này lần đầu tiên được áp dụng trong nghiên cứu gen chịu trách nhiệm tổng hợp ARN ribosom trong vùng cấu trúc nhân của lúa mỳ Từ đó, việc lập bản đồ di

truyền sử dụng chỉ thị RFLP đ4 được ứng dụng đối với nhiều loại cây trồng khác như cà chua, ngô và lúa [46]

Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội nghĩa là có khả năng biểu hiện trong tất cả các alen của cùng một locus gen Do vậy có thể phân biệt được các thể

đồng hợp tử (AA hoặc aa) và các cá thể dị hợp tử (aa) Đây là đặc điểm ưu việt của chỉ thị RFLP

Kỹ thuật RFLP không đòi hỏi phải biết trình tự gen song chỉ thị này cũng có mặt hạn chế do phải nuôi giữ và tuyển chọn một quần thể lớn các mẫu

dò và đòi hỏi phải chuẩn hoá một thư viện các đoạn ADN được phân lập nhân trong vector vì vậy kỹ thuật này cần có sự đầu tư đáng kể về trang bị kỹ thuật phòng thí nghiệm đồng thời phương pháp này thường phải tốn nhiều thời gian

và sức lực, giá thành cao, khi thực hiện đòi hỏi nhà nghiên cứu phải thành thạo

về kỹ thuật Đặc biệt là cần một lượng lớn ADN để lai mà số lượng đa hình thu được rất ít ỏi, thậm chí ở một số loài khó nhận được đa hình

2.4.2 Đa hình độ dài các đoạn nhân chọn lọc (AFLP)

Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR (Polymerase Chain Reaction) do Karl Mullis và cs phát minh 1985 [30] Nhờ enzym DNA polymerase xúc tác, trên các mạch khuôn ADN tổng hợp nên các mạch đơn mới Các mạch đơn mới

được tổng hợp lại được sử dụng làm khuôn cho quá trình tổng hợp mạch mới của chu kỳ tiếp theo Nhờ vào việc phát hiện ra loại enzym chịu nhiệt được tách từ một loại vi khuẩn suối nước nóng có tên là Thermus Aquaticus hoạt

động tốt nhất ở nhiệt độ 70 - 800C Người ta đ4 kết hợp với những tính chất cơ bản của ADN là có khả năng duỗi xoắn ở một nhiệt độ thích hợp, có khả năng kết cặp với những đoạn ADN có trình tự nucleotit bổ sung với đoạn ADN khuôn mẫu và có khả năng nhân đôi dưới xúc tác của enzym đặc hiệu để nhân bội những đoạn ADN khuôn mẫu Sau đó sự phát minh ra máy PCR có thể dễ dàng thực hiện được những phản ứng nhân bội ADN Phản ứng PCR dựa trên nguyên tắc tổng hợp ADN nhờ enzym ADN Polymerase chịu nhiệt (Taq,

Pfu…) với sự có mặt của đoạn ADN khuôn mẫu, ADN mồi, các nucleotit (dNTP) gồm dATP, dCTP, dGTP, dTTP và ion Mg2+ hoạt động như một chất xúc tác

Chỉ thị AFLP - đa hình chiều dài các đoạn ADN do kết quả khuyếch

đại một cách có chọn lọc những đoạn ADN được cắt bởi enzym giới hạn, do Vos và cs phát minh năm 1975 [30] Đây là một kỹ thuật chỉ thị phân tử dựa vào nguyên lý của PCR để nhân các đoạn cắt hạn chế AFLP khám phá hiện tượng đa hình qua sự khác nhau về độ dài của các đoạn ADN được nhân lên Phương pháp này linh hoạt có thể phát hiện được sự có mặt của những mảnh cắt giới hạn trong bất kỳ loại ADN nào Về nguyên tắc giống như RFLP, điểm khác biệt cơ bản là AFLP không cần tiến hành lai phân tử

do vậy thực hiện nhanh hơn

Kỹ thuật AFLP gồm 3 bước cơ bản là:

+ Cắt ADN hệ gen bằng enzym giới hạn sau đó gắn bổ sung các adaptor

đặc hiệu (trình tự bổ sung với đầu cắt) đặc trưng cho từng RE tạo nên các đoạn

có đầu mút giống nhau, từ trình tự các adaptor và trình tự vùng nhận biết của enzyme giới hạn, thiết kế 2 mồi trên cơ sở tịnh tiến thêm ngẫu nhiên 1 đến 2 nucleotit Như vậy, chỉ những đoạn ADN giới hạn nào có trình tự cả hai đầu tương đồng với mồi mới có 1-2 nu được tịnh tiến thêm thì sẽ được nhân lên

+ Nhân đoạn ADN bằng kỹ thuật PCR sử dụng hai đoạn mồi khác nhau Bước này được thực hiện nhằm giảm bớt số lượng quá lớn của các mảnh ADN sau khi cắt

và gắn bộ thích ứng Sự nhân bội chọn lọc đạt được bởi sử dụng những mồi được kéo dài phía điểm cắt giới hạn bằng cách thêm các nucleotit vào vị trí cắt Do vậy mà chỉ

có những mảnh ADN có trình tự bổ trợ với các bazơ thêm vào mới được nhân bội

+ Điện di các sản phẩm của phản ứng PCR nhờ hệ thống chạy điện di trên gel polyacrylamit Thường là từ 50-100 mảnh cắt giới hạn được nhân lên và phát hiện trên gel polyacrylamit biến tính nhờ sử dụng đồng vị phóng xạ hoặc nhuộm bạc Đây là một kỹ thuật thiết thực và đáng tin cậy bởi sự nghiêm ngặt của điều kiện phản ứng Sự

nhân chọn lọc được thực hiện khi sử dụng các mồi có chứa một hay nhiều hơn các nucleotide chọn lọc Những nucleotide này giúp cho các mồi nhận ra các

đoạn phân cắt đặc hiệu mà có trình tự tương xứng hoàn toàn Trình tự của mồi

bổ xung với trình tự của đoạn nối cộng thêm các nucleotide chọn lọc ở đầu 3’ Bằng cách làm giảm số phân đoạn tách rời đủ để nghiên cứu đa hình

Ưu điểm của kỹ thuật này là cho độ đa hình cao, lượng ADN tổng số tiêu tốn rất ít, dễ dàng lặp lại và có thể phân tích ADN ở bất kỳ nguồn gốc nào hay mức độ phức tạp nào Tuy nhiên phương pháp này còn nhiều hạn chế: không có khả năng phân biệt giữa thể đồng hợp tử và dị hợp tử, kỹ thuật này

đòi hỏi có kỹ thuật phòng thí nghiệm cao, chi phí tốn kém hơn các kỹ thuật phân tử khác

2.4.3 Đa hình các đoạn ADN được nhân ngẫu nhiên (RAPD)

Kỹ thuật RAPD - tính đa hình ADN được nhân bản ngẫu nhiên do William (1990), Welsh và cs (1991) phát minh [29], [30] Loại chỉ thị này

được sinh ra bởi phản ứng PCR do sự nhân bản những đoạn ADN hệ gen, sử dụng những đoạn mồi đơn lẻ, ngẫu nhiên khoảng 10 nucleotit dưới nhiệt độ kết cặp thấp (khoảng 370C)

Kỹ thuật RAPD là kỹ thuật dựa trên PCR nhưng dùng mồi đơn có trình

tự ngẫu nhiên dài trên dưới 10 base, mồi này thường có hàm lượng lớn G+C hơn 60% để đạt được sự tiếp cặp với mẫu đủ mạnh Sự nhân ADN chỉ xảy ra khi vị trí mồi ở hai điểm có sự định hướng ngược nhau trong khoảng tối đa

2000 base dọc theo NST Các mồi ngẫu nhiên là ngắn nên khả năng nó tìm

được những điểm gắn theo nguyên tắc bổ xung dọc trên phân tử ADN là không quá khó khăn Kết quả của phản ứng RAPD sẽ tạo ra nhiều đoạn ADN khác nhau về độ dài và trình tự Một mồi ngẫu nhiên có thể cho kết quả dương tính (có khả năng nhân được các đoạn ADN) với ADN từ nguồn này nhưng lại cho kết quả âm tính với ADN từ nguồn khác

Ưu điểm của phương pháp RAPD là thao tác đơn giản, giá thành thấp,

sử dụng lượng nhỏ ADN khuôn, có ưu điểm trong việc lập bản đồ ở những dòng nhị bội, những dòng cận phối hay các quần thể lai trở lại Lợi thế của phương pháp này là không cần biết thông tin về trình tự đoạn nhân RAPD

được dùng nhiều nhất trong xác định các trạng thái khác nhau, xác định quan

hệ di truyền và nghiên cứu đa dạng ở nhiều loài cây trồng trong đó có lúa [27] Kỹ thuật RAPD được sử dụng trong nghiên cứu sự thay đổi ADN genome Nghiên cứu của Sandhu S.S và cs (2002) [57] đ4 chỉ ra sự đa hình ADN của các dòng lúa chọn lọc có khả năng kháng chất diệt cỏ được tạo ra từ

đột biến chiếu xạ tia gamma Tuy nhiên chỉ thị RAPD có một số hạn chế như không phân biệt được thể dị hợp tử, độ nhạy của RAPD bị phụ thuộc vào điều kiện của phản ứng, đôi khi kết quả không lặp lại được, đặc biệt là những cơ thể có bộ gen lớn như lúa mỳ [36]

2.4.4 Đa hình các đoạn lặp lại đơn giản (SSR)

Chuỗi lặp lại có trật tự (Tandemly repeated sequences) là những chuỗi lặp lại có trật tự đầu đuôi trong một hệ gen, thường được gọi là ADN vệ tinh, tiểu vệ tinh hay vi vệ tinh, phân loại dựa theo số bản sao của chúng trong hệ gen và tính chất của chuỗi Thực ra một số chuỗi lặp lại cũng có thể được sử dụng như loại chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bội ADN (ví dụ: vi vệ tinh) Tuy nhiên, do chúng có bản chất là chuỗi lặp lại nên có thể xếp chúng vào một nhóm riêng

Chỉ thị SSR là sự khuyếch đại các đoạn lặp đơn giản (những đoạn ADN lặp lại một cách có trật tự, phân bố nhiều trong khắp hệ gen của sinh vật nhân chuẩn) Chỉ thị phân tử SSR là những đoạn ADN ngắn gồm một số nucleotid lặp lại liên tiếp, mỗi đơn vị có chiều dài từ 4 đến 6 cặp bazơ số lượng đơn vị lặp lại thay đổi từ 1 đến 40 đơn vị Những đoạn SSR phân bố ở đầu và cuối tâm động có tác dụng bảo vệ và liên quan đến sự di chuyển của NST Bản chất

đa hình SSR có thể được nhân do sự nhân bội từ ADN tổng số của hệ gen nhờ

sử dụng hai đoạn mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu của vùng lặp lại

Kỹ thuật SSR dựa trên nguyên lý PCR dùng các cặp mồi đặc hiệu để nhân các đoạn trình tự SSR Sự khác nhau trong cấu trúc đơn vị lặp lại dẫn đến

sự thay đổi độ dài đoạn lặp lại được nhân lên và xác định khi chạy điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide

Các bước thực hiện kỹ thuật SSR chủ yếu là:

- Tách chiết và tinh sạch ADN của các mẫu nghiên cứu

- Thực hiện phản ứng nhân gen qua PCR với các mồi đặc trưng cho các

hệ thứ hai của các chỉ thị phân tử [39] Cho đến nay nó được tìm thấy trong các genome của cơ thể Eukaryot khác như gia cầm, động vật có vú, cá, trên một số loại cây một lá mầm và hai lá mầm Những chuỗi đa hình đơn giản này đ4 được ứng dụng trong việc lập bản đồ ở cả hai đối tượng động vật và thực vật [35], [60]

ở thực vật, tần số và số lượng SSR đ4 được xác định trên lúa mì [54] và 34 giống cây trồng khác [50], [56] Những kết quả nghiên cứu này đ4 chỉ ra rằng ở thực vật, SSR mang trình tự lặp lại (AT)n nhiều hơn so với động vật Những nghiên cứu trên lúa [62], ngô [58] cũng cho kết quả tương tự Trong hệ gene lúa, (GA)n lặp lại cứ

225 kb một lần và (GT)n lặp lại cứ 480 kb một lần [47]

ở lúa, khi nghiên cứu 22706 nhân dòng thư viện cDNA và 1220 nhân dòng thư viện genome các nhà khoa học Nhật Bản đ4 phát hiện ra rằng trình tự

lặp lại phổ biến nhất trong genome cây lúa là d(CCG/CGG)n (khoảng 200000

đoạn lặp) Phổ biến thứ hai là trình tự d(AG/CT)n [34]

Chỉ thị SSR xuất hiện và phân bổ rộng trong hệ gen của tất cả sinh vật nhân chuẩn Các đoạn SSR đa hình về độ dài có thể được phát hiện khi lai với ADN trên gel hoặc có thể được tách dòng, đọc trình tự và nhân bằng PCR với mồi là các đoạn oligonucleotide phụ cận Các vị trí SSR là các chỉ thị đồng trội vì vậy chứa đựng thông tin cao SSR cũng là một chỉ thị trong lập bản đồ

và xác định chỉ thị thuần [38], [47] Những kết quả bước đầu về sử dụng chỉ thị SSR để lập bản đồ liên kết di truyền ở lúa đ4 được Zhao và cs công bố [66]

Các nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc và chức năng của các trình tự lặp lại thích hợp cho việc sử dụng trong phân tích genome, cho di truyền quần thể, xác định các thứ và các loài có quan hệ gần gũi, kiểm tra chất lượng về độ thuần khiết của hạt, chất lượng lai, đánh giá gen và nghiên cứu hệ thống phát sinh loài Theo MeCouch (1996), kỹ thuật này tỏ ra rất hữu hiệu trong việc phân định sai khác giống lúa trong cùng loài phụ do tính đa dạng giữa các alen cùng một locut SSR được dùng nhiều trong nghiên cứu quan hệ di truyền

và đa dạng ở các loài cây khác nhau như : lúa mạch, ngô Cho đến nay kỹ thuật này đang được sử dụng rộng r4i trong lĩnh vực di truyền phân tử của nhiều đối tượng khác nhau như đánh dấu gen, xác định giống, chẩn đoán bệnh

di truyền

Trong phân tích SSR không dùng phóng xạ hoặc bất cứ một bước nghiên cứu phức tạp nào khác vì vậy chỉ thị này được quan tâm hơn trong ứng dụng chọn giống thực vật ở lúa cho thấy, nghiên cứu sàng lọc thư viện genom hiện nay người ta đ4 tìm được trên 3.000 chỉ thị SSR định vị dọc theo 12 NST tạo nên một bản đồ khá dày đặc các chỉ thị SSR chỉ đặc thù cho bộ gen của loại cây trồng này [49]

Chỉ thị vi vệ tinh là chỉ thị đồng trội, có khả năng phát hiện sự đa hình rất cao, nhanh giữa các cá thể cần phân tích, hơn thế nữa chỉ thị vi vệ tinh di

truyền theo quy luật Menden, đòi hỏi một lượng nhỏ ADN, các thao tác khi sử dụng chỉ thị này trong phân tích di truyền rất đơn giản, kỹ thuật phòng thí nghiệm đơn giản không dùng lai và mẫu dò phóng xạ nên không đòi hỏi kỹ thuật phức tạp, có khả năng tự động hoá rất cao Ngoài ra việc sử dụng chỉ thị SSR có khả năng xác định được vị trí các nhóm gen liên kết trên NST nhanh hơn những chỉ thị khác tạo điều kiện cho việc nghiên cứu hệ gen của lúa, đặc biệt những nghiên cứu lập bản đồ gen kiểm soát tính trạng nông sinh học quan trọng trong quá trình chọn giống Tuy nhiên hạn chế của loại chỉ thị này là quá trình thiết kế mồi rất tốn kém mà mỗi loại mồi chỉ đặc trưng cho một loài [14]

Bằng tất cả những kỹ thuật được mô tả ở trên, kỹ thuật SSR là một phương pháp có nhiều ưu điểm phù hợp với mục đích nghiên cứu và điều kiện phòng thí nghiệm Do vậy, trong luận văn này chúng tôi đ4 chọn chỉ thị SSR cho việc nghiên cứu đa dạng của các dòng, giống lúa

2.5 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền sử dụng chỉ thị phân tử SSR trong và ngoài nước

Công nghệ sinh học nói chung và công nghệ chỉ thị phân tử ADN nói riêng trong thời gian qua đ4 có những bước tiến dài Ngày nay, hầu hết các phòng thí nghiệm ở các nước trên thế giới đ4 và đang ứng dụng hướng nghiên cứu này và đ4 mang lại lợi ích to lớn cho nền nông nghiệp Chỉ thị phân tử SSR được coi là một công cụ hữu hiệu trong phân tích di truyền, xác định tính

đa dạng hay lập bản đồ liên kết trên đối tượng là cây lúa

2.5.1 Một số kết quả nghiên cứu trên thế giới

Các nhà khoa học Trung Quốc sử dụng 36 mồi Microsatellite nghiên cứu 113 dòng, giống lúa của vùng Yunnan đ4 đưa ra kết luận rằng sự đa dạng của loài phụ Japonica cao hơn của Indica Cũng trong nghiên cứu này khi phân tích 13 mồi Microsatellite thì thấy 5 mồi RM1; RM19; RM21; RM164; RM206 có tính chất đa hình Còn 8 mồi RM8; RM9; RM10; RM122; RM203; OSR2; OSR17 và OSR28 không cho băng đa hình [48]

Hong L.Z và cs (2004) [41] trong nghiên cứu của mình đ4 sử dụng 72 cặp mồi SSR để phân tích đa hình của 358 dòng lúa cạn, kết quả thu đ−ợc tổng

số 928 alen, trung bình là 12,9 alen/1 locus, số l−ợng alen/1 locus dao động từ

2 - 33 alen/1 locus Khi phân tích sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ họ hàng giữa các dòng, giống lúa họ đ4 chia 358 dòng, giống lúa thành 6 nhóm khác nhau

Khi phân tích đa hình của 232 cá thể thuộc 6 quần thể lúa (3 quần thể thu thập từ Dongxiang tỉnh Jiangxi và 3 quần thể thu thập từ Chaling tỉnh Hunan, Trung Quốc), các nhà khoa học đ4 sử dụng 23 cặp mồi SSR, kết quả thu đ−ợc tổng số 115 alen Trong 23 cặp mồi SSR tất cả đều cho băng đa hình Kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra rằng quần thể lúa ở Dongxiang có mức độ đa dạng cao hơn quần thể ở Chaling [59]

Các nhà khoa học Philippin và Viện lúa Quốc tế (IRRI) đ4 sử dụng 37 cặp mồi SSR nằm trên 12 NST của lúa để nghiên cứu sự đa hình của 37 dòng duy trì thu thập từ Viện Nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI) và 44 dòng phục hồi thu thập từ Viện Nghiên cứu lúa Philippine (Philrice) Số alen phát hiện đ−ợc trên 1 locus dao động từ 2 - 9 alen/1 locus Có 14 locus phát hiện đ−ợc > 5 alen Trong tổng số 157 alen phát hiện đ−ợc thì có 115 (73,2%) alen là xuất hiện cả ở dòng duy trì và dòng phục hồi, 11 alen ở 9 locus chỉ có ở dòng duy trì, trong khi 3 alen ở 14 locus chỉ có ở dòng phục hồi [63]

Trong khuôn khổ hợp tác nghiên cứu giữa các nhà khoa học Mỹ với Viện nghiên cứu Lúa quốc tế (IRRI), các nhà khoa học đ4 sử dụng 111 cặp mồi SSR để nghiên cứu sự đa dạng di truyền của 38 dòng lúa trồng và 2 dòng lúa dại Kết quả thu đ−ợc 753 alen với từ 1 - 17 alen trên mỗi marker, trung bình là 6,8 alen Họ cho rằng mức độ đa dạng di truyền của loài phụ Japonica cao hơn loài phụ Indica ở NST số 6 và số 7, còn ở NST số 2 thì thấp hơn [43]

Ravi M và cs (2003) [53] trong một nghiên cứu phân tích 40 loài lúa trồng và 5 loài lúa dại khi dùng 38 cặp mồi SSR và 499 mồi RAPD nhằm so

sánh khả năng phân tích đa hình của hai loại chỉ thị SSR và RAPD Kết quả đ4 cho thấy tỉ lệ đa hình khi sử dụng mồi RAPD là 90%, trong 38 cặp mồi SSR

sử dụng chỉ có mồi RM115 là không cho đa hình, tỉ lệ cho băng đa hình trung bình là 0,578 phân bố từ thấp đến cao 0 (RM115) - 0,890 (RM202)

Zeng và cs (2004) [65] nghiên cứu sự đa dạng di truyền giữa 33 giống lúa, kết quả thu được 123 alen trên tổng số 25 cặp mồi SSR Tác giả phân các giống thuộc loài phụ Japonica ra làm 3 nhóm A1; A2; A3 còn những giống khác thuộc loài phụ Indica được chia làm 2 nhóm B1; B2 trong đó, một số giống có mối quan hệ họ hàng gần gũi với mức độ tương đồng di truyền đạt tới 80%

2.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

ở nước ta hiện nay, hướng nghiên cứu chọn tạo giống nhờ các chỉ thị phân tử đ4 và đang được ứng dụng Tuy kết quả chưa nhiều song cũng chứng

tỏ được rằng trong điều kiện của nước ta chúng ta hoàn toàn nắm bắt được công nghệ và có khả năng ứng dụng chúng, nhằm đẩy mạnh công tác chọn tạo giống cây trồng, vật nuôi trong nước

Trần Danh Sửu và cs (2001) [24] đ4 sử dụng chỉ thị phân tử tìm hiểu mối quan hệ di truyền tiến hoá, phân loại của 59 giống lúa trồng của Việt Nam có nguồn gốc ở vùng Tây Bắc ở miền Bắc và vùng Tây nam ở miền Nam Kết quả cho thấy tất cả các giống lúa nước vùng Tây Nam thuộc nhóm giống Indica, tất cả các giống lúa nước vùng tây Bắc thuộc nhóm giống Japonica, các giống lúa cạn vùng Tây Nam và lúa nước vùng Tây Bắc phân bố đều ở cả hai nhóm Japonica và Indica

Theo tác giả Nguyễn Văn Đồng và cs (1999) [8] đ4 nghiên cứu mối đa dạng di truyền của các dòng bố mẹ và con lai F1 trong sản xuất lúa lai hai dòng bằng kỹ thuật dấu chuẩn phân tử Đ4 dùng 15 cặp mồi SSR để nghiên cứu đa hình của 19 dòng, giống lúa bố mẹ và con lai F1 Kết quả thu được cho