Lý Thuyết thí nghiệm vi sinh

berculosis chết ở 62oC trong 30 phút. Phép diệt trùng này chỉ diệt tế bào sinh dưỡng gây bệnh, không diệt bào tử và vi trùng hoại sinh. Mục đích: giữ hương vị, phẩm chất của sản phẩm. Nước sôi: thêm 1% bicarbonate natri để tăng nhiệt độ, nước sôi chỉ diệt tế bào sinh dưỡng. Thời gian 5 phút. Chưng cách thủy nhiều lần: Môi trường huyết thanh hay những chất dễ biến tính với nhiệt độ. Áp dụng phương pháp chưng cách thủy nhiệt độ 70 80oC, mỗi lần đun 1 giờ và liên tiếp trong 3 ngày. Hơi nước lưu thông: Diệt trùng môi trường chứa chuối, nồng độ đường cao, dung dịch hóa học không chịu được nhiệt độ trên 100oC. Có thể dùng autoclave nhưng luôn mở khóa thoát hơi, như thế nhiệt độ không vượt quá 1000C. Đun 30 phút đến 1 giờ. Hơi nước bão hòa ápberculosis chết ở 62oC trong 30 phút. Phép diệt trùng này chỉ diệt tế bào sinh dưỡng gây bệnh, không diệt bào tử và vi trùng hoại sinh. Mục đích: giữ hương vị, phẩm chất của sản phẩm. Nước sôi: thêm 1% bicarbonate natri để tăng nhiệt độ, nước sôi chỉ diệt tế bào sinh dưỡng. Thời gian 5 phút. Chưng cách thủy nhiều lần: Môi trường huyết thanh hay những chất dễ biến tính với nhiệt độ. Áp dụng phương pháp chưng cách thủy nhiệt độ 70 80oC, mỗi lần đun 1 giờ và liên tiếp trong 3 ngày. Hơi nước lưu thông: Diệt trùng môi trường chứa chuối, nồng độ đường cao, dung dịch hóa học không chịu được nhiệt độ trên 100oC. Có thể dùng autoclave nhưng luôn mở khóa thoát hơi, như thế nhiệt độ không vượt quá 1000C. Đun 30 phút đến 1 giờ. Hơi nước bão hòa ápberculosis chết ở 62oC trong 30 phút. Phép diệt trùng này chỉ diệt tế bào sinh dưỡng gây bệnh, không diệt bào tử và vi trùng hoại sinh. Mục đích: giữ hương vị, phẩm chất của sản phẩm. Nước sôi: thêm 1% bicarbonate natri để tăng nhiệt độ, nước sôi chỉ diệt tế bào sinh dưỡng. Thời gian 5 phút. Chưng cách thủy nhiều lần: Môi trường huyết thanh hay những chất dễ biến tính với nhiệt độ. Áp dụng phương pháp chưng cách thủy nhiệt độ 70 80oC, mỗi lần đun 1 giờ và liên tiếp trong 3 ngày. Hơi nước lưu thông: Diệt trùng môi trường chứa chuối, nồng độ đường cao, dung dịch hóa học không chịu được nhiệt độ trên 100oC. Có thể dùng autoclave nhưng luôn mở khóa thoát hơi, như thế nhiệt độ không vượt quá 1000C. Đun 30 phút đến 1 giờ. Hơi nước bão hòa áp

BÀI 1 DỤNG CỤ, THIẾT BỊ, CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG VI SINH

- Dây cấy thẳng: dùng cấy sâu hoặc ly trích VSV trên môi trường đặc

- Dây cấy vòng: dùng cấy ria VSV trên môi trường thạch hoặc phân lập VSV trong môi trường lỏng hoặc môi trường đặc

- Dây cấy móc: dùng cấy nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn

- Tủ ấm: ấp VSV hoặc theo dõi sự sinh trưởng của VSV theo nhiệt độ

- Lò Pasteur

- Lò hấp (autoclave)

- Nồi chưng cách thủy

II Các phương pháp khử trùng và phòng vô trùng

1 Định nghĩa: một vật phẩm được coi là vô trùng khi không còn mang một mầm VSV nào

nữa Diệt trùng bằng phương pháp vật lý hoặc hóa học

- Điểm chết bởi nhiệt: là nhiệt độ thấp nhất để giết chết VSV trong 10 phút

- Thời gian ngắn nhất để giết chết VSV ở một nhiệt độ thấp nhất

 Có thể diệt trùng bằng nhiệt khô, nhiệt ẩm

 Nhiệt khô (lò Pasteur hoặc tủ sấy):

- Làm khô vi trùng và oxy hóa các cấu tử của chúng

- Khử dùng dụng cụ kim loại hay thủy tinh

- Khi dùng tủ sấy:

 Nhiệt độ lò sấy có thể lên đến 180o

C

 Điều chỉnh nhiệt độ lên từ từ 180o

C trong 30 phút hoặc 160oC trong 2 giờ Tắt lò, để nguội dưới 80oC mới được mở cửa tủ

- Hơ trên lửa: dây cấy, kéo, kẹp, …, có thể nhúng vào ancol rồi đốt, làm nhiều lần

Nhiệt độ (oC) Thời gian (phút) Nhiệt độ (oC) Thời gian (phút)

- Phép hấp Pasteur: Căn cứ trên thời gian và nhiệt độ diệt trùng Mycobacterium

tuberculosis chết ở 62oC trong 30 phút Phép diệt trùng này chỉ diệt tế bào sinh dưỡng gây bệnh, không diệt bào tử và vi trùng hoại sinh Mục đích: giữ hương vị, phẩm chất của sản phẩm

- Nước sôi: thêm 1% bicarbonate natri để tăng nhiệt độ, nước sôi chỉ diệt tế bào sinh

dưỡng Thời gian 5 phút

- Chưng cách thủy nhiều lần: Môi trường huyết thanh hay những chất dễ biến tính

với nhiệt độ Áp dụng phương pháp chưng cách thủy nhiệt độ 70 -80oC, mỗi lần đun

1 giờ và liên tiếp trong 3 ngày

- Hơi nước lưu thông: Diệt trùng môi trường chứa chuối, nồng độ đường cao, dung

dịch hóa học không chịu được nhiệt độ trên 100oC Có thể dùng autoclave nhưng luôn mở khóa thoát hơi, như thế nhiệt độ không vượt quá 1000C Đun 30 phút đến 1 giờ

- Hơi nước bão hòa áp suất cao (autoclave)

 Tia tử ngoại: tia UV, chỉ diệt trùng bề mặt

 Tia âm cực: có thể diệt trùng các dụng cụ đã bao gói, thực phẩm, thuốc, …

d ÂM BA và SÓNG SIÊU ÂM:

 Cường độ lớn và thời gian vừa đủ sẽ làm vỡ màng tế bào và nội chất VSV sẽ chảy ra Dùng

kĩ thuật này chủ yếu là phá vỡ tế bào hơn là diệt trùng

e PHÒNG VÔ TRÙNG (PHÒNG CẤY)

 Đảm bảo vô trùng, các đèn tử ngoại được mở liên tục Đèn chỉ tắt trước khi cấy 1 giờ

 Phòng có các dụng cụ như chổi, giẻ lau riêng và thường xuyên khử trùng Nguyên tắc chung của phòng vô trùng là khi cấy thì bầu không khí trong sạch và hạn chế sự hiện diện của VSV cũng như bào tử của chúng

- Kiểm soát sự vô trùng: để 370C trong 24 giờ

3 Diệt trùng bằng phương pháp hóa học:

Phân loại diệt trùng bằng phương pháp hóa học dựa trên các đặc điểm:

- Tính chất của vật cần sát trùng, thuốc sát trùng dụng cụ không thể dùng cho da

- Loại VSV cần khử Một chất diệt trùng mạnh có thể là một chất diệt nấm yếu Một chất diệt siêu vi trùng có thể không tác dụng với nấm

- Cần ấn định rõ các điều kiện tổng quát như nhiệt độ, pH, thời gian, nồng độ

 Dung dịch Phenol 2 – 5%: phun trong phòng để tẩy trùng, không được tiếp xúc trực tiếp

với da Bào tử và siêu vi trùng đối kháng mạnh hơn các tế bào sinh dưỡng, tính sát trùng giảm khi ở nhiệt độ thấp và sự hiện diện của savon

 Ancol etylic 70 – 80%: sát trùng ngoài da, tác động đông kết protein

 Iode: tác dụng lên hầu hết các loại vi trùng, có thể diệt nấm và siêu vi trùng

 Chlor và hợp chất chlor: tẩy uế nước, sàn nhà

 Dung dịch AgNO 3 0,1%: tác dụng lên hầu hết vi trùng

 Dung dịch CuSO 4: tác dụng lên mốc hơn là vi trùng, dùng sát trùng nước

 Phẩm màu: một số phẩm màu ngăn chặn sự tăng trưởng của vi khuẩn Gram âm

- SV quan sát các thiết bị và dụng cụ trên

- Làm nút ống nghiệm, nút erlen bằng gòn không thấm nước

- Gói đĩa Petri

- Học cách sử dụng autoclave, tủ sấy, tủ cấy, tủ ủ

- Khử trùng dụng cụ, que cấy

BÀI 2 MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG

I Khái niệm chung

- Môi trường dinh dưỡng đặc hoặc lỏng

- Dùng để phân lập, nuôi cấy, bảo quản VSV

- Yêu cầu: môi trường dinh dưỡng phải chứa đủ các chất dinh dưỡng cần thiết đối với hoạt

động sống của từng loại VSV và đảm bảo đủ điều kiện lý, hóa thích hợp (pH thích hợp, thế oxy hóa khử thích) đối với sự trao đổi chất giữa tế bào VSV với môi trường, không chứa chất độc hại với VSV và hoàn toàn vô trùng

- Quá trình trao đổi chất ở VSV gồm: quá trình xây dựng và quá trình trao đổi năng lượng

- Để thiết lập các môi trường tổng hợp cần phải biết rõ nhu cầu của VSV về các chất dinh dưỡng và đặc điểm trao đổi chất chủ yếu của chúng Nồng độ chất dinh dưỡng đưa vào phải thích hợp để duy trì mức độ cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa môi trường và tế bào VSV

- Gọi tên môi trường dinh dưỡng bằng cách dựa vào tên người tìm (ví dụ môi trường Hansen) hoặc theo nguồn chất dinh dưỡng chính (ví dụ PGA: potato – dextrin– agar)

II Nguyên tắc

1 Tùy theo yêu cầu nghiên cứu hoặc học tập

Ví dụ: nuôi VSV để quan sát đặc điểm đại thể phải chuẩn bị môi trường đặc

2 Tùy theo nhu cầu dinh dưỡng của VSV

Xét một số ví dụ:

- Nghiên cứu chuyển hóa nitrogen trong môi trường ta cho những chất có nitrogen vào

- Nghiên cứu VSV phân giải cellulose ta cho giấy cellulose vào môi trường

- Trong điều kiện nghiên cứu tác dụng kích thích một số chất như biotin, ta cho biotin vào môi trường

- Muốn ức chế vi khuẩn trong môi trường ta cho vào môi trường chất kháng sinh Cho streptomycin vào môi trường Martin để phân lập nấm men, nấm mốc; streptomycin có tác dụng ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn

III Phân loại

1 Thành phần

- Môi trường tự nhiên: dùng môi trường có sẵn trong tự nhiên như sữa huyết thanh, khoai tây, cám, đường, … Ưu điểm: có sẵn Nhược điểm: không ổn định

- Môi trường tổng hợp: dùng hóa chất có thành phần hóa học xác định

- Môi trường bán tổng hợp: dùng các sản phẩm tự nhiên, còn thêm một số hóa chất

2 Tính chất lý học:

- Môi trường lỏng

- Môi trường đặc: chứa 1,5 – 2% agar hoặc 10 -20% gelatin

- Môi trường bán lỏng (bán đặc): 0,35 – 0,7% agar

- Môi trường chọn lọc: đảm bảo sự phát triển ưu thế của một loại hoặc một nhóm VSV

xác định Ví dụ: môi trường dùng để phân lập vi khuẩn phân giải cellulose, vi khuẩn nitrat hóa, vi khuẩn cố định đạm, …

- Môi trường kiểm định: cho phép phân biệt một số đặc điểm của một số VSV cần xác

định Thường bổ sung thêm một số chất chỉ thị màu hoặc một số chất giúp tạo ra những phản ứng màu để quan sát thấy Ví dụ: môi trường lên men đường, môi trường thạch chì, môi trường khử khả năng sinh indol, …

IV Cách làm môi trường

Cẩn thận, chính xác và theo thứ tự sau:

1 Pha chế

- Môi trường lỏng: cân, đong chính xác từng thành phần môi trường và hòa tan vào nước

- Môi trường thạch: cân, đong chính xác từng thành phần môi trường hòa tan vào nước

và agar, đun tan

2 Lọc: cần phải trong để dễ quan sát

1 Môi trường lỏng: lọc qua vải màn nhiều lớp, qua bông thấm, hoặc qua giấy lọc

2 Môi trường đặc: lọc qua vải màn 2 lớp trong điều kiện có phểu lọc nóng

3 Điều chỉnh pH môi trường: thường dùng HCl 10% hoặc NaOH 10% hoặc NH3 25%

hoặc một số chất khác Sử dụng máy đo pH để kiểm tra chính xác hoặc cũng có thể dùng chất chỉ thị màu

4 Phân phối môi trường vào dụng cụ

1.Erlen, bình cầu: phân phối 1/3 – ½ thể tích bình

2.Ống thạch nghiêng: ¼ chiều cao ống

3.Ống thạch đứng: 1/3 – 2/3 chiều cao ống

5 Khử trùng môi trường

Làm thạch nghiêng: sau khi khử trùng xong, đặt ống nghiệm trên giá gỗ hoặc que thủy

tinh hoặc giá kim loại … sao cho thạch trong ống nghiêng tới 2/3 chiều cao của ống, không được chạm nút bông

V Các loại môi trường

- Môi trường phân lập nấm men, nấm mốc (Martin): Glucose 10g, Pepton 5g, KH2PO4 1g, MgSO4 0.5g, Rose Bengal 1/3000: 100mL, thạch 20g, nước máy vừa đủ 1000mL, streptomycine 0.03g (chú ý cho Streptomycine trước khi đổ vào đĩa Petri)

- Môi trường nuôi cấy nấm men (Hansen): Dextrin 50g, pepton 10g, KH2PO4 3g, MgSO4 3-5g, Thạch 20g, nước cất vừa đủ 1000mL, pH 6

- Môi trường nuôi cấy nấm mốc (Czapek): saccharose 30g, NaNO3 3g, KH2PO4 0.4g, FeSO4 0.01g, nước cất vừa đủ 1000 mL, pH 6

- Môi trường phân lập vi khuẩn (Nutrient Agar – NA):

VI Thực hành:

SV điều chế môi trường cần dùng cho bài học tiếp theo

BÀI 3 PHÂN LẬP VI SINH VẬT THUẦN KHIẾT

Để nghiên cứu hình thái, sinh lý, sinh hóa của VSV cần phải sử dụng dạng VSV thuần khiết.VSV thuần khiết là giống VSV được tạo ra từ một tế bào ban đầu.Quá trình phân lập gồm 3 bước:

1 Tạo ra các khuẩn lạc riêng lẻ từ một quần thể VSV trong tự nhiên (đất, nước, không khí, mẫu vật, bệnh phẩm, …)

2 Phân lập VSV thuần khiết

3 Kiểm tra độ thuần khiết

4 Tạo ra các tế bào riêng lẻ trên môi trường phân lập

5 Pha loãng mẫu vật cần phân lập

6 Cấy mẫu pha loãng trên môi trường đặc trưng cho một nhóm VSV xác định

1) Phân lập trên môi trường đặc hiệu

1.1) VSV hiếu khí hoặc hiếu khí tùy ý

- Dùng phương pháp cấy ria trên mặt thạch đĩa Petri

- Ủ VSV ở nhiệt độ thích hợp trong khoảng 24 giờ Có thể nhận được những khuẩn lạc riêng lẻ

- Sau đó, dùng paraffin trám lại, ủ ở nhiệt độ thích hợp.Sau khi vi khuẩn phát triển, dùng que cấy cắt môi trường, lấy những khuẩn lạc riêng lẻ cho vào môi trường lỏng thích hợp

2) Kiểm tra độ tinh khiết

Bằng mắt, bằng kính hiển vi, bằng cách cấy vào môi trường thạch trong đĩa Petri

Thực hành:

Phân lập VSV tinh khiết từ ống hỗn hợp VSV

BÀI 4 CẤY VI KHUẨN

I Định nghĩa

Cấy là sự chuyển vi khuẩn từ môi trường trong đó chúng đang sống trong môi trường mới

để chúng có thể tiếp tục phát triển trong điều kiện thuận lợi nhất

II Mục đích:

1 Bảo tồn vi khuẩn nuôi thuần khiết

2 Ly trích vi khuẩn trong thiên nhiên

3 Nghiên cứu tính chất sinh học

III Dụng cụ

1 Để cấy

- Dây cấy: dây cấy thẳng, dây cấy vòng, dây cấy dẹp và có móc

- Pipette: dùng để cấy vi khuẩn từ môi trường lỏng sang môi trường lỏng

2 Chứa môi trường

- Đĩa Petri

- Ống nghiệm

- Bình cầu, bình tam giác

IV Điều kiện thuận lợi

Để tránh tạp nhiễm các khuẩn khác cần thực hiện ở nơi đã làm vô trùng

1 Trong phòng vô trùng

2 Hoặc chọn nơi: sạch, không bám bụi hay mầm vi khuẩn, kín gió, thực hiện cấy nhanh, gần đèn cồn khoảng 5 -10cm, cầm ống nghiệm nghiêng ngang thật nhiều, không trò chuyện khi làm việc, diệt trùng thật kỹ dụng cụ

- Ngồi đối diện đèn cồn

- Giá ống nghiệm đặt bên trái (thuận tay phải)

- Tất cả dụng cụ còn lại đặt bên phải (thuận tay phải)

2 Chuẩn bị ống môi trường để cấy

- Ghi tên vi khuẩn cần cấy và ghi ngày cấy

3 Thực hiện sự cấy

- Khử trùng đầu ống nghiệm khi mở nút bông

- Tay phải cầm dây cấy: đốt dây cấy cho đỏ

- Tay trái cầm ống nghiệm có vi khuẩn, tay phải nắm nút bông giữa ngón út và cạnh bàn tay, tay trái xoay nhẹ ống nghiệm

- Cho đầu dây cấy đã khử trùng vào và tiếp xúc thành ống, dùng ngón cái thăm dò khi nguội, chấm đầu dây vào nơi có vi khuẩn, rút dây cấy ra khử trùng miệng ống nghiệm và đóng nút bông lại

- Lấy ống môi trường, mở nút bông theo cách trên và khử trùng miệng ống nghiệm

- Thực hiện sự cấy

- Khử trùng dây cấy trước khi đặt xuống bàn

ĐỐI VỚI VI KHUẨN HIẾU KHÍ

1 Cấy vào môi trường lỏng

a) Từ môi trường lỏng sang lỏng: dùng pipette hoặc que cấy vòng

b) Từ môi trường đặc sang lỏng: dùng que cấy vòng

2 Cấy vào môi trường rắn

a) Thạch sâu: dùng dây cấy thẳng

b) Thạch nghiêng: dây cấy vòng

c) Cấy vào đĩa Petri: dây cấy vòng

ĐỐI VỚI VI KHUẨN KỴ KHÍ

- Nguyên tắc: loại bỏ oxy ra khỏi môi trường và giữ trạng thái yếm khí của môi trường, có

thể thêm vào môi trường cysteine Na thiolycollate có tính khử

- Phương pháp loại bỏ oxy:Đun sôi 20 phút để loại bỏ oxy

a) Cách cấy vào thạch tròn:

- Đun sôi thật lâu cho oxy bay hết tức là lúc không còn thấy bọt

- Để nguội đến 45 -500C

- Dùng dây cấy lấy một ít vi khuẩn cho vào đáy ống nghiệm

- Rút dây cấy ra theo đường xoắn ốc

- Làm nguội nhanh bằng cách cho vào nước lạnh

- Để tránh sự tiếp xúc với không khí, cho vào một ít paraffin hoặc Vaseline trên mặt

b) Nếu cấy vào đĩa Petri: phải ủ trong bình kỵ khí (đã loại bỏ oxy)

ĐỐI VỚI NẤM MEN

Giống như vi khuẩn hiếu khí

ĐỐI VỚI NẤM MỐC

Dùng dây cấy có móc để trích một ít khuẩn ty từ ống giống rồi cấy vào môi trường mới

VI Kết quả

Quan sát sau 24 giờ ủ ở nhiệt độ thích hợp

Môi trường lỏng: vi khuẩn sẽ phát triển làm đục môi trường

Môi trường đặc: vi khuẩn sẽ tạo những vân nối trên mặt thạch

Đối với nấm: thì sau 72 giờ thấy sợi mảnh phát triển từ vết cấy

Đối với vi khuẩn kỵ khí: sẽ phát triển dưới đáy ống nghiệm trong lớp thạch tròn

VII Thực hành

Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc): lỏng, nghiêng, sâu

BÀI 5 QUAN SÁT HÌNH THÁI ĐẠI THỂ, VI THỂ

I Quan sát đại thể

- Nuôi cấy các nhóm VSV trên môi trường thạch đĩa Petri

- Quan sát, mô tả hình dạng của khuẩn lạc, màu sắc tố, bào tử, môi trường, …

- Mở nắp hộp Petri đặt dưới kính lúp hoặc kính hiển vi (vật kính 10X) Quan sát rìa mép khuẩn lạc, cấu tạo sợi và cuống sinh bào tử

- Đối với nấm mốc hoặc xạ khuẩn phát triển hệ sợi Khi làm tiêu bản, khuẩn ty phải thấm ướt, đồng thời tách các sợi rời ra, sau đó mới đậy lá kính lên

- Dịch thấm ướt của xạ khuẩn là nước, của nấm mốc phải là lactophenol

b Phương pháp giọt treo

- Quan sát sự di động của vi khuẩn

- Nhỏ vi khuẩn vào lá kính, úp ngược lá kính vào phiến kính lõm, xung quanh vết lõm có lớp paraffin dán lá kính vào phiến kính Quan sát dưới kính hiển vi

c Phương pháp nhuộm màu ở trạng thái sống

- Vi khuẩn, nhuộm xanh methylene 0,001 %

- Với nấm mốc, dùng phẩm xanh methilen Loeffler

2 Quan sát trạng thái nhuộm màu (nhuộm đơn)

- Để nhìn rõ hơn về hình dạng và đo kích thước tế bào VSV

- Các bước tiến hành:

Làm vết bôi: dùng que cấy lấy vi khuẩn và tạo vết bôi trong giọt nước vô trùng Đối với xạ khuẩn hoặc nấm mốc: làm tiêu bản bằng cách nuôi trên phiến kính Để khô

Cố định mẫu Hơ nhẹ phía dưới phiến kính qua lửa đèn cồn 3 đến 4 lần hoặc nhỏ giọt cồn lên phiến kính rồi hơ đốt Mục đích: giết chết tế bào sống, gắn chặt tế bào lên phiến kính, làm cho tế bào dễ bắt màu hơn Với xạ khuẩn: cố định tế bào với dung dịch cacnua, rửa lại bằng cồn 70% Sau đó, rửa lại bằng nước

Nhuộm màu: nhỏ vài giọt thuốc nhuộm xanh metilen 0,1% hay fushin lên vết bôi

từ 1 -2 phút Rửa nước, làm khô

Quan sát dưới vật kính dầu

3 Nhuộm Gram:

- Nguyên tắc:Vi khuẩn Gram dương có khả năng giữ được phức chất tím kết tinh và iot khi xử lý bằng cồn Vi khuẩn Gram âm không có khả năng này

- Cách thực hiện:

Dàn mỏng vết bôi: lấy vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm tạo vết bôi trong giọt nước vô trùng trên phiến kính

Cố định nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn

Nhuộm tiêu bản bằng tím kết tinh trong 60s

Nhuộm lại lugol trong 60s

- Nguyên tắc: một số vi khuẩn có khả năng hình thành bào tử Bào tử vi khuẩn có khả

năng chịu điều kiện ngoại cảnh không thuận lợi Bào tử có thể có hình tròn hoặc hình bầu dục Bào tử nằm chính giữa tế bào hoặc một đầu tế bào Đường kính bào tử không lớn hơn đường kính của tế bào vi khuẩn thường thuộc Bacillus, đường kính lớn hơn thuộc Clostridium.Bào tử kháng sự nhuộm màu thông thường nhưng khi đã ăn màu thì sẽ không mất màu khi rửa

- Cách thực hiện (phương pháp schaeffer hoặc fulton):

Làm vết bôi và cố định trên ngọn lửa đèn cồn

Nhuộm lục malachite 5%, hơ nóng trong 10 phút

Rửa nước

Nhuộm safranin 0.5% hoặc fuchsin trong 60s

Rửa nước, làm khô

Soi kính với vật kính đều

Kết quả bào tử bắt màu xanh lục, tế bào vi khuẩn bắt màu hồng nhạt

5 Nhuộm vỏ nhày:

- Nguyên tắc: một số vi khuẩn có thể tạo một màng nhầy bên ngoài màng tế bào, gọi là vỏ

nhầy hoặc giáp mạc Azotobacter có vỏ nhày khá dày

- Phương pháp Klett:

Làm vết bôi, để khô tự nhiên trong không khí

Nhuộm xanh methylene klett, hơ nóng đến bốc hơi trong 1 phút Nếu thuốc nhuộm khô phải bổ sung

Rửa nước

Nhuộm fuchsin klett trong 5 giây

Rửa nước làm khô

Soi kính với vật kính dầu

Kết quả: vỏ nhày nhuộm màu hồng, tế bào vi khuẩn nhuộm màu xanh

- Phương pháp làm bản âm nền đen:

Fuchsin pha loãng gấp 2 lần

Mực tàu: nghiền nát một phần mực tàu với 9 phần nước, khử trùng 1210C/ 10 phút

Để lắng trong 2 tuần, lấy phần trên sử dụng

Cho vài giọt fuchsin và một giọt dịch nghiên cứu lên phiến kính trộn đều, để yên 2 – 3 phút, thêm vài giọt mực tàu, trộn đều và trải mỏng

Để vết bôi khô Soi màu

Kết quả: trên phiến kính có âm bản đen, vi khuẩn có màu hồng còn vỏ nhầy không

Làm vết bôi và để khô tự nhiên

Nhuộm cristal violet 2 phút

Tẩy màu bằng dung dịch CuSO4 2%

Để khô – soi kính

Kết quả: vỏ nhầy không màu Vi khuẩn màu tím

6 Vi sinh vật hiếu khí, kỵ khí (test enzyme catalase bằng H 2 O 2 )