ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ TRONG NHÓM BỆNH UNG THƯ

Sự phát triển khách quanỨng dụng Sinh học Phân tử trong thực hành lâm sàng... Sự phát triển khách quanỨng dụng Sinh học Phân tử trong thực hành lâm sàng Liệu pháp trúng đích targeted the

ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ

TRONG NHÓM BỆNH UNG THƯ

Ts Bs Nguyễn Hữu Ngọc Tuấn

At the body level

bert-firebert.blogspot.com medicaljournalonline.blogspot.com occupiedmedia.us

www.healthywomenlife.com medicalxpress.com

How does life begin?

The central dogma of biology

DNA PROTEIN

CH GLUCID

CH LIPID

CH HEMOGLOBIN

CH NĂNG LƯỢNG

CH PROTEIN

CH AXIT NUCLEIC

Relationship of molecules

Cancer = Cellular Pathology

Cancer = Genomic Pathology

NHU CẦU CỦA THỰC HÀNH LÂM

Sự phát triển khách quan

Ứng dụng Sinh học Phân tử trong thực hành lâm sàng

Sự phát triển khách quan

Ứng dụng Sinh học Phân tử trong thực hành lâm sàng

Liệu pháp trúng đích

(targeted therapy)

ứng với điều trị

Định hướng điều trị

Cổ tử cung

NHỮNG YẾU TỐ THEN CHỐT ĐỂ PHÁT TRIỂN SHPT PHỤC VỤ LÂM SÀNG TẠI VN

1- Yếu tố mang tính khoa học

▪ Giá trị: chẩn đoán, tiên lượng,…

▪ Được sử dụng trong các nghiên cứu lâm sàng

trị và các cơ quan quản lý uy tín.

▪ Guidelines: NCCN guidelines, ESMO guidelines,…

▪ C ơ quan quản lý: FDA, EMA,…

đặc biệt là hình ảnh học, đem lại kết quả kém

2- Yếu tố mang tính kinh tế

1 Thường nhận được yêu cầu từ phía lâm sàng

▪ Bệnh/tình trạng có tần suất lớn

▪ Bệnh nhân đủ khả năng chi trả cho can thiệp đặc thù dựa trên kết quả xét nghiệm

Thực tế cho phép nhận định

Khó khăn về khả năng khoa học kỹ thuật để triển khai một xét nghiệm shpt mới là không có / rất ít và có thể vượt qua nếu nhu cầu trong thực hành lâm sàng là có

Liệu pháp trúng đích được triển khai là động lực mạnh nhất để phát triển shpt.

Khả năng chi trả cho các liệu pháp trúng đích (bảo hiểm hoặc không) của bệnh nhân quyết định tốc độ phát triển các xét

nghiệm shpt

BREAST CANCER

HER2 is required for normal cell development

ERBB2 17q21

Overexpression of HER2 increases cellular

proliferation and migration

PI3K / Akt Ras / MEK / MAPK

HER1

HER4

HER3 HER1

HER2, human epidermal growth factor receptor 2; PI3K, phosphoinositide 3-kinase; MAPK, mitogen-activated protein kinase; STAT, signal transducer and activator of transcription; CoA, co-enzyme A; TF, tissue factor; CoR, co-repressor

Overexpression of HER2 in BC

IHC

0.0

Months from diagnosis

HER2 positive / HerceptinHER2 negative

HER2 positive / no HerceptinOverall survival possibility

Overexpression of HER2 is associated with reduced survival in patients with BC

• Herceptin improves the prognosis of patients with

HER2-positive metastatic breast cancer

Dawood et al 2008

• In a retrospective analysis of database records, women with HER2-positive disease who received Herceptin had

a 44% reduction in risk of death compared to women with HER2-negative disease (multivariate analysis

adjusted for patient and tumour characteristics: HR 0.56; 95% CI 0.45, 0.69; p<0.0001)

HR, hazard ratio; CI, confidence interval

Summary of HER2-testing methods

CISH, chromogenic ISH; SISH, silver-enhanced ISH

IHC Uses antibodies to detect HER2 protein expression

FISH Uses fluorescence DNA probe to detect HER2 gene amplification

Dual

SISH

Advantages and disadvantages of HER2-testing methodologies (1)

Performed in majority of pathology laboratoriesRelatively easy, quick and cheap;

can be automatedIHC-stained slides can be stored and re-assessed

Cell morphology can be seen insame section

Less affected by pre-analytical factors and handling than IHC

Score interpretation more quantitative than for IHCIdentifies HER2-positive tumours (gene amplified) within IHC 2+ cases

Automation available

Susceptible to variations in testing protocol

Score interpretation subjectiveand semi-quantitative

Costly (more expensive than IHC)Signal decays over time

Areas of invasive carcinoma may

be difficult to identifyFew pathologists and technologistsare trained in the methodologyand its interpretation

IHC

Method

FISH

Interpretation of IHC results

IHC 1+

Barely perceptible membrane staining in >10% of

tumour cells;

cells only stained in part of membrane

Images courtesy of Dako

IHC 0

No staining or membranestaining in <10% of tumour cells

ISH: HER2 gene-amplification detection

aImage courtesy of W Hanna;

bimage from Invitrogen; cimage from Ventana

Dual SISH / Red

Amplified HER2c

Dinitrophenol-labelled DNA and centromeric probes with chromogenic detection (silver and Alk-Phos Red)

The CEP17 probe identifies the centromere of chromosome 17 Polysomy means there are

>2 CEP17 signals (green) and in consequence >2 HER2 gene signals (orange) detected per nucleus

This can result in false-negative interpretation of ISH

Normal

2 CEP17

2 HER2 genes Gene amplification

2 CEP17

>2 HER2 genes Polysomy

>2 CEP17

>2 HER2 genes Gene amplification vs polysomya

aData are signals per nucleus Image courtesy of J Rüschoff and M Hofmann

Proteolytic digestion

FISH probe mix

Wash

Mount on slidesView with fluorescence microscope

HER2 FISH pharmDx™

HER2:CEP17 ratio >2 HER2 signals >4

Polysomic case Is recognised but can be scored as FISH negative

(due to scoring ratio), should be retested with IHC

Is not recognised

Is scored as FISH positive

Hofmann et al 2008

FISH interpretation

FISH negative (no amplification)Ratio of HER2 gene (orange) to CEP17 (green) signals is <2.0

FISH positiveRatio of orange to green signals is >2.0

Images courtesy of W Hanna using PathVysion

The HER2-testing algorithm

ISH, in situ hybridisation Hanna & Kwok 2006

• If primary ISH testing is used, patients whose tumours overexpress HER2 (ie IHC 3+) may not be identified due to the HER2:FISH ratio

being <2.0 (eg chromosome 17 polysomic cases, Hofmann et al 2007)

• ISH-detection mechanism can be fluorescent, chromogenic or silver

Eligible for Herceptin

Retest with ISH

Patient tumour sample

Eligible for Herceptin

Eligible for Herceptin

Concordance between IHC

and FISH is 75-100%

aFor IHC results, 3+ scores are considered positive; bstudy used different

antibodies for IHC; therefore, concordance data are presented per antibody

Only studies with >100 cases are shown

Equipment calibration

Laboratoryprocedures

Time offixation

Assayvalidation

Staff competenceType of antigen

retrievalTest reagents

Control materials

Scoring system

Wolff et al 2007

HER2-testing variation

Post-analytic Pre-analytic

Analytic

NON SMALL CELL LUNG CANCER

Lung cancer genetics – increasing complexity

After Dearden et al., Ann Oncol 2013.

19.2

26.1 6.4

6

3.3 1.3

Lung cancer genetics – increasing complexity

After Dearden et al., Ann Oncol 2013.

47.9

11.2 5.4

1.6 1.6 1.7 2.8

23.8

Incidence of individual mutations for asian NSCLC

(adenocarcinoma)

EGFRa KRASa EML4-ALK PTENa BRAFa PIK3CA ErbB2 Unknown

Sharma et al Nature Reviews Cancer 7, 169–181 (March 2007) | doi:10.1038/nrc2088

EGFR mutations

Nat Rev Cancer (2007)7:169

OPTIMAL trial

INTENDED USE

The cobas® EGFR Mutation Test v2 is a real-time PCR test for the in vitro

qualitative detection and identification of mutations in exons 18, 19, 20, and 21 of the

epidermal growth factor receptor (EGFR) gene in DNA derived from formalin-fixed

paraffin-embedded (FFPET) tumor tissue and/or plasmafrom non-small cell lung cancer

TARGET

MMX1 EX19Del; S768I; EX28/IC MMX2 L858R; T790M; EX28/IC MMX3 v.2 L861Q; G719A/C/S; EX20Ins; EX28/IC

42 MUTATIONS DETECTED

v2

The cobas® EGFR Mutation Test v2 for use with plasma is a real-time PCR test for thein

vitro qualitative and semi-quantitativemeasurement of mutations in exons 18,

19, 20, and 21 of the EGFR gene in human plasma The EGFR test is further indicated for

serial measurement of EGFR mutation statusas an aid in the management of

NSCLC cancer patients

FFPET specimens are processed using the cobas® DNA Sample Preparation Kit and plasma

specimens are processed using the cobas® cfDNA Sample Preparation Kit The

cobas® EGFR Mutation Test v2 and cobas z 480 analyzer are used for automated amplification

and detection

• New reporting tool for management of NSCLC patients

Semi Quantitative Index

What is a Semi Quantitative Index

(SQI)?

The SQI is a semi-quantitative measure of the

amount of mutant cfDNA in a sample that can be

used to measure the presence of EGFR mutations

over time

cobas ® EGFR Test v2 CE-IVD package insert

Linearity of mutant DNA in K2 EDTA Plasma: Ex19 Del cell line DNA

SI = 7.042 + 3.507 * Log Copies per mL

MUTANT cfDNA TREND OVER TIME

Direct sequencing of EGFR mutations

NEJM (2004)350:2129

Adenocarcinoma with positive staining for EGFR exon 21 L858R mutation-specific antibody (x200)

Cooper W A et al J Clin Pathol Published Online First: 11 June 2013

doi:10.1136/jclinpath-2013-201607

Copyright © by the BMJ Publishing Group Ltd & Association of Clinical Pathologists All rights reserved.

XÁC ĐỊNH MÔ UNG THƯ NGUYÊN PHÁT

Tại sao?

Các giải pháp hiện hữu gồm những gì?

SHPT tiếp cận

vấn đề ra sao?

Tương lai có thể

sẽ như thế nào?

Tại sao?

?

Thông tin về mô nguyên phát là quan trọng để có quyết định điều trị hiệu quả nhất

Các giải pháp hiện hữu gồm những gì?

• Hóa mô miễn dịch

• Những marker thông dụng: CK-7, CK-20, TTF1,…

• Không có 01 marker duy nhất đại diện để xác định cơ quan đặc hiệu

• Không có 01 bộ các marker được thống nhất để sử dụng

• Tính chủ quan trong nhận định kết quả

• Tỷ lệ thành công khi xác định mô nguyên phát lúc đã biết rõ mô nguyên phát: 50-65%

• Tỷ lệ thành công khi xác định mô nguyên phát trong CUP: 25%

Các giải pháp hiện hữu gồm những gì?

Các giải pháp hiện hữu gồm những gì?

• Thăm khám và theo dõi trên lâm sàng:

• Dựa trên kiểu di căn thường gặp của khối u

• Ổ di căn ở gan: ung thư hệ tiêu hóa, phổi, vú, hệ niệu dục

• Ổ di căn ở phổi: ung thư vú, hệ tiêu hóa, thận, tiền liệt tuyến

Với các phương pháp hiện tại, chỉ 20-30% CUP xác định được mô nguyên phát.

SHPT tiếp cận vấn đề ra sao?

• Đánh giá sự biểu hiện gen của rất

nhiều gen cùng một lúc (gene

expression profile)

• Được giới thiệu năm 2005

• Dựa trên cấp độ RNA

• So sánh đặc điểm biểu hiện gen của

CUP với các mẫu mô nguyên phát và di

căn của nhiều loại ung thư khác nhau

DNA

RNA

PROTEIN

SHPT tiếp cận vấn đề ra sao?

• Đánh giá sự biểu hiện gen của rất nhiều gen cùng

một lúc (gene expression profile)

Khi biết mẫu mô nguyên phát:

• Tỷ lệ xác định thành công: 83-89%

• Tỷ lệ chính xác ở nhóm tế bào kém/không biệt hóa: 91% (IHC 71%)

• Độ tương đồng với các phương pháp khác: 94%

SHPT tiếp cận vấn đề ra sao?

• Đánh giá sự methyl hóa ở nhiều vùng trên DNA

cùng một lúc (methylation profile)

• Dựa trên DNA

• Dễ thao tác hơn vì DNA bền

• So sánh đặc điểm methyl hóa của CUP với các mẫu mô nguyên phát và di căn của nhiều loại ung thư khác nhau

SHPT tiếp cận vấn đề ra sao?

• Đánh giá sự methyl hóa ở nhiều vùng trên DNA

cùng một lúc (methylation profile)

SHPT tiếp cận vấn đề ra sao?

• Đánh giá sự methyl hóa ở nhiều vùng trên DNA

cùng một lúc (methylation profile)

SHPT tiếp cận vấn đề ra sao?

SHPT cung cấp các công cụ mới để xác định được mô nguyên phát cho các CUP

Tương lai có thể sẽ như thế nào?

Ý nghĩa lâm sàng với lợi ích của bệnh nhân làm trung tâm

Kỹ thuật học phù hợp và thuận tiện trong thực hành thường quy

Độ chính xác cao Giá thành hợp lý

Tương lai có thể sẽ như thế nào?

Ý nghĩa lâm sàng với lợi ích của bệnh nhân làm trung tâm

Hướng dẫn điều trị trúng đích Cải thiện kết quả điều trị

Tương lai có thể sẽ như thế nào?

Kỹ thuật học phù hợp và thuận tiện trong thực hành thường quy

FFPE / sinh thiết lỏng Micro-array

Tương lai có thể sẽ như thế nào?

Độ chính xác cao

Sự phát triển bioinformatics Tiệm cận 100%

Tương lai có thể sẽ như thế nào?

SINH THIẾT LỎNG

THỰC TẠI

UNG THƯ HỌC LÂM SÀNG

THỰC TẠI

UNG THƯ HỌC LÂM SÀNG

GiẢI PHẪU

BỆNH

THỰC TẠI

UNG THƯ HỌC LÂM SÀNG

SINH THIẾT

MÔ

•TIÊU CHUẨN VÀNG CHẨN ĐOÁN

•CÔNG CỤ DUY NHẤT MÔ TẢ ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ CỦA CÁC KHỐI U

THỰC TẠI

SINH THIẾT

MÔ

MỘT SỐ VẤN ĐỀ CỦA SINH THIẾT MÔ

1 Sinh thiết mô không thể đại diện cho toàn bộ khối u

Ductal carcinoma of the breast

Normal liver

parenchyma

https://library.med.utah.edu/WebPath/LIVEHTML/LIVER035.html

Michael Davidson & Naureen Starling, 2016

Gastric HER2 testing

MỘT SỐ VẤN ĐỀ CỦA SINH THIẾT MÔ

2 Sinh thiết mô có tính xâm lấn cao và không phù hợp trong một số

tình huống thể trạng bệnh nhân yếu

https://medicalxpress.com/news/2014-12-laparoscopy-ventriculoperitoneal-shunt-placement.html

https://medical-dictionary.thefreedictionary.com/fiberoptic+bronchoscopy

MỘT SỐ VẤN ĐỀ CỦA SINH THIẾT MÔ

3 Sinh thiết mô không khả thi (diễn tiến di căn)

https://liverandpancreassurgeon.com/primary-liver-cancer-versus-secondary/

http://www.mdguidelines.com/cancer-ovary https://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/brain-tumor/symptoms-causes/syc-20350084

MỘT SỐ VẤN ĐỀ CỦA SINH THIẾT MÔ

4 Sinh thiết mô không thể thực hiện nhiều lần

• Theo dõi trong quá trình điều trị

Chẩn đoán Di căn Điều trị bước 1 Điều trị bước 2

TIÊU ĐIỂM QUAN TÂM

HÌNH THÁI HỌC

ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ

TIÊU ĐIỂM QUAN TÂM

HÌNH THÁI HỌC

VẬT LIỆU TỪ SINH THIẾT LỎNG

Axit nucleic lưu hành tự do

Axit nucleic trong túi ngoại tiết

Axit nucleic trong tế bào bướu lưu hành

Siravegna G et al., 2017

Tế bào bướu lưu hành

AXIT NUCLEIC TỪ SINH THIẾT LỎNG

RNA

(mRNA, miRNA)

DNA

ỨNG DỤNG CỦA AXIT NUCLEIC

SỰ BIỂU HIỆN

GEN ĐỘT BIẾN

ĐẶC ĐIỂM CẬN GEN

ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO BƯỚU

MÔ TẢ ĐẶC ĐIỂM

KHỐI U

Cấp độ tế bào (khả năng di chuyển, tốc độ sinh sản,…)

Cấp độ phân tử (đột biến, biểu hiện gen,…)

ỨNG DỤNG CỦA SINH THIẾT LỎNG

BỨC TRANH VỀ

ĐẶC ĐiỂM PHÂN TỬ

CHUNG CỦA KHỐI U

ỨNG DỤNG CỦA SINH THIẾT LỎNG

BỨC TRANH VỀ ĐẶC ĐiỂM PHÂN TỬ CHUNG CỦA KHỐI U

ÍT/KHÔNG XÂM LẤN

ỨNG DỤNG CỦA SINH THIẾT LỎNG

BỨC TRANH VỀ ĐẶC ĐiỂM PHÂN TỬ CHUNG CỦA KHỐI U

THEO DÕI ĐIỀU TRỊ

HƯỚNG DẪN ĐIỀU TRỊ

CHẨN ĐOÁN

ÍT/KHÔNG XÂM LẤN

ỨNG DỤNG CỦA SINH THIẾT LỎNG

EGFR

(NSCLC)

Marchetti et al., 2015