Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa chịu mặn ứng phó với biến đổi khí hậu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ HUẾ ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG CHỌN TẠO GIỐNG LÚA CHỊU MẶN ỨNG PHÓ VỚI BIẾN ĐỔI KHÍ HẬU Chuyên ngành: Di truyền

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THỊ HUẾ

ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG CHỌN TẠO GIỐNG LÚA CHỊU MẶN

ỨNG PHÓ VỚI BIẾN ĐỔI KHÍ HẬU

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội, 2013

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THỊ HUẾ

ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG CHỌN TẠO GIỐNG LÚA CHỊU MẶN

ỨNG PHÓ VỚI BIẾN ĐỔI KHÍ HẬU

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60420121

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Hùng Lĩnh

TS Đỗ Thị Phúc

Hà Nội, 2013

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực tập và hoàn thành luận văn, ngoài sự nỗ lực cố gắng của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của các cán bộ thuộc bộ môn Sinh học phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp

Tôi rất trân trọng các thầy cô trong bộ môn Di truyền, khoa Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN cùng lãnh đạo và các cán bộ thuộc Bộ môn Sinh học phân tử Viện Di truyền Nông Nghiệp đã tạo điều kiện giúp đỡ giúp tôi xây dựng và hoàn thành luận văn này

Đặc biệt tôi chân thành cảm ơn TS Lê Hùng Lĩnh, TS Đỗ Thị Phúc đã tận tình hướng dẫn trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn Qua đây tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc TS Tạ Hồng Lĩnh, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam đã giúp đỡ, chia sẻ kinh nghiệm và có nhiều ý kiến đóng góp để tôi hoàn thành luận văn này

Cuối cùng tôi xin tỏ lòng cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn

Trân trọng!

Hà Nội, ngày 18 tháng 12 năm 2013

Nguyễn Thị Huế

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Tác động của mực nước biển dâng cao đến khu vực Đông Á 7 Bảng 2 Độ mặn tại một số điểm trên 4 hệ thống sông lớn vùng ĐBSH 9 Bảng 3 Kịch bản nước biển dâng ở Việt Nam so với thời kỳ 1980 – 1999 11 Bảng 4 So sánh chỉ thị phân tử so với chỉ thị hình thái 23 Bảng 5 Thông tin về các chỉ thị phân tử trên NST1 31 Bảng 6 Đánh giá tiêu chuẩn cải tiến (SES) bằng quan sát mức hại của

mặn giai đoạn mạ

37

Bảng 7 Kết quả thanh lọc mặn sau 2 tuần của các giống 45

Bảng 9 Kết quả thanh lọc mặn sau 2 tuần của các dòng 55 Bảng 10 Một số đặc điểm nông học và hình thái của các dòng/giống lúa

tham gia thí nghiệm tại Giao Thủy, Nam Định, năm 2012

59

Bảng 11 Năng suất và các yếu tố cấu thanh năng suất của các dòng/giống

tham gia thí nghiệm tại Giao Thủy, Nam Định, năm 2012

62

Bảng 12 Một số đặc điểm nông học và hình thái của các dòng chịu mặn

trong thí nghiệm tại Giao Thủy, Nam Định trong năm 2013

65

Bảng 13 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng chịu

mặn trong thí nghiệm tại Giao Thủy, Nam Định năm 2013

69

Hình 3 Mức tăng nhiệt độ trung bình mùa đông vào cuối thế kỷ 21

theo kịch bản phát thải trung bình

8

Hình 4 Kịch bản nước biển dâng cho các khu vực ven biển Việt Nam 10 Hình 5 Vị trí các chỉ thị trên NST1 và Locus gen Saltol 30 Hình 6 Thí nghiệm thanh lọc mặn giai đoạn mạ trong điều kiện nhân

tạo

37

Hình 7 Kết quả kiểm tra DNA tổng số trên gel agarose 0,8% 47 Hình 8 Kết quả điện di với chỉ thị RM493 trên 20 cá thể BC1F1 49 Hình 9 Kết quả điện di với chỉ thị RM3412b trên 20 cá thể BC1F1 50 Hình 10 Kết quả điện di với chỉ thị RM493 trên 18 cá thể BC2F1 50 Hình 11 Kết quả điện di với chỉ thị RM3412b trên 18 cá thể BC2F1 51 Hình 12 Kết quả điện di với chỉ thị RM493 trên 22 cá thể BC3F1 51 Hình 13 Kết quả điện di với chỉ thị RM3412b trên 22 cá thể BC3F1 52 Hình 14 Kết quả điện di với chỉ thị RM493 trên 32 cá thể BC3F2 53 Hình 15 Kết quả điện di với chỉ thị RM3412b trên 32 cá thể BC3F2 53 Hình 16 Mạ được 14 ngày tuổi, bắt đầu thí nghiệm thanh lọc mặn 57

4 IRRI Viện nghiên cứu lúa Quốc tế

5 Bộ NN&PTNT Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn

6 ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long

7 TGST Thời gian sinh trưởng

9 SES Standard Evaluating Score

13 AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism

14 CTAB Cetyltrimethyl Amonium Bromide

15 EDTA Ethylenediaminetetra Acetic Acid

16 MAS Marker Assisted Selection

18 RAPD Random amplified polymorphism DNA

19 RFLP Restriction Fragment Length Polymorphisms

24 QTL Quantitative Trait Loci

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài: 1

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 2

3 Ý nghĩa của đề tài 2

3.1.Ý nghĩa khoa học 2

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài 2

4.1 Đối tượng nghiên cứu: 2

4.2 Phạm vi nghiên cứu: 3

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Ảnh hưởng của BĐKH đến sản xuất nông nghiệp Thế giới và Việt Nam 4

1.1.1 Ảnh hưởng của BĐKH đến sản xuất nông nghiệp trên Thế giới 4

1.1.2 Ảnh hưởng của BĐKH đến sản xuất nông nghiệp tại Việt Nam 8

1.2 Nghiên cứu các đặc tính sinh lý, sinh hóa liên quan đến chống chịu mặn ở cây lúa 11

1.2.1 Cơ chế chống chịu mặn 11

1.2.2.Di truyền tính chống chịu mặn 16

1.3.Chỉ thị phân tử và ứng dụng trong chọn tạo giống cây trồng 18

1.3.1 Khái niệm về chỉ thị phân tử 18

1.3.2 Các loại chỉ thị phân tử 19

1.3.3 Ứng dụng phương pháp MAS(Marker Assisted Selection) trong chọn tạo giống 22

1.4 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn trong và ngoài nước 25

1.4.1 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn ở nước ngoài 25

1.4.2 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn trong nước 27

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 Đối tượng nghiên cứu 30

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 30

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 32

2.2 Nội dung nghiên cứu 32

2.3 Phương pháp nghiên cứu 32

2.3.1 Phương pháp lai hữu tính giữa giống lúa cho và nhận gen 32

2.3.1.1 Chuẩn bị cây mẹ: 32

2.3.1.2 Khử đực 33

2.3.1.3 Chọn cây bố 33

2.3.1.4 Thụ phấn 33

2.3.2 Phương pháp chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử (MAS) 33

2.3.3 Phương pháp thử độ mặn nhân tạo 35

2.3.4 Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng 38

2.3.5 Phương pháp tách chiết DNA và phân tích di truyền chỉ thị phân tử 38

2.3.5.1 Phương pháp tách CTAB 38

2.3.5.2 Kỹ thuật PCR với các mồi SSR 40

2.3.5.3 Phương pháp điện di trên gel agarose 0,8% 41

2.3.5.4 Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 4,5% 42

2.3.5.5 Phương pháp xử lý số liệu 44

Chương 3: KẾT QUẢ 45

3.1 Kết quả đánh giá xác định vật liệu bố mẹ trong nghiên cứu 45

3.1.1 Kết quả đánh giá khả năng chịu mặn của các giống lúa trong điều kiện nhân tạo 45

3.1.2 Kết quả đánh giá xác định vật liệu bố mẹ trong nghiên cứu 45

3.2 Kết quả chọn tạo dòng lúa chịu mặn từ tổ hợp lai OM6976/FL478 47

3.2.1 Kết quả tách chiết DNA bằng phương pháp CTAB 47

3.2.2 Kết quả kiểm tra đa hình tại locus gen saltol giữa FL478 và OM6976 48

3.2.3 Kết quả lai tạo con lai F1 của tổ hợp lai OM6976 và FL478 48

3.2.4 Sử dụng chỉ thị phân tử xác định các cá thể mang locus gen chịu mặn trong quần thể BC1F1 49

3.2.5 Sử dụng chỉ thị phân tử xác định các cá thể mang locus gen chịu mặn trong quần thể BC2F1 50

3.2.6 Sử dụng chỉ thị phân tử xác định các cá thể mang locus gen chịu mặn trong quần thể BC3F1 51

3.2.7 Sử dụng chỉ thị phân tử xác định các cá thể mang locus gen chịu mặn trong

quần thể BC3F2 52

3.3 Đánh giá vật liệu sử dụng trong nghiên cứu và chọn tạo giống lúa chịu mặn 54

3.3.1 Đánh giá tính chịu mặn của các dòng lúa chọn tạo trong điều kiện nhân tạo 54

3.3.2 Đánh giá các đặc tính nông sinh học, yếu tố cấu thành năng suất và khả năng chịu mặn của các dòng được tạo ra mang QTL/Saltol trong vụ mùa 2012 58

3.3.2.1 Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của một số dòng chịu mặn tại Giao Thủy, Nam Định trong vụ mùa năm 2012 58

3.3.2.1 Đánh giá các yếu tố cấu thành năng suất của một số dòng chịu mặn tại Giao Thủy, Nam Định trong vụ mùa 2012 61

3.3.3 Đánh giá đặc tính nông sinh học, yếu tố cấu thành năng suất và khả năng chịu mặn của các dòng được tạo ra mang QTL/Saltol trong vụ xuân 2013 64

3.3.3.1 Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của một số dòng chịu mặn tại Giao Thủy, Nam Định trong vụ Xuân năm 2013 64

3.3.3.2 Đánh giá các yếu tố cấu thành năng suất của một số dòng chịu mặn tại Giao Thủy, Nam Định trong vụ Xuân năm 2013 68

KẾT LUẬN 74

1 Kết luận 74

2 Kiến nghị 74

TÀI LIỆU THAM KHẢO 75

Tài liệu tiếng Việt 75

Tài liệu tiếng Anh 76

PHỤ LỤC 82

Phụ lục 1: Danh sách hóa chất và thành phần các dung dịch 82

Phụ lục 2: Phân tích chỉ tiêu hình thái và các chỉ tiêu cấu thành năng suất các dòng chịu mặn trong vụ mùa 2012 tại Giao Thủy, Nam Định 87

Phụ lục 3: Phân tích chỉ tiêu hình thái và các chỉ tiêu cấu thành năng suất các dòng chịu mặn trong vụ xuân 2013 tại Giao Thủy, Nam Định 91

1

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây biến đổi khí hậu đang diễn ra ở quy mô toàn cầu

do các hoạt động của con người làm phát thải quá mức khí nhà kính vào cầu khí quyển Biến đổi khí hậu tác động nghiêm trọng đến sản xuất, đời sống và môi trường trên phạm vi toàn thế giới Theo báo cáo của trường Đại học Stanford, đến năm 2030 sản lượng lương thực ở Châu Á giảm 10% hoặc hơn, đặc biệt là lúa gạo, năng suất và sản lượng lúa luôn bị đe dọa bởi thiên tai, sâu bệnh và các yếu tố môi trường và đáng chú ý là hiện tượng đất nhiễm mặn Đất trồng trọt bị ảnh hưởng mặn ước tính khoảng 380 triệu ha, chiếm 1/3 diện tích đất trồng trên toàn thế giới Việt Nam là một nước với 90% dân số làm nông nghiệp và là nước xuất khẩu gạo đứng hàng thứ 2 trên thế giới sau Thái Lan, chiếm khoảng 50% tổng sản lượng gạo thương mại trên thế giới (số liệu tính đến năm 2009) Lúa gạo là nguồn thu ngoại tệ lớn nhất của nền nông nghiệp xuất khẩu Việt Nam và cũng là nguồn thức

ăn chính gần 90 triệu dân số trong nước Tuy nhiên, với đường bờ biển dài 3.620

km trải dài từ Bắc vào Nam, hàng năm những vùng trồng lúa ven biển chịu ảnh hưởng rất nhiều do sự xâm nhiễm mặn từ biển Theo báo cáo năm 2010 của Cục Trồng trọt (Bộ Nông nghiệp và PTNT), tại ĐBSCL, xâm nhiễm mặn đã ảnh hưởng đến 620.000 ha/1.545.000 ha lúa đông xuân 2009 -1010, chiếm 40% diện tích toàn vùng tại các tỉnh ven biển như Tiền Giang, Trà Vinh, Sóc Trăng, Bạc Liêu, Kiên Giang, Cà Mau và Bến Tre Trong đó, diện tích có nguy cơ bị xâm nhập mặn cao khoảng 100.000 ha/650.000 ha chiếm 16% diện tích canh tác lúa ở các tỉnh trên Trước những thách thức trên, việc chọn tạo những giống lúa có khả năng chịu mặn là hết sức cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn cao Do đó chúng tôi tiến hành

đề tài: “Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa chịu mặn ứng phó với biến đổi khí hậu”

2

Ứng dụng chỉ thị phân tử kết hợp với phương pháp chọn giống truyền thống để tạo giống lúa chịu mặn năng suất cao đáp ứng nhu cầu về giống cho sản xuất, đặc biệt là cho các vùng ven biển ĐBSH nơi chịu nhiều ảnh hưởng của BĐKH

3.1.Ý nghĩa khoa học

Ứng dụng phương pháp chọn giống bằng chỉ thị phân tử để chọn tạo giống lúa chịu mặn giúp chọn lọc nhanh và chính xác nguồn gen chịu mặn ở các thế hệ con lai, nhờ vậy có thể rút ngắn thời gian chọn lọc trên đồng ruộng, giảm số lượng cá thể gieo trồng hàng vụ, giảm diện tích gieo trồng, giảm lao động nặng nhọc, giảm chi phí cho những thí nghiệm đồng ruộng góp phần tăng đầu tư cho nghiên cứu trong phòng thí nghiệm một cách chuẩn mực

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Những thành công bước đầu trong việc ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn lọc các cá thể lai sẽ mở ra hướng ứng dụng rộng rãi trong công tác chọn tạo giống nói chung, không chỉ với đặc tính chịu mặn mà còn đối với nhiều đặc tính nông sinh học quý khác

- Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ là vật liệu khởi đầu rất tốt trong nghiên cứu

và chọn tạo giống lúa chịu mặn đặc biệt cho các vùng đồng bằng ven biển của Việt Nam nơi chịu ảnh hưởng nặng nề của biến đối khí hậu

- Bổ sung thêm cơ sở lý luận trong công tác chọn tạo giống lúa bằng chỉ thị phân tử nhưng vẫn kế thừa các phương pháp chọn giống truyền thống

4.1 Đối tượng nghiên cứu:

- Là các giống lúa thuần mang QTL/Saltol (gen chịu mặn) được nhập từ IRRI,

- Các chỉ thị phân tử có liên quan được sử dụng trong nghiên cứu

3

4.2 Phạm vi nghiên cứu:

Thí nghiệm đƣợc triển khai tại: Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thuộc Viện

Di truyền Nông nghiệp (Từ Liêm, Hà Nội); Trung tâm Chuyển giao Công nghệ và Khuyến nông (Thanh Trì, Hà Nội); huyện Giao Thuỷ, Nam Định

Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2010 đến năm 2013

4

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Ảnh hưởng của BĐKH đến sản xuất nông nghiệp Thế giới và Việt Nam

1.1.1 Ảnh hưởng của BĐKH đến sản xuất nông nghiệp trên Thế giới

Biến đổi khí hậu gây nên thiên tai trên phạm vi toàn cầu xảy ra với tần suất nhiều hơn, phức tạp hơn, cường độ tăng mạnh hơn làm trầm trọng thêm mức độ ảnh hưởng của thiên tai Sự tăng nhiệt độ không khí, và đại dương, sự tan băng trên diện rộng và qua đó là mức tăng mực nước biển trung bình toàn cầu gây ngập lụt, nhiễm mặn nguồn nước, ảnh hưởng đến mọi mặt của hệ thống kinh tế xã hội toàn cầu trong tương lai [6]

Theo các nhà khoa học về biến đổi khí hậu (BĐKH) toàn cầu và nước biển dâng cho thấy, đại dương đã nóng lên đáng kể từ cuối thập kỷ 1950 Các nghiên cứu từ số liệu quan trắc trên toàn cầu cho thấy, mực nước biển trung bình toàn cầu trong thời kỳ 1961-2003 đã dâng với tốc độ 1,8 0,5mm/năm, trong đó, đóng góp do giãn nở nhiệt khoảng 0,42 0,12mm/năm và tan băng khoảng 0,70 0,50mm/năm (IPCC, 2007), tốc độ mực nước biển trung bình toàn cầu dâng khoảng 1,8mm/năm trong năm 2009 (Chuch và White, 2009)

5

Hình 1: Diễn biến nhiệt độ ở quy mô toàn cầu và khu vực

(Nguồn: IPCC AR4 WG-I Report, 2007)

Hình 2: Xu thế biến động mực nước biển trung bình tại các trạm quan trắc

nước biển trên toàn cầu (Nguồn NOAA/2010) Tuy nhiên, mực nước biển thay đổi không đồng đều trên toàn bộ đại dương thế giới: Một số vùng tốc độ dâng có thể gấp một vài lần tốc độ dâng trung bình toàn cầu trong khi mực nước biển ở một số vùng khác lại có thể hạ thấp Xu thế tăng của mực nước trung bình xuất hiện hầu hết tại các trạm quan trắc trên toàn

6

cầu, mặc dù, vẫn xuất hiện một số khu vực có xu hướng giảm như ở bờ biển phía Đông của Nam Mỹ và khu vực ven biển phía Nam Alaska và Đông Bắc Canada, vùng biển Scandinavia Theo một số báo cáo của các nhà khoa học, trong thập kỷ vừa qua, mực nước biển dâng nhanh nhất ở vùng phía Tây Thái Bình Dương và phía Đông Ấn Độ Dương [5]

Biến đổi khí hậu đã ảnh hưởng trực tiếp đến ngành nông nghiệp, đây là ngành cung cấp lương thực chính cho con người đang phải đứng trước thách thức vô cùng

to lớn, những khu vực tập trung trồng lúa nhiều nhất trên thế giới lại có nguy cơ bị xâm nhiễm mặn khi mực nước biển dâng cao Do đó, cần phải có các giống lúa có khả năng chịu được ngập và độ mặn cao

Bên cạnh đó, theo báo cáo của FAO (2010), trên 800 triệu ha đất trên toàn thế giới bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi muối và khoảng 20% diện tích tưới (khoảng 45 triệu ha) được ước tính bị vấn đề xâm nhiễm mặn theo mức độ khác nhau Mặt

khác, ài liệu “Tác động của mực nước biển dâng cao đến các nước đang phát triển:

Phân tích so sánh” của Ngân hàng Thế giới (WB) thực hiện tháng 2/2007 đã đánh

giá các tác động của mực nước biển dâng cao đối với tất cả các nước đang phát triển bằng cách sử dụng bộ chỉ số đồng nhất các chỉ thị và với các kịch bản khác nhau về mực nước biển dâng cao WB đã chia 84 nước đang phát triển ở ven biển thành 5 nhóm theo 5 văn phòng khu vực của WB gồm: Mỹ Latin và Caribê (25 nước); Trung Đông và Bắc Phi (13 nước); Châu Phi cận Xahara (29 nước); Đông Á (13 nước); và Nam Á (4 nước) Các kết quả nghiên cứu cho thấy 0,31% (194.309 km2) vùng lãnh thổ của 84 nước đang phát triển bị ảnh hưởng khi mực nước biển dâng cao 1m Tỷ lệ bị ngập có thể tăng lên 1,2% theo kịch bản nước biển dâng cao 5m Cho dù tỷ lệ này nhỏ song sẽ có khoảng 56 triệu người (hay 1,28% dân số) ở

84 nước đang phát triển bị ảnh hưởng khi mực nước biển dâng cao 1m Với kịch bản nước biển dâng cao 1m, Bahamas (khu vực Mỹ latinh và Caribê) là nước bị ảnh hưởng nặng nhất xét về diện tích bị ảnh hưởng (12% tổng diện tích) Việt Nam đứng đầu danh sách 10 nước bị ảnh hưởng về dân số, khu vực đô thị và đất ngập nước (khoảng 10%) Nông nghiệp của Ai Cập bị ảnh hưởng nhiều nhất, gần 13%

7

28% diện tích đất ngập nước của Việt Nam, Jamaica và Belize có thể bị ảnh hưởng khi mực nước biển dâng cao 1m Xét về tất cả các chỉ thị, theo Báo cáo của WB, Việt Nam nằm trong danh sách 5 nước bị ảnh hưởng nhiều nhất cùng với Ai Cập, Suriname và Bahamas [13]

Bảng 1 Tác động của mực nước biển dâng cao đến khu vực Đông Á

Tổng GDP 7.577.206 triệu USD GDP (triệu

8

1.1.2 Ảnh hưởng của BĐKH đến sản xuất nông nghiệp tại Việt Nam

Biến đổi khí hậu (BĐKH) trên phạm vi toàn cầu đã làm cho thiên tai ở Việt Nam ngày càng gia tăng về số lượng, cường độ và mức độ ảnh hưởng, ảnh hưởng rất lớn đến các hoạt động sản xuất, phát triển kinh tế xã hội Lĩnh vực chịu tác động mạnh mẽ nhất do BĐKH là nông nghiệp, thuỷ lợi, thuỷ sản, diêm nghiệp, lâm nghiệp, an ninh lương thực; các vùng đồng bằng và dải ven biển do mực nước biển dâng, người nghèo ở vùng nông thôn đòi hỏi chúng ta phải có chương trình, kế hoạch hành động cụ thể nhằm ứng phó kịp thời

Tại các vùng ven biển Việt Nam sẽ phải chịu ảnh hưởng nhiều nhất do biến đổi khí hậu gây ra như bão, lũ lụt, xói lở bờ biển và xâm nhập mặn…và đây là nguyên nhân làm chậm tốc độ tăng trưởng kinh tế của khu vực, tăng tỷ lệ nghèo đói và làm giảm khả năng ứng phó đối với các thiên tai do biến đổi khí hậu gây ra Đối với nước ta, các tác động của biến đổi khí hậu ban đầu có thể nhận thấy được thông qua những thay đổi về khí hậu theo mùa ở các vùng miền khác nhau; lượng mưa và mùa mưa cũng sẽ thay đổi

Hình 3: Mức tăng nhiệt độ trung bình mùa đông vào cuối thế kỷ 21 theo kịch bản

phát thải trung bình

9

Tuy nhiên, thách thức lớn nhất lại là khi mực nước biển dâng cao Dải ven biển thuộc vùng Đồng bằng sông Cửu Long và Đồng bằng sông Hồng - Thái Bình, hai vùng kinh tế trọng điểm của cả nước, mật độ dân cư cao và tập trung, địa hình bằng phẳng và thấp (80% diện tích Đồng bằng sông Cửu Long và 30% diện tích Đồng bằng sông Hồng có độ cao dưới 2,5m so với mặt nước biển, là những vựa lúa lớn của cả nước) Những ảnh hưởng đầu tiên là gia tăng nguy cơ xâm nhập mặn, an ninh lương thực bị đe dọa, tình trạng ngập lụt trong mùa mưa bão, xói lở bờ biển, phá vỡ các hệ thống đê biển, hồ chứa nước và nhấn chìm những cánh đồng lúa ở vùng đồng bằng ven biển, gây tổn hại nhiều hơn đối với các khu vực đất ngập nước, rạn san hô, các hệ sinh thái và những ảnh hưởng quan trọng khác đến đời sống của người dân

Bảng 2 Độ mặn tại một số điểm trên 4 hệ thống sông lớn vùng Đồng bằng sông Hồng Tên

sông

Trạm khảo sát

Khoảng cách đến cửa sông

Ngày có độ mặn lớn nhất

Sđỉnh max (‰)

10

Hình 4: Kịch bản nước biển dâng cho các khu vực ven biển Việt Nam

Theo kịch bản nước biển dâng, nếu nước biển dâng cao 1m, khoảng 39% diện tích ĐBSCL, trên 10% diện tích ĐBSH và Quảng Ninh bị ảnh hưởng trực tiếp, riêng thành phố Hồ Chí Minh khoảng 7% và các tỉnh ven biển miền trung gần 9% dân số bị ảnh hưởng Chỉ tính riêng nguyên nhân do đất ngập cũng làm giảm sản lượng lương thực đến 12%, tức là khoảng 5 triệu tấn thóc

Theo báo cáo công bố tháng 2/2007, Ngân hàng Thế giới đề cập đến hiện tượng nước biển dâng cao và ảnh hưởng của nó trên 84 quốc gia đang phát triển và Việt Nam được xem là 1 trong 5 nước chịu ảnh hưởng nặng nề nhất Khi nước biển dâng cao 1m, Việt Nam bị thiệt hại nhiều nhất về số dân bị ảnh hưởng (gần 11%),

về giá trị GDP bị tổn thất (10%), về diện tích các đô thị bị ngập (10%) và về diện tích các vùng ngập nước, ngập mặn đã được quy hoạch mất đi Việt Nam cũng

Bảng 3: Kịch bản nước biển dâng ở Việt Nam so với thời kỳ 1980 – 1999

(Kịch bản BĐKH nước biển dâng cho Việt Nam,

nguồn Bộ Tài nguyên Môi trường 2001)

1.2 Nghiên cứu các đặc tính sinh lý, sinh hóa liên quan đến chống chịu mặn ở cây lúa

1.2.1 Cơ chế chống chịu mặn

Lúa là cây lương thực thích hợp nhất trên đất mặn mặc dù nó luôn được đánh giá là cây nhiễm trung bình với mặn vì đất mặn luôn ở dưới điều kiện bị ngập nước, những cây trồng khác không thể sinh trưởng được ngoại trừ lúa (Aslam và ctv., 1993) Nhiễm mặn gây tổn hại đến cây lúa do mất cân bằng thẩm thấu và tích

Ảnh hưởng của Na+ là phá vỡ và cản trở vai trò sinh học của tế bào chất Hơn nữa, sự mất cân bằng tỷ lệ Na-K trong cây sẽ làm giảm năng suất hạt Cây lúa chống chịu mặn bằng cơ chế ngăn chặn, giảm hấp thu Na+ và gia tăng hấp thu K+

để duy trì sự cân bằng Na-K tốt trong chồi Ion K có vai trò quan trọng làm kích hoạt enzyme và đóng mở khí khổng, tạo ra tính chống chịu mặn (Ponnamperuma, 1984) Tuy thế việc khám phá ra cơ chế và những tổn hại trên cây lúa do mặn thì rất phức tạp, ngay cả dưới những điều kiện ngoại cảnh kiểm soát được

Mặn gây hại trên cây trồng bắt đầu bằng triệu chứng giảm diện tích lá, những lá già nhất bắt đầu cuộn tròn và chết, theo đó là những lá già kế tiếp và cứ thế tiếp diễn Cuối cùng, những cây sống sót có những lá già bị mất, những lá non duy trì sự sống và xanh Trong điều kiện thiệt hại nhẹ, trọng lượng khô có xu hướng tăng lên trong một thời gian, sau đó giảm nghiêm trọng do giảm diện tích lá Trong điều kiện thiệt hại nặng hơn, trọng lượng khô của chồi và rễ suy giảm tương ứng với mức độ thiệt hại ( Gregorio và ctv, 1997)

Nhiều nghiên cứu còn cho thấy, cây lúa chống chịu mặn trong suốt thời gian nảy mầm, trở nên rất nhiễm ở giai đoạn mạ non (giai đoạn 2-3 lá), tiếp tục chống chịu trong giai đoạn sinh sản dinh dưỡng, kế đến nhiễm suốt trong giai đoạn thụ phấn và thụ tinh, cuối cùng trở nên chông chịu hơn trong giai đoạn chín (Ponnamperuma, 1984) Tuy thế, một nghiên cứu khác cho rằng, tại giai đoạn trổ, cây lúa không mẫn cảm với mặn (Aslam và ctv., 1993) Do đó, sinh trưởng và phát triển của cây lúa phải được chia ra nhiều giai đoạn để nghiên cứu một cách đầy đủ

về cơ chế chống chịu mặn của lúa

13

Cơ chế chống chịu mặn của cây lúa được biết thông qua nhiều công trình nghiên cứu rất nổi tiếng (Akbar và ctv 1972, Korkor và Abdel-Aal 1974, Maas và Hoffman 1977, Mori và ctv 1987) Mặn ảnh hưởng đến hoạt động sinh trưởng của cây lúa dưới những mức độ thiệt hại khác nhau ở từng giai đoạn sinh trưởng phát triển khác nhau (Maas và Hoffman 1977)

Yeo và Flower và cs (1984) đã tổng kết cơ chế chống chịu mặn của cây lúa theo từng nội dung như sau:

• Hiện tượng ngăn chặn muối - Cây không hấp thu một lượng muối dư thừa nhờ hiện tượng hấp thu có chọn lọc

• Hiện tượng tái hấp thu - Cây hấp thu một lượng muối thừa nhưng được tái hấp thu trong mô libe Na+ không chuyển vị đến chồi thân

• Chuyển vị từ rễ đến chồi - Tính trạng chống chịu mặn được phối hợp với một mức độ cao về điện phân ở rễ lúa, và mức độ thấp về điện phân ở chồi, làm cho sự chuyển vị Na+ trở nên ít hơn từ rễ đến chồi

• Hiện tượng ngăn cách từ lá đến lá - Lượng muối dư thừa được chuyển từ lá non sang lá già, muối được định vị tại lá già không có chức năng, không thể chuyển ngược lại

• Chống chịu ở mô - Cây hấp thu muối và được ngăn cách trong các không bào (vacuoles) của lá, làm giảm ảnh hưởng độc hại của muối đối với hoạt động sinh trưởng của cây

• Ảnh hưởng pha loãng - Cây hấp thu muối nhưng sẽ làm loãng nồng độ muối nhờ tăng cường tốc độ phát triển nhanh và gia tăng hàm lượng nước trong chồi

Lúa có cơ chế điều chỉnh hàm lượng muối đi vào chồi rất nhỏ, điều này có thể là do sự hấp thu chọn lọc rất hiệu quả đối với K+ Một khả năng khác là ion Na+

được hấp thu với hàm lượng lớn có ý nghĩa, nhưng được hấp thu lại trong nhựa xylem trong những phần của đầu rễ hoặc chồi và sau đó được dự trữ hoặc chuyển lại trở vào đất (Yeo và Flower, 1984) Theo Aslam và ctv (1993), khi cây lúa được đặt trong dung dịch NaCl, hàm lượng sodium, calcium, kẽm, phosphorus và

14

chioride đều gia tăng, trong khi hàm lượng potassium và magnesium đều giảm trong nhựa của chồi Khả năng chống chịu mặn của cây lúa cao hay thấp có quan hệ với hiệu quả ngăn chặn Na+ và Cl- vào cây So sánh khă năng hấp thu lựa chọn K+cho thấy rằng, đã có sự khác nhau lớn giữa các giống lúa về khả năng hấp thu chọn lọc K+ trong môi trường có nồng dộ 100 mol/m3 NaCl Trong đó, giống NIAB6 (chống chịu) và BG402-4 có khả năng hấp thu chọn lọc K+ tốt hơn của chồi và rễ so với Na+

Hai giống IR1561 (giống nhiễm) và Basmati 370 có sự lựa chọn thấp nhất trong tất cả những dòng so sánh

Tỷ lệ “K+/Na+” hay đúng hơn là hàm lượng K+ trong dịch của chồi lúa xác định tính chống chịu mặn của những dòng lúa khác nhau Người ta còn thấy vai trò của kẽm (Zn) trong chồi có liên quan đến tính chống chịu mặn của cây lúa Khi hàm lượng Zn trong chồi của giống NIAB6 cao, tính chống chịu mặn cao Muhammed và ctv.(1987) cũng đã chứng minh rằng, ở giống chống chịu mặn KS282, nồng độ của Zn cao hơn so với dòng nhiễm IR28 Vai trò của Zn tham gia vào tính chống chịu mặn, có thể là do Zn làm gia tăng hàm lượng N trong chồi Điều này dẫn tới việc sinh trưởng nhanh hơn và năng suất lúa cao hơn trong điều kiện mặn Vì vậy, ở những giống chống chịu mặn tốt có liên quan đến hiệu quả ngăn chặn các ion Na+

và Cl- , sự hấp thu ưu tiên và lựa chọn ion K+ và Zn2+ , để

có tỷ lệ K+/Na+ và Zn/P tốt hơn cho tính chống chịu và S(K+,Na+) tốt hơn (Aslam và ctv.,1993)

Akbar và cs, 1985[25] bằng những thí nghiệm đánh giá tính chống chịu mặn

ở giai đoạn mạ, trong dung dịch dinh dưỡng Yoshida có độ mặn EC=12dSm-1, các yếu tố môi trường được kiểm soát trong 19 ngày Kết quả cho thấy, tăng khả năng hấp thu K+

là duy trì tốt tỷ lệ cân bằng Na+/K+ trong chồi Tỷ lệ Na+/K+ này được kiểm soát bởi hiệu quả gen cộng và gen trội, hai nhóm gen này rất phức tạp và đi đến kết luận tính chống chịu mặn ở cây lúa được điều khiển bởi đa gen

Chính vì vậy, để chọn lọc những giống lúa chống chịu mặn tốt, cần phải hiểu

cơ chế chống chịu mặn của chúng, từ đó mới có thể cải tiến cấu trúc di truyền Khả

Những nghiên cứu cho thấy, có mối tương quan giữa số lượng muối được đi vào rễ cây lúa với nồng độ muối trên chồi Mối quan hệ này được xác định bởi mối quan hệ giữa tốc độ sinh trưởng của chồi với sự di chuyển thực của những ion ngoài rễ Giá trị này là số lượng thực của những ion được di chuyển tới chồi trên đơn vị trọng lượng của rễ trong một đơn vị thời gian (Flower và Yeo, 1984) Ví dụ

ở giống lúa Pokkali (giống chống chịu mặn), hàm lượng Na ở chồi trung bình thấp hơn của giống IR22 (giống nhiễm mặn) Bởi vì hàm lượng Na ở chồi của giống lúa Pokkali được pha loãng do sự sinh trưởng dinh dưỡng nhanh của nó Với cơ chế này, cây hấp thu muối nhưng sẽ làm loãng muối nhờ tăng cường tốc độ phát triển nhanh và gia tăng hàm lượng nước trong chồi (Flower, 1988)

Quan sát kiểu chất của lá lúa trong điều kiện nhiễm mặn cho thấy có sự khác nhau về hàm lượng Na+ trong những lá khác nhau, tại bất cứ thời gian nào Những

lá già bị chết trong khi những lá non hơn vẫn giữ màu xanh và sinh trưởng Đây là điểm đặc trưng nhất trong cơ chế chống chịu mặn ở họ hoà bản Cây lúa là một tập hợp gồm lá cây/đốt/bộ rễ hợp lại, những nhánh cây có khả năng sống độc lập được tách ra Dạng sinh trưởng này giúp cây một lá mầm tự huỷ những phần, bộ phận của cây dễ dàng hơn so với những cây hai lá mầm Vì vậy, rụng lá là một hiện tượng thông thường ở những cây một lá mầm chống chịu mặn Qua phân tích những lá lúa sống trong môi trường mặn cho thấy, có sự chênh lệch hàm lượng muối từ lá này tới lá khác, muối luôn được tích luỹ ở nồng độ cao trong những lá già, và hiện tượng chết ở những lá già là một cơ chế loại muối ra khỏi cơ thể của cây lúa ( Yeo và Flower, 1984)

Các gen chịu mặn trên cây lúa qua nhiều nghiên cứu cho thấy nhiều QTLs (Quantitative Trait Loci) ở lúa đã được nhận biết cho chịu mặn chủ yếu nằm ở nhiễm sắc thể số 1, có một số gen chính liên quan đến khả năng chịu mặn như:

- Một gen trong số đó là saltol

- QNa với hút Na

- QTL quyết định tính trạng hút Na+, nồng độ K+ và tỷ lệ Na /K ratio, SKC1 hoặc OsHKT8, RNTQ1, SDS1

- Vận chuyển Na+ và Cl- trong thân lúa và qST1

Các gen chịu mặn: Cũng có những nghiên cứu xác định một số lớn QTL trên các nhiễm sắc thể khác như: NST số 3, 4, 10 và 12 (Glenn, 1997) NST số 4, 6

và 9 (Flowerset al, 2000) NST số 4, 6 và 9 (Koyama et al, 2001) NST số 4, 6, 7

và 9 (Lin et al, 2004) NST số 2, 3, 8, và 9 (Ammar, 2004) NST số 3 (Lee et al, 2006) NST số 8 và 10 (Islam et al, 2006)

1.2.2.Di truyền tính chống chịu mặn

Phần lớn những tính trạng chống chịu với điều kiện bất lợi do môi trường là tính trạng di truyền số lượng Tính trạng số lượng được định nghĩa một cách kinh điển là tính trạng có phân bố liên tục (continuous distribution), tính trạng này được điều khiển bởi nhiều gen, mỗi gen có một ảnh hưởng nhỏ đối với tính trạng mục tiêu [20]

Đã có khá nhiều các công trình nghiên cứu sự di truyền của tính chống chịu mặn Theo Mishra và ctv, 1998: Tính trạng chống chịu mặn là một tính trạng di

đó loại bỏ ở ngay từ những thế hệ đầu, những dòng không đáp ứng được yêu cầu của người chọn giống Nghiên cứu di truyền số lượng tính chống chịu mặn cho thấy, cả hai ảnh hưởng hoạt động của gen cộng tính và gen không cộng tính đều có

ý nghĩa trong di truyền tính chống chịu mặn ( Gregorio và Senadrina,1993; Lee, 1995)

Teng và cs 1994 [63] bằng những thí nghiệm đánh giá tính chống chịu mặn tại giai đoạn mạ của cây lúa trong dung dịch dinh dưỡng Yoshida có độ mặn tương đối cao (EC= 12 dSm-1) trong môi trường kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh; cho thấy tính trạng chiều dài chồi, hàm lượng Na và K ở trong chồi, khối lượng khô của chồi và rễ thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa giống chống chịu và giống nhiễm, tính trạng này chủ yếu được điều khiển do hoạt động của nhóm gen cộng tính Hệ số di truyền tính chống chịu thông qua các tính trạng này rất thấp

Do ảnh hưởng rất lớn của môi trường bên ngoài, sự thể hiện di truyền là rất thấp trong các tính trạng Phương pháp chọn giống chống chịu mặn có thể dùng phương pháp trồng dồn có cải tiến hoặc có thể dùng phương pháp phân hạt đơn (single seed descent) sẽ là thích hợp trong chọn giống chịu mặn Bằng phương pháp lai diallel đầy đủ Gregorio cad Senadhina (1993) cho rằng, có thể tìm ra một số cặp lai tốt phục vụ cho chương trình ưu thế lai Nghiên cứu về di truyền số lượng tính chống chịu mặn thông qua lai diallel 6 x 6, năng suất thể hiện hoạt động của nhóm gen cộng tính không có ý nghĩa trong điều kiện bình thường, nhưng trở nên có ý nghĩa trong điều kiện xử lý mặn Trong một số giống lúa, ưu thế hoạt động của gen cộng tính đối với năng suất là điều kiện thuận lợi cho chọn lọc giống trong môi trường mặn

18

Trong phân tích di truyền số lượng thông qua lai diallel 9 x 9, tính chống chịu mặn được xem xét qua hàm lượng Na+

, K+ và tỷ lệ Na+/K+ và điểm chống chịu mặn cho thấy, tính trạng này được kiểm soát bởi hoạt động của cả hai nhóm gen không cộng tính và cộng tính Hai nhóm gen này không đối xứng, kiểm soát tính trạng chống chịu mặn và tỷ lệ Na+/K+ Riêng tính trạng thể hiện khả năng hấp thu

K+ được kiểm soát bằng gen đối xứng Nghiên cứu của Gregorio và Senadhira (1993) còn cho thấy, tính trạng tỷ lệ Na+

/K+ thấp còn thể hiện ảnh hưởng siêu trội

và được điều khiển bởi ít nhất hai nhóm gen trội, ảnh hưởng của môi trường rất có

ý nghĩa và hệ số di truyền thấp (19,18%) Từ đó, các tác giả đề nghị quần thể con lai phải thật lớn, và việc tuyển chọn nên được thực hiện ở các thế hệ sau cùng, trong điều kiện mặn được kiểm soát chặt chẽ và giảm thiểu thấp nhất ảnh hưởng biến động của môi trường

Nghiên cứu về các thông số di truyền Mishra và ctv (1996) cho thấy, chiều dài bông và khối lượng 1000 hạt chịu tác động rất ít bởi các yếu tố môi trường, nếu như chọn giống chống chịu mặn dựa vào hai tính trạng này là không có hiệu quả Khối lượng bông, số hạt chắc trên bông, chiều cao cây có hệ số path rất cao trong môi trường mặn Chính ba tính trạng này đóng góp phần lớn trong việc tăng năng suất lúa trong môi trường mặn, nhất là khối lượng bông và số hạt chắc trên bông Narayanan và ctv (1990) cho rằng, số hạt chắc trên bông, chiều dài bông là tính trạng chính đóng góp vào năng suất của các giống lúa trong những vùng đất bị nhiễm mặn

1.3.Chỉ thị phân tử và ứng dụng trong chọn tạo giống cây trồng

1.3.1 Khái niệm về chỉ thị phân tử

Các chỉ thị phân tử ADN là những chỉ thị dựa trên bản chất đa hình ADN

Nó cho phép xác định được các chỉ tiêu trực tiếp của kiểu gen thông qua việc xác định các trình tự nhất định của gen, hay các trình tự đặc hiệu liên kết chặt với các gen mang các tính trạng mong muốn Bằng việc sử dụng các chỉ tiêu phân tích trực tiếp kiểu gen, khắc phục ảnh hưởng của các yếu tố môi trường, theo dõi và

19

phát hiện được các gene mong muốn, sự biến đổi của chúng qua các thế hệ khi chưa có sự biểu hiện ra kiểu hình

1.3.2 Các loại chỉ thị phân tử

- Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

Loại chỉ thị này được tạo ra bằng cách nhân lên một cách chọn lọc DNA hệ gen đã được cắt bằng enzyme giới hạn bằng máy PCR Sản phẩm tạo ra sẽ cho biết sự đa hình chiều dài đoạn phân cắt giới hạn của phân tử DNA

Chỉ thị AFLP được sử dụng rộng rãi trong những nghiên cứu lập bản đồ gen

và xác định chỉ thị phân tử liên kết gen Kỹ thuật tạo ra loại chỉ thị này được gọi

là nhân bội chọn lọc những đoạn cắt giới hạn (Selective Restriction Fragment Amplification - SRFA)

Sử dụng phương pháp này có thể tạo ra một bộ tập hợp những đoạn cắt giới hạn nhờ PCR mà không cần biết trình tự của chúng, cho phép nhân đặc hiệu một

số lượng lớn những mảnh cắt giới hạn Mỗi bộ gồm tập hợp một số lượng lớn những mảnh cắt DNA có thể phân tích đồng thời phụ thuộc vào độ phân giải của

hệ thống phát hiện

Phân tích sản phẩm bằng điện di trên gel polyacrylamide, mỗi mẫu thí nghiệm sẽ cho từ 50-100 băng DNA khác nhau nhờ sử dụng đồng vị phóng xạ hoặc nhuộm bạc Đây là kỹ thuật có thể tạo ra nhiều chỉ thị di truyền nhất với số lượng mồi tối thiểu Hệ thống này có độ phân giải rất cao, lượng băng thu được

rõ nét Vì vậy, nó được ứng dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm hiện nay [2] Đây là một kỹ thuật thiết thực và đáng tin cậy bởi sự nghiêm ngặt của điều kiện phản ứng

Đối với mỗi tổ hợp mồi, kỹ thuật AFLP có thể tạo ra số lượng chỉ thị di truyền nhiều nhất so với các kỹ thuật khác Lượng DNA tổng số tiêu tốn cho kỹ thuật này lại rất ít Đây là phương pháp có hiệu quả cao trong nghiên cứu đa dạng di truyền, tìm chỉ thị liên kết và lập bản đồ gen Tuy nhiên chỉ thị này là di

20

truyền trội, không có khả năng phân biệt giữa thể đồng hợp và thể dị hợp, khi sử dụng giá thành tương đối cao

- Chỉ thị STS (Sequence tagged sites)

Loại chỉ thị này lần đầu tiên được đề xuất bởi Olson năm 1989 Chỉ thị này được đưa ra từ việc xác định trình tự hai đầu của mẫu dò RFLP, trên cơ sở đó người ta thiết kế mồi dùng cho phản ứng PCR STS là các trình tự xác định, có vị trí duy nhất trên bản đồ, có thể sử dụng như các chỉ thị cho lập bản đồ những gen quan trọng trên NST STS được ứng dụng như một chỉ thị DNA trong chọn giống vì đây là kỹ thuật thực hiện khá nhanh, thuận tiện, đặc hiệu cao, xác định trên NST và giá thành thấp trong phân tích di truyền

Như vậy, về bản chất, chỉ thị STS là chỉ thị RFLP nhưng lại được phát hiện bằng kỹ thuật PCR thay cho kỹ thuật lai DNA [2] Tuy nhiên, những ứng dụng của chị thị STS hiện nay vẫn còn hạn chế vì số lượng chỉ thị STS được phát hiện còn rất thấp và ít đa hình

- Chỉ thị RAPD (Random amplified polymorphism DNA)

Đây là loại chỉ thị di truyền được tạo ra trên cơ sở của phản ứng PCR, sử dụng loại mồi đơn lẻ, ngẫu nhiên dài 10 nucleotide ở nhiệt độ kết cặp thấp (khoảng 370C) và quá trình nhân bội ngẫu nhiên những đoạn DNA hệ gen Sản phẩm nhân bội có thể được phân tách bằng điện di trên gel agarose hoặc polyacrylamide và có thể quan sát được sau khi gel được nhuộm với các hóa chất đặc trưng

Tuy nhiên, chỉ thị này là loại di truyền trội, không phân biệt được thể đồng hợp và thể dị hợp Sự khác biệt giữa 2 cá thể có thể nhận biết bằng sự có mặt hoặc vắng mặt của các băng RAPD đặc trưng Đó là hạn chế của loại chỉ thị này

so với chỉ thị đồng trội AFLP Mặc dù vậy, chỉ thị này vẫn là một công cụ hữu hiệu trong việc lập bản đồ ở những dòng nhị bội, những dòng cận phối hay các quần thể lai trở lại Lợi thế của loại này là không cần biết những thông tin về

21

trình tự Chỉ thị RAPD còn có thể sử dụng trong việc điền vào chỗ trống trên bản

đồ phân tử RFLP, lập bản đồ gen kháng đạo ôn ở lúa…

Phương pháp này đơn giản, rẻ tiền, dễ sử dụng Tuy nhiên độ chính xác còn phụ thuộc vào điều kiện phản ứng, thiết bị vận hành (máy PCR), và các kỹ năng thực hành của cá nhân cán bộ nghiên cứu

- Chỉ thị SSRs (Simple sequence repeats hay Microsatellites)

Các chỉ thị phân tử DNA thường được gọi tên theo kỹ thuật tương ứng như: RAPD, AFLP, STS, SSR… Tùy thuộc vào từng nghiên cứu cụ thể, các nhà khoa học sẽ lựa chọn chỉ thị thích hợp để sử dụng

SSRs là những đoạn DNA lặp lại một cách có trật tự (theo trật tự đầu cuối), gồm những đơn vị có chiều dài từ 1-6 nucleotide lặp lại (hay kiểu lặp lại ngắn) được gọi là Microsatellites SSRs có trong khắp hệ gen của cơ thể Eukaryote khác như gia cầm, động vật có vú, cá và trên vài loại cây một lá mầm và hai lá mầm

Bản chất đa hình của Microsatellites có thể được tạo ra do sự nhân bội từ DNA tổng số của hệ gen nhờ việc sử dụng hai đoạn mồi bổ sung với trình tự gần

kề hai đầu đoạn lặp lại Giá trị của SSR ở chỗ nó sinh ra đa hình từ nhiều vùng tương ứng, bao phủ rộng khắp hệ gen và có bản chất đồng trội nên dễ dàng phát hiện bằng phản ứng PCR Những đoạn đa hình đơn giản này đã được ứng dụng trong việc lập bản đồ ở cả động vật và thực vật

Kỹ thuật SSR là kỹ thuật khuếch đại các đoạn lặp đơn giản, còn gọi là phương pháp vi vệ tính (Microsatellites) Các đoạn lặp lại gồm 2 đến 6 cặp nucleotide được lặp đi lặp lại nhiều lần trong hệ gen Đoạn SSR điển hình là các đoạn có trình tự gồm 3 cặp nucleotide , lặp lại từ 9-30 lần Các đoạn trình tự bảo thủ thường dùng trong kỹ thuật SSR là ATT, AT, CTT, CT… Các đoạn lặp lại

có kích thước dài ngắn khác nhau tùy theo từng loài, từng giống vật nuôi cây trồng [2]

22

SSR là kỹ thuật dựa trên chuỗi phản ứng PCR với mục tiêu đầu tiên là nhận dạng các trình tự lặp lại đơn giản Sau khi các trình tự lặp lại đơn giản này được nhận dạng, bước tiếp theo là xác định trình tự của DNA và thiết kế mồi Các trình tự liền kề và các trình tự lặp lại sẽ tạo nên SSR Các mồi SSR sau đó sẽ được sử dụng như với mồi RAPD

Như vậy có thể thấy chỉ thị SSR là một loại chỉ thị chính xác, hữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền, phân loại các giống vật nuôi, cây trồng khác nhau trong cùng một loài Do đó, SSR cung cấp cho nhà chọn giống công cụ hiệu quả để liên kết kiểu hình với sự đa dạng của kiểu gen, chọn lọc các tính trạng mong muốn Ngoài ra, SSR còn có thể phân định sự sai khác giữa các giống trong cùng một loài phụ do khả năng cho phép đánh giá mức độ alen của cùng một locus

Để xác định sự có mặt của gen Saltol trong quần thể BC1F1, BC2F1, BC3F1,

BC3F2 chúng tôi lựa chọn sử dụng chỉ thị SSRs liên kết với QTL/Saltol

1.3.3 Ứng dụng phương pháp MAS(Marker Assisted Selection) trong chọn tạo giống

Từ lâu các nhà chọn giống đã quan tâm đến các chỉ thị hình thái liên kết với một số tính trạng nông học quan trọng và sử dụng nó như một phương tiện hữu ích trong quy trình chọn tạo giống mới Thay vì phải đánh giá kiểu hình của cả quần thể nhằm phát hiện những cá thể chứa gen mong muốn, người ta chỉ cần đi tìm những cá thể riêng biệt mang các chỉ thị hình thái liên kết với các gen đó Ngày nay phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử là phương tiện hữu ích trợ giúp cho chọn giống truyền thống nhằm khắc phục những trở ngại mà công tác chọn giống truyền thống khó giải quyết Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ, chỉ thị phân tử đã giải phóng cho các nhà chọn giống khỏi một lượng lớn công việc khi phải chọn lọc, phát hiện một lượng ít ỏi các cá thể quan tâm trong rất nhiều cá thể khác nhờ việc xác định sự có mặt hay vắng mặt của chỉ thị phân tử liên kết những alen đặc hiệu mà không cần đánh giá kiểu

23

hình Phương pháp này có thể giúp chọn lọc những cá thể mang nhiều tổ hợp gen cần thiết và loại bỏ các nhiễu do các tương tác trong cùng alen hay giữa các alen khác nhau gây ra Các tương tác này thường không thể phát hiện được bằng các phân tích kiểu hình

Bảng 4 So sánh chỉ thị phân tử so với chỉ thị hình thái

Kiểu gen của

các locus

Có thể xác định tại bất kỳ giai đoạn nào và ở bất kỳ mức độ nào: tế bào, mô hay toàn cơ thể

Có thể phân biệt được trong những giai đoạn nhất định và thường ở mức độ toàn bộ cơ thể

Các allen Phần lớn là đồng trội, nên

cho phép phân biệt mọi kiểu gen ở bất kỳ thế hệ phân ly nào

Tương tác theo kiểu trội – lặn, nên bị hạn chế sử dụng trong nhiều tổ hợp lai

Hiệu ứng lấn át hoặc cộng tính rất hiếm gặp

Hiệu ứng lấn át làm sai lệch việc đánh giá các cá thể phân ly

ở trong cùng một quần thể phân

ly Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử giúp các nhà chọn giống có thể:

- Tìm kiếm phát hiện những biến dị di truyền trong số các cá thể giữa các

loài, giống

- Lai tạo để tạo ra các tổ hợp lai mới

24

- Chọn lọc chính xác các tổ hợp gen quan tâm ngay ở giai đoạn cây con,

nên tiết kiệm được thời gian, nguồn lực, tiền bạc

- Cải tiến giống cây trồng nhanh, hiệu quả do không phụ thuộc vào giai

đoạn sinh trưởng, không bị ảnh hưởng của môi trường

Chỉ thị phân tử làm tăng hiệu quả sàng lọc trong các chương trình chọn giống nhờ các ưu điểm sau:

- Khả năng chọn lọc ngay từ giai đoạn cây con đang nẩy mầm trong khi

nhiều dấu hiệu chỉ có thể sàng lọc và phát hiện khi chúng được biểu hiện ở những giai đoạn muộn hơn trong quá trình sống nếu chỉ sử dụng phương pháp chọn giống truyền thống (như chất lượng quả, hạt, tính bất dục đực, khả năng phản ứng với chu kỳ quang…)

- Khả năng sàng lọc những dấu hiệu mà việc đánh giá các đặc tính này khó

khăn, đắt tiền và tốn thời gian (như hình thái rễ, tính kháng hay nhiễm đối với dịch hại hoặc đối với những nòi, những bệnh đặc hiệu, hay tính chống chịu những điều kiện gây sốc sinh học như hạn, mặn, thiếu muối, các chất độc…)

- Khả năng phân biệt trạng thái đồng hợp hay dị hợp của nhiều locus trong

cùng một thế hệ mà không cần kiểm tra thế hệ sau

- Khả năng chọn lọc đồng thời nhiều đặc tính trong cùng một thời gian, do

đó có thể đưa vào cùng lúc nhiều gen có giá trị về mặt nông học (như đưa cùng lúc nhiều gen kháng dịch hại khác nhau)

Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đã đưa ra và phân tích rất chi tiết một vài mô hình MAS Theo một số mô hình thì chỉ cần tiến hành lai trở lại 4 thế hệ thay vì 6 thế hệ như trước kia, ngay cả khi quần thể chọn giống có kích thước nhỏ và các dữ liệu về chỉ thị phân tử bị hạn chế Trong một số trường hợp thuận lợi, các nhà chọn giống có thể chỉ cần 3 lần lai trở lại là có thể đạt được kết quả như ý

Hướng nghiên cứu chọn giống nhờ chỉ thị phân tử có thể nói là hướng đi đầy triển vọng khi gắn kết được chọn giống truyền thống và công nghệ sinh học hiện

25

đại Nhờ đó, quá trình lập bản đồ di truyền, quá trình chọn lọc tính trạng đơn gen, đa gen có giá trị cao về mặt di truyền và kinh tế

1.4 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn trong và ngoài nước

1.4.1 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn ở nước ngoài

1.4.1.1 Nghiên cứu theo phương pháp truyền thống

Trên Thế giới, việc chọn tạo giống lúa chịu mặn đáp ứng với biến đổi khí hậu đã được các nhà khoa học chú trọng nghiên cứu từ lâu

Đánh giá khả năng chịu mặn ở lúa: kiểu gen chịu ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng (K+

Tính chống chịu của lúa được điều khiển bởi đa gen [33] Khi đánh giá tính chống chịu mặn ở giai đoạn mạ, trong dung dịch dinh dưỡng Yoshida có độ mặn

EC = 12dSm-1, các yếu tố môi trường được kiểm soát trong 19 ngày Kết quả cho thấy, lúa tăng khả năng hấp thu K+ là duy trì tốt tỷ lệ cân bằng Na+/K+ trong chồi Tỷ lệ này được kiểm soát bởi hiệu quả của gen cộng sinh và gen trội Theo báo cáo kết quả nuôi cấy tế bào soma lúa để tạo ra các biến dị soma chống chịu mặn cho thấy, từ giống Pokkali đã thu được dòng biến dị soma TCCP226-2-49-B-B-3 là giống lúa cao sản, thấp cây, sinh trưởng mạnh, chống chịu mặn cao như Pokkali, gạo có màu trắng và phẩm chất gạo tốt hơn giống gốc, cho năng suất cao hơn Pokkali Giống lúa này được sử dụng nhiều trong các chương trình chọn tạo giống lúa mặn tại nhiều trung tâm nghiên cứu lúa trên thế giới [43]

26

Với nhóm Japonica, có ít dòng giống thể hiện tính kháng mặn hơn nhóm Indica Một số giống thuộc các nước ôn đới có tính chịu mặn khá như Harra (Tây Ban Nha), Agami (Ai Cập) và Daeyabyeo (Hàn Quốc) Các giống Japonica nhiệt đới giống như Moroberekan mang tính kháng mặn cao, có nguồn gốc ở Guinea nơi đất canh tác ảnh hưởng ngập mặn Giống này đã được nghiên cứu và sử dụng làm cây cho gen kháng mặn và lập bản đồ quần thể [44]

Cho đến thời điểm hiện tại đã có rất nhiều nghiên cứu đánh giá và xác định

về tính chịu mặn của các giống lúa bản địa và giống lúa cải tiến Các giống lúa địa phương có nguồn gốc từ các vùng duyên hải Đông Á có tính kháng mặn cao như Nona Bokra (Ấn Độ), Pokkali (Sri Lanka), Getu (Ấn Độ), Khao Seetha (Thái Lan)… các giống thể hiện tính kháng mặn trên đều thuộc nhóm Indica Theo số liệu cập nhật gần đây, một số dòng giống thuộc nhóm Indica có nguồn gốc từ Saudi Arabia, Hawashi thể hiện tính chịu mặn vượt trội cao hơn cả Pokkali và Nona Bokra [43]

1.4.1.2 Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử

Việc nghiên cứu, ứng dụng chỉ thị phân tử trong di truyền chọn giống cây trồng được rất nhiều phòng thí nghiệm trên Thế giới thực hiện và đạt được những thành tựu đáng kể

Các nhà khoa học tại trường Đại học Cornel (Mỹ) đã định vị hàng loạt các chỉ thị phân tử RFLP trên bản đồ di truyền ở lúa

Hiện nay có rất nhiều chỉ thị phân tử ở lúa đã được phát hiện và thiết kế, trong đó có nhiều chỉ thị liên kết với gen có ý nghĩa kinh tế quan trọng: khoảng

20 gen kháng bệnh bạc lá, 30 gen kháng bệnh đạo ôn, 12 gen kháng rầy nâu… Phần lớn các nghiên cứu sử dụng các quần thể Indica lai với Japonica (như IR64 x Azucena hoặc Co29 x Moroberekan), và lập bản đồ quần thể RIL, DH hoặc F2 Tuy nhiên, gần đây, việc sử dụng quần thể lai hồi giao thì quy tụ được QTLs chịu mặn nhanh hơn rất nhiều [44] Các tính trạng liên quan đến khả năng chịu mặn ở lúa thể hiện do các gen phức hợp kiểm soát Các QTL liên quan đã

27

được xác định trên NST số 1, 4, 6 và 7 Một số nghiên cứu khác phát hiện số ít QTL trên NST số 2, 3, 5, 9, 10 và 12 Tuy nhiên, hiện nay vẫn chưa tìm thấy QTL thể hiện tính chịu mặn ở NST số 8 và 11

Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ, việc ứng dụng các chỉ thị phân tử kết hợp với lai truyền thống và các lần lai trở lại để chọn tạo các dòng/giống lúa có khả năng chống chịu với các điều kiện bất ổn của môi trường như chống chịu mặn, chịu hạn, ngập chìm… có ý nghĩa to lớn đối với sản xuất nông nghiệp [41]

Ngoài ra có rất nhiều gen như gen thơm của giống Jasmin, gen điều khiển tính trạng hạt dài, gen điều khiển thời gian sinh trưởng và nhiều gen QTL có liên quan đến tính trạng khác của cây lúa như gen chịu mặn, khô hạn, ngập chìm, chịu độc tố nhôm, chịu thiếu phosphor… cũng đã được phát hiện và lập bản đồ

di truyền phân tử để đưa vào sử dụng chọn tạo giống

Do có thể xác định được kiểu gen tại bất kỳ giai đoạn nào, ở bất kỳ cơ quan (mô, cơ quan, toàn cơ thể…) nên việc chọn tạo giống bằng chỉ thị phân tử được

dự đoán là phương pháp chủ yếu trong việc lai tạo của thế kỷ 21 [42]

1.4.2 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn trong nước

1.4.2.1 Chọn giống theo phương pháp truyền thống

Giai đọan 2009-2013 Viện Lúa ĐBSCL đã thực hiện chọn tạo bộ giống lúa chịu mặn bước đầu đã xác định được 30 dòng lúa có triển vọng chịu mặn đó là những dòng kế thừa, được phát hiện chịu mặn qua nhiều lần thanh lọc trong phòng thí nghiệm và nhà lưới Các dòng này đang được trồng khảo nghiệm trên đồng ruộng tại các tỉnh: Sóc Trăng, Kiên Giang, Bến Tre, Bạc Liêu…

Trung tâm Thực nghiệm sinh học nông nghiệp công nghệ cao thuộc Viện Di

truyền nông nghiệp - đơn vị thực hiện đề tài “Nghiên cứu khảo nghiệm và tuyển

chọn giống lúa chịu mặn thích hợp cho vùng đất nhiễm mặn tỉnh Thái Bình”

(thực hiện trong hai năm từ tháng 1/2012- tháng 12/2013) vừa khảo nghiệm và

28

tuyển chọn thành công 3 giống lúa chịu mặn, chất lượng gạo ngon, thích nghi với đồng đất tỉnh Thái Bình, đó là các giống Hương ưu 98, DT 68 và H2 - DT Tại bộ môn Sinh học Phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp, đã tiến hành thực hiện nhiều đề tài về chọn tạo giống lúa, ứng phó với các điều kiện khô hạn, ngập chìm, hay chịu mặn… Kết quả đã chọn tạo thành công một số giống lúa có khả năng chịu mặn như Bắc Thơm 7, chịu ngập chìm như AS996…

1.4.2.1 Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử:

Việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong việc đánh giá nguồn gen và vật liệu phục vụ chọn tạo giống đã được triển khai và thu được một số thành tựu đáng kể Tại một số viện nghiên cứu như Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện lúa ĐBSCL, Viện Công nghệ sinh học… đã triển khai sử dụng chỉ thị phân tử để phát hiện gen kháng bệnh và lập bản đồ di truyền gen kháng bệnh bạc lá với cây lúa [3] Một số báo cáo về việc ứng dụng phương pháp này trong việc chọn tạo giống lúa kháng bạc lá và đã có một số dòng kháng có triển vọng [1]

Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đã bắt đầu sử dụng chỉ thị phân

tử để xác lập bản đồ di truyền và chuyển những gen kháng đạo ôn vào những giống có tính trạng ưu việt Ngoài ứng dụng nghiên cứu chỉ thị phân tử trong chọn giống kháng đạo ôn, còn có các dự án nghiên cứu kháng rầy nâu như:

- Sử dụng chỉ thị phân tử có thể xác định các chỉ thị DNA liên quan tới các

gen kháng bệnh (bạc lá lúa, gỉ sắt ở cà chua, lạc, hay bệnh xoăn lùn ở bông…)

Bằng việc ứng dụng STS để phân tích gen kháng rầy nâu từ loài hoang dại Oryza

australiensis vào giống lúa trồng Oryza sativa L (IR 31917-45-3-2), Nguyễn Thị

Lang và ctv (1999),Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long

- Lập bản đồ phân tử cho 3 gen kháng rầy nâu bphX, bph4, Bph6 và phát

hiện một loạt các chỉ thị SSR liên kết gần với các gen kháng đó, Lưu Thị Ngọc Huyền, Vũ Đức Quang, Bộ môn Sinh học phân tử, Viện Di truyền nông nghiệp,

- Một số nghiên cứu ứng dụng maker phân tử trong chọn giống lúa chịu

mặn tạo bằng kỹ thuật nuôi cấy túi phấn, hay sử dụng chỉ thị phân tử để phân

29

tích đa hình và phân tích dựa trên bản đồ QTL để chọn tạo giống lúa có khả năng chịu nóng… được PGS.TS Nguyễn Thị Lang (Viện Lúa ĐBSCL), Phạm Thị Xim (Trung tâm Giống tỉnh Kiên Giang), GS.TS Bùi Chí Bửu (Viện KHKT Nông nghiệp miền Nam) phối hợp thực hiện nghiên cứu

Ngoài ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa mới có khả năng chống chịu lại điều kiện bất lợi của môi trường, các giống cây trồng khác cũng được ứng dụng nghiên cứu: keo lá tràm, bông, ngô…

30

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

- Giống lúa FL478 là giống chịu mặn nhập từ Viện lúa Quốc tế IRRI Thông qua

dự án hợp tác: “Tạo giống lúa chịu ngập chìm và chịu mặn thích nghi với điều

kiện nước biển dâng cho các vùng bờ biển đồng bằng Việt Nam” do chính phủ

Đan Mạch tài trợ giai đoạn 2010-2012,

- Giống OM6976 là giống lúa năng suất cao tại ĐBSCL

- Giống lúa Pokkali: giống chống chịu có nguồn gốc từ Ấn Độ

- Giống lúa IR29: giống mẫn cảm từ Viện Lúa Quốc tế (IRRI)

- Các chỉ thị phân tử SSR liên kết chặt với gen Saltol trên nhiễm sắc thế số 1:

RM3412b, RM493, AP3206; RM10748; RM140; RM10825 (Niones JM, 2004), [57], thông tin chi tiết về chỉ thị phân tử được thể hiện qua bảng 6 hình 5

Hình 5 Vị trí các chỉ thị trên NST1 và Locus gen Saltol

Ghi chú: Bên trái là tên các chỉ thị phân tử, bên phải là vị trí trên NST1; Vùng đỏ QTL/Saltol; vùng gạch chéo: tái tổ hợp.)

o Máy li tâm lạnh (Eppedorf 5810 – R và 2K15 Sigma)

o Máy điện di ngang Bio-Rad GT (Anh), máy điện di đứng Bio-Rad

o Máy soi gel (T2201, sigma), mặt nạ chắn tia UV (Sigma)

o Thiết bị Votex (Genie 2 và MS1 Minishaker)

o Nồi hấp thanh trùng (05MBI-160T-3- Nga)

o Cân điện tử Sartorious (Đức)