CHUYÊN đề ỨNG DỤNG DI TRUYỀN học

Từ qui trình cơ bản trên ta thấy các qui trình khác nhau chủ yếu ở nguồn biến dị di truyền: NGUỒN NGUYÊN LIỆU CỦA CHỌN GIỐNG: Nguyên liệu cho quá trình chọn giống được tạo ra từ nguồn b

CHUYÊN ĐỀ: ỨNG DỤNG DI TRUYỀN HỌC

PHẦN I: MỞ ĐẦU

Chưa bao giờ mà những vấn đề về Di truyền học lại nóng như hiện nay kể cả trên các diễn đàn cũng như thực tế cuộc sống Đặc biệt những vấn đề về Ứng dụng của Di truyền học vào chọn

tạo giống cũng trở nên bức thiết hơn bao giờ hết Những nội dung di truyền học mà chúng ta đã biết

là thành tựu của cả thế giới trong một thời gian dài Suy cho cùng, những thành tựu này là để conngười hiểu rõ về thiên nhiên hơn, qua đó tận dụng tối đa nguồn lực tự nhiên để con người có đượccuộc sống tốt hơn Có nghĩa là phục vụ cho con người Từ mục đích đó, ta thấy, các thành tựu về ditruyền được chia thành 2 mảng:

- Phục vụ cho việc sản xuất ra những sản phẩm đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của con

người trong cuộc sống

- Phục vụ cho việc chăm sóc sức khỏe của con người, đảm bảo vốn gen của loài người được

trọn vẹn và hoàn hảo nhất (có thể)

Ứng dụng của di truyền học được thể hiện trong nhiều lĩnh vực khác nhau Trong đó bao

gồm các nguyên tắc ứng dụng và các thành tựu đã đạt được trong lĩnh vực Di truyền học ứng dụng.Các ứng dụng chủ yếu bao gồm:

 Tạo giống bằng nguồn biến dị tổ hợp

 Tạo giống bằng phương pháp gây đột biến

 Tạo giống bằng công nghệ tế bào

 Tạo giống bằng công nghệ gen

Trong chương trình sinh học phổ thông, số tiết về Ứng dụng di truyền còn hạn chế, kiến thức

giáo khoa sơ sài, chưa đi sâu khai thác bản chất vấn đề, các câu hỏi ở mức đơn giản và bài tập gầnnhư không có tài liệu đề cập nên học sinh thường gặp lung túng trong học và ôn luyện Xuất phát từ

thực tế trên chúng tôi lựa chọn chuyên đề: “Ứng dụng Di truyền học vào chọn giống”

Tuy nhiên do thời gian soạn thảo ngắn, trình độ hạn chế cho nên chuyên đề không tránh khỏi

sai sót, chúng tôi rất mong nhân được sự đóng góp nhiệt tình của các thầy cô giáo và các bạn đồngnghiệp để chuyên đề này được hoàn thiện hơn

PHẦN II: NỘI DUNG

A LÝ THUYẾT CƠ BẢN

I MỘT SỐ VẤN ĐỀ VỀ CHỌN GIỐNG

GIỐNG: là một tập hợp cá thể sinh vật do con người chọn tạo ra, có phản ứng như nhau trước

cùng 1 điều kiện ngoại cảnh, có những đặc điểm di truyền đặc trưng, chất lượng tốt, năng suất cao

và ổn định; thích hợp với điều kiện khí hậu, đất đai, kĩ thuật sản xuất nhất định

NHIỆM VỤ CỦA NGHÀNH CHỌN GIỐNG: là cải tiến các giống hiện có, tạo giống mới có

năng suất cao phẩm chất tốt nhằm đáp ứng yêu cầu ngày càng tăng của sản xuất và đời sống

Trong sản xuất nông nghiệp, giống là yếu tố căn bản nhất vì giống quyết định mức phản ứng (haygiới hạn năng suất của giống) Muốn có nhiều giống thỏa mãn những nhu cầu ngày càng cao và phứctạp của con người, lẽ dĩ nhiên phải cần tạo ra nhiều biến dị, làm nguồn nguyên liệu cho quá trình chọn

lọc giống, trong đó biến dị di truyền đương nhiên là nguồn nguyên liệu quan trọng nhất.

QUI TRÌNH TẠO GIỐNG MỚI: gồm 3 bước cơ bản:

- Tạo nguồn nguyên liệu (biến dị di truyền): đột biến, biến dị tổ hợp, ADN tái tổ hợp.

- Chọn lọc biến dị di truyền có kiểu gen mong muốn.

- Tạo dòng thuần, sau đó có thể dùng dòng thuần cho nhiều mục đích khác nhau.

Từ qui trình cơ bản trên ta thấy các qui trình khác nhau chủ yếu ở nguồn biến dị di truyền: NGUỒN NGUYÊN LIỆU CỦA CHỌN GIỐNG: Nguyên liệu cho quá trình chọn giống được tạo

ra từ nguồn biến dị tổ hợp, đột biến và ADN tái tổ hợp

- Nguồn gen tự nhiên: có nguồn gốc hoàn toàn từ tự nhiên có nguồn gốc từ các động thực vật

hoang dã

Đặc điểm của giống vật nuôi có nguồn gốc từ tự nhiên là những nhóm sinh vật được hình thành

ở một địa phương bất kì có khả năng thích nghi cao với điều kiện môi trường ở địa phương đó

Lợi ích: Có sẵn trong tự nhiên, không phải mất tiền của và công sứ c để tạo ra; thích nghi tốtvới môi trường sống của chúng

- Nguồn gen nhân tạo: do con ngưới chủ động tạo ra để phục vụ nhu cầu sản xuất và sinh hoạt

của con người

Được tạo ra thông qua quá trình đột biến và lai tạo

Lợi ích: Tạo ra nguồn gen phong phú, đa dạng và phù hợp với nhu cầu của con người

Quá trình lai tạo để tạo giống lợn Waton Mochibuta ở trang trại Global Pig Farm ở Nhật Bản

Hình Nguồn gen nhân tạo PHƯƠNG PHÁP TẠO NGUỒN NGUYÊN LIỆU CHO CHỌN GIỐNG:

Các phương pháp tạo nguồn nguyên liệu gồm :

+ Lai hữu tính: tạo ra vô số biến dị tổ hợp

+ Gây đột biến: tạo ra các đột biến di truyền

+ Công nghệ tế bào:

+ Công nghệ gen: tạo ra ADN tái tổ hợp

II CHỌN TẠO GIỐNG QUA LAI HỮU TÍNH

1 Tạo giống thuần dựa trên nguồn biến dị tổ hợp

– Tổ hợp gen mới luôn được hình thành trong sinh sản hữu tính tạo nên các biến dị tổ hợp vô

cùng phong phú, làm nguồn nguyên liệu cho quá trình chọn lọc

– Giống thuần chủng được định nghĩa là giống có đặc tính di truyền ổn định qua nhiều thế hệ

Suy rộng từ định nghĩa này, thì giống thuần chủng đơn giản là giống có kiểu gen đồng hợp.

1.1 Khái niệm biến dị tổ hợp

Biến di tổ hợp là biến dị xuất hiện do sự tổ hợp vật chất di truyền của bố mẹ trong quá trình sinh sản hữu tính

Biến di tổ hợp xuất hiện thông qua quá trình giao phối

Biến dị tổ hợp là nguồn nguyên liệu phong phú cho chọn giống và tiến hóa

1.2 Cơ sở tế bào học của biến dị tổ hợp

- Quá trình phát sinh giao tử: do sự phân li và tổ hợp của các cặp NST tương đồng trong giảm phân hình thành nhiều tổ hợp gen khác nhau trong giao tử đực và giao tử cái

- Quá trình thụ tinh: do sự kết hợp ngẫu nhiên giữa các giao tử đực và cái qua thụ tinh hình thành nhiều tổ hợp gen khác nhau ở thế hệ con cháu

- Hoán vị gen: do bắt chéo trao đổi đoạn ở kì đầu I giảm phân dẫn đến tái tổ hợp gen giữa từng cặp NST tương đồng

* Các gen nằm trên các NST khác nhau sẽ phân li độc lập với nhau, nên các tổ hợp gen mới luôn được hình thành trong sinh sản hữu tính.

1.3 Các bước tạo giống thuần dựa trên nguồn biến dị tổ hợp

Bước 1: Tạo các dòng thuần khác nhau về những đặc tính cũ.

Bước 2: Lai giống và chọn các tổ hợp gen mong muốn

Bước 3: Tự thụ hoặc giao phối gần để tạo ra các giống thuần chủng mới

Cần chú ý về các dòng thuần khác nhau trong bước 1 và những dòng thuần khác nhau trong bước 2 Nếu để ý, chúng ta sẽ thấy kết quả của phương pháp này là tạo ra những dòng thuần khác với dòng thuần của bố mẹ

1.4 Thành tựu giống thuần dựa trên nguồn biến dị tổ hợp:

Giống lúa VX83 là kết quả của phép lai giữa giống lúa X1(NN75-10): năng suất cao, chốngbệnh bạc lá, không kháng rầy, chất lượng gạo trung bình với giống lúa CN2 (IR 197446 – 11 – 33):năng suất trung bình, ngắn ngày, kháng rầy, chất lượng gạo cao

1.5 Ưu-Nhược điểm:

Ưu điểm: Đơn giản dễ thực hiện, không đòi hỏi kỹ thuật cao Có thể dự đoán được kết quả

dựa trên các QL di truyền

Nhược điểm:

- Mất nhiều thời gian và công sức để chọn lọc và đánh giá từng tổ hợp gen

- Khó duy trì những tổ hợp gen ở trạng thái thuần chủng vì sự phân li trong giảm phân vàquá trình đột biến thường xuyên xảy ra

2 Tạo giống lai có ưu thế lai cao:

2.1 Khái niệm ưu thế lai

Ưu thế lai là hiện tượng con lai có năng suất, sức chống chịu, khả năng sinh trường và phát triển vượt trội so với các dạng bố mẹ hoặc so với dạng trung bình của bố mẹ

Đặc điểm của ưu thế lai

Ưu thế lai thể hiện rõ nhất ở F1 sau đó giảm dần qua các thế hệ

Ưu thế lai cao nhất thể hiện ở lai khác dòng

2.2 Giả thuyết về cơ sở di truyền của hiện tượng ưu thế lai

Cơ sở di truyền của ưu thế lai: có nhiều giả thuyết khác nhau, trong đó giả thuyết siêu trội là

được chấp nhận hơn cả

Nội dung giả thuyết này: trạng thái dị hợp về nhiều cặp gen sẽ giúp con lai có kiểu hình

vượt trội so với bố mẹ ở trạng thái đồng hợp tử

Ví dụ: P: AAbbDDee (2 tính trạng trội) x aaBBddEE (2 tính trạng trội) → AaBbDdEe (4

tính trạng trội)  Kiểu gen dị hợp có sức sống, sức sinh trưởng phát triển ưu thế hơn hẳn dạng đồnghợp trội và đồng hợp lặn

Có thể tóm tắt giả thuyết này như sau AA < Aa > aa

Giải thích hiện tượng ưu thế lai bằng thuyết siêu trội:

- Mỗi alen của một gen thực hiện chức năng riêng của mình; ở trạng thái dị hợp thì chức năng của cả 2 gen đều được biểu hiện

- Mỗi alen của gen có khả năng tổng hợp riêng ở những môi trường khác nhau, do vậy kiểu gen dị hợp có mức phản ứng rộng hơn

- Cả 2 alen ở trạng thái đồng hợp sẽ tạo ra số lượng một chất nhất định quá ít hoặc quá nhiều

c òn ở trạng thái dị hợp tạo ra lượng tối ưu về chất này

- Qua lai giống, người ta thấy con lai sinh ra một chất mà không thấy ở cả bố và mẹ thuần chủng, do đó cơ thể mang gen dị hợp được chất này kích thích phát triển.

Ưu thế lai biểu hiện rõ nhất trong lai khác dòng vì: trong mỗi dòng thuần các gen đều ở

trạng thái đồng hợp tử, nên ở F1 đại bộ phận các gen đều ở trạng thái dị hợp, khi đó các gen trội (phần lớn quy định các tính trạng tốt) được biểu hiện, vì vậy F1 có ưu thế lai cao, có độ đồng đều cao về phẩm chất và năng suất

Ưu thế lai thể hiện rõ nhất ở F1 và giảm dần qua các thế hệ vì tỉ lệ kiểu gen dị hợp trong

quần thể cao nhất ở F1, các thế hệ sau tỉ lệ kiểu gen dị hợp giảm dần nên ưu thế lai cũng giảm dần

Thường không sử dụng con lai F1 làm giống vì: ưu thế lai sẽ giảm dần qua các thế hệ Để

sử dụng tốt, người ta thường dùng cách lai duy trì – sử dụng một cặp lai đã có hiệu quả để sản xuất qua nhiều thế hệ, sau đó thay thế hoàn toàn bằng một cặp lai khác

Khó khăn: Không phải lúc nào lai 2 dòng thuần khác nhau cũng cho ưu thế lai Điều này

phụ thuộc vào sự tương tác giữa các gen trong tổ hợp gen, sự tương tác giữa những gen cùng và khác alen, và cả vị trí của gen (trên nhiễm sắc thể thường hay giới tính, nằm trong nhân hay ngoài tếbào chất v.v…)

Khắc phục: phải lai nhiều tổ hợp lai khác nhau để tìm ra tổ hợp lai cho ưu thế lai cao nhất

2.3 Phương pháp tạo ưu thế lai

Lai khác dòng đơn: Tự thụ phấn liên tục qua 5-7 thế hệ để tạo ra các dòng thuần Lai 2

dòng thuần khác nhau sẽ được dạng ưu thế lai khác dòng A B C

Lai khác dòng kép: Nhiều khi lai khác dòng không cho ưu thế lai Nhưng khi dùng con lai

thuộc các dòng lai khác nhau cho lai với nhau lại cho ưu thế lai

Để tạo ra giống lai mới có đặc tính tốt của nhiều dòng thường dùng ghép lai khác dòng kép gồm nhiều dạng khởi đầu tham gia

Lai thuận và lai nghịch: để tìm khả năng gen đó nằm trên nhiễm sắc thể thường, nhiễm sắc

thể giới tính hay do gen nằm ngoài tế bào chất Ưu thế lai phụ thuộc vào cả đặc tính của tế bào chất

Vì vậy, phép lai thuận và lai nghịch cho hiệu quả ưu thế lai không giống nhau lai thuận và lai nghịch

để xác định xem hướng lai nào tạo ra cá thể lai có giá trị nhất

2.4 Biện pháp duy trì và củng cố ưu thế lai

Đối với cây trồng có thể sử dụng sinh sản sinh dưỡng thay thế cho sinh sản hữu tính

Ở vật nuôi, ưu thế lai được duy trì, củng cố bằng lai luân phiên, con lai tạo ra trong mỗi thế

hệ được lần lượt cho lai trở lại với dạng bố, mẹ ban đầu

2.5 Ứng dụng của ưu thế lai

Là phép lai giữa hai dòng thuần chủng khác nhau rồi dùng con lai F1 làm mục đích kinh tế (để làm sản phẩm) không làm giống

2.6 Ưu-Nhược điểm:

Ưu điểm: Nhanh chóng chọn được dạng F1 cho ƯTL cao

Nhược điểm:

- Tốn nhiều thời gian và công sức trong viếc xác định tổ hợp cho ƯTL

- UTL khó duy trì qua các thế hệ

III TẠO GIỐNG MỚI BẰNG PHƯƠNG PHÁP GÂY ĐỘT BIẾN

1 Khái niệm đột biến sinh học

- Đột biến là những biến đổi bất thường trong vật chất di truyền ở cấp độ phân tử (ADN, gen) hoặc cấp độ tế bào (nhiễm sắc thể), dẫn đến sự biến đổi đột ngột của một hoặc một số tính

- Đột biến là quá trình xảy ra đột ngột, riêng rẽ, ngẫu nhiên, không định hướng ở cơ thể sốngtrong điều kiện tự nhiên.

- Đa số là đột biến gen lặn và có hại, một số ít có lợi và có ý nghĩa rất lớn đối với quá trình tiến hóa và chọn giống

2 Phương pháp tạo đột biến

Tạo giống bằng phương pháp gây đột biến là phương pháp sử dụng các tác nhân đột biến

nhằm làm thay đổi vật liệu di truyền của sinh vật để phục vụ cho lợi ích con người Có 3 hướng:

- Tạo đột biến bằng việc sử dụng các tác nhân vật lí

- Tạo đột biến bằng các tác nhân hóa học

- Tạo giống bằng phương pháp sốc nhiệt

3 Cơ sở khoa học của chọn giống bằng phương pháp đột biến

- Mỗi một kiểu gen nhất định của một giống chỉ cho một năng suất nhất định Trong điều kiện nuôi trồng tối ưu thì thì mỗi giống chỉ cho một năng suất tối đa nhất định (mức phản ứng của kiểu gen)

- Để thu được năng cao hơn thì phải thay đổi vật chất di truyền của giống do đó ta sử dụng các tác nhân vật lí, hóa học tác động vào bộ máy di truyền để gây đột biến

4 Đối tượng áp dụng

- Vi sinh vật: Phương pháp tạo giống sinh vật bằng gây đột biến đặc biệt hiệu quả vì tốc độ

sinh sản của chúng rất nhanh nên chúng nhanh chóng tạo ra các dòng đột biến

- Thực vật: Phương pháp gây đột biến được áp dụng đối với hạt khô, hạt nảy mầm, hoặc

đỉnh sinh trưởng của thân, cành, hay hạt phấn, bầu nhụy của hoa

- Động vật: Phương pháp gây đột biến nhân tạo chỉ được sử dụng hạn chế ở một số nhóm

động vật bậc thấp, khó áp dụng cho các nhóm động vật bậc cao vì cơ quan sinh sản của chúng nằm sâu trong cơ thể nên rất khó xử lý Chúng phản ứng rất nhạy và dễ bị chết khi xử lý bằng các tác nhân lí hóa

5 Quy trình tạo giống mới bằng phương pháp gây đột biến: gồm 3 bước

Bước 1- Xử lí mẫu vật bằng tác nhân gây đột biến thích hợp.

Bước 2- Chọn lọc các thể đột biến có kiểu hình mong muốn.

Bước 3- Tạo dòng thuần chủng

5.1 Xử lí mẫu vật bằng tác nhân gây đột biến

Kích thích và iôn hóa các nguyên tử khi

chúng đi xuyên qua các mô sống Các

phân tử ADN, ARN trong tế bào chịu tác

động trực tiếp của các tia phóng xạ hoặc

chịu tác động gián tiếp của chúng qua quá

trình tác động lên các phân tử nước trong

tế bào (đặc biệt là các gốc OH- và

H2O2 sinh ra có tác dụng ôxi hóa rất

mạnh) làm thay đổi cấu trúc phân tử

ADN gây ra đột biến gen và đột biến

NST

Tác động vào hạt khô,

hạt nảy mầm, hoặc đỉnh sinh trưởng của thân, cành, hay hạt phấn, bầu nhụy của hoa gây ra đột

biến gen và đột biến NST

Chiếu xạ với cường

độ và liều lượng thích hợp lên đỉnh sinh trưởng của thân, cành hoặc hạtphấn, bầu nhụy, môthực vật nuôi cấy

Tia tử

ngoại

Không có khả năng xuyên sâu và ion hóa

các nguyên tử mà chỉ có khả năng kích

thích , nhưng khi được tế bào hấp thu nó

cũng gây ra đột biến gen và đột biến NST

Các tế bào vi sinh vật, bào tử hoặc hạt phấn ở thực vật để gây đột biến gen và đột biến NST

Nhiệt độ Tăng giảm nhiệt độ đột ngột (sốc nhiệt)

làm cơ chế nội cân bằng của cơ thể không

khởi động kịp gây chấn thương bộ máy di

Thực vật :

* Ngâm hạt khô hay hạt đang nảy mầm trong

dung dịch có nồng độ hóa chất thích hợp

* Tiêm dung dịch hóa chất vào bầu nhụy,

hoặc quấn bông có tẩm hóa chất vào điểm sinh

trưởng ở thân, chồi cây

*Quấn bông tẩm hóa chất vào đỉnh sinh trưởng của thân hoặc chồi

* Dùng hóa chất dạng hơi để phun

Động vật :Dùng hóa chất tác dụng lên tinh hoàn, buồng trứng

NMU Thay thế G –X thành X- G hoặc A-T

Acridin Gây đột biến mất hoặc thêm cặp Nu,

nếu được chèn vào mạch khuôn cũ gâyđột biến thêm cặp Nu

Cônsixin Rối loạn hình thành thoi vô sắc dẫn

đến rồi loạn phân li cặp nhiễm sắc thể

5.2 Chọn lọc các thể đột biến có kiểu hình mong muốn

Khi trong quần thể giống xuất hiện các đột biến, dựa vào những đặc điểm có thể nhận biết đểtách các cá thể mang đột biến có lợi ra khỏi quần thể giống

- Hướng tạo thể đa bội được chú trọng nhiều đối với các giống cây trồng thu hoạch chủ yếu

về thân, lá, củ như cây lấy gỗ, cây lấy sợi, cây rau

Ví dụ: Rau muống 4n có lá và thân to, sản lượng 30 tạ/ha Dương liễu 3n lớn mạnh, cho gỗ tốt, dưa hấu, nho tam bội không hạt; dâu tằm tứ bội

- Xử lý giống lúa Mộc Tuyền bằng tia gama tạo ra giống lúa MT1 chín sớm, cây thấp và cứng, chịu phân, chịu chua, năng suất tăng 15-25% Lai giống có chọn lọc giữa 12 dòng đột biến từ giống ngô M1 tạo thành giống ngô DT6 chín sớm, năng suất cao, hàm lượng prôtêin tăng 1,5%, tinh bột giảm 4%

- Táo gia lộc xử lí NMU → táo má hồng cho năng suất cao

Hình Đột biến thân lùn ở lúa

6.2 Trong chọn giống vi sinh vật

Tạo được chủng nấm penicilium đột biến có hoạt tính penicilin tăng gấp 200 lần dạng ban đầu Tạo được chủng vi khuẩn đột biến có năng suất tổng hợp lizin cao gấp 300 lần dạng ban đầu

Trên nấm men, vi khuẩn, người ta đã chọn tạo được các thể đột biến sinh trưởng mạnh để sảnxuất sinh khối chọn được những chủng vi sinh vật không gây bệnh, đóng vai trò một kháng nguyên, gây miễn dịch ổn định cho kí chủ chống loài vi sinh vật đó, trên nguyên tắc này đã tạo được những vacxin phòng bệnh cho người và gia súc

6.2 Trong chọn giống vật nuôi:

Phương pháp gây đột biến chỉ được sử dụng hạn chế ở một số nhóm động vật thấp, khó áp dụng cho các nhóm động vật bậc cao do chúng phản ứng rất nhạy và dễ bị chết khi xử lí bằng các tác nhân lí hóa

7 Ưu – Nhược điểm:

Ưu điểm:

- Nhanh chóng tạo được sự đa dạng của các thể đột biến

- Có hiệu quả cao đối với Vi sinh vật.

Nhược điểm:

- Đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, trình độ kỹ thuật cao và sự bảo đảm an toàn, nghiêmngặt đối với các tác động xấu lên môi trường

- Khó dự đoán kết quả do đột biến vô hướng

IV TẠO GIỐNG MỚI BẰNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO

1 Khái niệm về công nghệ tế bào:

Công nghệ tế bào là quy trình để tạo ra những tế bào có kiểu nhân mới, từ đó tạo ra cơ thểvới những đặc điểm mới, hoặc hình thành cơ thể mới không bằng sinh sản hữu tính mà thông qua sựphát triển của tế bào xô ma nhằm nhân nhanh các giống vật nuôi, cây trồng

Công nghệ tế bào gồm 3 bước là:

Bước 1: Tách các tế bào từ cơ thể động vật hay thực vật

Bước 2: Nuôi cấy tế bào trong môi trường nhân tạo để hình thành mô sẹo

Bước 3: Dùng hoocmon sinh trưởng kích thích mô sẹo phân hóa thành các cơ quan hoặc tạo

vô tính để tạo thành cây trưởng thành

3 Tạo giống bằng công nghệ tế bào

3.1 Tạo giống bằng công nghệ tế bào ở thực vật

Bao gồm các phương pháp: Nuôi cấy hạt phấn, nuôi cấy tế bào thực vật in vitrô tạo mô sẹo,chọn dòng tế bào xôma có biến dị và dung hợp tế bào trần

3.1.1 Công nghệ nuối cấy hạt phấn

Tạo dòng thuần lưỡng bội từ dòng đơn bội dựa trên đặc

tính của hạt phấn là có khả năng mọc trên môi trường nhân tạo

thành dòng đơn bội và tất cả các gen của dòng đơn bội được

biểu hiện ra kiểu hình cho phép chọn lọc invitro (trong ống

nghiệm) những dòng có đặc tính mong muốn

Ưu điểm của phương pháp này là tạo ra các dòng thuần

chủng; tính trạng chọn lọc được sẽ rất ổn định

Lưu ý: Dùng để chọn các cây có đặc tính chống chịu

hạn, chịu lạnh, chịu mặn, kháng thuốc diệt cỏ

3.1.2 Nuôi cấy tế bào thực vật in vitro tạo mô sẹo

Ưu điểm của phương pháp này là nhân nhanh giống cây trồng quý - hiếm và sạch bệnh, tạo

ra nhiều cá thể mới có kiểu gen giống với cá thể ban đầu

Ứng dụng : Nhân nhanh các giống cây có năng suất cao, chất lượng tốt, thích nghi với điều

kiện sống và duy trì ưu thế lai

3.1.3 Dung hợp tế bào trần

Quy trình tạo giống mới bằng phương pháp dung hợp tế bào trần

Ưu điểm của phương pháp này là tạo ra các cây lai khác loài mang đặc điểm của cả 2 loài

nhưng không cần phải trải qua sinh sản hữu tính, tránh hiện tượng bất thụ của con lai

Thành tựu tạo ra giống mới từ phương pháp dung hợp tế bào trần

Sơ đồ tạo cây lai pomato

3.1.4 Chọn dòng tế bào xô ma có biến dị

Quy trình tạo giống mới từ chọn dòng tế bào xô ma có biến dị

Ưu điểm là tạo các giống cây trồng mới, có các kiểu gen khác nhau của cùng một giống ban

đầu

Phương pháp này tạo ra các giống mới dựa vào hiện tượng đột biến gen và biến dị số lượng NST tạo thể lệch bội khác nhau

Tiêu chí

phân biệt Nuôi cấy hạt phấn

Nuôi cấy tế bào thực vật

in vitrô tạo mô sẹo

Chọn dòng tế bào xôma có biến dị

Lai tế bào sinh dưỡng

Nguồn

nguyên

liệu

Hạt phấn (n) hay noãn

chưa thụ tinh Tế bào (2n) Tế bào (2n)

Tế bào 2n của hai

loài

Quy trình

tiến hành

- Nuôi cấy hạt phấn hay

noãn trong ống nghiệm

→ cây đơn bội.

- Từ tế bào đơn bội

nuôi trong ống nghiệm

→ mô đơn bội → gây

lưỡng bội hóa → cây

lưỡng bội hoàn chỉnh.

Nuôi trên môi trường nhân tạo; tạo mô sẹo;

bổ sung hoocmôn kích thích sinh trưởng cho phát triển thành cây trưởng thành.

Nuôi trên môi trường nhân tạo;

chọn lọc các dòng

tế bào có đột biến gen và biến dị số lượng NST khác nhau.

Tạo tế bào trần, cho dung hợp hai khối nhân và tế bào chất thành một, nuôi trong môi trường nhân tạo cho phát triển thành cây lai.

Tạo dòng thuần lưỡng

bội từ dòng đơn bội.

Tạo dòng thuần lưỡng bội.

Dựa vào đột biến gen và biến dị số lượng NST tạo thể lệch bội khác nhau.

Lai xa, lai khác loài tạo thể song nhị bội, không thông qua lai hữu tính, tránh hiện tượng bất thụ của con lai.

- Giúp bảo tồn nguồn

gen của một số giống quý hiếm.

Tạo ra các giống cây trồng mới có các kiểu gen khác nhau của cùng một giống ban đầu.

Tạo ra các giống mới mang đặc điểm của cả 2 loài mà hữu tính khó có thể tạo ra được.

3.2 Tạo giống mới bằng công nghệ tế bào ở động vật

Bao gồm các phương pháp: cấy truyền phôi, nhân bản vô tính bằng kỹ thuật chuyển nhân

3.2.1 Sản xuất vacxin tổng hợp bằng công nghệ tế bào:

+ Cho lai tế bào ung thư với tế bào động vật có vú có chức năng sản sinh kháng thể.

+ Nuôi cấy tế bào lai để chúng sinh sản liên tục, lâu dài, tạo ra khối lượng lớn kháng thể

- Ưu điểm: Tạo kháng thể có độ tinh khiết tuyệt đối

3.2.2 Sản xuất vật nuôi bằng công nghệ tế bào:

Áp dụng công nghệ tế bào trong sản xuất vật nuôi chủ yếu là hình thức cấy truyền hợp tử và nhân bản vô tính

3.2.2.1 Cấy truyền phôi: còn gọi là công nghệ tăng sinh sản ở động vật Sau khi phôi được lấy ra từ

động vật và trước khi khi cấy phôi vào động vật cần trải qua các bước sau:

- Bằng kĩ thuật chia tách phôi động vật thành hai hay nhiều phôi rồi cấy các phôi này vào tử cung của các con vật khác nhau, có thể tạo ra được nhiều con vật có kiểu gen giống nhau

- Phối hợp hai hay nhiều phôi thành một thể khảm

- Làm biến đổi các thành phần trong tế bào của phôi khi mới phát triển theo hướng có lợi chocon người

3.2.2.2 Nhân bản vô tính: Điển hình cho kĩ thuật này là nhân bản thành công cừu Đôli (Dolly)

- Các bước tiến hành:

+ Tách tế bào tuyến vú của cừu cho nhân, nuôi trong phòng thí nghiệm

+ Tách tế bào trứng của cừu khác, loại bỏ nhân của tế bào này

+ Chuyển nhân của tế bào tuyến vú vào tế bào trứng đã bỏ nhân

+ Nuôi cấy trên môi trường nhân tạo để trứng phát triển thành phôi

+ Chuyển phôi vào tử cung của một cừu mẹ để nó mang thai

Cừu con sinh ra có kiểu hình giống hệt kiểu hình của cừu cho nhân tế bào

- Ý nghĩa:

+ Nhân nhanh giống vật nuôi quý hiếm hoặc tăng năng suất trong chăn nuôi

+ Tạo ra các động vật mang gen người nhằm cung cấp cơ quan nội tạng để thay thế, ghép nội quan cho người bệnh.

Tiêu chí

phân biệt Phương pháp cấy truyền phôi

Phương pháp nhân bản vô tính bằng kỹ thuật chuyển nhân (Cừu Dolli) Nguồn

nguyên liệu - Phôi động vật - Tế bào cho nhân và tế bào nhận nhân

- Tách TB tuyến vú của cá thể cho nhân; tách

TB trứng của cá thể khác và loại bỏ nhân

- Chuyển nhân của TB tuyến vú, TB trứng đãloại bỏ nhân, nuôi cấy trên môi trường nhân tạo

Nuôi cấy phôi: Phôi được tạo thành nhờ

sự tham gia của tế bào sinh dục đực vàcái

Nuôi cấy phôi: Phôi được tạo thành nhờ sựphối hợp nhân của tế bào sinh dưỡng của vậtcho nhân với TBC của tế bào trứng của vậtnhận

Ý nghĩa - Giúp nhân nhanh các giống vật nuôi có

đặc tính quý

- Nhân nhanh các giống vật nuôi quý hiếm

- Cho phép tạo ra các giống động vật mang

- Cải biến phẩm chất giống VN đáp ứngnhu cầu sản xuất gen người để ứng dụng trong lĩnh vực y học.

V TẠO GIỐNG MỚI BẰNG CÔNG NGHỆ GEN

1 Khái niệm công nghệ gen

Công nghệ gen là một quy trình công nghệ dùng để tạo ra những tế bào hoặc sinh vật có gen

bị biến đổi hoặc có thêm gen mới, từ đó tạo ra cơ thể với những đặc điểm mới

Công nghệ gen được thực hiện phổ biến hiện nay là kỹ thuật chuyển gen (tạo ra phân tử

ADN tái tổ hợp để chuyển gen từ tế bào cho sang tế bào nhận)

Kỹ thuật chuyển gen (kỹ thuật tạo ADN tái tổ hợp) là chuyển một đoạn ADN từ tế bào cho

sang tế bào nhận bằng nhiều cách khác nhau

2 Quy trình tạo ADN tái tổ hợp

2.1 Thành phần tham gia

Tế bào cho: là những tế bào chứa gen cần chuyển (vi khuẩn, thực vật, động vật)

Tế bào nhận: vi khuẩn, tế bào thực vật (tế bào chồi, mầm), tế bào động vật (như tế bào

trứng, phôi)

Enzyme: gồm enzym cắt giới hạn và enzyme nối

Enzyme cắt giới hạn (restrictaza), cắt hai mạch đơn của

phân tử ADN ở những vị trí nucleotid xác định

Enzyme nối: (ligaza), tạo liên kết phosphodieste làm liền

mạch ADN, tạo ADN tái tổ hợp

Thể truyền: (véc tơ chuyển gen): Là phân tử ADN có khả

năng tự nhân đôi, tồn tại độc lập trong tế bào và mang gen từ tế

bào này sang tế bào khác, thể truyền có thể là các plasmid, virut

hoặc một số NST nhân tạo như ở nấm men

AND tái tổ hợp là một phân tử AND nhỏ được lắp giáp từ

các đoạn AND từ các phân tử khác nhau (thể truyền và gen cần

chuyển)

2.2 Các khâu cơ bản trong kĩ thuật chuyển gen.

2.2.1 Tạo ADN tái tổ hợp.

- Tách chiết thể truyền và gen cần chuyển ra khỏi tế bào (phân lập gen)

- Xử lí bằng một loại enzim giới hạn để tạo ra cùng 1 loại đầu dính

- Dùng enzim nối để gắn chúng tạo ADN tái tổ hợp

2.2.2 Đưa ADN tái tổ hợp vào tế bào nhận.

Dùng muối CaCl2 hoặc xung điện cao áp làm giãn màng sinh chất của tế bào để ADN tái tổhợp dễ dàng đi qua

2.2.3 Phân lập dòng tế bào chứa ADN tái tổ hợp.

- Chọn thể truyền có các dấu chuẩn dễ nhận biết hoặc dùng gen “đánh dấu” hay gen “thôngbáo”

- Bằng các kỹ thuật nhất định nhận biết được các tế bào có ADN tái tổ hợp dựa vào sản phẩmđánh dấu

Hình Công nghệ chuyển gen

Hình Qui trình tạo dòng vi khuẩn mang gen insulin người.

2.3 Các công cụ và kĩ thuật của công nghệ gen.

2.3.1 Vectơ tách dòng (thể truyền).

Đó là phương tiện chuyển gen, thường là các phân tử ADN nhỏ, cho phép gắn các gen(ADN) ngoại lai, có khả năng tự sao chép, tồn tại độc lập trong tế bào chủ và đặc biệt phải mang tínhiệu nhận biết trong tế bào đã mang vectơ tái tổ hợp

Các loại vectơ tách dòng (thể truyền) thường dùng là : Plasmit (có nguồn gốc vi khuẩn),Phage (có nguồn gốc virut), Cosmit (thể truyền lai, có cả thuộc tính của plasmit và phage), Ti-plasmit (dùng để nhân dòng và chuyển gen ở thực vật), Các NST nhân tạo

Các thể truyền khác nhau về một số thuộc tính phân tử, loại tế bào chủ và kích thước tối đacác đoạn ADN mà chúng có thể mang

* Plasmit : Plasmit là những cấu trúc nằm trong tế bào chất của vi khuẩn Tùy loài vi khuẩn, mỗi tế

bào chứa vài đến vài chục plasmit Plasmit chứa ADN dạng vòng, có khả năng nhân đôi độc lập với

hệ gen của tế bào và trong một tế bào, mỗi loại plasmit thường có nhiều bản sao

- Đặc điểm của các thể truyền có nguồn gốc từ E.coli plasmit :

+ Có một trình tự khởi đầu tái bản ADN (Ori) Trình tự này là thiết yếu để plasmit có thể táibản trong tế bào E coli

+ Có một hoặc một số vị trí giới hạn đặc thù Đây là điểm để cài các đoạn ADN (hoặc gen)cần chuyển vào thể truyền

+ Có một gen chỉ thị chọn lọc Gen này biểu hiện như một gen trội, nhờ vậy nó giúp phânbiệt được dễ dàng tế bào E coli mang ADN tái tổ hợp

- Ưu điểm :

+ Cấu trúc tương đối đơn giản, kích thước nhỏ

+ Dễ tinh sạch và phân tích sản phẩm ADN tái tổ hợp

+ Có thể nhân lên một số lượng lớn trong tế bào chủ với tốc độ nhanh, do vậy hiệu suất nhândòng cao.

+ Kích thước lớn (so với thể truyền plasmit) làn việc phân tích trình tự phức tạp hơn

+ Số bản sao của phage trong mỗi tế bào chủ thường thấp hơn so với thể truyền plasmit

* Ti-plasmit : Là một plasmit kích thước lớn ( 200kb) tìm thấy ở vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens gây nốt sần ở thực vật Ti-plasmit là vectơ chuyển gen vào tế bào thực vật

* Các vectơ NST nhân tạo :

- NST nhân tạo nấm men (YAC): Là thể truyền có khả năng tự tái bản trong tế bào nấm men.

Cấu trúc gồm :

+ Đầu mút NST (TEL) có ở 2 đầu của mỗi vectơ Cấu trúc đầu mút này là cần thiết để NST

có thể bền vững và ổn định trong tế bào nấm men

+ Tâm động của nấm men (CEN) Trình tự này là thiết yếu để NST nhân tạo có thể phân lichính xác về các tế bào con khi tế bào nấm men phân chia

+ Mỗi vai của NST nhân tạo có một gen chỉ thị để phát hiện được tế bào nấm men mangYAC

+ Một trình tự khởi đầu tái bản Trình tự này giúp vectơ có thể tái bản trong tế bào nấm men.+ Một vị trí đa nhân dòng mang các trình tự nhận biết duy nhất của các enzim giới hạn đượcdùng làm điểm gắn ADN cần nhân dòng

- NST nhân tạo vi khuẩn (BAC): Được dùng để nhân dòng các đoạn ADN kích thước lớn đến

300kb trong tế bào E.coli BAC chứa :

+ Một trình tự khởi đầu sao chép của một plasmit có trong tự nhiên

- Vectơ này có thể mang các đoạn ADN ngoại lai có kích thước lớn khoảng 40 - 50kb

- Vectơ này vừa được thừa hưởng khả năng tự tái bản của plasmit vừa có khả năng tự đónggói của phage

* Vectơ con thoi: Là nhóm vectơ vừa có khả năng tái bản trong tế bào vi khuẩn vừa có khả năng

biến nạp và biểu hiện chức năng trong các tế bào động vật có vú và các tế bào nhân thực khác Nóicách khác chúng có thể dùng để biến nạp vào hai hay nhiều loại tế bào chủ khác nhau

2.3.2 Enzim cắt, enzim nối.

* Enzim cắt giới hạn (Restrictaza): Là các enzim có khả năng nhận biết một đoạn trình tự trên phân

tử ADN và cắt ADN ở những điểm đặc hiệu Enzim cắt giới hạn chia làm 2 nhóm chính tùy thuộcvào kiểu cắt ADN của chúng:

- Enzim cắt giới hạn đầu so le : Là enzim có khả năng nhận biệt đoạn trình tự nhưng lại cắt ởcác vị trí lệch nhau giữa 2 mạch đơn theo kiểu cắt chữ Z Khi sử dụng enzim cắt giới hạn đầu so lecắt 2 nguồn ADN tạo ra các đầu dính, từ đó có thể nối các đoạn ADN bị cắt lại với nhau

- Enzim cắt giới hạn đầu bằng: Là enzim có khả năng nhận biết đoạn trình tự và cắt ngay tại

vị trí giới hạn đó để tạo đầu bằng nhau

- Cần phải sử dụng enzim nối ligaza hoặc các đoạn nối chuyên dụng cho mỗi loại enzim

* Enzim nối (Ligaza): Xúc tác phản ứng nối tạo liên kết photphodieste giữa hai nuclêôtit liên tiếp.

2.4 Các phương pháp chuyển gen.

2.4.1 Chuyển gen trực tiếp.

Là phương pháp sử dụng các kĩ thuật như kĩ thuật siêu âm, kĩ thuật xung điện, vi tiêm, bắngen để nạp gen là vào tế bào chủ

- Kĩ thuật siêu âm: Là kĩ thuật dùng máy siêu âm để đưa ADN ngoại lai xâm nhập vào bộgen tế bào trần của vật chủ

- Kĩ thuật xung điện : Là kĩ thuật sử dụng dòng điện cao áp khoảng 500V/cm với thời gian 5%o giây tạo các lỗ thủng trên tế bào trần làm cho gen lạ bên ngoài dễ xâm nhập vào bộ gen của tếbào chủ.

4 Kĩ thuật vi tiêm: Là kĩ thuật sử dụng một lượng nhỏ ADN (các gen) tiêm vào tế bào chủhoặc tiêm vào tế bào trứng đã thụ tinh ở giai đoạn phôi có 4-8 tế bào

- Kĩ thuật bắn gen: Là kĩ thuật sử dụng sử dụng thiết bị bắn vi đạn mang gen cần chuyển(súng bắn gen) vào bộ gen của tế bào chủ Vi đạn là các hạt vonfram hoặc vàng trộn với gen cầnchuyển và phụ gia làm gen chuyển bao quanh vi đạn Vi đạn được gắn vào đầu viên đạn lớn hơn, sau

đó được nạp vào súng bắn gen Súng bắn gen có lưới thép mịn ở đầu nòng cho phép khi bắn thì viênđạn lớn được giữ lại, còn vi đạn được bắn vào tế bào với gia tốc lớn Gen cần chuyển được bắnvào có thể tái tổ hợp với bộ gen của tế bào chủ, tạo nên tế bào mang gen được chuyển, từ đó tạo ra

cơ thể chuyển gen

2.4.2 Chuyển gen gián tiếp.

Là kĩ thuật chuyển gen (tải nạp) nhờ các nhân tố trung gian như vi khuẩn Agrobacterium

hoặc virút và phage

- Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium : Là phương pháp sử dụng vi khuẩn gây các khối

u ở thực vật Vi khuẩn Agrobacterium chứa một plasmit lớn tạo nên khối u ở thực vật gọi là plasmit Cây bị nhiễm Agrobacterium qua vết xước thì vi khuẩn truyền một đoạn ADN của Ti-

Ti-plasmit có mang các gen sản sinh auxin, opin cho cây, làm cây hình thành khối u Ti-Ti-plasmit đượcbiến đổi bằng cách loại bỏ gen gây khối u mà lại được gắn gen mới để chuyển gen vào cây trồng

- Chuyển gen nhờ virút và phage : Là phương pháp sử dụng các virut (SV 40, BPV ) hoặccác phage (phage , phage M13) để chuyển gen vào vi khuẩn hoặc tế bào thực vật

2.5 Ứng dụng công nghệ gen trong tạo giống biến đổi gen.

Thành tựu nổi bật nhất trong ứng dụng kĩ thuật di truyền là khả năng cho tái tổ hợp thông tin

di truyền giữa các loài đứng xa nhau trong bậc thang phân loại mà lai hữu tính không thể thực hiệnđược Công nghệ gen đã tạo ra các sinh vật biến đổi gen

2.5.1 Khái niệm sinh vật biến đổi gen

Sinh vật biến đổi gen là sinh vật mà hệ gen của nó đã được con người làm biến đổi cho phù hợp với lợi ích của mình

Sinh vật biến đổi gen có thể dược tạo ra theo các cách sau :

- Đưa thêm 1 gen lạ của 1 loài khác vào hệ gen (gọi là sinh vật chuyển gen)

- Làm biến đổi 1 gen đã có sẵn trong hệ gen

- Loại bỏ hoặc làm bất hoạt 1 gen nào đó trong hệ gen

2.5.2 Một số thành tựu tạo giống biến đổi gen

Thành tựu nổi bật nhất trong ứng dụng công nghệ gen là khả năng cho tái tổ hợp thông tin ditruyền giữa các loài đứng xa nhau trong bậc thang phân loại mà lai hữu tính không thể thực hiệnđược

2.5.2.1 Tạo động vật chuyển gen:

* Mục tiêu:

- Tạo nên giống mới có năng suất và chất lượng cao hơn

- Sinh vật biến đổi gen có thể được tạo ra dùng trong ngành công nghiệp dược phẩm (như nhà máy sinh học sản suất thuốc cho con người)

* Phương pháp tạo động vật chuyển gen:

- Tách lấy trứng ra khỏi cơ thể sinh vật rồi cho thụ tinh trong ống nghiệm (hoặc lấy trứng đã thụ tinh)

- Tiêm gen cần chuyển vào hợp tử.

- Cấy hợp tử đã được chuyển gen vào tử cung của con vật để nó mang thai và sinh đẻ bình thường

- Nếu gen được chuyển gắn thành công vào hệ gen của hợp tử và phôi phát triển bình thườngthì sẽ cho ra đời 1 sinh vật biến đổi gen (chuyển gen)

* Thành tựu:

Bằng phương pháp vi tiêm, cấy nhân

đã có gen đã cải biến, sử dụng tế bào gốc,

… tạo ra những giống động vật mới có năng

suất và chất lượng cao và đặc biệt có thể sản

xuất ra các loại thuốc chữa bệnh cho người:

Chuyển gen prôtêin huyết thanh của

người vào cừu biểu hiện ở tuyến sữacho

sản phẩm với số lượng lớnchế biến

thành thuốc chống u xơ nang và bệnh về

đường hô hấp ở người

Chuyển gen sản xuất r-prôtêin của

ngườibiểu hiện ở tuyến sữacho sản phẩm

với số lượng lớnsản xuất prôtêin C chữa

bệnh máu vón cục gây tắc mạch

Chuyển gen hoocmôn sinh trưởng của

chuột cống vào chuột nhắtnên nó có khối

lượng gần gấp đôi so với chuột cùng lứa

2.5.2.2 Tạo giống cây trồng biến đổi gen:

* Mục tiêu:

- Tạo giống cây trồng kháng sâu hại

- Tạo giống cây chuyển gen có đặc tính quí

- Tạo giống cây biến đổi gen có sản phẩm được bảo quản tốt hơn

*Phương pháp:

- Tạo ADN tái tổ hợp: tách thể truyền và gen cần chuyển ra khỏi tế bào

- Xử lí plasmit và ADN chứa gen cần chuyển bằng enzim cắt restrictaza

- Nối đoạn vừa cắt vào plasmit nhờ enzim ligaza

- Tái sinh cây từ tế bào nuôi cấy  cây có đặc tính mới

* Thành tựu tạo giống thực vật

- Tạo giống bằng công nghệ gen mở ra nhiều ứng dụng mới cho trồng trọt: sản xuất các chất bột,đường với năng suất cao, sản xuất các loại prôtêin trị liệu, các kháng thể và chất dẻo Thời gian tạo giống mớirút ngắn đáng kể

- Đến nay đã có hơn 1200 loại thực vật đã được chuyển gen Trong số đó có 290 giống câycải dầu, 133 giống khoai tây và nhiều loại cây trồng khác như cà chua, ngô, lanh, đậu nành, bôngvải, củ cải đường

- Phương pháp chuyển gen ở thực vật rất đa dạng: chuyển gen bằng plasmit, bằng virut,chuyển gen trực tiếp qua ống phấn, kỹ thuật vi tiêm ở tế bào trần, dùng súng bắn gen

- Ví dụ:

+ Tạo ra giống cà chua chuyển gen kéo dài thời gian chín, giống cà chua chuyển gen khángvirut.

+ Tạo ra giống lúa chuyển gen tổng hợp beta- carôten

+ Chuyển gen trừ sâu từ vi khuẩnbông vải  giống mới kháng sâu hại

2.5.2.3 Tạo giống vi sinh vật biến đổi gen

Ngày nay, đã tạo được các chủng vi khuẩn cho sản phẩm mong muốn không có trong tựnhiên, bằng cách chuyển một hay một nhóm gen từ tế bào của người hay một đối tượng khác vào tếbào của vi khuẩn

Các vi sinh vật như E.coli, nấm men bánh mì là những đối tượng đầu tiên được sử dụngtrong công nghệ gen để sản xuất một số loại prôtêin của người như insulin chữa bệnh tiểu đường,hoocmon tăng trưởng của người (HGH), hoocmôn Somatostatin điều hòa hoocmôn sinh trưởng vàinsulin trong máu, văcxin viêm gan B để phòng bệnh viêm gan B…

*Tạo chủng vi khuẩn E.coli sản xuất insulin của người

- Insulin là hormone của tuyến tụy có chức năng điều hòa glucose trong máu Trường hợp insulin do cơ thể sản xuất không đủ hoặc mất chức năng sẽ gây bệnh tiểu đường do glucose bị thải

ra qua nước tiểu

- Gen tổng hợp insulin được tách từ cơ thể người và chuyển vào vi khuẩn E.coli bằng

plasmid Sau đó, nuôi cấy vi khuẩn để sản xuất insulin trên qui mô công nghiệp đáp ứng nhu cầu chữa bệnh cho con người

*Tạo chủng vi khuẩn E.coli sản xuất somatostatin

- Somatostatin là loại hormone đặc biệt được tổng hợp từ não động vật, có chức năng điều hòa hormone sinh trưởng và insulin đi vào máu

- Bằng công nghệ gen hiện nay đã tạo được chủng E.coli sản xuất somatostatin

2.6 Tách dòng ADN trong các véctơ plasmid

Sau khi một phân đoạn ADN được cắt khỏi một phân tử ADN có kích thước lớn hơn bằng enzym giới hạn, phân đoạn ADN đó cần được “cài” vào một véctơ để có thể nhân lên Hay nói cách khác là một phân đoạn ADN cần được cài vào một phân tử ADN thứ hai (véctơ) để có thể nhân lên được trong tế bào chủ như đã nói ở trên Cho đến nay, tế bào chủ được sử dụng rộng rãi nhất để nhân lên các đoạn ADN trong công nghệ ADN tái tổ hợp là vi khuẩn E coli

Các véctơ ADN điển hình thường có 3 đặc tính:

a) Chúng phải chứa một trình tự khởi đầu sao chép (tái bản), cho phép chúng tự sao chép độclập với nhiễm sắc thể của tế bào chủ

b) Chúng phải mang một dấu chuẩn chọn lọc cho phép dễ dàng xác định và phân lập được các

tế bào mang véctơ tái tổ hợp (mang đoạn ADN cài) với các tế bào không mang véctơ tái tổhợp

c) Có vị trí cắt của một hoặc nhiều enzym giới hạn khác nhau Đây chính là vị trí cài của phânđoạn ADN cần tách dòng vào véctơ.

Véctơ tách dòng phổ biến nhất là các phân tử ADN sợi kép, mạch vòng kích thước nhỏ(khoảng 3 kb) được gọi là các plasmit Các véctơ này phần lớn có nguồn gốc từ các loài vi khuẩn vàmột số từ các sinh vật nhân chuẩn đơn bào (nấm men) Trong nhiều trường hợp, các phân tử ADNnày trong tự nhiên đã mang sẵn các gen mã hóa tính kháng chất kháng sinh Như vậy, các plasmidtrong tự nhiên đã có sẵn hai thuộc tính là: khả năng tự sao chép trong tế bào chủ và có trình tự dấuchuẩn chọn lọc Ngoài ra, các véctơ plasmit còn một ưu điểm nữa là chúng có thể đồng thời tồn tạinhiều bản sao trong tế bào Điều này có thể giúp khuếch đại và phân lập được một số lượng lớn mộtphân đoạn ADN nào đó từ một quần thể tế bào nhỏ

Trước đây, một số véctơ plasmit chỉ có một vị trí cắt của enzym giới hạn duy nhất Cùng vớithời gian, cấu trúc của các véctơ plasmit được cải tiến theo hướng cắt bỏ bớt các trình tự không cầnthiết và gắn thêm vào đoạn trình tự có thể được cắt bằng nhiều loại enzym giới hạn khác nhau Vị trítrên véctơ mang đoạn trình tự như vậy được gọi là vị trí đa tách dòng (polycloning site) Có những

vị trí đa tách dòng hiện nay có kích thước ngắn nhưng có thể được cắt bởi trên 20 loại enzym giớihạn khác nhau Nhờ đặc tính này, một véctơ có thể được dùng để tách dòng nhiều phân đoạn ADN

có nguồn gốc khác nhau Trên cơ sở các nguyên tắc tương tự, ngoài véctơ plasmit, hiện nay người ta

đã phát triển được nhiều loại véctơ khác nhau có nguồn gốc phagơ, hoặc lai giữa vi khuẩn - phagơ(như phagemid, cosmid P), hoặc có nguồn gốc từ nấm men (ví dụ: YAC)

Việc cài một phân đoạn ADN vào một véctơ thường là một công việc tương đối đơn giản.Người ta thường sử dụng cùng một loại enzym giới hạn để cắt véctơ và đoạn ADN cài Chẳng hạnnhư việc sử dụng enzym EcoRI sẽ cắt và chuyển véctơ từ dạng “vòng” sang dạng “mạch thẳng” cóhai đầu dính Do được cắt bởi cùng enzym giới hạn, nên đoạn ADN cài cũng có hai đầu dính vớitrình tự bổ trợ với trình tự đầu dính của véctơ Các đầu dính này sẽ liên kết véctơ và đoạn ADN càilại với nhau hình thành nên một phân tử ADN mạch vòng mới (phân tử ADN tái tổ hợp) chỉ cònthiếu hai liên kết phosphodieste duy nhất còn lại ở mỗi mạch Hai liên kết này sẽ được “hàn” kínnhờ sử dụng enzym ADN ligase trong sự có mặt của ATP Để hạn chế khả năng gắn kết lại của haiđầu dính của chính véctơ (vì hai đầu dính này có trình tự bổ trợ) sau khi được cắt bởi enzym giớihạn, người ta thường cho lượng ADN cài dư thừa so với véctơ để phần lớn các véctơ sau khi gắn lại

là các véctơ tái tổ hợp mang các đoạn ADN cài

Một số loại véctơ không những cho phép phân lập và tinh sạch được một phân đoạn gen nào

đó, mà còn có thể điều hòa sự biểu hiện của gen nằm trong phân đoạn ADN cài Những véctơ nhưvậy được gọi là các véctơ biểu hiện Các véctơ này thường phải chứa trình tự promoter nằm ngượcdòng sát với vị trí cài gen Nếu vùng mã hóa của gen (không chứa promoter) được gắn vào véctơtheo đúng chiều khung đọc của gen, thì gen cài sẽ được phiên mã thành mARN và dịch mã thànhprotein trong tế bào chủ Các véctơ biểu hiện thường được sử dụng để biểu hiện các gen đột biếnhoặc các gen lai để tiến hành phân tích chức năng của chúng Chúng cũng có thể được dùng để sảnxuất một lượng lớn một loại protein nào đó vốn không thu được hiệu suất tương tự bằng các conđường tự nhiên Ngoài ra, các promoter trong các véctơ biểu hiện có thể được lựa chọn sao cho sựbiểu hiện của gen cài có thể được điều hòa bằng việc bổ sung một hợp chất đơn giản vào môi trườngnuôi cấy (như một loại đường hoặc axit amin chẳng hạn) Việc có thể điều khiển chủ động sự biểuhiện của một gen nào đó có ý nghĩa quan trọng, đặc biệt đối với các gen gây độc

2.7 Biến nạp các véctơ ADN vào tế bào chủ

Biến nạp là quá trình ở đó một cơ thể chủ có thể tiếp nhận một phân tử ADN ngoại lai từ môitrường bên ngoài Một số vi khuẩn (trong đó không có E coli) có khả năng biến nạp tự nhiên đượcgọi là các vi khuẩn khả biến di truyền Vi khuẩn E coli có thể trở nên khả biến khi được xử lý vớiion Ca2+ Mặc dù cơ chế khả biến chưa được biết đầy đủ, nhưng dường như ion Ca2+ bao bọc lại các

bào được xử lý với Ca2+ vì vậy được gọi là các tế bào khả biến Người ta có thể sử dụng một chấtkháng sinh mà véctơ plasmid mang gen dấu chuẩn mã hóa tính kháng chất kháng sinh đó để chọnlọc được các thể mang plasmid tái tổ hợp Các tế bào mang véctơ tái tổ hợp có thể sinh trưởng trongmôi trường chứa chất kháng sinh, trong khi các tế bào khác thì không.

Thông thường quá trình biến nạp có hiệu suất không cao Chỉ có một tỉ lệ nhỏ các tế bàođược xử lý biến nạp có thể tiếp nhận được plasmid tái tổ hợp Nhưng, chính hiệu quả biến nạp thấpgiúp hầu hết các tế bào mang véctơ tái tổ hợp thường chỉ tiếp nhận một plasmid duy nhất Thuộctính này giúp cho các tế bào biến nạp và dòng tế bào do chúng sinh ra (do phân chia trực phân) chỉmang một véctơ ADN tái tổ hợp duy nhất và cho phép các nhà nghiên cứu thể phân lập và tinh sạchđược các gen hoặc hoặc sản phẩm của các gen riêng rẽ từ hỗn hợp biến nạp mang cả các phân tửADN khác

2.8 Thư viện hệ gen

Đối với các hệ gen đơn giản, kỹ thuật tách dòng thường khá đơn giản Chẳng hạn như với hệgen một số virut có kích thước khoảng 10 kb, người ta có thể trực tiếp tách chiết ADN, cắt chúngbằng enzym giới hạn rồi tiến hành phân tích điện di Các phân đoạn ADN tách biệt trên gel điện diđược cắt khỏi gel, tinh sạch rồi cài vào các véctơ

Trong khi đó, đối với các hệ gen phức tạp, kích thước lớn (như hệ gen người), việc cắt ADNtổng số bằng enzym giới hạn rồi phân tích điện di thường dẫn đến sự hình thành một dải băng điện

di liên tục do có sự phân bố liên tục của các phân đoạn ADN được cắt giới hạn chỉ khác nhau mộthoặc một vài nucleotit Vì vậy, để đơn giản hóa quy trình tách dòng ở những hệ gen này, người tathường tiến hành biến nạp toàn bộ các phân đoạn ADN (thu được sau khi cắt bằng enzym giới hạn)vào véctơ tách dòng rồi biến nạp tất cả chúng vào tế bào chủ, sau đó mới phân lập các dòng tế bàomang véctơ tái tổ hợp có các đoạn cài ADN khác nhau Tập hợp các dòng tế bào như vậy được gọi làthư viện hệ gen Như vậy, thư viện hệ gen là tập hợp các dòng tế bào mang các véctơ tái tổ hợp chứacác đoạn ADN cài khác nhau có cùng nguồn gốc (cùng hệ gen)

Để thiết lập một thư viện gen, hệ gen của tế bào đích (chẳng hạn ADN hệ gen người) đượccắt bằng enzym giới hạn để tạo ra các phân đoạn ADN có kích thước trung bình mong muốn Kíchthước các phân đoạn (đoạn cài) có thể dao động từ 100 bp đến trên 1 Mb (đối với các phân đoạnADN kích thước rất lớn, phân tử ADN thường được cắt không hoàn toàn bằng một enzym giới hạn).Các phân đoạn ADN cắt giới hạn sau đó được “trộn” với một loại véctơ phù hợp (trước đó được cắtbởi cùng loại enzym giới hạn) và ADN ligase Kết quả của bước này sẽ tạo ra một tập hợp các véctơmang các đoạn ADN cài khác nhau

Người ta có thể tạo ra nhiều thư viện gen khác nhau bắt nguồn từ các nguồn vật liệu khácnhau Thư viện hệ gen đơn giản nhất bắt nguồn từ ADN hệ gen tổng số được cắt bằng một enzymgiới hạn duy nhất, gọi là thư viện hệ gen Loại thư viện này có ý nghĩa ứng dụng rõ rệt nhất nhằmgiải mã trình tự các hệ gen Ngược lại, đối với mục đích tìm và phân lập ra một phân đoạn mang genmong muốn, thì thư viện hệ gen chỉ tỏ ra hiệu quả đối với hệ gen chỉ chứa một phần tương đối nhỏcác vùng không mã hóa Đối với các hệ gen phức tạp hơn, thư viện hệ gen không phù hợp cho việctìm ra phân đoạn mang gen mong muốn bởi vì phần lớn các dòng trong thư viện mang các đoạn càithuộc các vùng không mã hóa

Để có được thư viện gen mang hầu hết các đoạn cài là các vùng mã hóa, người ta sử dụngthư viện cADN Các bước thiết lập thư viện cADN được minh họa trên hình 10 Theo đó, trongbước đầu tiên thay vì bắt đầu từ ADN, người ta phiên mã ngược trình tự mARN thành trình tự ADNphiên bản (cADN) Quá trình này được gọi là quá trình phiên mã ngược và được thực hiện nhờ mộtenzym ADN polymerase đặc biệt là reverse transcriptase

Enzym này có khả năng tổng hợp ADN bắt nguồn từ phân tử ARN mạch đơn làm khuôn banđầu Khi có mặt enzym reverse transcriptase, các trình tự mARN được phiên mã ngược thành cácphân tử ADN sợi kép, và những phân tử này có thể được gắn vào các véctơ

Để có thể phân lập được các đoạn cài riêng rẽ từ thư viện hệ gen, các tế bào E coli được tiếnhành biến nạp với tất cả các phân đoạn trong thư viện Mỗi một tế bào biến nạp thường chỉ mangduy nhất một véctơ mang đoạn cài ADN Vì vậy, khi các tế bào nhân lên sau đó chúng sẽ sẽ tạo ranhiều dòng tế bào, mỗi dòng chứa nhiều bản sao của một phân đoạn trong thư viện cADN Khuẩnlạc được tạo ra từ các tế bào mang các trình tự ADN mong muốn có thể được phân lập và từ đó thulại ADN Có một số cách để xác định các dòng tế bào đã mang gen biến nạp Chẳng hạn phươngpháp được nêu dưới đây sử dụng các mẫu dò ARN và /hoặc ADN để xác định các quần thể tế bàomang một đoạn ADN nhất định nào đó.

2.9 Sử dụng lai mẫu dò để xác định các dòng tế bào trong thư viện gen

Trong phương pháp sử dụng mẫu dò, người ta sử dụng các đoạn trình tự ADN /ARN có trình

tự bổ trợ được đánh dấu và lai với các dòng tế bào mang các đoạn gen cài khác nhau trong thư viện

hệ gen Kỹ thuật này được gọi là phương pháp lai khuẩn lạc Một thư viện hệ gen điển hình thườngchứa hàng ngàn đoạn cài khác nhau được mang bởi cùng một loại véctơ tách dòng Sau khi véctơđược biến nạp vào một chủng vi khuẩn phù hợp, các tế bào vi khuẩn được cấy trên bề mặt đĩa petrichứa môi trường bán rắn chứa agar Mỗi tế bào sau đó sẽ phát triển lên thành một khuẩn lạc riêng rẽ,

và các tế bào trong cùng một khuẩn lạc đều mang cùng loại véctơ và đoạn gen cài giống nhau

Trong kỹ thuật lai khuẩn lạc, người ta cũng có thể sử dụng loại màng lai được dùng trong cácphương pháp thẩm tách Southern và Northern để thu hồi được một lượng “vết” ADN đủ cho sự kếtcặp với mẫu dò ở đây, người ta sẽ dùng màng lai ép lên bề mặt đĩa nuôi cấy chứa khuẩn lạc và inhình chúng lên màng lai (cùng với ADN của chúng) sao cho vị trí của các dòng tế bào trên màng laitương ứng với các vị trí khuẩn lạc của chúng trên đĩa petri (theo nguyên tắc “đóng dấu”) Điều nàyđảm bảo cho việc khi chúng ta xác định được một vị trí trên màng lai có kết quả “dương tính” vàviệc bắt cặp với mẫu dò thì chúng ta sẽ xác định được tương ứng khuẩn lạc mang dòng tế bào chứavéctơ tái tổ hợp mang đoạn gen cài mong muốn

Màng lai được đem lai với mẫu dò như sau: người ta tiến hành xử lý màng lai sao cho màng

tế bào vỡ ra và các phân tử ADN thoát ra ngoài gắn lên màng lai tại chính vị trí tế bào của chúng.Các màng lai sau đó được ủ với các mẫu dò được đánh dấu từ trước trong các điều kiện giống nhưkhi tiến hành các kỹ thuật thẩm tách Northern hay Southern

Trong công nghệ ADN tái tổ hợp, ngoài các véctơ plasmit có nguồn gốc vi khuẩn, người tacòn có thể sử dụng véctơ có nguồn gốc virut (bacteriophage), hoặc từ các sinh vật bậc cao hơn nhưnhiễm sắc thể nhân tạo nấm men (YAC), hay nhiễm sắc thể nhân tạo có nguồn gốc vi khuẩn (BAC),hoặc một số véctơ lai giữa chúng (vd: cosmid, P) Trong các véctơ có nguồn gốc bacteriophage,phage l được sử dụng phổ biến ADN của virut này được cải biến và sử dụng như véctơ tách dòng.Véctơ này được sử dụng để tách dòng các thư viện hệ gen về nguyên tắc giống hệt như khi sử dụngcác véctơ plasmit Chỉ có một điểm khác là khi tiến hành lai để xác định các dòng gen biến nạp thì

vị trí các mẫu dò được xác định trên màng lai tương ứng với vị trí các vết tan thay cho vị trí cáckhuẩn lạc như khi sử dụng véctơ tách dòng plasmit

B CÂU HỎI LÝ THUYẾT TỰ LUẬN

1 Thế nào là DNA tái tổ hợp invitro ? Tại sao kĩ thuật tái tổ hợp DNA còn gọi là kĩ thuật tạo

dòng phân tử ?

DNA tái tổ hợp invitro là DNA tạo thành do ghép nối những đoạn DNA khác nhau trong ống

nghiệm và biểu hiện hoạt tính khi đưa trở lại tế bào sống Kĩ thuật tái tổ hợp DNA còn gọi là kĩ thuậttạo dòng phân tử vì cho phép từ một bản sao của một đoạn acid nucleic nhân lên thành dòng gồm các bản sao giống nhau

2 Ý nghĩa của enzyme restrictase ?

+ Giúp vi khuẩn nhận biết và hạn chế khả năng sinh sản của phage bằng khả năng cắt DNA một cách đặc hiệu của restrictase enzyme

+ Enzyme restrictase được dùng để cắt DNA trong kĩ thuật tái tổ hợp DNA

3 Nững loại enzyme nào được dùng để cắt, nối và sao chép gene ? Loại enzyme nào đóng vai trò hàng đầu ?

Nuclease, DNA polymerase, ligase, reverse transcriptase, terminal transferase, hàng đầu là restrictase

4 Một gene cấu trúc biết rõ trình tự đã được tổng hợp nhân tạo lần đầu tiên bởi nhóm của Khorona vào 1969 nhưng gene này không có hoạt tính Giải thích.

Thiếu trình tự điều hòa (promoter)

5 Tạo nòi vi khuẩn sản xuất insulin bằng phương pháp hóa tổng hợp gene như sau: dùng ligase nối các đoạn oligonucleotide đã tổng hợp thành polynucleotide Polynucleotide được gắn vào plasmid Tế bào chứa plasmid mang gene insulin sẽ sản xuất ra proinsulin, qua xử lí hóa học sẽ thu được insulin Ở một thí nghiệm người ta thấy tế bào chứa plasmid mang gene insulin không tổng hợp ra proinsulin Giải thích.

Do plasmid không có gắn promoter cần cho sự phiên mã gene lạ

6 Có 3 phương pháp thu nhận gene để thực hiện kĩ thuật tái tổ hợp DNA:

Cách 1: Tách các đoạn DNA từ hệ gene: dùng enzyme restriction cắt toàn bộ DNA thành các đoạn nhỏ rồi gắn vào vector mang gene tạo plasmid tái tổ hợp

Cách 2:Hóa tổng hợp nhân tạo gene (xem câu 5)

Cách 3: sinh tổng hợp gene từ mRNA tương ứng: tổng hợp cDNA mạch đơn từ mRNA trưởng thànhnhờ enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase), sau đó dùng DNA polymerase tổng hợp cDNA mạch kép từ cDNA mạch đơn Gắn cDNA mạch kép vào plasmid và biến nạp vào tế bào vi khuẩn

Trong thực tiễn kĩ thuật di truyền, người ta thường dùng cách nào ? Giải thích.

+Trong thực tiễn kĩ thuật di truyền, người ta thường dùng cách 3

+cách 1:tách các đoạn DNA từ hệ gene có nhiều bất lợi: hệ gene của những sinh vật khác nhau chứa rất nhiều gene; số đoạn DNA tạo ra có thể rất nhiều trong đó có những đoạn DNA tương tự nhau; số đoạn DNA rất nhiều nên cần một số lượng rất lớn các dòng vi khuẩn mang DNA; phần lớn

DNA Eukarytotae bậc cao không mã hóa tổng hợp protein nên dễ làm tốn công vô ích khi tạo dòng

Tuy nhiên, cách này vẫn dùng có hiệu quả trong lập ngân hàng của DNA hệ gene hay thư viện DNA

hệ gene

+cách 2: Phải biết trình tự nucleotide của gene Tuy nhiên, nhờ sự phát triển của phương pháp nghiên cứu cấu trúc bậc một của protein và các sản phẩm khác của gene cùng phương pháp xác địnhtrình tự nucleotide đã thúc đẩy nhanh cách này

+cách 3:dòng cDNA của hệ gene là những đoạn nucleotide ngẫu nhiên, gần như không phụ thuộc loại tế bào dùng để lấy DNA; dòng cDNA chứa trình tự mã hóa liên tục nên cDNA có thể tổng hợp

protein cần thiết với số lượng lớn; protein được tạo ra với số lượng lớn thì mRNA của protein đó có

tỉ lệ cao nên dễ xác định đúng dòng cDNA mong muốn

7 Vector chuyển gene là gì ?

Vector chuyển gene là phân tử DNA có khả năng tự sao chép, tồn tại độc lập trong tế bào mà không nhất thiết phải gắn vào hệ gene tế bào chủ và mang được gene mong muốn với số lượng lớn Vector phải gắn thêm promoter (trình tự điều hòa) tạo thuận lợi cho sự phiên mã gene lạ cũng như các gene đánh dấu để dễ dàng phát hiện ra vector hay gene lạ gắn vào Vector được cấu tạo tùy theo mục tiêu sử dụng và được cải tiến không ngừng

8 Vì sao vector phage λ được dùng rộng rãi để lập ngân hàng gene thay vì đưa plasmid vào tế báo vi khuẩn bằng biến nạp ?

+Dễ bảo quản, dễ tách ra để phân tích, dễ loại bỏ

+Có hệ thống tự động xâm nhập và sinh sản trong tế bào vi khuẩn

+Một ưu thế của phage là có khả năng mang đoạn DNA lạ dài hơn so với plasmid

+Dễ xác định DNA lạ đã gắn vào phage chưa

9 Vì sao để đưa DNA tái tổ hợp vào thực vật nhiễm gene (transgenic plant) người ta thường bắn DNA trực tiếp vào tế bào mà không tạo tế bào trần ?

+Tạo tế bào trần: phải làm mất vách tế bào để DNA ngấm vào trong; thường tế bào có sức sống kém, khó phân chia để tự tái sinh

+DNA được bắn với tốc độ nhanh, xuyên thủng vách tế bào vào trong

10 Tại sao PCR có vai trò cách mạng hóa nghiên cứu cấu trúc và chức năng của gene ?

+Thời gian thực hiện cực nhanh, đơn giản và ít tốn kém

+Độ tinh sạch của mẫu không cần cao

+Khuyếch đại nhanh nhiều bản sao của các đoạn acid nucleic mà không cần tạo dòng

+Được hoàn thiện không ngừng và có nhiều ứng dụng như xác định trình tự nucleotide, gây đột biếnđiểm định hướng, Có thể thực hiện PCR ngay trong tế bào với cả DNA và RNA

11 Làm sao tạo đột biến điểm định hướng tức là chủ động gây đột biến tại một điểm chuyên biệt mong muốn ?

+Làm mất đoạn

+Làm tăng đoạn

+Nối các đoạn gene lại

+Thay thế 1 nucleotide này bằng 1 nucleotide khác

12 Vì sao lai acid nucleic và PCR được coi là phương pháp chẩn đoán mới trong y học ?

+Tác nhân gây bệnh nhiễm trùng nếu hiện diện đủ cho phân tích thì không cần nuôi cấy

+Có thể dùng được ngay khi vi sinh vật gây bệnh không nuôi được như các bệnh do nhiễm virus.+Một mẫu có thể xác định đại diện cho tất cả serotype

+Có thể tạo dòng ngay chính gene bệnh để sản xuất mẫu thử tương ứng