chuyên đề “ứng dụng di truyền học tạo giống bằng công nghệ gen

Vector tách dòng được sử dụng để chuyển gen nhằm tạo số lượng lớn cácbản sao của một gen hoặc một trình tự DNA trong các tế bào chủ.. Vector biểu hiện mạnh là các vector có các đặc điểm:

CHUYÊN ĐỀ DUYÊN HẢI VÀ ĐỒNG BẰNG BẮC BỘ

LẦN THỨ XII – NĂM 2019



-CHUYÊN ĐỀ ỨNG DỤNG DI TRUYỀN HỌC TẠO GIỐNG

BẰNG CÔNG NGHỆ GEN

* * *

tháng 8 năm 2019

MỤC LỤC

CHUYÊN ĐỀ 1

A PHẦN MỞ ĐẦU 5

1 Lý do chọn đề tài 5

2 Mục đích của đề tài 5

3 Nội dung của đề tài 5

4 Đối tượng áp dụng 6

5 Phương pháp nghiên cứu 6

B PHẦN NỘI DUNG 7

I KHÁI QUÁT VỀ CÔNG NGHỆ GEN 7

1 Công nghệ gen là gì? 7

2 Một số yếu tố cần thiết trong kỹ thuật gen 8

2.1 Gen cần tách dòng 8

2.2 Enzym giới hạn 8

2.2.1 Khái niệm enzyme giới hạn 8

2.2.2 Cách gọi tên enzyme giới hạn 8

2.3 Các loại enzyme thường sử dụng trong kỹ thuật gen 10

2.3.1 Enzyme xúc tác tổng hợp DNA, RNA 10

2.3.2 Enzyme DNA ligase 10

2.3.3 Các loại enzyme phân cắt acid nucleic 10

2.4 Vector tách dòng 11

2.4.1 Khái niệm 11

2.4.2 Các loại vector tách dòng 11

2.5 Vector biểu hiện gen 15

2.5.1 Đặc điểm cấu trúc vector biểu hiện gen 15

2.5.2 Các loại promoter thường sử dụng trong vector biểu hiện gen 16

3 Các thao tác cơ bản trong kỹ thuật chuyển gen 17

3.1 Tách acid nucleic từ tế bào 17

3.1.1 Tách chiết DNA từ tế bào hoặc tổng hợp nhân tạo DNA từ mRNA 17

3.1.1.1 Tách chiết DNA từ tế bào 17

3.1.1.2 Tổng hợp nhân tạo DNA từ mRNA 18

3.1.2 Tách chiết acid nucleic để làm vector tách dòng 18

3.1.4 Kiểm tra độ tinh sạch DNA, RNA 19

3.1.4.1 Kiểm tra độ tinh sạch DNA, RNA bằng điện di trên gel 19

3.1.4.2 Kiểm tra độ tinh sạch của DNA, RNA bằng quang phổ kế 21

3.2 Tạo vector tái tổ hợp 21

3.3 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ 22

3.4 Sàng lọc các dòng tế bào mang các vector tái tổ hợp 23

3.4.1 Chọn lọc tế bào tái tổ hợp bằng chỉ thị kháng sinh 23

3.4.2 Chọn lọc dòng tế bào tái tổ hợp bằng gen chỉ thị màu 25

3.4.3 Chọn lọc dòng tế bào bằng phương pháp lai phân tử 25

3.5 Nuôi cấy tế bào tái tổ hợp để thu sản phẩm 25

II ỨNG DỤNG CỦA CÔNG NGHỆ GEN 26

2.1 Nghiên cứu cơ bản về cấu trúc và chức năng của gen 26

2.1.1 Tách dòng gen 26

2.1.1.1 Xây dựng thư viện hệ gen 27

2.1.1.2 Xây dựng thư viện cDNA 28

2.1.2 PCR và ứng dụng của PCR 30

2.2 Ứng dụng công nghệ gen trong y học, dược học 35

2.2.1 Liệu pháp gene 35

2.2.2 Ứng dụng công nghệ gen trong sản xuất các chế phẩm sinh học 36

2.3 Ứng dụng công nghệ gen tạo các sinh vật biến đổi gen 40

2.3.1 Các phương pháp chuyển gen 40

2.3.1.2 Phương pháp chuyển gen gián tiếp 40

2.3.1.3 Phương pháp chuyển gen trực tiếp 42

* Chuyển gen nhờ siêu âm 42

* Chuyển gen trực tiếp bằng cách lắc với silicon carbide 42

* Chuyển gen bằng kỹ thuật điện xung 43

* Chuyển gen bằng kỹ thuật vi tiêm 43

2.3.2 Chuyển gen ở thực vật 43

2.3.3 Chuyển gen ở động vật 45

III MỘT SỐ CÂU HỎI, BÀI TẬP VỀ CÔNG NGHỆ GEN 48

C -ỨNG DỤNG THỰC TIỄN CỦA CHUYÊN ĐỀ 70

D PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 71

1 KẾT LUẬN 71

2 ĐỀ NGHỊ 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO 72

72

CHUYÊN ĐỀ ỨNG DỤNG DI TRUYỀN HỌC TẠO GIỐNG BẰNG CÔNG NGHỆ GEN

Tác giả: Đỗ Thị Loan Trường Trung học phổ Chuyên Hưng Yên

A PHẦN MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Những hiểu biết sâu sắc về di truyền học có vai trò cách mạng hóa đối với sựphát triển của loài người Di truyền học đã cung cấp cơ sở khoa học cho nhữngứng dụng trong thực tiễn sản xuất chọn giống vi sinh vật, vật nuôi và cây trồng.Đặc biệt, sự ra đời của kỹ thuật di truyền đã cung cấp cho con người công cụvượt giới hạn trong cuộc cách mạng công nghệ sinh học tạo sự chuyển biến lớntrong nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm, y dược học và nhiều lĩnh vực khác.Hiện nay, trong thời đại công nghệ sinh học phát triển, chương trình Sinhhọc trung học phổ thông tổng thể cũng đổi mới, cập nhật những ứng dụngnguyên lí, quy trình công nghệ sinh học trong giảng dạy Và những kiến thứcnày cũng là một chuyên đề quan trọng trong thi THPT Quốc gia và thi học sinh

giỏi quốc gia môn Sinh học Vì vậy, tôi chọn chuyên đề “Ứng dụng di truyền

học tạo giống bằng công nghệ gen” giúp hệ thống lại kiến thức lý thuyết và các

câu hỏi, bài tập củng cố cho học sinh ôn tập trong thi THPT Quốc gia và thi Họcsinh giỏi quốc gia môn Sinh học

+ Khái quát về công nghệ gen

+ Các ứng dụng của công nghệ gen

- Một số câu hỏi, bài tập về công nghệ gen

4 Đối tượng áp dụng

- Học sinh ôn thi trung học phổ thông Quốc gia

- Học sinh ôn thi học sinh giỏi các cấp

- Các giáo viên Sinh học

5 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp thu thập tài liệu

B PHẦN NỘI DUNG

Công nghệ gen được ứng dụng trong nghiên cứu hệ gen, phân tích các sảnphẩm của gen, trong y học, dược học và trong nông nghiệp tạo ra các sản phẩmchuyển gen cho năng suất, chất lượng cao giúp đem lại lợi ích kinh tế to lớn chocon người

I KHÁI QUÁT VỀ CÔNG NGHỆ GEN

cơ thể sinh vật mới mang những đặc tính mới, cũng như tạo ra sản phẩm mới.Công nghệ di truyền sử dụng các phương pháp sinh học phân tử để táchDNA từ cơ thể sống và sau đó cắt, nối các gen trên DNA Bằng cách như vậy,người ta có thể loại bỏ các gen không mong muốn và đưa vào các gen mới đặchiệu theo chủ ý lựa chọn Các thao tác cắt, nối trên DNA được thực hiện bênngoài cơ thể sống trong các ống nghiệm (in vitro) Phân tử DNA mới được tạodựng sau các thao tác cắt, nối có một số đặc điểm khác với phân tử DNA banđầu được tách ra từ tế bào sống, được gọi là DNA tái tổ hợp và kỹ thuật nàyđược gọi là kỹ thuật tái tổ hợp DNA Sự tái tổ hợp DNA được đánh giá là thànhcông chỉ sau khi đưa được phân tử DNA tái tổ hợp vào trong tế bào sống vàchúng biểu hiện các hoạt tính di truyền và ở thế hệ con cháu sẽ mang phân tửDNA tái tổ hợp

Ba lĩnh vực ứng dụng chủ yếu của công nghệ gen là:

- Nghiên cứu cơ bản về cấu trúc và chức năng của gen

- Sản xuất các chế phẩm sinh học

- Tạo các sinh vật biến đổi gen

2 Một số yếu tố cần thiết trong kỹ thuật gen

2.1 Gen cần tách dòng

- Gen cần tách dòng thường là những gen mã hoá các protein, enzym hoặcgen mã hoá các đặc điểm quý (năng suất cao, khả năng chống bệnh…) cần thiếtcho con người trong thực tiễn sản xuất hoặc trong nghiên cứu Gen này có thểđược tách chiết từ bộ gen vi sinh vật, động thực vật và con người hoặc tổng hợpnhân tạo từ mRNA theo con đường sao mã ngược

2.2 Enzym giới hạn

2.2.1 Khái niệm enzyme giới hạn

Enzyme giới hạn (Restriction Enzyme - RE) là enzyme có khả năng nhậnbiết các trình tự nucleotid đặc hiệu trên phân tử DNA và cắt đặc hiệu phân tửDNA tại những vị trí nhất định thành những đoạn ngắn

Căn cứ vào khả năng nhận biết vị trí và cắt đặc hiệu của enzyme mà người ta

2.2.2 Cách gọi tên enzyme giới hạn

Cách gọi tên enzyme giới hạn được thống nhất ký hiệu bằng 3- 5 chữ cáikèm theo các số La Mã

Chữ cái đầu tiên viết hoa, chỉ tên chi của vi khuẩn (sinh vật) đã tách đượcenzyme giới hạn

Hai chữ cái tiếp theo viết thường, chỉ loài hoặc giống vi sinh vật đã táchđược enzyme giới hạn

Chữ cái tiếp theo viết hoa chỉ tên chủng của vi khuẩn đã tách được enzyme

Chữ số La Mã chỉ số thứ tự dòng vi khuẩn hoặc sinh vật mà enzyme giới hạnđược phát hiện.

co là tên giống coli

R là tên chủng Ry13

I là thứ tự dòng vi khuẩn

2.2.3 Các kiểu cắt của enzyme giới hạn:

Enzyme giới hạn có hai kiểu cắt

Cắt thẳng tạo ra các đầu bằng, enzyme giới hạn cắt cả hai mạch của phân tử

DNA cùng một điểm tạo các đoạn cắt có đầu bằng (hay đầu tù) (blunt ends).

Các đoạn DNA tạo ra có đầu bằng nên không có khả năng tự dính lại với nhau

Do vậy để nối các đoạn DNA có đầu bằng phải sử dụng enzyme nối (DNAligase) hoặc các adaptor (bộ chuyển đổi) chuyên dụng cho mỗi loại enzyme

Cắt lệch (cắt sole): Các enzyme giới hạn nhận biết và cắt phân tử DNA ở các

vị trí khác nhau giữa hai mạch đơn DNA tạo nên các đoạn cắt có đầu sole (hay

đầu dính – sticky ends) Có 2 loại là đầu dính 5’ và đầu dính 3’ Các đầu so le cóthể tự nối lại với nhau mà không cần có mặt của enzyme nối, do đó các enzymecắt tạo đầu so le hay được sử dụng trong công nghệ gen

Ví dụ: enzyme EcoR I nhận biết đoạn có 6 nucleotid và cắt tạo đầu so le

Tên và kiểu cắt của một số enzyme giới hạn:

2.3 Các loại enzyme thường sử dụng trong kỹ thuật gen

2.3.1 Enzyme xúc tác tổng hợp DNA, RNA

Nhóm enzyme xúc tác tổng hợp DNA gọi chung là DNA polymerase, gồmrất nhiều loại khác nhau có vai trò xúc tác gắn các nucleotid mới vào chuỗimạch đơn DNA đang tổng hợp Một số loại enzyme DNA polymerase điển hìnhlà: Taq DNA polymerase, Stoffel DNA polymerase, Pfu DNA polymerase, VentDNA DNAmerase, T4 DNA polymerase, enzyme phiên mã ngược, enzyme xúctác tổng hợp RNA,…

2.3.2 Enzyme DNA ligase

Enzyme DNA ligase là loại enzyme xúc tác hình thành các liên kếtphosphoeste nối các đoạn DNA với nhau Mỗi loại enzyme DNA ligase có cáctính chất đặc trưng riêng, có khả năng nối các đoạn DNA đầu bằng hoặc đầu sole

VD: Enzyme E.coli DNA ligase chỉ nối các đoạn DNA có đầu so le, còn T4

DNA ligase là enzyme được tách chiết từ thực khuẩn thể T4, có khả năng nốicác đoạn DNA cắt đầu bằng hoặc đoạn DNA cắt so le được sử dụng rộng rãitrong kỹ thuật gen Trong kỹ thuật gen còn chứa một số loại enzyme khác thamgia vào phản ứng nối DNA như T4 polynucleotide kinase, Alkalinephosphatase…

2.3.3 Các loại enzyme phân cắt acid nucleic

Các enzyme phân cắt phân tử DNA (DNase) hoặc cắt phân tử RNA (RNase)

có vai trò quan trọng trong các kỹ thuật tinh sạch DNA, RNA, trong phản ứng

nhau: DNase I, Nuclease S1, Exonuclease… Các loại enzyme cắt RNA chủ yếugồm RNase A, RNase H…

2.4 Vector tách dòng

2.4.1 Khái niệm

Vector tách dòng (cloning vector) còn gọi là phương tiện chuyển gen Vectortách dòng là thường là các phân tử DNA có kích thước nhỏ cho phép cài cácđoạn DNA cần thiết, có khả năng tái bản không phụ thuộc vào sự phân chia của

tế bào, tồn tại trong tế bào vật chủ qua nhiều thế hệ không gây biến đổi bộ gencủa tế bào vật chủ

Vector tách dòng phải có nhiều điểm cắt đặc hiệu duy nhất cho các loạienzyme giới hạn khác nhau, đồng thời mang các gen “tín hiệu” (gen chỉ thị màuhoặc chỉ thị kháng sinh) để dễ dàng nhận biết các tế bào mang vector tái tổ hợp

Đặc điểm cần thiết của các vector tách dòng:

- Kích thước vector càng nhỏ càng tốt để có thể cài DNA có kích thước tối

đa Kích thước vector nhỏ càng dễ xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và sao chépcàng nhanh

- Vector phải có điểm khởi đầu tái bản (ori), tức là có khả năng để tái bản

- Vector có khả năng xâm nhập vào tế bào

- Vector phải có đặc điểm cho phép dễ nhận biết chúng trong tế bào chủ.Chúng thường chứa các gen kháng chất kháng sinh hoặc gene tổng hợp chấtmàu, dễ dàng phát hiện trong môi trường thạch

Vector tách dòng được sử dụng để chuyển gen nhằm tạo số lượng lớn cácbản sao của một gen hoặc một trình tự DNA trong các tế bào chủ Vector táchdòng có vai trò quan trọng trong tách dòng gen, giải trình tự gen hoặc xây dựngcác bản đồ gen…

2.4.2 Các loại vector tách dòng

2.4.2.1 Vector tách dòng là plasmid

Plasmid là các phân tử DNA xoắn kép dạng vòng, có kích thước nhỏ, trong

tế bào chất của tế bào vi khuẩn hoặc tế bào nấm men Kích thước trung bình củaplasmid từ 1 – 5 kb, plasmid có khả năng tự tái bản độc lập với sự phân chia tếbào Plasmid cho cài gắn các đoạn DNA lạ, không gây ảnh hưởng tới chức năng

và hoạt động của tế bào Plasmid ở vi khuẩn mang một số ít gen như các gen xácđịnh giới tính, gen kháng chất kháng sinh, gen sinh độc tố… Mỗi loài vi khuẩn

có các loại plasmid đặc trưng riêng

VD: Vi khuẩn E.coli có nhiều loại plasmid khác nhau: plasmid giới tính F,

plasmid Col E1 mang gen sinh độc tố colicin ức chế sinh trưởng và tiêu diệt cácloại vi khuẩn khác…

Qui ước: viết tên một plasmid gồm chữ p viết thường (viết tắt của chữplasmid) đầu tiên, sau đó là một hoặc hai, ba chữ tiếp theo viết hoa chỉ chữ đầutên tác giả tạo nên plasmid hoặc tên vi khuẩn phát hiện plasmid và chữ số chỉthứ tự chủng vi khuẩn có plasmid đó

VD: pBR322: B – Bolivar, R – Rodriguez là tên hai tác giả tạo nên plasmidnày, 322 chỉ số thứ tự

Vector tách dòng phage có một số ưu điểm hơn so với plasmid như vectorphage cho cài gắn đoạn DNA kích thước lớn hơn plasmid, phage có hệ thốnggen giúp xâm nhiễm và tạo nên số bản sao rất cao trong tế bào vi khuẩn Vectortách dòng là phage được sử dụng làm vector tách dòng hiêu quả ở cả tế bào chủ

là Prokaryote và Eukaryote

Cấu trúc vector phage M13mp18

2.4.2.3 Vector tách dòng là phagemid

Phagemid cấu tạo gồm một số gen của plasmid (các gen chỉ thị, đoạn ori…)

và một phần gen của phage (đoạn ori, các gen cần thiết cho sự đóng gói)

2.4.2.4 Vector tách dòng là cosmid

Vector cosmid được thiết kế từ một đoạn của plasmid và đoạn cos của phage

λ Trình tự cos điều khiển đóng gói DNA của phage vào phần đầu của phage.Vector tách dòng là cosmid cho phép cài gắn đoạn DNA có kích thước lớn 40 -

50 kb

VD: Vector SuperCos kích thước 7,9kb có cấu trúc gồm 2 đoạn cos của bộgen phage, 2 gen chỉ thị kháng sinh (ampicilin và neomycin), đoạn ori của virusSV40 và đoạn đa cắt nối (MCS) Vector cosmid cho cài gắn DNA có kích thước

2.4.2.5 Vector tách dòng là các NST nhân tạo

Bộ gen của sinh vật bậc cao có kích thước rất lớn Do đó, khi thiết lập cácngân hàng bộ gen, ngân hàng cDNA sử dụng các loại vector plasmid, phage,phagemid, cosmid… tạo nên số lượng dòng rất lớn, gây khó khăn trong táchdòng Các NST nhân tạo được thiết kế làm vector tách dòng, cho phép cài gắncác đoạn DNA có kích thước rất lớn từ 100kb – hàng nghìn kb, tạo thuận lợitrong tách dòng và lập ngân hàng gen

Vector tách dòng là NST nhân tạo vi khuẩn BAC (Bacteria ArtificialChromosomes): Cấu trúc vector BAC gồm các đoạn ori, các gen chỉ thị đặchiệu, đoạn đa cắt nối (MCS – many cloning site) và promoter đặc hiệu

Vector BAC cho phép cài gắn đoạn DNA kích thước từ 100kb – 300kb.Vector BAC được ứng dụng nhiều trong lập ngân hàng bộ gen và giải trình tự bộgen của sinh vật Prokaryote và Eukaryote

Vector tách dòng là NST nhân tạo nấm men (YAC – Yeast ArtificialChromosomes) có thể cho cài gắn đoạn DNA lớn tới 2000kb Vector YAC đượcthiết kế từ một số trình tự đặc hiệu của bộ gen nấm men, trong đó có 3 trình tựquan trọng là trình tự tái bản ARS (Autonomous Replicating Sequences), tâmđộng CEN (centromer) và trình tự TEL (telomer)

Ngoài các trình tự chủ yếu ARS, CEN, TEL… vector YAC còn được gắnthêm các gen chỉ thị đặc hiệu với tế bào nấm men trpI (auxotrophs), ura3(uracin), leu2 (leucin), his3 (histidin)… các gen chỉ thị kháng sinh và các đoạnori của vi khuẩn hoặc đoạn đa cắt nối (MCS)…

2.4.2.7 Vector tách dòng ở tế bào sinh vật Eukaryote

Nhiều loại vector tách dòng plasmid, cosmid… hoạt động kém ở các tế bàothực vật và động vật bậc cao Do vậy, trong tách dòng gen và chuyển gen ở độngvật có vú và nhiều loài sinh vật bậc cao khác, người ta thường sử dụng vectortách dòng là các loại virus được cải tiến bộ gen, cắt bỏ các gen độc lực và càigắn thêm các gen chỉ thị đặc hiệu

Các loại virus SV40 (Simian virus), adenovirus, retrovirus, baculovirus vàvirus herpes…cải biến bộ gen (loại bỏ các gen độc, thêm các gen chỉ thị và cácđoạn MCS…) được sử dụng làm vector tách dòng, vector chuyển gen ở sinh vậtbậc cao

2.5 Vector biểu hiện gen

2.5.1 Đặc điểm cấu trúc vector biểu hiện gen

Vector biểu hiện là những vector tách dòng mang các promoter mạnh, chophép biểu hiện đồng thời cả gen chỉ thị và gen tách dòng tạo nên các protein lai

Để tạo ra vector biểu hiện, thường người ta sử dụng ngay chính các vectornhân dòng, rồi bổ sung thêm một promoter (trình tự tín hiệu khởi đầu phiên mã)

và có thể thêm cả trình tự tín hiệu kết thúc phiên mã phù hợp với loại tế bào chủ

mà gen nhân dòng được biểu hiện Vậy một vector biểu hiện gen gồm các thànhphần chủ yếu: promoter mạnh, trình tự khởi đầu sao chép (ori), vị trí khởi đầuphiên mã, vị trí bám của riboxom, tín hiệu kết thúc quá trình dịch mã, các trình

tự đa cắt nối (MCS) và các gen chỉ thị

Vector biểu hiện mạnh là các vector có các đặc điểm: có khả năng tạo sốlượng lớn bản sao trong tế bào chủ; promoter hoạt động mạnh, dịch mã tạonhiều protein lai; đoạn trình tự MCS có nhiều vị trí cắt đặc hiệu của nhiều loạienzym giới hạn; vector vẫn giữ được hoạt tính khi cài gắn gen tách dòng kíchthước lớn; hoạt động của vector không ảnh hưởng hoặc gây ức chế tế bào chủ;gen chỉ thị dễ dàng nhận biết…

2.5.2 Các loại promoter thường sử dụng trong vector biểu hiện gen

Các loại vector biểu hiện gen trong tế bào prokaryote thường sử dụng cácpromoter mạnh của thực khuẩn thể (T7 promoter; T3 promoter,…) hoặc một sốpromoter mạnh của vi khuẩn (Lac promoter, Trp promoter, Lac UV5promoter…)

Biểu hiện trong tế bào eurokaryote thường sử dụng các vector biểu hiện gen

có các promoter mạnh của virus CMV promoter, SV40 promoter…hoặc cácpromoter mạnh gen nấm men như PGK promoter, ADH I promoter, GALpromoter, AOX I promoter…

2.6 Các hệ thống biểu hiện gen

Biểu hiện gen tạo sản phẩm protein tái tổ hợp là kỹ thuật quan trọng, quyết

dụng trong biểu hiện gen bao gồm: tế bào vi khuẩn, tế bào nấm men, tế bàotrứng động vật có vú và baculovirus,…

Mỗi loại hệ thống biểu hiện gen có đặc điểm đặc trưng riêng, cùng với cácthuận lợi và hạn chế nhất định Cần căn cứ vào đặc điểm của gen biểu hiện, bảnchất của protein tách dòng và protein lai, cũng như điều kiện cụ thể của từngphòng thí nghiệm để lựa chọn hệ thống biểu hiện gen thích hợp

3 Các thao tác cơ bản trong kỹ thuật chuyển gen

Trọng tâm của công nghệ gen là kỹ thuật chuyển gen tạo DNA tái tổ hợpnhằm chuyển gen từ tế bào này sang tế bào khác Kỹ thuật chuyển gen có thểchia thành 5 bước sau: 1) tách acid nucleic khỏi tế bào, 2) tạo vector tái tổ hợp,3) biến nạp vector tổ hợp vào tế bào chủ, 4) sàng lọc các dòng tế bào mangvector tái tổ hợp, 4) sàng lọc các dòng tế bào mang các vector tái tổ hợp, 5) nuôicấy tế bào tái tổ hợp để thu sản phẩm

3.1 Tách acid nucleic từ tế bào

- Gen cần tách dòng có thể được chuẩn bị theo hai con đường: tách chiết từ

bộ gen vi sinh vật, động thực vật và con người hoặc tổng hợp nhân tạo cácoligonucleotid từ mRNA Trong thực tế, các gen mang các đặc điểm quý hiếm,cần thiết cho con người chủ yếu được tách chiết từ bộ gen vi sinh vật hoặc từ bộgen sinh vật bậc cao

Đồng thời, cũng cần tách các vector tách dòng như plasmid ra khỏi tế bào vikhuẩn hay bộ gen của phage để chuẩn bị tạo vector tái tổ hợp

3.1.1 Tách chiết DNA từ tế bào hoặc tổng hợp nhân tạo DNA từ mRNA 3.1.1.1 Tách chiết DNA từ tế bào

Nguyên tắc chung tách chiết DNA:

Chuẩn bị mẫu  Phá vỡ tế bào Hòa tan DNA Loại bỏ tạp chất (Protein,polysaccharide,…) Tủa DNA – Rửa DNA Làm khô Kiểm tra chất lượngDNA

- Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân (tế bào Eukaryote) Thông thườngngười ta nghiền tế bào, mô trong một hỗn hợp chất tẩy (SDS, sarcosyl) vàproteinase (proteinase K) Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân,giải phóng DNA ra môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết vớiDNA

- Bước 2: loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu làcác protein Mẫu được lắc thật mạnh trong một dung dịch phenol và chloroform,

không hòa tan axit nucleic Protein khi bị biến tính sẽ không còn hòa tan trongpha nước có chứa axit nucleic và sau khi li tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữapha nước và pha phenol : chloroform Pha nước có chứa axit nucleic được thunhận lại.

- Bước 3: Tủa axit nucleic Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận lại axitnuclêic dưới dạng cô đặc, một mặt nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của cácenzyme, mặt khác để có thể hòa tan lại trong dung dịch theo nồng độ mongmuốn Có 2 cách tủa thông dụng là tủa trong ethanol và tủa trong isopropanol

3.1.1.2 Tổng hợp nhân tạo DNA từ mRNA

- Tách chiết RNA toàn phần cũng bao gồm các bước cơ bản như đối vớiDNA

- Tách chiết mRNA: 90 – 99% RNA tổng số là rRNA, tRNA Các loại RNAnày có kích thước và trình tự xác định và có thể tách riêng một cách dễ dàngbằng điện li và li tâm Riêng mRNA chiếm 1-5% có kích thước và trình tự đadạng, song chúng có 1 đặc điểm chung là có đuôi polyA nên người ta có thể táchriêng ra bằng sắc kí cột oligo dT – cellulose

- Tổng hợp nhân tạo DNA từ mRNA: Từ mRNA dưới sự xúc tác của enzymephiên mã ngược RT (Reverse transcriptase) và sự tham gia của các đoạn mồioligo dT ngắn (12-18 nucleotide) và các nguyên liệu dNTP (dATP, dTTP, dCTP,dGTP) sẽ tổng hợp mạch DNA mạch kép

3.1.2 Tách chiết acid nucleic để làm vector tách dòng

- Vector tách dòng có thể là plasmid của vi khuẩn hoặc bộ gen của phage,NST nấm men,vector nhân tạo…nên tùy kích thước gen cần chuyển và tế bàochủ mà chọn vector nào và cần tách chúng ra khỏi tế bào để sử dụng làm vectortách dòng

Lớp dịch lỏng chứa DNA

Thêm cồn tuyệt đối lạnh

và dung dịch muối

Li tâm, hút bỏ dịch lỏng

- Ví dụ chọn plasmid là vector tách dòng thì cần tách plasmid ra khỏi tế bào

vi khuẩn:

+ Chuẩn bị dịch nuôi cấy vi khuẩn thích hợp

đêm, ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 5-6 phút thu sinh khối

+ Phá vỡ tế bào bằng hoá chất hoặc siêu âm Sau đó xử lý natri acetat(pH=4,3) và ly tâm 12000 vòng trong 10 phút Sau ly tâm bộ gen và protein của

vi khuẩn kết tủa ở đáy, lớp dịch nổi phía trên chứa DNA plasmid Thu lớp dịchnổi, thêm ethanol hay làm lạnh để kết tủa DNA plasmid

3.1.4 Kiểm tra độ tinh sạch DNA, RNA

DNA hay RNA được tách chiết ở bước trên có thể bị lẫn tạp với protein haypolysaccharide,… Vì vậy, trước khi sử dụng cần kiểm tra độ tinh sạch củachúng Có 2 phương pháp là kiểm tra độ tinh sạch DNA, RNA bằng điện di trêngel và bằng quang phổ kế

3.1.4.1 Kiểm tra độ tinh sạch DNA, RNA bằng điện di trên gel

Kỹ thuật điện di sử dụng một loại gel là các hợp chất polyme nhưpolysaccharide Gel hoạt động như một chiếc “rây” cho phép phân tách các phẩn

tử acid nucleic, protein ra khỏi nhau dựa trên kích thước, độ tích điện, cấu trúc

và một số tính chất vật lý khác

- Điện di trên gel agarose (agarose gel electrophoresis)dùng để tách các đoạnDNA có kích thước từ 100 bp đến 50 kb.Tại pH > 7, DNA tích điện âm, dưới tácdụng của điện trường thì DNA sẽ chạy từ (-) về phía (+)

Tốc độ di chuyển của DNA trên gel phụ thuộc vào kích thước DNA, cấu trúcDNA (DNA siêu xoắn chạy nhanh nhất, dạng vòng chạy nhanh hoen dạng thẳngkhi có cùng khối lượng phân tử), nồng độ agarose, cường độ dòng điện, đệmđiện di, nhiệt độ,…

Kết quả điện di cho các vạch gọn, phân tách rõ ràng nghĩa là DNA trongmẫu đảm bảo cho nghiên cứu Nếu các vạch kéo dài hoặc phân tách không rõcần xử lý lại từ khâu xử lý proteinase K, để đảm bảo độ tinh sạch cuả mẫunghiên cứu.

3.1.4.2 Kiểm tra độ tinh sạch của DNA, RNA bằng quang phổ kế

Trên cơ sở mức độ hấp thụ ánh sáng khác nhau của các bazơ nitơ trong cácmạch đơn DNA, DNA mạch kép và RNA có thể xác định hàm lượng của DNA,RNA trong dịch chiết bằng chỉ số hấp phụ quang phổ

Để kiểm tra độ tinh sạch của DNA trong dịch chiết dựa vào tỷ lệ A260/A280 Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm của các mẫu DNA cho phépxác định nồng độ DNA trong dung dịch

đôi

CDNA (ng/ml) = OD260nm * 50 * độ pha loãng

Protein có mức hấp thụ cao nhất ở bước sóng 280 nm, đồng thời hấp thụ ởbước sóng 260 nm, do vậy tỷ lệ A260/ A280 biểu thị mức độ protein còn sót lạitrong dịch chiết DNA( RNA) được coi là tinh sạch khi tỷ số A260/ A280 = 1,8-2,0

3.2 Tạo vector tái tổ hợp

Dựa vào đặc điểm của gen cần tách dòng để lựa chọn loại vector tách dòng

và các enzym giới hạn phù hợp, nhằm thực hiện phản ứng ghép nối giữa các gencần chuyển với vector tách dòng tạo vector tái tổ hợp

Tùy thuộc vào kích thước đoạn DNA cần chuyển và tế bào chủ mà chọn vector tách dòng có thể là plasmid vi khuẩn, phage, phagemid, cosmid hay các NST nhân tạo,…

Enzyme giới hạn có khả năng nhận biết các trình tự nucleotid đặc hiệu trênphân tử DNA và cắt đặc hiệu phân tử DNA tại những vị trí nhất định thànhnhững đoạn ngắn

Cắt cả DNA cần chuyển và DNA vector bằng cùng 1 enzyme giới hạn đểtách đoạn DNA mục tiêu và mở vòng plasmid Mục đích cắt cả DNA cần chuyển

và DNA vector bằng cùng 1 enzyme giới hạn để tạo ra đầu dính bổ sung để cóthể gắn chúng với nhau Tùy loại enzyme cắt giới hạn có thể tạo ra đầu dínhbằng hoặc đầu dính so le nhau Sau đó chúng được gắn với nhau bằng enzymelygase để tạo DNA tái tổ hợp

3.3 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ

Sử dụng các cách khác nhau (sốc nhiệt, xung điện, bắn gen ) để đưa cácvector tái tổ hợp vào tế bào chủ Tạo điều kiện môi trường thích hợp để vectortái tổ hợp tồn tại và được nhân lên cùng tế bào chủ

Tế bào chủ có thể là tế bào vi khuẩn, nấm men, thực vật hay động vật, nhưng

thường dùng là tế bào vi khuẩn E.coli Một trong những phương pháp biến nạp

rộng ra cho DNA tái tổ hợp chui vào

Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ được thực hiện bằng nhiều kỹ thuậtkhác nhau: bắn gen, vi tiêm, xung điện, sốc nhiệt, sử dụng PEG (polyethyleneglycols)…

Hiệu quả biến nạp phụ thuộc vào loại tế bào chủ, kích thước vector tái tổhợp và kỹ thuật biến nạp thích hợp Để hiệu quả biến nạp cao, cần lựa chọn kỹthuật biến nạp thích hợp với mỗi loại tế bào chủ Thực tế, tỉ lệ biến nạp rất thấp

< 1/1000 Vì sau biến nạp, đa số tế bào không giành được plasmid mới Hơnnữa, một số tế bào đã được các plasmid tái khép vòng do thoát khỏi khửphosphat bằng phosphatase kiềm Một số giành được DNA ngoại lai không cóplasmid (DNA này sẽ tự hủy) Chỉ có một số ít tế bào được biến nạp DNA tái tổhợp Vì vậy, sau bước biến nạp cần phải biết được và tách được tế bào có DNAtái tổ hợp

Enzyme nối lygase

3.4 Sàng lọc các dòng tế bào mang các vector tái tổ hợp

Sàng lọc (screening) dòng tái tổ hợp là quá trình kiểm tra, chọn lọc và táchriêng các dòng tái tổ hợp có hoạt tính

Dòng tế bào tái tổ hợp (còn gọi là thể tái tổ hợp) là dòng các tế bào mangvector tái tổ hợp, được nuôi ở môi trường thích hợp thành các khuẩn lạc Tùytheo đặc điểm của gen chỉ thị có trong vector tái tổ hợp, có thể lựa chọn các tếbào tái tổ hợp theo nhiều phương pháp khác nhau Phương pháp chọn lọc tế bàotái tổ hợp có thể sử dụng nhiều kỹ thuật khác nhau: sử dụng chỉ thị kháng sinh,

sử dụng chỉ thị màu hoặc lai phân tử với mẫu dò đánh dấu phóng xạ, huỳnhquang…

3.4.1 Chọn lọc tế bào tái tổ hợp bằng chỉ thị kháng sinh

Là phương pháp đơn giản và dễ sử dụng

Dựa vào gen kháng chất kháng sinh trong vector tái tổ hợp, chuẩn bị môitrường dinh dưỡng có bổ sung chất kháng sinh tương ứng để nuôi cấy tế bào saubiến nạp Trong môi trường có chất kháng sinh tế bào chứa vector tái tổ hợp cógen kháng chất kháng sinh tồn tại và phát triển được

Ví dụ sàng lọc DNA tái tổ hợp với vector tách dòng là pBR322 pBR322

Trong pBR322, DNA đích được xen vào vị trí BamHI nằm ở gen TetR Saubước biến nạp, có 3 loại tế bào: tế bào không chứa plasmid, tế bào chứa plasmidkhép vòng nguyên vẹn và tế bào chứa DNA tái tổ hợp Ta cần biết và tách rađược những tế bào có nhận DNA tái tổ hợp

Những tế bào không chứa plasmid sẽ không thể sống được trong môi trường

có ampicillin và tetracycline Những tế bào chứa plasmid nguyên vẹn sẽ sốngđược trong môi trường có ampicillin và tetracycline Những tế bào chứa DNAtái tổ hợp sẽ sống được trong môi trường có ampicillin nhưng mẫn cảm vớitetracycline (gen kháng tetracycline bị gãy do enzyme giới hạn cắt và chèn ANDcài vào)

- Nuôi cấy hỗn hợp các tế bào trong môi trường chứa ampicillin Chỉ các tếbào chứa plasmid khép vòng nguyên vẹn và tế bào chứa DNA tái tổ hợp mớisống được và hình thành các khuẩn lạc

- Nuôi cấy in dấu các tế bào mọc được ở môi trường chứa ampicillin sangmôi trường có tetracycline Những tế bào chứa plasmid nguyên vẹn sẽ sốngđược còn tế bào chứa DNA tái tổ hợp không sống được trên môi trường cótetracycline Ta chọn các khuẩn lạc tương ứng trên đĩa chứa ampicillin và nuôicấy chúng tiếp tục

3.4.2 Chọn lọc dòng tế bào tái tổ hợp bằng gen chỉ thị màu

Sử dụng gen chỉ thị mầu với gen chỉ thị kháng sinh là phương pháp chọn lọcdòng tế bào tái tổ hợp có hiệu quả cao Trong kỹ thuật sàng lọc thể tái tổ hợp ở

tế bào vi khuẩn, gen LacZ kết hợp với ITPG và X-gal làm gen chỉ thị màu tươngđối phổ biến

3.4.3 Chọn lọc dòng tế bào bằng phương pháp lai phân tử

Là phương pháp chọn lọc dòng tế bào tổ hợp có độ chính xác cao Tuynhiên, kỹ thuật thực hiện tương đối phức tạp, tốn kếm về hóa chất và đòi hỏi cácthiết bị chuyên dùng Tùy theo điều kiện nghiên cứu, có thể sử dụng phươngpháp lai acid nucleic (DNA, RNA) với mẫu dò đánh dấu phóng xạ hoặc đánhdấu huỳnh quang Các bước thực hiện chủ yếu gồm:

- Sau khi biến nạp, các tế bào vi khuẩn hoặc nấm men được nuôi cấy ở hộpPetri để mỗi tế bào phát triển thành một khuẩn lạc Đặt một màng lai(nitrocellulose) lên trên hộp Petri, để các khuẩn lạc in dấu lên màng lai ở các vịtrí tương ứng

- Lấy màng lai đã in dấu các khuẩn lạc vi khuẩn sau biên nạp đem lai phân ửvới mẫu thăm dò đánh dấu phóng xạ hoặc huỳnh quang, mẫu do phải có trình tựtương ứng với đoạn đặc hiệu của gen tái tổ hợp

- Ủ ở nhiệt độ thích hợp để tạo phản ứng lai Rửa màng lai để loại bỏ cácthăm dò không được lai và thực hiện phóng xạ tự ghi

Kết quả hiện hình phóng xạ cho thấy ở những vị trí có phản ứng lai sẽ có cácchấm đen trên phim nhạy phóng xạ, hoặc các vết màu khi hiện hình huỳnhquang Lựa chọn các khuẩn lạc ở các vị trí tương ứng trong hộp Petri thu đượccác dòng tái tổ hợp

3.5 Nuôi cấy tế bào tái tổ hợp để thu sản phẩm

Tế bào tái tổ hợp được nuôi trong các bình lên men, với điều kiện thích hợp

về dinh dưỡng, nhiệt độ, độ pH, để các tế bào tăng sinh khối nhanh, tạo cácsản phẩm protein tái tổ hợp ở mức cao nhất Thực hiện công nghệ tách chiếtprotein tái tổ hợp, tinh sạch thu chế phẩm

II ỨNG DỤNG CỦA CÔNG NGHỆ GEN

2.1 Nghiên cứu cơ bản về cấu trúc và chức năng của gen.

2.1.1 Tách dòng gen

Hệ gen động vật, thực vật, vi sinh vật thường quá lớn để phân tích bằng điện

di trên gel và lập bản đồ giới hạn nên tách dòng gen được thực hiện với mụcđích xác định một phân đoạn DNA đặc thù trong hệ gen, tinh sạch đoạn gen đóvới các phân đoạn khác, khuếch đại, tạo nhiều bản sao các phân đoạn gen, sau

đó, có thể phân tích phân đoạn gen đã tách dòng bằng lập bản đồ giới hạn và giảitrình tự DNA

Tách dòng gen (gene cloning) là gắn một gen, 1 trình tự DNA cần thiết vàovector tách dòng, tạo vector tái tổ hợp và đưa vào tế bào nhận (tế bào chủ) nhằmthu được một số lượng lớn các bản sao của gen hoặc trình tự DNA cần thiết.Tách dòng gen in vitro gồm tách dòng gen đã biết và tách dòng gen chưabiết

* Tách dòng gen đã biết

- Tạo đoạn DNA cài (DNA insert): tách chiết DNA cần tách dòng từ các mẫunghiên cứu  khuếch đại DNA bằng PCR cắt đoạn gen cài bằng enzim giớihạn thích hợp Sử dụng cùng enzim giới hạn đó cắt vector tách dòng

- Tạo vector tái tổ hợp: trộn vector tách dòng và các đoạn cài DNA chungvới nhau với tỷ lệ nhất định, có sự tham gia của enzyme T4 DNA lygase.

vector tái tổ hợp

- Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ: vector tái tổ hợp sẽ được nhânlên với số lượng lớn bản sao Tế bào chủ thường là tế bào vi khuẩn vì chúng sinhsản nhanh, thao tác dễ, ít tốn kém

- Chọn và sàng lọc các thể tái tổ hợp: Nuôi cấy vi khuẩn có vector tái tổ hợptrong môi trường thích hợp, sử dụng các gen chỉ thị là gen mã hóa khả năngkháng kháng sinh, X – gal,… để chọn các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp

* Tách dòng gen chưa biết

Tách dòng gen chưa biết là kỹ thuật từ mRNA tạo nên các gen tương ứng

Dự đoán cấu trúc của protein do gen chỉ huy tổng hợp, kết hợp phân tích thànhphần và trình tự sắp xếp của các acid amin trong phân tử protein do gen mã hóa

để xác định gen cần nghiên cứu

Tách chiết RNA tổng số  sử dụng enzyme sao mã ngược RT (Reversetranscriptase) và DNA polymerase tạo DNA bổ sung (cDNA – complementaryDNA)  tách dòng gen cDNA

Sau khi tách dòng gen, người ta xây dựng các thư viện DNA – là tập hợp cácphân đoạn DNA của cùng hệ gen Có 2 loại thư viện DNA chính là thư viện hệgen và thư viện cDNA

2.1.1.1 Xây dựng thư viện hệ gen

Thư viện hệ gen là tập hợp các dòng phân đoạn DNA của hệ gen đã đượctách dòng của một cơ thể nào đó Thư viện hệ gen có tính đặc trưng loài Thưviện hệ gen chứa toàn bộ trình tự nucleotide trong vật chất di truyền của một cơthể, bất kể trình tự nucleotide có được biểu hiện hay không Như vậy, thư viện

hệ gen chứa tất cả các trình tự: các trình tự exon và intron, các vùng khởi đầuphiên mã, kết thúc phiên mã, các trình tự điều hòa và liên gen

Hệ gen được cắt bằng các enzyme giới hạn tạo các đoạn DNA khác nhau mỗi đoạn được gắn vào một vector tách dòng và nhân dòng trong một dòng vikhuẩn khác nhau Mỗi dòng vi khuẩn mang một đoạn DNA bộ gen, tập hợp tất

cả các dòng vi khuẩn gọi là thư viện hệ gen

Đương lượng hệ gen (Genomic equivalent) f – số dòng trong một thư việnhoàn chỉnh = độ dài của hệ gen/ kích thước trung bình của đoạn DNA chèn vàovector tách dòng

Ví dụ: Hệ gen của E.coli có kích thước là 4,6 Mb tạo ra các phân đoạn DNA

có kích thước trung bình 5kb  Số dòng trong thư viện gen của E.coli là:

f = 4600000/5000 = 920

Tập hợp tất cả các dòng vi khuẩn và phage tái tổ hợp được tạo nên thư viện

sơ cấp Các dòng tái tổ hợp được phân lập từ môi trường nuôi cấy rồi đượcchuyển vào các ống nghiệm phù hợp Thư viện sơ cấp thường có mật độ thấp,kém ổn định nên tập hợp các dòng vi khuẩn, phage tái tổ hợp lại trải ra trên môitrường nuôi cấy lần nữa Kết quả, tập hợp thế hệ con thu được hình thành nênthư viện thứ cấp Thư viện thứ cấp có lượng lớn hơn thư viện sơ cấp và thườngđược sàng lọc nhiều lần

2.1.1.2 Xây dựng thư viện cDNA

Bộ gen của sinh vật nhân chuẩn có kích thước lớn gồm DNA mã hóa cácprotein, enzym, một phần lớn DNA rất lớn không mã hóa thông tin di truyền vàmột số gen chưa rõ chức năng Trong mỗi tế bào cơ thể chứa tất cả các gen trong

bộ gen Các tế bào, các mô có các gen hoạt động ở từng giai đoạn khác nhau Vìvậy, tập hợp của các phân tử mRNA thu nhận được từ 1 tế bào phản ánh tập hợpcác gen đang được biểu hiện (ở mức phiên mã) trong tế bào ở 1 thời điểm nhấtđịnh Tuy nhiên, mRNA thường kém bền nên khó thao tác cũng như duy trì cácvector tách dòng Vì vậy, người ta đã xây dựng một thư viện phản ánh đượctrình tự DNA được phiên mã ngược từ các phân tử mRNA Phân tử DNA nàyđược gọi là cDNA (DNA bổ sung– complementary DNA)

Thư viện cDNA không giống với thư viện hệ gen, thư viện cDNA phải đượcxác lập từ 1 loại tế bào xác định, trong đó, các gen quan tâm phải được biểu hiệnthành mRNA Thiết lập thư viện cDNA cũng tương tự như thư viện hệ gennhưng có một số khác biệt:

- Trước tiên, mRNA trong tế bào phải được tách ra bằng cách cho hỗn hợpRNA thu được từ 1 loại mô qua cột sắc kí có chứa oligodeoxytimin để mRNA cóđuôi polyA được giữ lại còn tRNA, rRNA sẽ chảy xuống dưới mRNA được rút

ra khỏi cột nhờ dung dịch muối loãng

- Bổ sung các đoạn mồi oligo dT ngắn (12-18 nucleotide) với hỗn hợp

- Bổ sung enzyme phiên mã ngược RT (Reverse transcriptase) và các nguyênliệu dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)  tổng hợp mạch DNA đơn bổ sung với

- Nhờ hoạt tính của RNAseH hoặc dung dịch thủy phân kiềm sẽ loại bỏ

- Nhờ hoạt tính của DNA polymerase tổng hợp mạch DNA đơn thứ 2 bổsung bổ sung với mạch DNA đơn thứ nhất tạo DNA mạch kép có cấu trúc kẹptóc Sau đó, cấu trúc kẹp tóc được cắt bởi nuclease N1

Sau khi tạo được cDNA, thư viện cDNA được tạo ra như sau:

- Chọn vector: vector tách dòng thường được dùng là plasmid Plasmid đượccắt bởi 1 enzyme giới hạn và được xử lý với photphatase kiềm để tránh bị khépvòng tự động

- Tạo các đầu dính cho cDNA rồi tổ hợp với plasmid tạo vector tái tổ hợp

- Biến nạp vào vi khuẩn chủ và nhân lên tạo thư viện cDNA

- Sàng lọc thư viện hệ gen hay thư viện cDNA để tìm ra các dòng gen mongmuốn Việc xác định gen này có thể sử dụng phương pháp lai acid nucleic Mẫu

dò acid nucleic là 1đoạn DNA hoặc RNA ngắn sẽ liên kết với trình tự gen cầntìm, được đánh dấu phóng xạ, sau đó chúng ta theo dõi và phát hiện Khi xácđịnh được dòng gen mong muốn, chúng ta có thể nuôi cấy nhân các tế bào tạonhiều bản sao của gene hay có thể tạo ra các sản phẩm protein do gen đó mã hóatùy theo mục đích nghiên cứu

2.1.2 PCR và ứng dụng của PCR

Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR (Polymerase Chain Reaction) do Karl Mullisphát minh năm 1985, là phương pháp nhân bản nhanh (khuếch đại) một đoạnDNA nào đó trong ống nghiệm nhờ việc sử dụng enzyme polymerase và các yếu

tố cần thiết khác

Với kỹ thuật PCR trong lĩnh vực DNA tái tổ hợp tạo ra một bước tiến cáchmạng đối với di truyền học phân tử cho phép nghiên cứu sâu về chức năng củagen và được ứng dụng trong sinh học phân tử, chẩn đoán các bệnh di truyền ởngười, phân tích pháp y,…

Sau n chu kì phản ứng, ta sẽ có 2n bản sao của đoạn gen cần nhân lên

2.1.2.2 Thành phần phản ứng

- DNA làm khuôn chứa gen cần khuếch đại

- DNA polymerase (Tag polymerase) từ vi khuẩn Themus aquaticus

- Cặp mồi: mồi xuôi và mồi ngược

+ Mồi xuôi là trình tự bổ sung với sợi khuôn (3’  5’), là trình tự trên sợi cónghĩa

+ Mồi ngược là trình tự bổ sung với sợi mang mã (sợi 5’  3’)

- 4 loại deoxyribonucleotide (dNTP)

- Ion Mg2+, thường dùng MgCl2hoặc MgSO4

2.1.2.3 Các giai đoạn của phản ứng PCR:

- Gây biến tính DNA: Dùng nhiệt tách sợi đôi thành sợi đơn, nhiệt độ đượcdùng là 940C

sung Nhiệt độ thích hợp 54oC

- Kéo dài chuỗi: DNA mới được tổng hợp nhờ Taq polymerase (extension),nhiệt độ được dùng là 720C.

Mỗi chu kỳ chỉ đòi hỏi vài phút hoặc ít hơn cho nên từ 1 DNA ban đầu cóthể khuyếch đại thành hàng triệu bản sao chỉ trong vòng vài giờ

2.1.2.4 Các ứng dụng của PCR

Ưu thế nổi trội của PCR là chỉ cần một lượng nhỏ DNA để chẩn đoán Các tếbào máu, niêm mạc là những vật liệu thích hợp để chẩn đoán ở cá thể sau sinh,với bào thai chỉ cần một lượng nhỏ lông tơ màng đệm PCR được sử dụng đểphát hiện nhanh các gene đặc hiệu, gene kháng nguyên của nhiều loại virus gây

ung thư, giúp chẩn đoán sớm bệnh nhân ung thư Ngoài ra, PCR được sử dụng

để phát hiện các đột biến xen/ mất đoạn, đột biến điểm

PCR chẩn đoán bệnh ung thư: Ung thư vòm họng phần lớn do virus EBV

gây nên Virus này thuộc họ virus Herpes có bộ gen DNA mạch kép Bằng kỹthuật PCR, với cặp mồi đặc hiệu khác nhau nhân các đoạn gen đặc trưng củavirus EBV có thể chẩn đoán ung thư vòm họng chính xác trên 90%

Áp dụng kỹ thuật PCR và các kỹ thuật phân tử trong chẩn đoán sớm cácbệnh truyền nhiễm như bệnh sốt rét, bệnh lao,

Phát hiện đột biến xen/ mất đoạn: Hội chứng Waardenburg là bệnh di

truyền trội trên NST thường, đặc trưng bởi tật điếc và hình thành sắc tố khôngbình thường gây mắt trắng, mi trắng Một số dạng hội chứng này do đột biến ởgen PAX – 3 – gen quy định 1 nhân tố phiên mã tham gia điều hòa sự phát triểncủa phôi Đột biến này là mất đoạn 18 bp ở vùng mã hóa nơi gắn kết của nhân tốphiên mã PCR đoạn DNA bình thường cho sản phẩm là đoạn DNA156 bp còntrình tự đột biến gen sinh ra đoạn DNA ngắn hơn là 138 bp

Ứng dụng xác định vân tay DNA (DNA fingerprinting)

Năm 1984, Sir Alec Jeffreys - nhà di truyền học người Anh, đã phát triểnmột kỹ thuật gọi là dấu vân tay DNA, phân tích các mẫu DNA để xác định các

cá thể

Vân tay di truyền là một kỹ thuật pháp y sử dụng để xác định danh tính mộtngười bằng cách so sánh DNA của người đó với mẫu đã có, ví dụ như, mẫu máuthu được từ hiện trường vụ án có thể được so sánh di truyền với mẫu máu củangười tình nghi Từ lượng nhỏ DNA thu từ máu, tinh dịch, nước bọt, tóc… DNA được tách chiết từ mẫu vừa thu nhân lên bằng PCR  phân tích nhờ kỹthuật điện di và thấm tách southern Hệ gen người có nhiều trình tự DNA ngắnđược lặp lại với số lượng biến động trên NST khác nhau Các đoạn lặp lại nốitiếp với số lượng biến động này được gọi là VNTR (variable number of tandemrepeats) là một trong những loại dấu vân tay quan trọng

Kỹ thuật xác định vân tay DNA còn được dùng để xác định huyết thống

quan hệ cha mẹ con cái Mẫu DNA được lấy từ người mẹ hoặc người cha cầnxác định và phân tích những chỉ thị DNA Khi phân tích chỉ thị DNA của ngườicon thì tất cả các băng DNA của con phải được tìm thấy trong tổ hợp các băngcủa DNA của bố, mẹ.Trong cặp NST tương đồng thì con thì con nhận 1 NST từcha và 1 NST từ mẹ nên có khoảng 1 nửa số băng của con sẽ được thừa hưởngtrình tự DNA từ mẹ và nửa còn lại từ cha

Một biến thể của kỹ thuật này cũng có thể được sử dụng để xác định các mốiquan hệ tiến hóa giữa các sinh vật

2.2 Ứng dụng công nghệ gen trong y học, dược học

2.2.1 Liệu pháp gene

Liệu pháp gene là kỹ thuật đưa gene vào trong một cơ thể mắc bệnh vì mụcđích trị liệu Người bệnh mang gen đột biến sẽ được chuyển một bản sao củagen bình thường, nhờ vậy mà protein bình thường được tạo ra và triệu chứng củabệnh bị loại bỏ Để gene ổn định trong tế bào soma, các tế bào tiếp nhận genebình thường phải là các tế bào có khả năng phân chia suốt đời cá thể như các tếbào tủy xương

Ở một số nước phát triển, liệu pháp gen đã có những thành tựu nhất định.Bệnh “suy giảm miễn dịch kết hợp nghiêm trọng” (X-SCID) do gene lặn trênNST X gây nên Gen kiểu dại γc mã hóa chuỗi γ của thụ thể interleukin – 2 Độtbiến gen này làm tế bào lympho T và tế bào T độc không phát triển bình thường.Khi mắc bệnh trẻ thường chết trong vòng 1 năm tuổi Để chữa trị bằng liệu phápgene, các tế bào gốc được tách ra từ tủy xương người bệnh và được nuôi cấy vớiretrovirus mang gen γc kiểu dại Tế bào gốc mang gene bình thường được cấytrở lại người bệnh, chúng có khả năng tạo miễn dịch bình thường.

Tuy nhiên, liệu pháp gene cũng đặt ra một số các câu hỏi khác về mặt kỹthuật: làm thế nào để điều khiển hoạt động của gene thay thế để tế bào có thểtổng hợp được một lượng sản phẩm vừa đủ đúng thời điểm và đúng vị trí?, làmsao khẳng định được việc cài gene thay thế vào hệ gene không gây hại đến chứcnăng khác của tế bào?,…

Phương pháp chuyển gene liệu pháp có định hướng và tiếp tục nghiên cứuphát triển với một số bệnh di truyền như bệnh máu khó đông, ung thư, HIV,…

2.2.2 Ứng dụng công nghệ gen trong sản xuất các chế phẩm sinh học

Ứng dụng công nghệ gen trong sản xuất các chế phẩm sinh học: tạo cácchủng vi sinh vật biến đổi gen nhằm phục vụ các mục đích khác nhau của conngười Điển hình là công nghệ gen đã tạo các chủng vi sinh vật mới có khả năngsản suất nhiều loại sản phẩm sinh học có giá trị như acid amin, protein, vitamin,enzyme, hormone, kháng sinh trên quy mô công nghiệp với số lượng lớn

và giá thành rẻ

Thành tựu đã đạt được như tạo chủng vi khuẩn E coli sản xuất

hormone insulin để chữa tiểu đường ở người, tạo chủng vi khuẩn E.coli sản suất