chuyên đề “ ứng dụng di truyền học

Nguồn gen tự nhiên Nguồn gen tự nhiên là có nguồn gốc hoàn toàn từ tự nhiên có nguồn gốc từ các động - thực vật hoang dã Đặc điểm của giống vật nuôi có nguồn gốc từ tự nhiên là những nhó

Phần I: MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn chuyên đề

Trong chương trình sinh học phổ thông, ứng di truyền học là phần kiến thức không thểthiếu trong kỳ thi tuyển sinh đại học, các kì thi học sinh giỏi trong nước và quốc tế Mặtkhác, đây là nội dung kiến thức đã và đang ảnh hưởng ngày càng lớn đến đời sống conngười nói riêng và sự sống của toàn bộ sinh giới nói chung Qua thực tế giảng dạy trongnhững năm gần đây, tôi thấy phần kiến thức ứng dụng di truyền học hay được ra trong các

đề thi đại học, thi học sinh giỏi đặc biệt là các kì thi học sinh giỏi Quốc gia, thi chọn độituyển Quốc tế với nhiều bài tập mở rộng, nâng cao, ngày càng mới lạ Do đó học sinh rất dễgặp khó khăn, lúng túng khi gặp những bài tập này Nhiều học sinh vận dụng lý thuyết đểgiải bài tập một cách mơ hồ, không cơ sở khoa học

Từ thực tế trên, chúng tôi xây dựng chuyên đề “ Ứng dụng di truyền học” để giúp

các em học sinh lĩnh hội cơ sở khoa học vững chắc để giải quyết các bài tập có liên quan vàcác bài tập mở rộng Đồng thời, áp dụng những kiến thức đó vào cuộc sống thực tiễn củamỗi cá nhân học sinh

2 Mục đích của chuyên đề

- Hệ thống kiến thức giúp học sinh nắm chắc cơ sở khoa học của ứng dụng di truyền

- Rèn luyện kĩ năng vận dụng lí thuyết vào giải quyết bài tập phần ứng dụng di truyền chohọc sinh đại trà và học sinh giỏi môn Sinh học

- Nâng cao kết quả dạy và học cũng như kết quả thi đại học, thi chọn học sinh giỏi mônSinh học

Phần II: NỘI DUNG

LÝ THUYẾT

A CHỌN TẠO GIỐNG CÂY TRỒNG DỰA TRÊN NGUỒN BIẾN DỊ TỔ HỢP

I GIỐNG VÀ PHƯƠNG PHÁP CHỌN GIỐNG

1 Khái niệm

- Giống là một tập hợp cá thể sinh vật do con người chọn tạo ra, có phản ứng như nhautrước cùng 1 điều kiện ngoại cảnh, có những đặc điểm di truyền đặc trưng, chất lượng tốt,năng suất cao và ổn định; thích hợp với điều kiện khí hậu, đất đai, kĩ thuật sản xuất nhấtđịnh

2 Quy trình tạo giống mới bao gồm các bước:

+ Tạo nguồn nguyên liệu là biến dị di truyền (biến dị tổ hợp, đột biến và ADN tái tổ

hợp)

+ Đánh giá kiểu hình để chọn ra kiểu gen mong muốn

+ Tạo và duy trì dòng thuần có tổ hợp gen mong muốn

+ Đưa giống tốt ra sản xuất đại trà

3 Phương pháp tạo nguồn nguyên liệu cho chọn giống

- Nguyên liệu cho quá trình chọn giống được tạo ra từ nguồn biến dị tổ hợp, đột biến vàADN tái tổ hợp

- Các phương pháp tạo nguồn nguyên liệu:

+ Lai hữu tính: tạo ra vô số biến dị tổ hợp

+ Gây đột biến: tạo ra các đột biến di truyền

+ Công nghệ gen: tạo ra ADN tái tổ hợp

II NGUỒN NGUYÊN LIỆU CỦA CHỌN GIỐNG

1 Nguồn gen tự nhiên

Nguồn gen tự nhiên là có nguồn gốc hoàn toàn từ tự nhiên có nguồn gốc từ các động - thực vật hoang dã

Đặc điểm của giống vật nuôi có nguồn gốc từ tự nhiên là những nhóm sinh vật được hìnhthành ở một địa phương bất kì có khả năng thích nghi cao với điều kiện môi trường ở địa phương

đó

Lợi ích: Có sẵn trong tự nhiên, không phải mất tiền của và công sức để tạo ra; thích nghitốt với môi trường sống của chúng

2 Nguồn gen nhân tạo

- Đặc đi ểm của nguồn gen này là do con ngưới chủ động tạo ra đ ể phục vụ nhu cầu sảnxuất và sinh hoạt của con người

- Được tạo ra thông qua quá trình đột biến và lai tạo

- Lợi ích: Tạo ra nguồn gen phong phú, đa dạng và phù hợp với nhu cầu của con người

3 Ý nghĩa:

Nguồn gen phong phú là điều kiện vật chất tốt để tạo ra giống mới Tập hợp đủ nguồn gentốt và sử dụng tính đa dạng của chúng đáp ứng yêu cầu và mục đích đặt ra là một trong nhữngđiều kiện quyết định thành công của nhà chọn giống Bởi vậy những người làm công tác chọngiống cần nắm được tính đa dạng của các loại hình trong cùng loài, các thứ và các giống trongcùng chi, nắm vững đặc trưng tính trạng (tính trạng số lượng và tính trạng chất lượng) của nguồngen để giải quyết các mục tiêu đặt ra

III CHỌN GIỐNG VẬT NUÔI VÀ CÂY TRỒNG BẰNG BIẾN DỊ TỔ HỢP

1 Biến dị tổ hợp

a Khái niệm

Là biến dị xuất hiện do sự tổ hợp vật chất di truyền của bố mẹ trong quá trình sinh sản hữutính

Nguyên nhân tạo biến di tổ hợp là do quá trình giao phối

Biến dị tổ hợp là nguồn nguyên liệu phong phú cho chọn giống và tiến hóa

b Cơ sở tế bào học

- Nguyên nhân gây ra biến dị tổ hợp đó là:

+ Quá trình phát sinh giao tử

+ Quá trình thụ tinh

+ Hoán vị gen

- Biến dị tổ hợp là quan trọng cho chọn giống vật nuôi, cây trồng do:

+ Biến dị tổ hợp xuất hiện do sự tổ hợp lại vật chất di truyền của thế hệ bố mẹ thông quaquá trình giao phối Quá trình giao phối bao gồm từ việc phát sinh giao tử, tổ hợp tự do của cácgiao tử thành hợp tử

+ Trong quá trình phát sinh giao tử, các gen alen phân li độc lập theo các cặp NST đồngdạng và tổ hợp tự do của các gen không alen theo các NST không đồng dạng đã làm xuất hiện sốloại giao tử theo công thức 2n, trong đó n là số cặp gen dị hợp, các gen này nằm trên các NSTđồng dạng khác nhau

+ Trong giảm phân tạo giao tử còn xảy ra hiện tượng hoán vị gen, các gen tương ứng traođổi chỗ cho nhau trên NST khác nguồn gốc của cặp đồng dạng cũng tạo ra sự đa dạng các loạigiao tử

+ Khi thụ tinh, sự tổ hợp tự do của các giao tử hợp thành hợp tử theo công thức 4n đã tạo

ra vô số hợp tử khác nhau về kiểu gen, các tổ hợp gen mới có quan hệ tương tác với nhau hoặctheo kiểu gen – alen hoặc theo kiểu gen không alen cho ra kiểu hình mới tạo nên sự đa dạngphong phú của giống cây trồng vật nuôi

c Phương pháp tạo biến dị tổ hợp

- Tạo ra biến dị tổ hợp thông qua hình thức lai giống.

2 Các phương pháp lai (kiểu lai):

Trong quá trình chọn tạo giống tuỳ theo kết quả cần đạt mà thực hiện các phươngpháp lai khác nhau Các phương pháp lai theo sự tham gia của bố mẹ được phân thành laimột lần và lai nhiều lần Trong trường hợp đầu công tác chọn lọc được tiến hành trong quầnthể con lai lặp lại với bố hoặc mẹ theo một hệ thống

a Lai một lần

* Lai đơn

Là phép lai chỉ có sự tham gia của một bố và một mẹ, phép lai chỉ tiến hành một lần.Phép lai đơn được sử dụng rộng rãi vì bố và mẹ được nghiên cứu tỉ mỉ thông qua cáctính trạng Người ta tiến hành phép lai giữa 2 bố mẹ có các tính trạng bổ sung Lai đơn cóthể tiến hành trong loài (lai gần) nhưng cũng có thể thực hiện phép lai khác loài phụ hoặckhác loài (lai xa).Ví dụ: A x B

* Lai thuận nghịch:

Khi lai thuận nghịch thì mỗi dạng trong phép lai lần lượt làm bố và làm mẹ Phép lainày cho phép xác định mối quan hệ giữa nhân và tế bào chất, sự ảnh hưởng của tế bào chấttới con lai Con lai ở phép lai thuận và nghịch giống hay khác nhau phụ thuộc vào dạng ditruyền tế bào chất của bố mẹ

Lai thuận nghịch thường dùng để xác định dạng nào dùng làm mẹ tốt, dạng nào làm

bố tốt (Khi lai xa, tỷ lệ kết hạt phụ thuộc dạng dùng làm bố hay mẹ)

Sơ đồ lai thuận nghịch

* Lai đỉnh

Các dòng, giống mang lai thử được dùng làm bố và lai với 1 hoặc 2 mẹ là cácvật liệu thử có phổ di truyền rộng Phép lai này dùng để xác định khả năng tổ hợpchung để loại bỏ các dòng, giống không có khả năng tổ hợp

* Lai luân phiên

Lai luân phiên là phép lai mà trong đó tất cả các dòng, giống tham gia vào sơ đồlai đều được lần lượt cặp đôi với nhau kể cả chiều thuận và nghịch

Đây là phép lai phân tích rất hiệu quả để tìm khả năng phối hợp của các dòng,giống với nhau.

b Lai nhiều lần

* Lai trở lại (hồi giao)

Còn gọi là lai tích lũy hay lai bão hòa, tức là đem con lai F1 lai trở lại với bố hay

mẹ với số lần cần thiết để lấy thêm đặc tính tốt của bố hay mẹ

Sơ đồ lai trở lại

Phép lai này được áp dụng phổ biến để khắc phục tính bất dục đực tế bào chất (CMS)cho một giống nhằm tạo ra các dòng CMS mới sử dụng trong chọn giống ưu thế lai hệ “3dòng”

Để tăng cường trong cây lai tính trạng cần thiết của bố hay mẹ

* Lai nhiều bậc

Là phép lai phức tạp điển hình, trong đó sau lần lai thứ nhất người ta tiếp tục sử dụng

F1 lai tiếp với 1 giống khác và có thể tiếp tục với giống thứ 4, 5 tùy theo yêu cầu của chươngtrình tạo giống

Sơ đồ: (((( A x B ) x C ) x D) x E) x H

Sơ đồ lai nhiều bậc

Cách lai này được sử dụng rộng rãi do con người ngày càng nâng cao sự đòihỏi Lai nhiều bậc có khả năng vô tận trong việc tạo thành các dạng hình mới.

* Lai nhiều bố mẹ (lai phức tạp)

Thường áp dụng để tạo ra quần thể mới ở cây giao phấn hoặc để tổng hợp nhiềutính trạng của nhiều giống vào con lai nhằm nâng cao hiệu quả của chọn lọc

Có nhiều cặp bố mẹ tham gia vào việc tạo thành giống lai mới

Sơ đồ lai nhiều bố mẹ

3 Lai tạo ưu thế lai

a Khái niệm ưu thế lai

Ưu thế lai là hiện tượng con lai có năng suất, phẩm chất, sức chống chịu, khả năngsinh trưởng và phát triển vượt trội so với các dạng bố mẹ

Đặc điểm của ưu thế lai

- Ưu thế lai thể hiện rõ nhất ở F1 sau đó giảm dần qua các thế hệ

- Ưu thế lai cao nhất thể hiện ở lai khác dòng

b Giả thuyết về cơ sở di truyền của hiện tượng ưu thế lai

Giả thuyết về ưu thế lai được thừa nhận rộng r ãi nhất là thuyết siêu trội

Nội dung giả thuyết : Kiểu gen dị hợp có sức sống, sức sinh trưởng phát triển ưu thế hơnhẳn dạng đồng hợp trội và đồng hợp lặn Có thể tóm tắt giả thuyết này như sau AA < Aa > aa

Giải thuyết siêu trội

c Giải thích hiện tượng ưu thế lai bằng thuyết siêu trội

+ Mỗi alen của một gen thực hiện chức năng riêng của mình; ở trạng thái dị hợp thì chứcnăng của cả 2 gen đều được biểu hiện

+ Mỗi alen của gen có khả năng tổng hợp riêng ở những môi trường khác nhau, do vậykiểu gen dị hợp có mức phản ứng rộng hơn

+ Cả 2 alen ở trạng thái đồng hợp sẽ tạo ra số lượng một chất nhất định quá ít hoặc quánhiều c òn ở trạng thái dị hợp tạo ra lượng tối ưu về chất này

+ Qua lai giống, người ta thấy con lai sinh ra một chất mà không thấy ở cả bố và mẹ thuầnchủng, do đó cơ thể mang gen dị hợp được chất này kích thích phát triển

d Phương pháp tạo ưu thế lai

Bước 1: Tạo dòng thuần chủng tr ước khi lai bằng cách cho tự thụ phấn hoặc giao phốigần qua 5 – 7 thế hệ

Bước 2: Cho các dòng thuần chủng lai với nhau:

Tùy theo mục đích người ta sử dụng các phép lai:

Lai khác dòng đơn: cho hai dòng thuần chủng lai với nhau thu được F1

Dòng thuần A x Dòng thuần B => Con lai F1

Lai khác dòng kép: cho lai nhiều dòng thuần chủng khác nhau và cho con lai của chúnglai với nhau thu được đời con

Dòng thuần A x Dòng thuần B => Con lai C

Dòng thuần D x Dòng thuần E => Con lai F

Cho con lai C x Con lai F => Con lai G

Bước 3: Chọn các tổ hợp có ưu thế lai mong muốn

e Phương pháp duy trì ưu thế lai

- Ở thực vật: Cho lai sinh sản sinh dưỡng, sinh sản vô tính

- Ở động vật: Sử dụng lai luân phiên: cho con đực con lai ngược lại với cái mẹ hoặc đựcđời bố lai với cái ở đời con

f Ứng dụng của ưu thế lai

- Là phép lai giữa hai dòng thuần chủng khác nhau rồi dùng con lai F1 làm mục đích kinh

tế (để làm sản phẩm) không làm giống

4 Lai xa

a Khái niệm

Là lai giữa các cá thể khác loài , khác chi hoặc xa họ hàng hơn nữa Thường gặp hiệntượng không kết hạt ở cây lai F 1 Ngoài ra còn lai xa về địa lý là lai giữa những cá thể cùng loài ,

cùng giống nhưng cách xa về địa lý Ví dụ: Lai khoai tây trồng Solanum tuberosum L với khoai tây hoang dại Solanum demissium.

Lai xa nhằm mục tiêu giải quyết các nhiệm vụ đặc biệt trong chọn giống cây trồng màkhông thực hiện được trong lai gần Hướng chủ yếu trong lai xa là tăng cường tính chống chịucủa giống cây trồng với các điều kiện ngoại cảnh bất thuận và với các loài sâu bệnh nguy hiểmgây tổn thất lớn cho mùa màng Các tính trạng chống chịu được tìm kiếm từ các loài hoang dạihoặc bán hoang dại Do bố mẹ rất khác nhau về bản chất di truyền cho nên có sự tái tổ hợp rấtmới, đời sau phân li mạnh, có những biến dị đặc biệt, từ các biến dị này có thể chọn lọc để tạothành giống mới với các tính trạng đặc biệt quý giá

b Ưu điểm của cây lai xa:

- Năng suất cao hơn lai gần

- Chống chịu tốt với sâu, bệnh, hạn, rét, phèn, mặn

- Phẩm chất giống tăng: tăng lượng glucid, protid, đường, vitamin, độ bền của sợi.

- Nên lai thuận nghịch trong lai xa và lai thật nhiều hoa, lai thuận nghịch sẽ cho kết quảkhác nhau về tính kết hạt, sức sống hạt lai

c Đặc điểm của con lai khác loài

- Lai xa cho con lai có tính di truyền dao động rất lớn, dễ thích nghi với điều kiện môitrường mới

- Con lai có ưu thế lai mạnh

- Đời sau của cây lai xa thường xuất hiện hiện tượng phân ly cho nhiều loại hình mới,phong phú, có xu thế khôi phục dạng hình bố mẹ

- Đặc trưng về tế bào học thường đặc biệt Ví dụ: lúa mì trắng có 2n = 14, lúa mì đen 2n =

42, con lai 2n = 14 + 42 = 56

d Những khó khăn trong lai xa và biện pháp khắc phục

* Tính không kết hạt khi lai xa

- Do nhụy cái không tiếp nhận hạt phấn làm cho hạt phấn không nảy mầm hoặc nảy mầm

nhưng ống phấn không đến được túi phôi

Cách khắc phục:

+ Tiếp cận vô tính; ghép cây mẹ lên cây bố để cây mẹ tiếp nhận một số chất có hoạt tínhsinh lý được sản sinh từ gốc ghép cây bố

+ Thụ phấn mentor; mentor sử dụng là hạt phấn cây của cây mẹ song đã được làm yếu đến

mức không có khả năng thụ tinh song vẫn xảy ra thụ phấn Hạt phấn bố được trộn lẫn với hạtphấn dùng làm mentor Dưới sự kích thích của mentor nhụy cái tiếp nhận hạt phấn lạ khi có thụphấn mà thụ tinh lại không xảy ra với hạt phấn của cùng loài

+ Sử dụng các chất điều tiết sinh trưởng; nếu nguyên nhân không tiếp nhận hạt phấn là do

thiếu các chất điều tiết sinh trưởng thì có thể phun thêm vào nhụy cái các chất cần thiết nhưGiberelin, Auxin … các chất này sẽ làm cho ống phấn phát triển mạnh, giải phóng các inhibitor(chất kìm hãm) giúp hạt phấn nảy mầm bình thường đưa tinh trùng đến túi phôi

- Do không thụ tinh được do sự chênh lệch về số lượng nhiễm sắc thể nên khi tạo thành

hợp tử thì không có sự hòa hợp, hợp tử không hình thành được

Cách khắc phục:

+ Nhóm cây có cùng dãy đa bội như chi Solanum … người ta đa bội hóa bố hoặc mẹ đểtạo cho bố mẹ có số lượng nhiễm sắc thể bằng nhau

- Hình thành hợp tử nhưng phôi bị chết sớm hoặc muộn Nguyên nhân chính là quá trình

cung cấp chất dinh dưỡng cho phôi bị ngừng trệ do sự bất hợp giữa nhân và tế bào chất

Cách khắc phục:

+ Lai nghịch đảo để tìm sự hòa hợp tế bào chất.

+ Cứu phôi, ngay sau khi hợp tử hình thành thì sau đó phôi và nội nhũ cũng phát triển.

Tách phôi đưa vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo để nuôi phôi và tạo cây trong ống nghiệm sau

đó đưa đi trồng

e Tính bất dục của con lai xa

* Nguyên nhân:

- Không hòa hợp giữa nhân của loài này và tế bào chất của loài kia.

- Không hòa hợp giữa nhân các bộ nhiễm sắc thể của cha và mẹ

- Khác nhau về cấu trúc của các nhiễm sắc thể

- Sự biểu hiện của gen lặn bất dục.

Các nguyên nhân trên làm cho quá trình phân chia tế bào bị rối loạn, các nhiễm sắc thểkhông cặp đôi được và sinh ra các giao tử kém sức sống trong quá trình phân chia giảm nhiễm

* Biện pháp khắc phục: phụ thuộc vào phương thức sinh sản của con lai xa và mục tiêu

- Đối với cây sinh sản hữu tính, sản phẩm thu hoạch là hạt thì công việc rất khó khăn và

tốn kém Có thể sử dụng các biện pháp: Gây đa bội như dùng Colchicine gây đa bội tạo được conlai F1 bình thường Trong các cây F1 do mỗi nhiễm sắc thể đều có một cặp nhiễm sắc thể tươngđồng nên hình thành được giao tử bình thường Lai trở lại với bố hoặc mẹ, chọn lọc định hướngcác thể phân ly Lai thuận nghịch, F1 sẽ bất dục, nhưng nếu tạo được một số lớn cá thể F1 sẽ pháthiện được vài cá thể có hạt phấn hữu dục, lấy hạt phấn này thụ cho tất cả con lai

B TẠO GIỐNG BẰNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO

I PHƯƠNG PHÁP TẠO GIỐNG BẰNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO

1 Khái niệm

Công nghệ tế bào là một ngành kĩ thuật áp dụng phương pháp nuôi cấy mô hoặc tếbào trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo để tạo ra những mô, cơ quan hay cơ thể hoànchỉnh mang đặc tính của cơ thể cho mô, tế bào

2 Các giai đoạn của công nghệ tế bào

Bước 1 : Tách các tế bào từ cơ thể động vật hay thực vật

Bước 2 : Nuôi cấy tế bào trong môi trường nhân tạo để hình thành mô sẹo

Bước 3 : Dùng hoocmon sinh trưởng kích thích mô sẹo phân hóa thành các cơ quanhoặc tạo thành cơ thể hoàn chỉnh

Các phương pháp tạo giống mới bằng công nghệ tế bào ở động vật và thực vật

ở thực vật đều chứa thông tin di truyền cần thiết của một cơ thể hoàn chỉnh và các tế bàođều có khả năng sinh sản vô tính để tạo thành cây trưởng thành.

II TẠO GIỐNG BẰNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT

1 Công nghệ nuối cấy hạt phấn

a Các phương pháp cơ bản sử dụng trong nuôi cấy bao phấn và hạt phấn

Có 2 phương pháp cơ bản được sử dụng trong nuôi cấy bao phấn và hạt phấn là: Phương pháp1: Các bao phấn được nuôi cấy trên môi trường có agar hoặc môitrường lỏng và sự phát sinh phôi xảy ra trong bao phấn

Phương pháp 2: Hạt phấn được tách rời khỏi bao phấn hoặc bằng phương pháp cơhọc hoặc do nứt nẻ tự nhiên của bao phấn và được nuôi trên môi trường lỏng

b Quy trình nuôi cấy

Bước 1: Chọn bao phấn: Bao phấn thích hợp nhất có chứa hạt phấn bắt đầu từ thể 4nhân đến ngay sau lần nguyên phân thứ nhất Bao phấn của các hoa đầu tiên cho kết quả tốthơn bao phấn của hoa muộn

Bước 2: Xử lý nụ hoa: Cần xử lý ở nhiệt độ thích hợp các nụ hoa sau khi cắt khỏi cây

và trước khi tách bao phấn để nuôi cấy, nhằm kích thích sự phân chia của hạt phấn và từ đótạo cây đơn bội

Bước 3: Chọn môi trường tái sinh cây thích hợp: Tùy theo đối tượng nuôi cấy baophấn, hạt phấn mà chúng ta lựa chọn môi trường thích hợp tương ứng

Bước 4: Điều chỉnh điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, ánh sáng cho tái tạo calus hoặcnếu chọn được thành phần môi trường nuôi cấy thích hợp có thể sẽ cho ra cây con trực tiếpqua phôi hoặc gián tiếp thông qua calus Cây con sau đó được chuyển qua môi trường thíchhợp sẽ ra rể và lá

Bước 5: Chọn lọc cây đơn bội:Không phải tất cả cây tái sinh khi nuôi cấy bao phấn,hạt phấn đều là cây đơn bội vì callus và phôi lưỡng bội cũng có thể được sinh ra từ tế bào vỏbao phấn có nhiều cách để xác định cây đơn bội như: làm tiêu bản để đếm số lượng nhiễmsắc thể, đo hàm lượng DNA trong tế bào, so sánh cây tái sinh từ bao phấn với cây mẹ về khảnăng sinh trưởng, hình thái, kích thước

Bước 6: Lưỡng bội hoá các thể đơn bội bằng xử lý cochicine:

Các cây đơn bội thu được sau nuôi cấy bao phấn, để có thể sử dụng được trong chọngiống thì cần lưỡng bội hoá tạo cây lưỡng bội

c Nhị bội hóa cây đơn bội

Để cây đơn bội trở nên hữu thụ phải tiến hành nhị bội hóa số lượng NST của cây đơnbội bằng các cách sau:

- Tái sinh qua phương pháp nuôi cấy mô: Những thể lưỡng bội được hình thành từ sựnhân đôi xảy ra thường xuyên trong quá trình nuôi cấy mô thực vật đơn bội Thường sửdụng mô lá của cây đơn bội nuôi cấy

- Cảm ứng nhị bội hóa với cochicin: Cochicin được sử dụng ở nồng độ 0.05 – 0.5%tùy theo từng loài thực vật và loại mô cần được xử lý

d Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo cây đơn bội trong nuôi cấy bao phấn, hạt phấn in vitro

* Tuổi hạt phấn.

Cây đơn bội chỉ thu được khi cấy bao phấn chứa hạt phấn ở giai đoạn phát triển thíchhợp, bắt đầu từ thể 4 nhân cho đến ngay sau lần nguyên phân đầu tiên

* Trạng thái sinh lý của cây cho bao phấn và hạt phấn

Kết quả tạo cây đơn bội phụ thuộc nhiều vào trạng thái sinh lý của cây bố, mẹ chobao phấn, hạt phấn Trạng thái sinh lý lại liên quan đến điều kiện môi trường mà cây sinhtrưởng như: quang chu kỳ, cường độ ánh sáng, nhiệt độ và môi trường dinh dưỡng khoáng

Khả năng thành công cao nhất với những bao phấn thu được trong lần trổ hoa đầutiên và giảm dần trong những lần trổ hoa tiếp theo

Sử dụng bao phấn từ những cây sinh trưởng dưới cường độ ánh sáng cao, ngày ngắn

sẽ cho hiệu quả tạo phôi cao hơn

* Tiền xử lý bao phấn và hạt phấn

Hiệu quả nuôi cấy bao phấn, hạt phấn cao hơn khi tiến hành xử lý mẫu trước khi cấy

Xử lý Nhiệt độ lạnh đã làm tăng khả năng tạo mô sẹo và cây từ bao phấn, đồng thờicho phép bảo quản mẫu lâu hơn

Bao phấn từ những cây sinh trưởng dưới cường độ ánh sáng cao, trong điều kiệnngắn ngày sẽ cho hiệu quả tạo phôi cao hơn

- Nuôi cấy bao phấn:

+ Vì bao phấn có kích thước lớn nên thao tác dễ dàng

+ Môi trường nuôi cấy đơn giản

- Nuôi cấy hạt phấn:

+ Tạo ra giống cây trồng sạch bệnh

+ Giống tạo ra có phẩm chất di truyền đồng đều

+ Phát sinh phôi dễ dàng trong quá trình nuôi cấy

+ Tạo cây đơn bội thuận lợi cho việc nghiên cứu di truyền

Tóm lại, nuôi cấy bao phấn, hạt phấn ra đời đã làm giảm thời gian, đồng thời làmtăng vọt số lượng các cá thể đơn bội thu được

- Nuôi cấy bao phấn:

+ Khó sàng lọc cây đơn bội

+ Khi nuôi cấy bao phấn thường gặp hiện tượng bạch tạng

+ Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn, hạt phấn tạo cây đơn bội phức tạp, phụ thuộc nhiềuyếu tố: tuổi hạt phấn, trạng thái sinh lý của bao phấn và hạt phấn, kiểu gen, kinh nghiệm…

2 Nuôi cấy tế bào thực vật in vitro tạo mô sẹo

a Quy trình nhân giống in vitro

Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ

- Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây chonguồn mẫu nuôi cấy)

- Các cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởngmạnh

- Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc vàphòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu sẽ làm giảm tỉ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năngsống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro

Bước 2: Nuôi cấy khởi động

Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro Giai đoạn này cần đảm bảocác yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt.

- Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây: mô non, ítchuyên hóa (đỉnh chồi, mắt ngủ, lá non, vảy củ…)

- Xác định chế độ khử trùng mẫu cấy thích hợp: thường dùng các chất: HgCl2 0.1%

xử lý trong 5- 10 phút, Na0Cl, Ca(0Cl)2 5-7% xử lý trong 15- 20 phút, hoặc H2O2, dungdịch Br…

Bước 3: Nhân nhanh

- Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượngthông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính

- Vấn đề là phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để cóhiệu quả là cao nhất Theo nguyên tắc chung môi trường có nhiều cytokinin sẽ kích thích tạochồi chế độ nuôi cấy thường là: 25-27o C, 16h chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng 2000-4000lux

Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

- Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môitrường tạo rễ Môi trường tạo rễ thường được bổ sung một lượng nhỏ auxin Một số chồi cóthể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môitrường không chứa chất điều tiết sinh trưởng

- Đối với các phôi vô tính thường chỉ cần gieo chúng trên môi trường không có chấtđiều tiết sinh trưởng hoặc môi trường có chứa nồng độ thấp của xytokinin để phôi phát triểnthành cây hoàn chỉnh

Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên

- Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cầnđảm bảo một số yêu cầu:

- Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định( số lá, số rễchiều cao cây)

- Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước

- Phải chủ động điều chỉnh được ẩm độ, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng như cóchế độ dinh dưỡng phù hợp

b Ưu điểm và hạn chế của nhân giống in vitro

* Ưu điểm

- Hệ số nhân giống nhanh

- Cho ra các cá thể tương đối đồng nhất về mặt di truyền

- Có thể nhân giống cây trồng ở quy mô công nghiệp (kể cả trên các đối tượng khónhân bằng phương pháp thông thường)

- Chủ động kế hoạch sản xuất

- Tạo được cây sạch virus

- Các cây sau nhân in vitro có xu hướng được trẻ hóa nên nâng cao hiệu quả nhânbằng các phương pháp thông thường sau đó

- Một số loài cây trồng rất dễ bị biến dị khi nhân giống in vitro

c Khó khăn của kĩ thuật nhân giống in vitro

* Sự tạp nhiễm: Vi khuẩn, nấm, côn trùng đặc biệt là ve bét thường nhiễm vào hệ

thống mô mạch và gây nhiễm môi trường sau 1 tuần nuôi cấy Vài loài vi khuẩn thường gâynhiễm: Acinebacter, Aerococcus, Agrobacterium, Bacillus, Clostridium, Curtobacterium,Erwinia, Pseudomonas…

* Tính bất định về mặt di truyền: Kỹ thuật nhân giống vô tính áp dụng với mục đích

tạo quần thể cây trồng đồng nhất với số lượng lớn nhưng phương pháp cũng tạo ra nhữngbiến dị tế bào soma qua nuôi cấy mô sẹo

* Hiện tượng thủy tinh thể: Trong nuôi cấy mô cũng thường gặp hiện tượng thủy tinh

thể mẫu nuôi cấy Khi chuyển ra khỏi bình nuôi cấy, cây con dễ bị mất nước và tỷ lệ sốngsót thấp Dạng này thường thấy khi nuôi cấy trên môi trường lỏng hay môi trường bán rắn,đặc biệt khi sự trao đổi khí thấp, quá trình thoát hơi nước tập trung trong cây

d Kết luận

Với lợi thế tạo ra lượng cây giống lớn, đồng đều, sạch bệnh… nhân giống cây trồngứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật đã mở ra hướng mới cho nền sản xuất nông nghiệphàng hóa hiện nay

Nhân giống in vitro là một hướng phát triển mới cần phải được quan tâm, đầu tư vàphát triển thêm

Nhiệm vụ của các nhà nuôi cấy mô tế bào thực vật là tiếp tục xây dựng và hoàn thiệncác quy trình nhân giống in vitro với các cây trồng mang lại hiệu quả kinh tế cao, đáp ứngnhu cầu thị trường

3 Dung hợp tế bào trần

Tế bào trần là những tế bào không có thành tế bào Chính vì thế chúng có thể hòa lẫnvào nhau (dung hợp) và thành 1 tế bào lai mang trong mình vật chất di truyền của cả 2 tếbào

Có thể nói việc dung hợp tế bào trần và tái sinh thành cây lai từ tế bào trần là 1 trongnhững thành tựu tuyệt vời của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào Bằng phương pháp này đẻ raphương pháp lai xa giữa các loài điều mà không thể thực hiện bằng các phương pháp lai hữatính thông thường

Tế bào lai này được tái sinh và thành 1 cây lai Quá trình này xảy ra ở tế bào nên gọi

là lai tế bào và thông qua tế bào soma nên gọi là lai soma hay lai vô tính tế bào

a Kĩ thuật tách tế bào trần

* Phương pháp cơ học

Phương pháp này dựa trên cơ sở phá các mối liên kết của mô bằng các dao sắc nhọn(sharp-edged knife) và giải phóng các protoplast riêng rẽ Phương pháp này cho hiệu suấtthấp

* Phương pháp enzyme

Để phá vỡ thành tế bào người ta thường sử dụng các enzyme chiết xuất từ các sinhvật chứa nhiều enzyme phân giải thành vách tế bào như: nấm, ốc và mối Các enzyme này

đã được thương mại hóa theo các phương pháp khác nhau với mức độ tinh khiết khác nhau

Hỗn hợp enzyme thường dùng là enzyme celluloza và macerozim được chiết xuất từ

nấm Trichdearina virde và Aspergillus niger và đã được sản xuất công nghiệp Nồng độ

dung dịch enzyme sử dụng tùy thuộc đối tượng Các hỗn hợp enzyme thường được sử dụng

ở pH 5,5 – 5,8 trong 3 – 8 h

Ngoài ra để protoplast không bị vỡ sau khi thành cellulose bị phân hủy người ta phải

bổ sung những chất tăng áp lực thẩm thấu vào dung dịch enzyme để duy trì cân bằng thẩmthấu giữa nội bào và môi trường bên ngoài Các dung dịch thường dùng là dung dịch đườngmanitol, sorbitol Nồng độ sử dụng khoảng 0,3 – 0,7M tùy theo đối tượng thực vật

So với phương pháp cơ học thì phương pháp này có hiệu quả cao hơn rất nhiều.Phương pháp enzyme cho phép tách được hàng gram protoplast Có thể thu được từ 1 gam

lá cỏ luzec hoặc khoai tây là 6-12 triệu tế bào trần

Vì protoplast thực chất là tế bào trần không có thành cho nên có thể tách được từnhiều nguồn khác nhau như các bộ phận của cây ( rễ, lá, hạt phấn), callus, tế bào đơn…

c Nuôi cấy tế bào trần

* Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy

- Thành phần của môi trường nuôi cấy lỏng hay đặc tùy thuộc vào vật liệu thựcvật.Môi trường này có thêm Auxin và Xitokinin để giúp sự tái tạo vách và các lần phân chiađầu tiên

- Đảm bảo đủ các yếu tố dinh dưỡng: axit amin, polyamin, Hydrolysat Cazein, nướcdừa, mạch nha…

- Đảm bảo điều kiện nhiệt độ, pH, ánh sáng,áp suát thẩm thấu…

- Trong lần tự nhân đôi đầu tiên, môi trường phải có áp suất thẩm thấu cao, Auxin,Xitikinin thích hợp, ánh sáng yếu Sau đó cần giảm áp suất thẩm thấu bắng cách pha loãngmôi trường để giúp cho sự tăng trưởng tế bào

Khi mô sẹo được hình thành cần chuyển chúng vào trong môi trường rắn chứa Auxin

ở nồng độ thấp hơn và Xitokinin cao hơn Sau cùng kích thích ra rễ cần loại Xitokinin, tăngnồng độ Auxin

* Nuôi cấy tế bào trần chia làm 2 giai đoạn

Giai đoạn 1:

- Từ tế bào trần tao thành tế bào, phân chia tạo thành microcallus Sau một thời giannuôi cấy một đến hai tuần các tế bào trần tái tạo vỏ và phân chia tạo nên các microcallus

- Điều kiện nuôi cấy:

+ Nuôi trong môi trường lỏng lắc

+ Lớp nuôi trợ dưỡng: tế bào trần, lớp xốp có khả năng thấm từ dưới lên, callus từ

mô tế bào mà từ đó tách tế bào trần, agar

Giai đoạn 2

- Microcallus thành callus ổn định hình thành phát sinh cơ quan Chuyển cácmicrocallus lên môi trường cứng, chúng sẽ tạo thành các mô sẹo Từ đó chuyển sang môitrường tái sinh chồi và cây hoàn chỉnh

- Điều kiện nuôi cấy

+ Nuôi cấy trên môi trường đặc

+ Chú ý tới ánh sáng và quang chu kì

+ Có chất điều tiết sinh trưởng cho qua trình tái sinh cây

+ Loại bỏ chất gây ánh sáng thẩm thấu

* Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của tế bào trần

- Nuôi cấy tế bào trần thường yêu cầu 1 số thay đổi so với quy trình nuôi cấy môbình thường do bản chất của tế bào trần

- Các thay đổi thường liên quan đến sự điều chỉnh nồng độ muối vô cơ, thêm vào cáchợp chất hữu cơ, vitamin, đường để đảm bảo khả năng thẩm thấu và chất điều tiết sinhtrưởng để kích thích sự phân chia tế bào

Có 2 phương pháp dung hợp tế bào trần:

* Dung hợp bằng hóa chất

+ Xử lý bằng NaNO3

Năm 1970, Power và cộng sự đã dùng NaNO3 (0,25 M) kích thích dung hợp haiprotoplast Carlson và cộng sự (1972) cũng dùng phương pháp này để sản xuất cây lai soma

đầu tiên (Nicotiana glauca × N langsdorffii) Tuy nhiên, phương pháp này cho hiệu suất

thấp vì NaNO3 không thích hợp với tế bào bị không bào hóa mạnh như protoplast từ nhu mô

lá

+ Xử lý bằng PEG

Thường sử dụng poly ethylen glycol (PEG 5-25%) là chất có tác dụng dính kết tế bàotrần dể dung hợp chúng Nồng độ và trọng lượng phân tử của PEG quyết định sự thành côngcủa thí nghiệm dung hợp

PEG có trọng lượng phân tử thấp (~ 100) không thể tạo ra một sự dính chặt chắcchắn, trong khi PEG trọng lượng phân tử 6000 cho hiệu quả dung hợp cao hơn

Xử lý PEG cùng với pH/Ca2+ có hiệu quả tăng tần số dung hợp và khả năng sống của cácprotoplast

PEG có 2 tác dụng:

+ Cung cấp một câu nối để Ca2+ có thể liên kết các bề mặt màng với nhau

+ Dẫn đến sự rối loạn tích điện bề mặt màng trong suốt quá trình rửa giải

Dung hợp tế bào trần bằng xử lí PEG

* Dung hợp bằng điện

Phương pháp này đơn giản hơn, nhanh hơn và hiệu quả hơn dung hợp bằng hóa chất.Điều quan trọng hơn cả là dung hợp bằng điện (electrofusion) không gây độc đối với tế bàonhư thường thấy ở các protoplast hoặc các thể dị nhân được xử lý bằng PEG

Cách tiến hành: Đưa dung dịch hỗn hợp tế bào trần(2 bản cực được thiết kế trong cáchộp dung hợp), các tế bào trần sẽ lần lượt sắp xếp thành chuỗi nằm giữa 2 bản cực Khi có 1xung điện cao (750-1000V) trong 1 thời gian rất ngắn(1-200 mili giây) vùng tiếp xúc giữa 2màng tế bào sẽ bị vỡ, 2 tế bào trần hòa nhập vào nhau-quá trình dung hợp sẽ xảy ra

e So sánh đặc điểm nuôi cấy tế bào trần với nuôi cấy các tế bào vẫn còn thành tế bào

So với quy trình nuôi cấy mô tế bào bình thường thì nuôi cấy tế bào trần thường yêucầu 1 số thay đổi do bản chất của tế bào trần Các thay đổi thường liên quan đến sự điềuchỉnh nồng độ muối vô cơ, thêm vào các hợp chất hữu cơ, vitamin, đường để đảm bảo khảnăng thẩm thấu và chất điều tiết sinh trưởng để kích thích sự phân chia tế bào

Nuôi cấy tế bào trần có nhiều ưu thế hơn so với nuôi cấy các tế bào vẫn còn thành tếbào

Ưu thế của kĩ thuật nuôi cấy và tách tế bào trần là tế bào không có màng cứng, ởtrạng thái đơn bào, mật độ tế bào thu được trên một một đơn vị thể tích môi trường có thểrất cao (đạt 106 tế bào/ 1ml môi trường)

Tế bào trần ở một số cây trồng có khả năng tái sinh rất mạnh, ví dụ tế bào mô thịt lá

ở thuốc lá, cải dầu… Bằng thao tác di truyền ở tế bào trần có thể dễ dàng tạo ra các tế bàobiến đổi gen Tế bào với kiểu gen biến đổi sẽ được bảo tồn khi tái sinh tế bào thành câyhoàn chỉnh Điều này rất khó thực hiện ở các tế bào vẫn còn thành tế bào

Nuôi cấy tế bào trần cho phép khả năng biến nạp các gen thuận lợi vào tế bào thựcvật mà trước kia thường bị vỏ tế bào ngăn cản

Nuôi cấy tế bào trần cho phép khả năng dung hợp tế bào - gắn hai tế bào trần lạithành một tế bào với hai bộ thông tin di truyền của hai tế bào tạo nên một thể lai vô tính màkhông cần hiểu biết chính xác về sự liên hệ giữa các gen, ít tốn kém, nhanh,trực tiếp và ápdụng các kĩ thuật chuyển gen( bơm AND, hóa thẩm, điện thẩm…) giúp loại trừ tính bất thụhữu tính, tạo cây lai hữu thụ; Giúp chuyển những đặc tính có lợi vào cây trồng, ít đòi hỏiphương tiện phức tạp

Tế bào lai thu được từ việc dung hợp hai tế bào trần được tái sinh và thành một câylai Quá trình này xảy ra ở tế bào nên gọi là lai tế bào và thông qua tế bào soma nên gọi là

lai soma hay lai vô tính tế bào Từ phương pháp này đẻ ra phương pháp lai xa giữa các điều không thể thực hiện bằng phương pháp lai hữu tính thông thường.

loài-Tuy nhiên quá trình nuôi cấy protoplast còn tồn tại một số trở ngại đó là:

- Quá trình cô lập nuôi cấy phải hoàn thiện

- Chưa có phương pháp hiệu quả để tuyển chọn các sản phẩm phù hợp

Sơ đồ tạo cây lai pomato

4 Chọn dòng tế bào xô ma có biến dị

a Khái niệm

Biến dị dòng soma (somaclonal variation) là khái niệm dùng để chỉ tất cả các biến dịthể hiện ở các tế bào, mô nuôi cấy và cây có nguồn gốc từ nuôi cấy mô (Larkin vàScowcropt, 1981)

Biến dị dòng soma còn được gọi là biến dị dòng vô tính

Biến dị này đã được quan sát ở nhiều loài cây trồng như thuốc lá, khoai tây, cà chua,mía, họ cải… bao gồm đây đủ các tính trạng nông học như chiều cao cây, số nhánh, thờigian sinh trưởng cũng như các tính trạng hóa sinh khác

b So sánh biến dị tế bào soma và đột biến

Cần phân biệt giữa hai khái niệm: biến dị tế bào soma và đột biến

- Chỉ dùng cho trường hợp khi nào có các

bằng chứng thể hiện các biến đổi di

- Xảy ra ở cả tế bào sinh dục và tế bào

sinh dưỡng - Xảy ra ở các tế bào sinh dưỡng (soma).

- Liên quan đến biến đổi cấu trúc DNA

(gen), NST hay số lượng NST - Có thể liên quan đến cấu trúc DNA(gen),cNST và số lượng cNST Ngoài ra còn

có thể liên quan đến mức độ biểu hiện gen-Thường được tạo ra khi xử lý mẫu với

các tác nhân vật lý, hoá học có trong môi

* Phương thức nhân giống in vitro

Các phương thức nhân giống khác nhau sẽ cho tỷ lệ xuất hiện các biến dị vô tínhkhác nhau Nhìn chung nếu chồi bất định được tái sinh từ một tế bào thì cơ hội để xuất hiệncác biến dị soma thường là lớn hơn rất nhiều từ các chồi được tái sinh từ nhiều tế bào Cácquá trình nuôi cấy callus, huyền phù hoặc protoplast do đó thường có nhiều biến dị soma

* Loại mẫu cấy

Các loại mẫu cấy khác nhau thường thể hiện mức độ biến dị khác nhau Các mẫu cấy

có nguồn gốc từ các thể tiền chồi như chồi nách, chồi đỉnh hoặc meristem thường có mức độbiến dị thấp hơn khi sử dụng các mẫu cấy có nguồn gốc không phải đỉnh sinh trưởng như lá,

rễ hay protoplast Khả năng xảy các biến dị soma còn phụ thuộc vào kiểu gen cũng như tuổicây mẹ Các dòng già hơn thường ẩn các biến dị sẵn có ở mức cao hơn các dòng trẻ hơn.Các loài có độ bội càng cao và số lượng NST càng nhiều thì có tính biến dị càng cao

* Loại và nồng độ chất điều tiết sinh trưởng sử dụng

Cho các mô nuôi cấy dài ngày trong môi trường chứa các auxin mạnh như 2,4 Dhoặc 2,4,5 T thường gây ra các sai khác trong cây tái sinh Ví dụ như các cây dầu dừa táisinh từ callus nuôi cấy dài ngày trên môi trường có chứa 2,4 D có tỷ lệ rất lớn các biến dịkhi trồng trên đồng ruộng

Thời gian nuôi và số lần cấy chuyển Việc nuôi cấy dài ngày trong điều kiện in vitrocũng như tăng số lần cấy chuyển cũng sẽ làm tăng khả năng xuất hiện các biến dị somaNguyên nhân của hiện tượng này là do sự thay đổi của các kiểu methyl hóa bình thường củaDNA genome

d Cơ chế tạo biến dị soma

* Sự thay đổi các kểu Methyl hóa bình thường của DNA genome

Quá trình methyl hóa là một quá trình mà một nucleotide cụ thể, thường là Adeninehay Cytosin – có một nhóm methyl gắn liền với nó Khi quá trình methyl hóa xảy ra nhưvậy trong một vùng mã hóa DNA cho một gen hoạt động, nó đã cản trở gen này và gen bịbất hoạt Việc bất hoạt gen do quá trình methyl hóa có thể không được nhận biết về mặt hiệntượng mặc dầu quá trình này đã được tìm thấy trong nuôi cấy mô ở một số loàinhư ngô,khoai tây và nho

* Sự sắp xếp lại của NST

Sự mất, nhân đôi và tái tổ hợp vô tính là các nguồn chính của biến dị di truyền thểhiện ở các dòng soma Ví dụ: Khi nghiên cứu về cơ chế dẫn đến sự thay đổi trong NST, một

số ý kiến cho rằng sự tái bản muộn của vùng dị NS là nguyên nhân chính dẫn đến các biến

dị dòng vô tính ở ngô và đậu lớn

và chọn những tế bào sống sót phân chia thành khuẩn lạc mô sẹo hoặc cấy trực tiếp lên môitrường chọn lọ c chứa độc tố.

- Chọn gián tiếp:

Trong trường hợp này đặc điểm của dong được chọn là kết quả biểu hiện khuyết tật.của tế bào Thí dụ điển hình là tổng hợp enzym nitrate reductase (NR) Trên môi trườngchứa Clo3- những tế bào có NR sử dụng clo3- như NO3- và khử thành clo2-, clo2- tác dụngnhư một độc tố cho nên chỉ có những tế bào không có NR mới sống sót trên môi trườngchọn lọc

* Cách chọn dòng tế bào:

- Không có tác nhân chọn lọc

Các tế bào và callus không xử lý sinh trưởng trong nuôi cấy in vitro ở các thời kỳkhác nhau trên môi trường không chứa tác nhân chọn lọc (độc tố hoặc các chất ức chế),đượccảm ứng để phân hóa các cây hoàn chỉnh Các cây tái sinh sẽ được trồng trên đồng ruộng đểchọn lọc các biến dị Bằng phương thức này người ta đã thu được các biến dị dòng soma củacác cây trồng khác nhau

- Có nhân tố chọn lọc

Theo phương pháp này các dòng tế bào biến dị được sàng lọc từ nuôi cấy nhờ vàokhả năng sống sót của chúng khi có mặt các độc tố/chất ức chế trong môi trường dinhdưỡng, hoặc dưới các điều kiện stress của môi trường Các biến dị có thể thu được bằngcách chọn lọc trực tiếp, gián tiếp Sự phân lập được tiến hành trong nuôi cấy dịch huyền phùhoặc bằng cách dàn trải tế bào đơn/protoplast

Kháng các đồng đẳng base của DNA

d Ứng dụng của biến dị soma

Trong cải tiến giống cây trồng truyền thống, nhà chọn tạo giống phải trồng một sốlượng lớn các cây trong nhà kính hay trên đồng nếu như muốn chọn lọc một đặc tính cụ thểnào đó Nếu làm như vậy,số nguyên liệu sử dụng sẽ bị giới hạn bởi diện tích có sẵn và thờigian Ngoài ra các yếu tố di truyền cũng cản trở đến quá trình chọn lọc

Các hệ thống nuôi cấy tế bào giúp cho các nhà chọn tạo giống có môi trường đượcxác định rõ ràng,nơi mà áp lực chọn lọc có thể làm trên hàng ngàn các tế bào đơn và có khảnăng tái sinh thành cây hoàn chỉnh Như vậy có thể chọn lọc từ lượng rất nhỏ các vật liệu ditruyền đồng nhất về di truyền và xây dựng các thử nghiệm nhanh chóng trong một vài đĩapetri hay bình nuôi cấy

Có thể nghiên cứu một loài nhiệt đới ở vùng ôn đới hay ngược lại vì điều kiện môitrường đặc thù là có thể tạo ra ở bất cứ đâu

Tạo ra dòng tế bào nuôi cấy có khả năng sản xuất các chất hoạt tính sinh học vớinăng suất cao

Tạo ra các giống cây trồng mang những đặc tính biến dị quý

III TẠO GIỐNG BẰNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

1 Cấy truyền phôi

Cấy truyền phôi là thao tác chuyển phôi từ cơ thể động vật cho sang các cơ thể động

vật nhận.

+ Từ một phôi có thể tách và cho phát triển thành nhiều phôi khác nhau

+ Có thể phối hợp hai hay nhiều phôi thành một thể khảm, có ý nghĩa trong tạo raloài mới

+ Có thể làm biến đổi thành phần của tế bào phôi theo hướng có lợi cho con người

a Quy trình cấy truyền phôi ở bò

* Chọn bò cho phôi

- Bò cái năng suất cao về một hoặc vài tính trạng mong muốn và các tính trạng đóphải đơợc di truyền cho thế hệ sau

Yêu cầu của bò cho phôi:

+ Năng suất về tính trạng mong muốn đặc biệt cao, di truyền cho thế hệ sau ơu tiênnhững tính trạng có hệ số di truyền cao và giá trị thơơng phẩm lớn

+ Không mắc bất cứ một khuyết tật hoặc bệnh di truyền nào

+ Khả năng sinh sản tốt, quá trình sinh sản bình thơờng Cổ tử cung dễ dàng khi đơadẫn tinh quản, súng cấy phôi và đặc biệt là dụng cụ gội rửa phôi

+ Thể trạng, sức khoẻ tốt, vật nhanh nhẹ, không hung dữ và đơợc tiêm phòng tất cảcác bệnh

+ Không quá già (không nên quá 10 tuổi)

+ Chu kỳ động dục bình thơờng, biểu biện chu kỳ rõ ràng

+ Buồng trứng hoạt động tốt

* Chọn bò nhận phôi

Yêu cầu của bò nhận phôi:

+ Sinh trưởng và phát triển bình thường, không khuyết tật, thể trạng tốt, không quágầy và không quá béo

+ Không mắc bệnh di truyền và bệnh truyền nhiễm (Brucellois, Trichomoniasis ,phải đơợc tiêm chủng định kỳ các bệnh đầy đủ

+ Trạng thái sinh lý sinh sản bình thường

Yêu cầu về chăm sóc, nuôi dưỡng bò nhận phôi

+ Chăm sóc, nuôi dơỡng tốt

+ Chủ động theo dỏi quá trình mang thai, can thiệp nếu có sự cố xảy ra nhơ sảy thai,

đẻ non, đẻ khó

+ Chọn bò tơ hoặc bò sinh sản không quá già và hung dữ

+ Số lượng bò nhận phôi gấp đôi số phôi cần cấy(10 phôi cần 20 bò nhận phôi)

Gây siêu bài noãn là quá trình tác động để một lần động dục, buồng trứng bò cónhiều trứng phát triển, chín và rụng đồng thời

Mục đích: thu được nhiều phôi chất lượng cao

* Phối giống

Thời gian phối giống: Sau khi tiêm PGF2à 42-48h (thơờng phối 2 lần vào chiều ngàythứ 5 và sáng ngày thứ 6 của chu kỳ)

Giống đực được phối phải có nhiều đặc điểm tốt, đặc trưng cho giống

c Ý nghĩa của công nghệ cấy truyền phôi

Phổ biến và nhân nhanh giống tốt, quí, hiếm ra thực tếsản xuất trên cơ sở khai tháctriệt để tiềm năng di truyền của những cá thể cái cao sản thông qua việc lấy phôi và cấytruyền những phôi của chúng (tận dụng được đồng thời những đặc tính tốt ở cả con bố vàcon mẹ)

Nâng cao cường độ chọn lọc, đẩy mạnh công tác giống trên cơ sở tăng nhanh tiến bộ

di truyền hàng năm

Nâng cao khả năng sinh sản, các sản phẩm thịt, sữa trong chăn nuôi bò

Hạn chế mức tối thiểu số lượng gia súc làm giống, từ đó giảm các chi phí khác đikèm (chuồng trại, vật tư, nhân lực…)

Giúp cho người chăn nuôi dễ dàng, thuận lợi trong việc xuất nhập, vận chuyển, traođổi con giống giữa các nước, các vùng, các địa phương

Bảo tồn, giữ gìn con giống dưới dạng trứng, phôi, tinh trùng – phương pháp giữ gìnvật liệu di truyền (phương pháp ex situ)

Hạn chế một số dịch bệnh và nâng cao khả năng chống chịu bệnh, khả năng thíchnghi cho con vật ở môi trường mới, cụ thể:

2 Nhân bảo vô tính ở động vật

a Khái niệm

Nhân bản (cloning) là tạo ra “bản sao” của một tế bào hoặc một sinh vật Các “bảnsao” được tạo ra bằng kỹ thuật cloning được gọi là các clone, các clone này giống y hệtnhau về mặt di truyền

Nhân bản người và động vật có thể xảy ra trong tự nhiên hoặc nhân tạo Đây là mộthình thức sinh sản đặc biệt mà kết quả là tạo ra các cơ thể giống hệt nhau về gen

Có hai kiểu nhân bản động vật là nhân bản phôi (nhân bản từ các tế bào phôi) vànhân bản vô tính từ các tế bào trưởng thành Nhân bản phôi người và động vật có thể xẩy ratrong tự nhiên hoặc nhân tạo (các trường hợp sinh đôi cùng trứng là ví dụ điển hình củanhân bản phôi người và động vật trong tự nhiên) còn nhân bản vô tính từ các tế bào trưởngthành chỉ có thể xảy ra trong phòng thí nghiệm

Trong nhân bản vô tính từ một tế bào trưởng thành, “bản sao” (clone) sẽ là một độngvật giống y chang “bố/mẹ” về mặt di truyền “Bố/mẹ” này chính là động vật cho nhân tế bàolưỡng bội để nhân bản

Nhân bản vô tính có thể thực hiện được với các tế bào có nhân lưỡng bội lấy từ phôi,thai, hoặc từ một động vật trưởng thành, thậm chí có thể từ các mô đông lạnh

b Kỹ thuật nhân bản

Nhân bản phôi động vật (cloning) hiện nay dùng một trong 3 kỹ thuật sau:

Phân tách các tế bào blastomere (blastomere separation), chia cắt phôi túi (blastocystdivision) và kỹ thuật chuyển nhân tế bào thân (somatic cell nuclear transfer)

* Nhân bản phôi bằng phân tách các tế bào blastomere (blastomere seperation): Đầu

tiên trứng và tinh trùng được thụ tinh trong ống nghiệm tạo thành phôi Phôi này được nuôicấy cho phát triển đến giai đoạn 2 hoặc 4 tế bào (mỗi tế bào trong khối 2 hoặc 4 tế bào nàyđược gọi là một blastomere) Đến giai đoạn này người ta tách bỏ màng bọc phôi và chuyểnphôi vào một môi trường đặc biệt làm cho các blastomere tách rời nhau ra Mỗi blastomerenày sau đó được nuôi cấy riêng biệt cho phép hình thành nên một phôi Phương pháp này cóthể tạo ra tối đa là 4 phôi bản sao giống hệt phôi ban đầu về mặt di truyền Mỗi phôi mớiđược tạo ra bằng phương pháp này sau đó có thể đem cấy vào tử cung một “mẹ nuôi” chophép phôi phát triển thành thai nhi trong quá trình mang thai của “mẹ nuôi” Trong kỹ thuậtnày, các cá thể “bản sao” vẫn mang bộ gen lưỡng bội có nguồn gốc từ hai bố-mẹ

* Nhân bản phôi bằng chia cắt phôi túi (blastocyst division):

Đầu tiên trứng và tinh trùng cũng được thụ tinh trong ống nghiệm tạo thành phôi.Nhưng khác với kỹ thuật phân tách blastomere, phôi này được nuôi cấy cho phân chia tớikhi tạo thành blastocyst Lúc này người ta chia cắt blastocyst đó thành 2 phần và cấy vào hainửa đó vào tử cung của một “mẹ nuôi” Qua quá trình mang thai tự nhiên, hai nửa blastocystnày phát triển thành hai cá thể sinh đôi giống hệt nhau Cũng như các “bản sao” được tạo rabằng kỹ thuật phân tách blastomere, các “bản sao” được tạo ra trong kỹ thuật chia cắtblastocyst cũng mang bộ gen lưỡng bội có nguồn gốc từ hai bố-mẹ

* Nhân bản bằng chuyển nhân tế bào thân (Nuclear Transplanation):

Để nhân bản bằng kỹ thuật chuyển nhân cần có hai tế bào, một tế bào trứng và một tếbào cho Qua thực nghiệm thấy trứng chưa thụ tinh phù hợp nhất cho kỹ thuật này vì dườngnhư nó dễ dàng dung nạp nhân cho hơn Tế bào trứng phải được loại bỏ nhân, quá trình nàylàm mất đi hầu hết thông tin di truyền của trứng

Bằng các kỹ thuật khác nhau, tế bào thân được đưa về giai đoạn G0 (pha không hoạtđộng) khi đó hoạt động sinh học của tế bào thân được “tắt” nhưng tế bào không chết Ởtrạng thái này nhân tế bào thân đã sẵn sàn được trứng chấp nhận Đặt nhân tế bào cho vàotrong tế bào trứng đã loại nhân Sau đó tế bào trứng được kích thích phát triển thành phôitrên in vitro và được đưa vào tử cung “mẹ nuôi” cho phát triển thành thai

Nếu tất cả các khâu trong quá trình này được thực hiện một cách chính xác, một bảnsao hoàn hảo của động vật cho nhân sẽ ra đời Nếu trứng được dùng trong quy trình nàyđược lấy từ cùng cá thể cho nhân tế bào thân, kết quả sẽ là một phôi vô tính thừa hưởng toàn

bộ vật chất di truyền của cá thể đó (cả DNA nhân và DNA ty thể) bởi vì DNA ngoài nhân(DNA ty thể) có nguồn gốc từ bào tương tế bào trứng của cơ thể “mẹ” Nhiều “bản sao” cóthể được tạo ra bằng cách chuyển các nhân giống nhau vào các trứng lấy từ một cơ thể choduy nhất Nếu các nhân tế bào thân và trứng lấy từ các cá thể khác nhau, chúng sẽ khônghoàn toàn giống cơ thể cho nhân vì các “bản sao” sẽ khác ở một số gen ty thể

c Tóm tắt quy trình nhân bản bằng phương pháp chuyển nhân gồm các bước sau:

- Lấy tế bào trứng (nhân đơn bội) của cơ thể “mẹ”, hút bỏ nhân đơn bội

- Lấy tế bào thân trưởng thành (máu, da …) của cá thể sẽ nhân bản, đồng bộ hóa chutrình tế bào của tế bào này, hút lấy nhân lưỡng bội

- Đưa nhân lưỡng bội vào trong trứng đã hút bỏ nhân nói trên (bằng tiêm trực tiếphoặc bằng kích thích xung điện) để tạo nên “hợp tử” hay “phôi vô tính”

- Kích thích để “hợp tử” tiếp tục phát triển và phân chia tạo nên khối blastocyst(dùng shock điện hoặc dùng môi trường có chứa chất cytochalasin B)

- Sau đó khối blastocyst này có thể được: Nuôi cấy trong labo nhằm để lấy tế bàogốc, qua đó có thể tạo ra các clone tế bào gốc phôi mang gen giống với cơ thể cho tế bàothân (Mục đích nhân bản trị liệu)

Hoặc đem cấy vào tử cung của một “mẹ nuôi” để cho phát triển thành bào thai, qua

đó có thể tạo nên một “bản sao” giống hệt cơ thể cho nhân tế bào thân (Mục đích nhân bản

vô tính động vật/người)

Như vậy, vật liệu của nhân bản phôi bằng kỹ thuật phân tách blastomere và phân chiablastocyst là phôi được thụ tinh bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (có sự tham gia củatrứng và tinh trùng) còn vật liệu của nhân bản bằng kỹ thuật chuyển nhân tế bào là các “phôi

vô tính” được tạo ra bằng cách chuyển nhân một tế bào thân sang một tế bào trứng đã hút bỏnhân

Cả phôi thụ tinh nhân tạo và phôi được tạo ra bằng kỹ thuật chuyển nhân tế bào thânđều là các tế bào gốc toàn năng, có khả năng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Khácvới nhân bản bằng kỹ thuật phân tách blastomere và phân chia blastocyst, các động vật đượcnhân bản bằng kỹ thuật chuyển nhân tế bào thân chỉ mang vật liệu di truyền của một bốhoặc mẹ

d Nhân bản vô tính (reproductive cloning) người và động vật:

Nhân bản vô tính, còn gọi là nhân bản DNA trưởng thành, là một dạng sinh sản vôtính nhân tạo dựa trên kỹ thuật nhân bản

Kỹ thuật nhân bản vô tính được dùng với mục đích tạo ra một “bản sao” giống hệtmột động vật hoặc một người đang tồn tại Kỹ thuật này đã được dùng để nhân bản cừu vàcác động vật có vú khác

* Nhân bản vô tính người và động vật được thực hiện như thế nào?

Nhân bản vô tính người và động vật được thực hiện dựa trên kỹ thuật chuyển nhân tếbào thân

Quy trình này bắt đầu bằng việc thay thế nhân đơn bội của một tế bào trứng bằngnhân lưỡng bội lấy từ một tế bào thân của cá thể hoặc phôi sẽ được nhân bản Trứng này sau

đó được kích thích cho phép phân chia hình thành blastocyst Sau đó cấy blastocyst này vào

tử cung của một “mẹ nuôi” cho phát triển thành thai và cho ra đời một cá thể Cá thể này sẽ

là một “bản sao” của cá thể đã cho nhân tế bào DNA trong nhân tế bào của cá thể “bản sao”được thừa hưởng chỉ từ một bố/mẹ (bản gốc) duy nhất

* Ưu thế và bất lợi của nhân bản vô tính người và động vật