TÀI LIỆU MÔN HÓA SINH: CHƯƠNG 3 PROTEIN

PROTEIN • Hợp chất hữu cơ, trọng lượng phân tử cao • Cấu tạo bởi nhiều acid amin nối với nhau bằng liên kết peptid • Chứa 4 loại nguyên tố : C, H, O, N, có thể có S, PPhân biệt: ACID AMIN : đơn vị cấu tạo nhỏ nhất của protein. PEPTID: từ 2 đến vài chục (< 50) acid amin. M < 6000 (theoquy ước) PROTEIN: • >50 acid amin cho tới cả ngàn hay vài chục ngàn. • Cấu trúc rất phức tạp • M > 6000. • Có 2 loại–Protein đơn giản (Protein thuần = Holoprotein)–Protein phức tạp (Protein tạp = Hétéroprotein) : có thêm nhóm ngoại trong phân tử (lipid, glucid, acid nucleic)

Chương 3

PROTEI

N

1 ĐẠI CƯƠNG

 PROTEIN

• Hợp chất hữu cơ, trọng lượng phân tử cao

• Cấu tạo bởi nhiều acid amin nối với nhau bằng liên kếtpeptid

• Chứa 4 loại nguyên tố : C, H, O, N, có thể có S, P

Phân biệt:

 ACID AMIN : đơn vị cấu tạo nhỏ nhất của protein.

 PEPTID: từ 2 đến vài chục (< 50) acid amin M < 6000

– Protein đơn giản (Protein thuần = Holoprotein)

– Protein phức tạp (Protein tạp = Hétéroprotein) :

có thêm nhóm ngoại trong phân tử (lipid,

2 ACID AMIN

• Acid amin là sản phẩm thủy phân cuối cùng của

peptid và protein

• Các dạng protein khác nhau của mọi loài sinh vật

được xây dựng trên 20 acid amin được gọi là 20 acid amin chuẩn hay là 20 acid amin thường gặp trong phân tử protein

2.1.Cấu tạo hóa học

Acid amin là chất hữu cơ mà phân tử có chứa nhóm carboxyl

-COOH và nhóm amin -NH2

Gốc

riêng cho

mỗi aa

Phần chung của các aa

2.2.Phân loại

2.2.1.Acid amin mạch thẳng

2.2.1.1 Acid amin trung tính (acid monoamin

monocarboxylic) Có 9 acid amin chứa một nhóm amin

và một nhóm carboxyl

STT Công thức cấu tạo Tên thông dụng và

ký hiệu (3 chữ và 1

Tên hóa học

 Acid amin có gốc R là chuỗi hydrocarbon no:

1 Glycin (Gly) (G) Acid -amino acetic

2 Alanin (Ala) (A) Acid -amino propionic

3 Valin (Val) (V) Acid -amino isovaleric

isocaproic

5 Isoleucin (Ile) (I) Acid -amino

- valeric

methyl-6

 Acid amin có gốc R chứa nhóm –OH:

6 Serin (Ser) (S) Acid -amino

-hydroxy propionic

7 Threonin (Thr) (T) Acid -amino

-hydroxy butyric

 Acid amin có gốc R chứa S:

8 Cystein (Cys) (C) Acid -amino

-thiol propionic

9 Methionin (Met) (M) Acid -amino

-methylthio- n-butyric

2.2.1.2 Acid amin acid (acid monoamin dicarboxylic)

Có 4 acid amin chứa 1 nhóm amin và 2 nhóm carboxyl

STT Công thức cấu tạo Tên thông dụng và

ký hiệu (3 chữ và 1 chữ)

Tên hóa học

10 Acid aspartic (Asp) (D) Acid -amino succinic

11 Asparagin (Asn) (N) -amid của acid aspartic

12 Acid glutamic (Glu) (E) Acid -amino glutaric

13 Glutamin (Gln) (Q) -amid của acid

glutamic

8

2.2.1.3 Acid amin kiềm (acid diamin monocarboxylic)

Có 2 acid amin chứa 2 nhóm amin và 1 nhóm carboxyl

STT Công thức cấu tạo Tên thông dụng và

ký hiệu (3 chữ và 1

2.2.2.Acid amin mạch vòng

2.2.2.1 Acid amin có nhân thơm

STT Công thức cấu tạo Tên thông dụng và

ký hiệu (3 chữ và 1

2.2.2.2 Acid amin chứa dị vòng

STT Công thức cấu tạo Tên thông dụng và

ký hiệu (3 chữ và 1 chữ)

Tên hóa học

 Acid amin có gốc R có nhân imidazol:

18 Histidin (His) (H) Acid -amino

-imidazol propionic

 Acid amin có gốc R có nhân indol:

19 Tryptophan (Trp) (W) Acid -amino

(3-indolyl) propionic

20 Prolin (Pro) (P) Acid pyrolidin

2-carboxylic

 Selenocystein ( acid L-- amin )

• Tìm thấy trong một số protein

• Một nguyên tử selen thay cho nguyên tử S trong cấu tạo của cystein

• Do selenocystein được kết hợp vào phân tử protein trong quá trình phiên dịch nên nó thường được xem

như là "acid amin thứ 21".

• Gặp tại trung tâm hoạt động của một số ít enzym

như những enzym có tác dụng phân hủy các

peroxyd ở động vật và một số ít vi khuẩn Cũng tìm thấy trong một số enzym tham gia vào quá trình

chuyển hóa của các hormon steroid

• Nhu cầu hàng ngày khoảng vài microgam

• Selenocystein không có trong protein thực vật hay nấm men

• Selenocystein không được mã hóa bởi bộ ba mật mã như 20

acid amin chuẩn thường gặp trong phân tử protein

• Trong quá trình sinh tổng hợp protein,

selenocystein được vận chuyển bởi 1 ARNt đặc

hiệu (ARNt Sec)

• Anticodon của ARNt Sec nhận biết được một codon stop trên ARNm codon (UGA) và như vậy

selenocystein được gắn vào chuỗi polypeptid

 Một số các acid amin hiếm gặp trong phân tử protein

 Một số acid amin không gặp trong phân tử protein

• Leucin không vị, Ile và Arg có vị đắng

• Muối nitrat của acid glutamic có vị ngọt kiểu

đạm nên thường được dùng làm gia vị

nm)Cystein hấp thu yếu ở =

240nmAcid amin khác hấp thu ở = 220nm

2.4.Tính lưỡng tính của acid amin:

• Nhóm carboxyl -COOH : thể hiện tính acid

• Nhóm amin - NH2 : thể hiện tính baz

 Acid amin có tính lưỡng tính

 Môi trường kiềm: aa phân ly như một acid và thành anion

 Môi trường acid : aa hoạt động như một base và

thành cation

2.5.Tính chất hóa học của acid amin

2.5.1 Hóa tính do chức -amin

Van-Slyke đề nghị ứng dụng để định lượng N2 của acid amin

Schiff)

Phản ứng được Sorensen dùng để định phân acid

amin trong nước tiểu

(Phản ứng Sanger )

Phản ứng Sanger được dùng để xác định aa N cuối

của chuỗi peptid

2.5.1.4. Phản ứng với phenylisothiocyanat (PITC)

(Phản ứng Edman)

Phản ứng Edman được dùng để xác định amin N cuối của chuỗi polypeptid

2.5.2.Hóa tính của nhóm carboxyl

2.5.2.1 Phản ứng khử nhóm carboxyl

2.5.2.2 Phản ứng khử carboxyl (decarboxyl hóa)

2.5.3.Hóa tính do 2 nhóm chức -NH2 và –COOH (phản ứng với ninhydrin)

ninhydrin + acid amin CO2 + NH3 + aldehyd +

ninhydrin

bị khử ninhydrin bị khử ngưng tụ với ninhydrin không

bị khử

Sản phẩm màu xanh tím

• Ứng dụng : định tính, định lượng acid amin (sắc ký, điện di)

• Các acid amin cho màu vàng nhạt với ninhydrin

2.5.4 Hóa tính của gốc R

thơm của phenylalanin và tyrosin

threonin

tyrosin cho phản ứng với thuốc thử Milon

(HgNO3/HNO3 đđ)

Gốc R quyết định các phản ứng đặc hiệu

2.6.Phân tích hỗn hợp acid amin

• Phương pháp sắc ký

• Phương pháp điện di

• Phương pháp vi sinh vật

2.6.1.Sắc ký trên giấy

• Đặc điểm : nguyên tử oxy của nhóm carboxyl ở vị trí

trans

đối với nguyên tử hydro của nhóm NH

• Các nguyên tử trong nhóm peptid đều nằm trên

một mặt phẳng

3.2.2.1 Liên kết disulfur (S-S)= cầu disulfur

• Liên kết đồng hóa trị được tạo thành do sự kết hợp giữa hai phân tử Cystein với nhau, loại đi 2 H

• Hình thành giữa 2 Cystein trong cùng một chuổi polypeptid

hoặc giữa 2 Cystein thuộc 2 chuỗi polypeptid khác nhau

• Protein của tóc, lông, móng sừng rất bền vững với các tác

nhân hóa học do chứa tới 12% Cystein

3.2.2.2 Liên kết hydro

• Lực hút tĩnh điện giữa nguyên tử hydro thừa điện dương và

nguyên tử oxy thừa điện âm

• Là liên kết yếu nhưng nhiều,

• Tác dụng to lớn trong việc hình thành và duy trì cấu trúc không gian của chuỗi polypeptid, đặc biệt là cấu trúc bậc II của protein

3.2.2.3 Liên kết muối (liên kết ion)

• Lực hút tĩnh điện giữa các nhóm -COO- (của acid

amin acid :

Lys, Arg)

• Các tương tác không phân cực khác:

– Gốc phenyl của phenylalanin

– Nhóm - CH3 của Alanin, Leucin

– Nhóm - C2H5 của Isoleucin 38

3.4.Cách xác định thứ tự acid amin trong chuỗi

polypeptid

3.4.1 Phân tích thành phần acid amin

 Thủy phân hoàn toàn chuỗi polypeptid

• HCl 6N ở 100-120oC /10 - 24

giờ Nhược điểm :

– Tryptophan bị phá hủy hoàn toàn

– Serin và threonin bị phá hủy một phần

– Glutamin và asparagin chuyển thành acid glutamic, acid aspartic và NH4+

• Thủy phân bằng kiềm nóng

– Cystein, Serin và Threonin bị phá hủy

– Các acid amin đều bị racemic hóa

– Tryptophan không bị phá hủy

 Xác định thành phần acid amin

3.4.2 Xác định acid amin N cuối của chuỗi

polypeptid

 Phản ứng Sanger

 Phản ứng Edman

3.4.3 Xác định acid amin C cuối

2 phương pháp

a - Khử nhóm -COOH tự do của aa C cuối

thành alcol - amin tương ứng

- Thủy phân hoàn toàn : có các aa tự do và

alcol -amin tương ứng

- Sắc ký so với các alcol -amin mẫu

b - Bằng carboxypeptidase đặc hiệu (cắt đứt liên kếtpeptid của aa cuối)

- Sắc ký so với các aa mẫu

3.4.4 Thủy phân polypeptid thành những peptid nhỏ

• Cắt các polypeptid thành những peptid nhỏ hơn

• Xác định thứ tự của các peptid nhỏ này

• Suy ra thứ tự của chuỗi polypeptid

Thường dùng các enzym peptidase đặc hiệu : chymotrypsin, trypsin, pepsin, carboxypeptidase hoặc hoá chất

Tách các đoạn peptid nhỏ (điện di, sắc ký)

Xác định thành phần aa, aa C cuối, N cuối của chúng

Tổng hợp để xác định thứ tự của chuỗi polypeptid

3.5.Peptid có hoạt tính sinh học

• Tham gia vào các phản ứng oxy hoá khử

• Là peptid nội bào phổ biến nhất (có ở tim,gan thận, phổi,hồng

• Penicillin (Penicilinum notatum) (peptid có chứa valin, cystein)

• Gramicidin ( Bacillus brevis) (10 aa vòng)

4 PROTEIN

• Cấu tạo bởi nhiều aa liên kết với nhau bằng liên kết peptid

• Ranh giới giữa polypeptid và protid không rõ rệt

• M > 6000 (theo quy ước)

4.1 Cấu trúc của Protein

4 bậc:

 Cấu trúc bậc I : Biểu thị thứ tự của các aa trong

chuỗi polypeptid hoặc nhiều chuỗi polypeptid và vị trí của các cầu disulfur (nếu có)

 Cấu trúc bậc II : Biểu thị sự xoắn của chuỗi

polypeptid (điển hình là cấu trúc bậc II của protein sợi) Liên kết hydro giữ vai trò quan trọng trong cấu trúc bậc II

 Cấu trúc bậc III: Biểu thị sự xoắn và gấp khúc của chuỗi polypeptid Liên kết disulfur đóng vai trò

quan trọng trong việc duy trì cấu trúc này

 Cấu trúc bậc IV : Biểu thị sự kết hợp của nhiều chuỗi polypeptid có cấu trúc bậc III trong phân

tử protein

- Mỗi chuỗi polypeptid: bán đơn vị

- Liên kết bởi lk hydro, tương tác Van der Waals

50

51

• Cromoprotein : nhóm ngoại là chất màu (hemoglobincó

nhóm ngoại là porphyrin + Fe2+)

• Lipoprotein : nhóm ngoại là lipid (phosphatid,

sterol, acid béo)

• Phosphoprotein : nhóm ngoại là acid phosphoric

(casein của

sữa)

• Metaloprotein : protein có kim loại (Fe, Cu,

Zn, Mg) (ferritin của gan và lách có 20% Fe3+)

4.3 Tính chất lý hoá của protein

• Trọng lượng phân tử của protein thiên nhiên ;

khoảng vài ngàn cho đến hàng triệu

• Xác định khối lượng phân tử protein : siêu ly tâm phân tách

4.3.2 Biến tính của protein

• Protein gọi là biến tính khi nó chịu những sự thay đổi

về tính chất như độ hoà tan bị giảm, mất đi một số tính chất đặc hiệu

Ví dụ :

- Đông vón không thuận nghịch của lòng trắng trứng

- Hemoglobin biến tính không thể kết hợp với oxy

 Biến tính thuận nghịch : khi cấu trúc phân tử có thể trở lại

dạng ban đầu

Ví dụ : trypsin ở 90oC và pH=3 sẽ biến tính Làm lạnh

nó sẽ trở

lại cấu trúc ban đầu có hoạt tính

 Biến tính không thuận nghịch : khi protein không thểtrở lại dạng ban đầu

Ví dụ : lòng trắng trứng khi đun sôi

• Tác nhân gây biến tính : vật lý, hoá học

• Ứng dụng

- Đề phòng biến tính : chọn điều kiện thích hợp

- Bảo quản ở nhiệt độ thấp (0-4 oC) Tốt nhất là

dạng đông khô

- Trong xét nghiệm sinh hoá: loại tạp protein bằngcác acid như acid tricloracetic, acid sulfosalicylichay các muối kim loại nặng

4.3.3 Tính chất lưỡng tính

Ứng dụng để phân tách các hỗn hợp protein bằng phương pháp điện di protein

4.4 Chiết xuất và tinh chế protein

• Phức tạp và khó khăn do dễ bị biến tính

• Gồm các bước cơ bản sau :

- Nghiền nát nguyên liệu

- Chiết bằng nước, dung dịch muối

- Phân đoạn bằng sắc ký, điện di

- Tinh chế

- Kiểm tra lại độ thuần nhất và tinh khiết

• Sự vận động và phối hợp (actin và myosin)

• Sự chống đở cơ học (collagen, elastin)

• Sự bảo vệ miễn dịch (Ig, interferon, fibrinogen)

• Sự tạo ra và dẫn truyền các xung động thần kinh

• Điều hòa (hormon, protein kìm hãm)

• Dự trữ, dinh dưỡng (ovalbumin, ferritin)

5 BIẾN HÓA PROTEIN

5.1 Tiêu hóa protein - Các enzym thủy phân protein

5.1.1 Endopeptidase

62

5.1.3 Enzym thủy phân protein ở các tổ chức

• Có các Catepsin : A,B,C

• Những tế bào cũng chứa carboxypeptidase và

aminopeptidase

• Các enzym được chứa trong các lysosome

Sự có mặt của các enzym này giải thích hiện tượng tự tiêu của tế

bào khi tế bào chết

5.2.Cân bằng động của protein

Nitơ trong cơ thể liên tục chuyển hóa nhưng vẫn đảm bảo sự cân bằng đạm

Cân bằng đạm

Nitơ nhập = Nitơ xuất(+) Nitơ nhập > Nitơ xuất(-) Nitơ nhập < Nitơ xuất

– (+) : cơ thể đang lớn, có thai, dưỡng bệnh– (-) : đói ăn, sốt, sau khi mổ 63

Các trường hợp bệnh lý:

• Giảm protein trong huyết thanh

– do giảm nhập hoặc giảm sản xuất

– do tăng mức phân hủy

– do mất protein

– do loãng máu

• Tăng protein trong huyết thanh

– do máu cô đặc

– xuất hiện protein bất thường

– suy vỏ thượng thận (Addison)

6 THOÁI HÓA ACID AMIN

6.1.Những quá trình chung của sự thoái hóa acid amin6.1.1 Khử amin

• Phóng thích Nitơ dưới dạng NH3

• 4 con đường khử amin

6.1.1.1 Khử amin - khử oxy

6.1.1.2 Khử amin nội phân tử

6.1.1.3 Khử amin thủy phân

6.1.1.4 Khử amin oxy hóa

Cd ch#: 2 giai dop n

Amin hóa-khử oxy là một trong những con đường chính

để cố định NH3 vào hợp chất hữu cơ (-cetoglutaric) và nhóm amin này có thể dễ dàng chuyển từ acid glutamic sang một acid -cetonic

khác nhờ phản ứng chuyển amin 70

với coenzym khử là NADPH

6.1.2 Phản ứng trao đổi amin

Braustein và Krisman (1937) (nghiên cứu ở cơ)

Acid glutamic Acid

-cetoglutaric

Alanin

Các phản ứng trao đổi amin chịu tác dụng xúc tác

của các enzym gọi chung là transaminase

P P

Alanin PyridoxalP PyridoxaminP Acid pyruvic

Cơ chế của sự trao đổi amin: gồm 2 giai đoạn:

Acid glutamic

Pyridoxal

Acid -cetoglutaric Pyridoxamin

• Transaminase có ở cơ, gan, thận, tim, ruột Hai loại phổ biến và

hoạt động mạnh

– Glutamic oxaloacetic transaminase (GOT) =

Aspartic transaminase (ASAT)

– Glutamic pyruvic transaminase (GPT) = Alanin

transaminase (ALAT)

6.1.3 Khử carboxyl

• Là quá trình khá phổ biến ở động vật đặc biệt là rất phổ biến ở VSV

76

6.2.1.2 Sự tạo thành urê (chu trình ornitin của

Krebs và Henseleit)

• Máu tĩnh mạch cửa đến gan chứa nhiều NH3 hơn

máu ở gan ra

• Nồng độ urê của máu ở gan ra cao hơn máu tới gan

• Ở động vật đã cắt gan, nồng độ urê trong máu giảm

• Trong 1 số trường hợp bệnh về gan như xơ gan,

nồng độ

NH3 trong máu cao

• Gan là nơi sản xuất urê từ những gốc NH3

• Krebs và Henseleit đã chứng minh bằng thực

nghiệm sự tạo thành urê Sau đó Ratner và Cohen

đã xác định chi tiết các phản ứng enzym của quá trình tổng hợp urê

• Quá trình này gồm 3 giai đoạn

H2N-C-O PO H2

O carbamyl phosphat

- Bufic 2 : chuyen nhfim Carbamyl tfii Ornitin de

OHT — Ornitia carbamyl transferase

Giai doqn chuy£n CITRUMN tWnh ARGININ

BYfic 1: ket hpp citxulin vfii a aspartic tpothanh

Giei dean 2

Bufic tfich Arginosuccinic A$nh Arginin v$ acid fumaric

Arginosuccinat

Fumamt -• Malat -• Oxaloacetat

Trao ddi amin {Glu)

84

Ornitin

• Một số acid -cetonic biến hóa theo con đường

của các acid béo sau khi khử carboxyl Acetyl CoA

Tổng hợp các

acid béo

Tạo thành các chấtcetonic (các acid amin tạo ceton)

• Ngoài ra có 5 acid amin vừa tạo đường vừa tạo

ceton (vừa tạo oxaloacetat vừa tạo acetyl CoA):

Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Isoleucin và

Lycin

S;f thofi i hfi a cua sCén carbon cua c:ic acid amin.

6.3.Thoái hóa riêng biệt của các acid amin

6.3.1.Các acid amin tạo oxaloacetat

• Aspartat và Asparagin

6.3.2.Các acid amin tạo pyruvat

• Threonin, Alanin, Cystein

6.3.3 Các acid amin tạo succinyl CoA (cũng có thể tạo

glucid)

• Methionin, Valin, Isoleucin, Leucin.

6.3.4 Các acid amin tạo -cetoglutarat

• Acid glutamic, Glutamin, Histidin, Prolin, Arginin.

6.3.5 Các acid amin tạo Acety CoA

• Threonin, Glycin, Serin, Alanin, Cystein, Phenylalanin, Tyrosin,

Tryptophan, Lysin, Leucin 91

y-Glutamyl cystein + Glycin

Glutathion déng vai tré ciia I

he"

(v$n chuyén hydro).

• Acid amin bán cần thiết (Arg, His)

Arginin @fin can thiet)

Histidin fbfin can thietl

Glycin

Alanin Cystein

Glutamin

Acid aseartic Asparagin

Tyrosin

Profin Serin

Nguyén t%c chung :

Amin héa N.4I3I'H

Acid atti iti céti tliié‘t • acid amiti mé cd thé khétig

thé téng hpp dUpc céc a in-cetonic céa chétig

• Glycin : được tổng hợp từ CO2 và NH3.

• Alanin: được tổng hợp từ pyruvat nhờ phản ứng chuyển amin

từ glutamat

• Cystein: được tổng hợp từ Met qua nhiều giai đoạn

• Acid glutamic: được tổng hợp nhờ phản ứng amin hóa

-cetoglutarat

• Glutamin: được tổng hợp từ glutamat và NH3 , xúc tác bởi

glutamat synthetase

• Acid aspartic: được tổng hợp từ oxaloacetat nhờ

phản ứng chuyển amin từ glutamat

• Asparagin: được tổng hợp từ aspartat và NH3, xúc tác bởi

asparagin synthetase