BÀI GIẢNG SỰ PHIÊN MÃ, DỊCH MÃ - Transcription

Vùng trình tự trên DNA mà RNA polymerase gắn vào và khởi động phiên mã... QUÁ TRÌNH PHIÊN MÃ Ở PROKARYOTEKhởi động: RNA polymerase nhận biết vùng promoter và khởi động phiên mã Kéo dài

Sự phiên mã - Transcription

CÁC LÝ DO ĐỂ DNA KHÔNG PHẢI LÀ PHÂN TỬ CHO SỰ DỊCH MÃ:

1 Cuộc sống nguyên thủy là RNA.

2 Virus có bộ gen là RNA.

3 RNA có số lượng nhiều hơn DNA.

4 Thêm cơ chế kiểm soát.

5 Ribosome khó cố định trên DNA.

6 DNA có cấu trúc nén chặt.

7 DNA của eukaryote có intron.

8 Ở eukaryote, DNA nằm trong nhân còn dịch mã xảy ra ở tế bào chất.

9 Cơ chế dịch mã gây nhiều biến đổi trên acid nucleic.

10.RNA bị phân hủy sau khi hoàn tất quá trình dịch mã tạo protein.

Chỉ duy nhất mRNA giữ

thông tin di truyền và được

dịch mã thành protein

CÁC ĐIỂM TƯƠNG ĐÔNG VÀ KHÁC BIỆT GIỮA SỰ PHIÊN MÃ VÀ SAO CHÉP

Sản phẩm DNA mạch đôi RNA mạch đơn

Nucleotide Thymine Uracil

CẤU TRÚC CỦA THYMINE VÀ URACIL

CẤU TRÚC CỦA CYTOSINE VÀ URACIL

TRƯỚC PHIÊN MÃ

 DNA bản mẫu

 Enzyme polymerase

 Promoter

BẢN MẪU DNA

Sao chép DNA diễn ra toàn bộ phân tử trong khi phiên mã chỉ xảy ra ở những đoạn DNA đặc biệt  gen cấu trúc hay còn gọi là đơn vị phiên mã

BẢN MẪU DNA

Trong mạch đôi DNA:

1 mạch gọi là mạch khuôn (template strand), là mạch mà RNA sẽ được phiên mã Mạch này còn được gọi là mạch đối mã (antisense strand)

1 mạch gọi là mạch mã hóa (coding strand), là mạch có trình tự nucleotide mã hóa cho các acid amin Mạch này còn được gọi là sense strand

transcription

RNA

G C A G U A C A U G U C

BẢN MẪU DNA

Chỉ có template strand mới được sử dụng trong quá trình phiên mã Coding strand không được sử dụng trong phiên mã

Tuy nhiên hai mạch của DNA có thể được sử dụng làm template strand

Chiều phiên mã trên hai mạch DNA là ngược hướng nhau  phiên mã bất đối xứng (asymmetric transcription)

5'

3'

3' 5'

Cấu trúc phiên mã của bộ gen Adenovirus

ENZYME RNA POLYMERASE

•Tên đầy đủ: enzyme RNA polymerase phụ thuộc DNA (DNA=dependent RNA polymerase).

•Sản phẩm của enzyme này là các loại RNA: mRNA, tRNA, rRNA, các RNA nhỏ.

•RNA polymerase có chức năng helicase.

•Ở prokaryote: là 1 protein đa tiểu phần, có kích thước khoảng 480 KDa.

•Ở eukaryote: gồm 3 loại RNA polymerase Mỗi loại polymerase cũng là một protein đa tiểu phần chịu trách nhiệm cho sự phiên mã của nhiều loại RNA khác nhau

RNA-pol của E coli

RNA polymerase của các sinh vật prokaryote khác cũng

tương tự như ở E coli

RNA-pol I II III

Sản phẩm

phiên mã 45S rRNA hnRNA

5S rRNA tRNA snRNA

RNA-pol của eukaryote

CẤU TẠO CỦA RNA POLYMERASE II

Vùng trình tự trên DNA mà RNA polymerase gắn vào và khởi động phiên mã

3'

3' 5'

start

-10 region

T A T A A T

A T A T T A

(Pribnow box)

-35 region

Vùng -35 và vùng -10

70 chịu trách nhiệm nhận biết các vùng -35 và vùng -10 của promoter

Promoter ở eukaryote

QUÁ TRÌNH PHIÊN MÃ Gồm 3 giai đoạn:

- Khởi đầu

- Kéo dài

- Kết thúc

QUÁ TRÌNH PHIÊN MÃ Ở PROKARYOTE

Khởi động: RNA polymerase

nhận biết vùng promoter và

khởi động phiên mã

Kéo dài: RNA polymerase

kéo dài mạch RNA đang tổng

hợp

Kết thúc: RNA polymerase

nhận biết dấu hiệu kết thúc và

ngừng kéo dài mạch RNA,

RNA mới tổng hợp được tách

ra khỏi mạch DNA khuôn

GIAI ĐOẠN KHỞI ĐỘNG

RNA polymerase nhận biết nhận biết vùng -35 (TTGACA) và trượt tới vùng -10 (TATAAT), sau

đó nó tách DNA mạch đôi tại vùng này

Vùng DNA mạch đôi bị tách ra dài khoảng 17

bp  1bp

Không cần RNA mồi

Ngay khi liên kết 3’ – 5’ phosphodiester đầu tiên được hình thành, tiểu phần  rời khỏi holoenzyme

GIAI ĐOẠN KÉO DÀI

Sau khi tiểu phần  rời khỏi RNA polymerase, phần core enzyme tiếp tục trượt dài trên DNA mạch khuôn

để tổng hợp sợi RNA mới

Các NTP được gắn tuần tự vào mạch RNA đang tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung với mạch DNA khuôn

(NMP)n + NTP  (NMP)n+1 + PPi

Hình thành cấu trúc bong bóng phiên mã (transcription bubble) là phức hợp bao gồm RNA polymerase + đoạn DNA khoảng 40 nucleotide + RNA mới tổng hợp

Phần trình tự đầu 3’ của RNA mới tổng hợp liên kết với DNA khuôn trong khi phần trình tự đầu 5’ tách ra khỏi cấu trúc bong bóng phiên mã khi quá trình phiên mã đang tiếp diễn

GIAI ĐOẠN KẾT THÚC

RNA polymerase kết thúc trượt dài và tổng hợp mạch RNA, khi đó mạch RNA mới tổng hợp tách ra khỏi phức hợp phiên

mã (bao gồm DNA + RNA polymerase + RNA)

Có hai kiểu kết thúc phiên mã: phụ thuộc vào nhân tố và độc lập với nhân tố 

Nhân tố  là một ATPase và là 1 helicase Protein hình thành từ 6 tiểu phần Hoạt tính helicase của nhân tố  phân cắt liên kết hydro giữa DNA và RNA

Nhân tố  chịu trách nhiệm dừng quá trình phiên mã tại những vị trí đặc biệt trên RNA Nhân tố này gắn vào những trình tự đặc biệt trên RNA, sau đó tương tác với RNA polymerase Khi tương tác với nhân

tố , RNA polymerase dừng phiên mã và rời khỏi phức hợp phiên mã

GIAI ĐOẠN KẾT THÚC

Kết thúc phiên mã theo kiểu độc lập nhân tố  phụ thuộc vào cấu trúc kẹp tóc (stem loop structure)

Cấu trúc kẹp tóc được hình thành trên phân tử RNA ở những đoạn trình tự đặc biệt Trình tự này dài khoảng 30-40 nucleotide, giàu GC theo sau là một chuỗi polyU

Cấu trúc kẹp tóc làm thay đổi cấu trúc của RNA polymerase vì thế RNA polymerase dừng phiên mã

Khi RNA polymearse dừng lại, hai mạch DNA bắt cặp lại với nhau Chính sự bắt cặp của DNA này làm giảm sự bắt cặp giữa RNA-DNA Điều này làm cho phức hợp kéo dài bị phá vỡ, giải phóng RNA mới tổng hợp ra ngoài

QUÁ TRÌNH PHIÊN MÃ Ở EUKARYOTE

•Có 3 loại RNA polymerase: I (rRNA), II (mRNA), III (tRNA)

•Cần các nhân tố phiên mã (transcription factor) để hoạt động

•RNA polymerase không gắn trực tiếp vào promoter Thay vào đó, nó hình thành phức hợp với các nhân tố phiên mã để gắn vào promoter và khởi động phiên mã

•Sự phiên mã ở eukaryote cần vùng promoter và vùng trình tự thượng nguồn (upstream regulatory region) để bắt đầu

•Cis-acting element: là những trình tự đặc biệt trên DNA, chúng kiểm soát sự phiên

mã của một gen hoặc nhiều gen

•Trans-acting factor: là những protein nhận biết và gắn trực tiếp/gián tiếp vào các cis-acting element để kiểm soát sự phiên mã

TF for eukaryotic transcription

QUÁ TRÌNH KHỞI ĐỘNG

Hình thành phức hợp tiền-khởi động (Pre-initiation complex-IPC), bao gồm các bước sau:

-Đầu tiên tiểu phần TBP của TFIID nhận biết vùng TATA trên DNA

-TFIIA gắn vào và làm bền phức hợp trên promoter gồm TFIIB và tiểu phần TBP.-TFIIB gắn vào TBP và huy động phức hợp RNA polymerase+TFIIF

-TFIIE có hoạt tính ATPase và helicase đến gắn vào và thực hiện tách mạch DNA Ngoài ra, TFIIE có chức năng huy động TFIIH

-TFIIF có chức năng ngăn RNA polymerase II gắn vào vùng DNA không đặc hiệu-TFIIH tháo xoắn DNA và phosphoryl hóa RNA polymerase II

RNA pol II

TF II FTBP TAF TATA

QUÁ TRÌNH KÉO DÀI

-Giống ở prokaryote

-Không đi kèm với sự dịch mã vì sự phiên mã xảy ra trong nhân còn sự dịch mã xảy ra trong tế bào chất

-Chủ yếu do RNA polymerase đảm nhiệm Enzyme này gắn từng NTP vào đầu 3’

OH của nucleotide trên mạch RNA đang tổng hợp Chiều phiên mã là 5’  3’

QUÁ TRÌNH KẾT THÚC

-Sự phiên mã kết thúc khi gặp trình tự AATAAA theo sau là các GT lặp lại

-Sự kết thúc phiên mã đi kèm với các biến đổi sau phiên mã

-RNA sau khi tổng hợp được gọi là RNA sơ cấp Chúng cần được biến đổi để trợ thành các RNA hoàn chỉnh

-Quá trình biến đổi sau phiên mã là chủ chốt ở eukaryote

QUÁ TRÌNH BIẾN ĐỔI SAU PHIÊN MÃ

-Phân tử mRNA sơ cấp còn được gọi là heteronuclear RNA – hnRNA hnRNA thường dài hơn gấp nhiều lần mRNA trưởng thành

-Quá trình biến đổi bao gồm:

Gắn mũ ở đầu 5’ (Capping at the 5’ end)

Gắn đuôi ở đầu 3’ (Tailing at the 3’ end)

Cắt ghép RNA (mRNA splicing)

• Xảy ra ngay sau khi bắt đầu phiên

ribonucleotide

• Mũ m7G (7-methylguanosine) được gắn vào đầu 5’ của phân tử mARN

• Xảy ra trong nhân

• Giúp Ribosome nhận biết mARN trong quá trình dịch mã

• Bảo vệ đầu 5’ của mARN không bị phân cắt

GẮN MŨ Ở ĐẦU 5’

-Phosphatase cắt một gốc

phosphate ở ribonu đầu tiên

-Guanosyl transferase chuyển một

GTP đến đầu 5’ vừa bị cắt này

-Cap-MTase chuyển một nhóm

methyl từ SAM đến gốc guanine tạo

ra cấu trúc cap 0

-Đường ribose của các ribonu kế

tiếp cũng có thể được methyl hóa để

tạo ra các cấu trúc cap 1, cap 2, cap

3, cap 4…

GẮN MŨ Ở ĐẦU 5’

 Không có trình tự polyT trên mạch DNA khuôn  sự tổng hợp đuôi polyA không phụ thuộc vào mạch DNA khuôn

 Xảy ra trong nhân tế bào và trước quá trình cắt ghép RNA

 Vai trò: Ổn định các mRNA và tham gia vào quá trình vận chuyển mRNA từ trong nhân ra tế bào chất

GẮN ĐUÔI POLY A Ở ĐẦU 3’

-Có 3 trình tự đặc biệt trên phân tử tiền mRNA ở gần đầu 3’, đó là AAUAAA, CA và vùng giàu GU Vùng CA chính là vùng tín hiệu để phân cắt RNA.

-Sau khi 3 vùng trình tự này được tổng hợp, hai protein CPSF và CStF của RNA polymerase II sẽ đến bám vào các vùng này.

-Sau đó, hai protein này huy động các protein khác là nhân tố phân cắt và PAP đến tạo một phức hợp tại vùng này.

-Phức hợp này sẽ phân cắt phân tử tiền mRNA tại vị trí CA, sau đó PAP sẽ tổng hợp một đuôi khoảng 200 adenine vào đuôi 3’ của tiền mRNA sử dụng cơ chất là ATP

-Cuối cùng, khi đuôi polyA được hình thành thì các polyA binding protein sẽ đến bám vào đuôi polyA này để bảo vệ đuôi này khỏi

sự phân cắt của ribonuclease.

A~G no-coding region 1~7 coding region

L 1 2 3 4 7 700 bp 5 6 7

E

CẤU TRÚC GEN Ở EUKARYOTE

Gen ở eukaryote được cấu tạo bởi các vùng mã hóa (coding region) và vùng không mã hóa (non-coding region) nằm xen kẻ nhau

Vùng mã hóa (exon) là những trình tự nucleotide xuất hiện trong mRNA trưởng thành

Vùng không mã hóa (intron) là những trình tự sẽ bị cắt bỏ trong quá trình cắt ghép RNA, vì thế không hiện diện trong mRNA trưởng thành

The Spliceosome Forms

snRNAs (U1, U2, U4, U5 and U6) and associated proteins = snRNPs

• U1 binds to the GU sequence at the 5' splice site, along with

accessory proteins/enzymes,

• U2 binds to the branch site, and ATP is hydrolyzed;

• U5/U4/U6 trimer binds, and the U5 binds exons at the 5' site, with U6 binding to U2;

• U1 is released, U5 shifts from exon to intron and the U6 binds at the 5' splice site;

• U4 is released, U6/U2 catalyzes transesterification, U5 binds exon

at 3' splice site, and the 5' site is cleaved, resulting in the

formation of the lariat;

• U2/U5/U6 remain bound to the lariat, and the 3' site is cleaved and exons are ligated using ATP hydrolysis The spliced RNA is released and the lariat debranches

Cắt ghép mRNA

BIÊN TẬP mRNA

Human apo B

gene hnRNA (14 500 base)

Biến đổi tRNA

tRNA precursor

RNA-pol III TGGCNNAGTGC GGTTCGANNCC

DNA

Precursor transcription

RNAase P endonuclease

Cleavage

ligase

tRNA nucleotidyl transferase

Addition of CCA-OH

Biến đổi rRNA

• 45S transcript in nucleus is the

precursor of 3 kinds of rRNAs

• The matured rRNA will be assembled

with ribosomal proteins to form

ribosomes that are exported to

cytosolic space

transcription splicing

45S-rRNA

18S-rRNA

5.8S and 28S-rRNA

28S 5.8S

18S

• The rRNA precursor of tetrahymena

has the activity of self-splicing

(1982)

• Self-splicing happened often for

intron I and intron II

§3.4 Ribozyme

• Both the catalytic domain and the

substrate locate on the same

structure.

• At least 13 nucleotides are conserved.

Hammer-head

• Be a supplement to the central

dogma

• Redefine the enzymology

• Provide a new insights for the origin

of life

• Be useful in designing the artificial

ribozymes as the therapeutical

agents

Significance of ribozyme

Thực hiện nhờ phức hệ spliceosome: snRNA + Protein

đầu 5’ và đầu 3’ Vị trí phân nhánh gần đầu 3’(giàu GC và có A ở trung tâm)

điểm nối giữa exon 1 và đầu 5’ của intron (↓GT intron)

phosphodiester giữa vị trí 5’ của G tại điểm cắt với nu A bảo thủ nằm gần đầu 3’ trong intron tạo cấu trúc “thòng lọng”

intron được cắt rời, Intron được loại ra

phosphodiester, dạng thòng lọng được giải phóng ra

đầu 5’-3’ tạo thành phân tử mRNA hoàn thiện