BÀI CHUẨN bị THỰC tập BỆNH ký SINH TRÙNG

Yêu cầu chung  Nắm vững nguyên lý, cách tiến hành, phạm vi ứng dụng của từngphương pháp  Bước đầu phân biệt trứng giun sán với một số dị vật trong phân  Bước đầu phân biệt trứng sán l

BÀI CHUẨN BỊ THỰC TẬP BỆNH KÝ SINH TRÙNG

Phương pháp nuôi ấu trùng

Yêu cầu chung

 Nắm vững nguyên lý, cách tiến hành, phạm vi ứng dụng của từngphương pháp

 Bước đầu phân biệt trứng giun sán với một số dị vật trong phân

 Bước đầu phân biệt trứng sán lá, sán dây, giun tròn

Cách lấy phân

 Lấy phân tươi

 Phân đã thải ra ngoài:

như trên hình vẽ

 Mẫu ghi đầy đủ các thông tin: loài vật, địa điểm, ngày lấy mẫu…bảo quản lạnhtrong quá trình vận chuyển hoặc giữ mẫu

1,2 giọt Glyxerin 50%

 Tiến hành:

Dùng pince hoặc đũa

thủy tinh lấy 1 mẫu phân

to bằng hạt đỗ đặt lên

Nhỏ vào đó 1-2 giọt Glyxerin 50%, để giữ tiêu bản lâu khô và dễ nhìn (Nếu

không có Glyxerin có thể dùng nước sạch để thay thế) Dầm nát phân và gạt cặn bã rahai đầu phiến kính Dung dịch phân bên trong được dàn mỏng

Những tiêu bản này được đặt lên kính hiển vi để tìm trứng giun sán

Tiêu bản đạt yêu cầu khi

Giữa dung dịch phân và mép của phiến kính tạo thành một hành lang sạch sẽ.Dung dịch phân được dàn mỏng đến mức ánh sáng có thể qua được và khôngtràn ra mép phiến kính

 Ứng dụng: có thể tìm được trứng sán lá, trứng sán dây, trứng giun tròn, đốt sándây, noãn nang đơn bào

 Ưu nhược điểm của phương pháp

- Ưu điểm: đơn giản, dễ làm nên dễ áp dụng, cho kết quả nhanh

- Nhược điểm: Độ chính xác không cao

II. Phương pháp gạn rửa sa lắng (dội rửa nhiều lần)

1 Nguyên lý

Phương pháp này dựa vào sự chênh lệch tỷ trọng giữa tỷ trọng của nước và tỷtrọng trứng giun sán để phân ly trứng ra khỏi phân Trứng giun sán có tỷ trọng nặnghơn sẽ lắng xuống dưới

2 Cách tiến hành

Ước lượng một khối lượng phân khoảng bằng quả táo (định tính) hoặc cân chínhxác một khối lượng phân (5-10 gam phân – định lượng) của đối tượng cần xétnghiệm cho vào một giá lọc Đặt giá lọc và mẫu phân vào cối sứ Đổ vào đó mộtlượng nước bằng 2/3 thể tích cối sứ Dùng cháy sứ rửa mẫu phân nhiều lầntrong cối sứ và giá lọc Loại bỏ cặn bã lớn trong giá lọc, giữ lại dung dịch lọc

Chuyển dung dịch lọc sang một cốc sạch Bổ sung thêm nước cách miệng cốckhoảng 2cm Để yên tĩnh khoảng 10 phút Gạn bỏ lớp nước phía trên giữ lạiphần cặn ở đáy Sau đó lại tiếp tục dội mạnh nước sạch vào cặn lắng Lặp lạithao tác này khoảng 3-5 lần đến khi cặn đã trở nên sạch Cuối cùng gạn lớpnước trong bên trên, giữ lại cặn Cặn được đổ ra đĩa petri và đặt dưới kính hiển

vi soi nổi để tìm trứng giun sán

 Lưu ý:

- Nên dùng loại cốc có đáy hẹp

- Lượng cặn đổ ra hộp lồng sao cho có thể soi được dưới kính hiển

vi soi nổi để tìm trứng giun sán Nếu quá đặc, chỉ lấy một lượng nhỏ rồi phaloãng

- Trong trường hợp định lượng yêu cầu phải kiểm tra toàn bộ phầncặn bã thu được Đếm và phân loại trứng giun sán

3 Phạm vi ứng dụng, ưu nhược điểm của phương pháp

- Phương pháp này được ứng dụng để tìm trứng sán lá (trừ sán lásinh sản gia cầm), đốt sán dây

- Ưu điểm: đơn giản, dễ làm, có thể thực hiện tại phòng thí nghiệmhoặc tại cơ sở sản xuất

- Nhược điểm: không tìm được trứng giun tròn và noãn nang củađơn bào

1 Nguyên lý

Dựa vào sự chênh lệch tỷ trọng giữa trứng giun sán và một số dung dịch có tỷtrọng nặng hơn (dung dịch muối, dung dịch đường) để phân ly trứng ra khỏi phân.Những trứng giun sán có tỷ trọng nhỏ hơn tỷ trọng của các dung dịch này sẽ nổilên trên

+ Đặt giá lọc và mẫu phân vào cối sứ, đổ vào đó một lượng nước muối bão hòagấp khoảng 5 lần khối lượng phân

+ Dùng chày sứ rửa mẫu phân nhiều lần trong nước muối Loại bỏ cặn bã trêngiá lọc

+ Chuyển dung dịch phân sang lọ tiêu bản Điều chỉnh lượng dung dịch bằng

cách cho thêm dung dịch nước muối bão hòa đến phần có tiết diện nhỏ nhất của

lọ

+ Để yên tĩnh trong 15-20 phút, để trứng nổi lên

+ Dùng vòng vớt bằng thép nhỏ có đường kính 0,5mm để vớt lớp váng trên bềmặt và đặt lên phiến kính

+ Kiểm tra tiêu bản trên kính hiển vi ở vật kính 10x hoặc 40x để tìm trứng giunsán

 Lưu ý: Trong trường hợp định lượng cần cân chính xác một khối lượng phân

và đong chính xác lượng dung dịch muối bão hòa để xác định cường độ nhiễm.Khi đó nên dùng các ống nghiệm có chia vạch (ống 15ml) để chứa dung dịchphân sau khi được lọc Sau đó bổ sung thêm dung dịch muối bão hòa đến phầnmiệng ống nghiệm Đặt lamen lên trên miệng ống sao cho lamen vừa chạm vào

bề mặt dung dịch phân Để yên tĩnh trong thời gian 15-20 phút để trứng/noãnnang nổi lên Cuối cùng, chuyển lamen sang phiến kính và kiểm tra dưới kínhhiển vi ở vật kính 10x hoặc 40x để tìm trứng giun sán/noãn nang đơn bào

Phạm vi ứng dụng

Ứng dụng ở cơ sở sản xuất và phòng thí nghiệm

Ưu điểm

Tìm được tất cả các loại trứng giun tròn Ngoài ra có thể tìm thấy trứng sán lá

sinh sản gia cầm (Prosthogonimus spp.)

- Sau khi lọc, chuyển dung dịch phân sang ống ly tâm hoặc ống nghiệm 15 ml.

Ly tâm với tốc độ 1500 vòng/ phút trong vòng 15 phút

- Lấy ống lý tâm ra, bổ sung thêm NaCl bão hòa đến miệng ống

- Đặt lamen lên bề mặt ống nghiệm, để yên tĩnh trong 15 phút để trứng/noãnnang nổi lên

- Chuyển lamen sang phiến kính, đặt phiến kính dưới KHV, tìm trứng/noãnnang ở vật kính 10x hoặc 40x

Sử dụng ly tâm có thể làm tăng độ nhạy của phương pháp

- Magnesium sulfate: (MgSO4; SG 1.20): 450 g MgSO4 1,000 ml nước

- Zinc Sulfate (ZnSO4; SG 1.18–1.20): 331 g ZnSO4 1,000 ml nước ấm

- Sodium Nitrate (NaNO3; SG 1.18–1.20): 338g NaNO3 1,000 ml nước

- Saturated Salt (NaCl; SG 1.18–1.20) 350 g NaCl 1,000 ml nước

- Modified Sheather’s Solution (SG 1.27): 454 g granulated sugar + 355 ml nước + 6 ml formaldehyde Hòa tan đường trong nước ấm, nếu dung dịch đục

Ưu điểm: tìm được tất cả trứng sán lá, trứng sán dây, trứng giun tròn và noãn nangđơn bào

V Phương pháp đếm trứng Stole

1 Phương pháp đếm trứng Stole

Mục đích: xác định được mức độ nhiễm trứng giun sán ở vật nuôi

Vật liệu và dụng cụ

- Phân gia súc cần xét nghiệm: 4 g; NaOH 0.1N

- Đũa thủy tinh, pipete

- Bình chia độ, loại 60 ml hoặc 100ml

- Bi sắt, hoặc sỏi: 2 – 3 viên

- Phiến kính, lam kính

- KHV có vật kính 10x hoặc 40x

Các tiến hành

- Đổ 56ml NaOH 0.1N vào bình chia độ

- Từ từ đưa phân gia súc vào bình sao cho mực dung dịch trong bình đạt 60mlthì dừng lại

- Dùng đũa thủy tinh dầm nát phân trong dung dịch

- Thêm vào bình 2-3 viên bi sắt hoặc sỏi

- Lắc đều bình chia độ để dung dịch phân và NaOH đồng nhất tại mọi vị trí

- Dừng lại đột ngột, dùng pipete lấy 0.15 ml dung dịch phân, đưa lên phiến kính,quan sát trên kính hiển vi, đếm trứng giun, sán

Gọi a là số trứng đếm được trong 0.15 ml dung dịch phân

X là số trứng có trong 1 ml dung dịch phân (tương đương với 1g phân)

X = a x 100

Ưu điểm:

- Bằng phương pháp đếm trứng Stole, có thể tìm được trứng của sán lá, sán dây,giun tròn và noãn nang đơn bào

- Xác định được cường độ nhiễm sán trên gia súc

- Đánh giá được hiệu quả thuốc tẩy giun, sán

Nhược điểm:

Độ chính xác không cao

VI Phương pháp đếm trứng McMaster

Mục đích: xác định mức độ nhiễm trứng giun sán hoặc noãn nang đơn bào.

Dụng cụ: buồng đếm McMaster

Hóa chất: dung dịch muối NaCl bão hòa

Tiến hành:

- Cân chính xác 2gram phân của đối tượng cần xét nghiệm

- Đong chính xác 58 ml dung dịch muối NaCl bão hòa

- Cho phân và dung dịch muối vào giá lọc và cối sứ

- Rửa và lọc dung dịch phân

- Dùng pipette hút dung dịch phân chuyển vào 2 buồng đếm

- Để yên tĩnh 15 phút để trứng giun sán/noãn nang nổi lên

- Đặt buồng đếm dưới KHV để tìm trứng giun sán

Lưu ý: tìm, phân loại và đếm tất cả trứng/noãn nang có trong mẫu phân

Gọi n là số trứng đếm được trong 2 buồng đếm

X là số trứng có trong 1 gram phân

X = n x 100

VII Phương pháp tìm ấu trùng

 Nguyên lý: - Một số giun tròn không thải trứng mà thải ấu trùng ra ngoài môi

trường hoặc thải trứng nhưng khi trứng đến trực tràng thì nở thành ấu trùng

- Lợi dụng tính ưa hoạt động của ấu trùng giun tròn ở điều kiệnnhiệt độ 37⁰C để phân ly ấu trùng ra khỏi phân gia súc

1 Phương pháp Baermann

- Dụng cụ: + Hệ thống Baerman bao gồm: 1 phễu thủy tinh (hoặc phễu nhựa)nối với 1 ống nghiệm thông qua 1 ống cao su; toàn bộ hệ thống được đỡ trên 1giá đỡ

+ Nhiệt kế, nước ấm 37oC, lưới lọc, bông, đĩa lồng, kính hiển vi

+ Cân hoặc ước lượng phân gia súc cần xét nghiệm cho vào giá lọc và đặt lênphễu nhựa.

+ Để yên tĩnh khoảng 30 – 45 phút

+ Nhẹ nhàng đưa giá lọc có chứa phân ra khỏi phễu nhựa

+ Gạn bỏ lớp nước phía trên hệ thống, giữ lại phần cặn ở đáy ống nghiệm.+ Đổ toàn bộ phần cặn vào đĩa lồng, đưa lên KHV soi nổi để tìm ấu trùng giuntròn

- Phạm vi ứng dụng: Dùng để xét nghiệm phân các loài đại gia súc có lượngphân lớn và nhão (trâu, bò)

Ứng dụng tìm ấu trùng giun phổi ở động vật nhai lại, giun lươn ở chó(Strongyloides steracolis)

2 Phương pháp Vaid

- Dụng cụ: đĩa petri, pince, nhiệt kế, nước ấm 37oC

- Tiến hành:

+ Đổ nước ấm 37oC vào trong đĩa petri

+ Dùng pince gắp phân của đối tượng cần xét nghiệm cho vào đĩa petri

+ Để đĩa petri yên tĩnh trong khoảng 30 phút đến 2 giờ

+ Dùng pince gắp mẫu phân ra khỏi đĩa petri

+ Gạn bớt lớp nước trong ở phía trên, giữ lại cặn

+ Đặt đĩa petri lên KHV soi để tìm ấu trùng giun tròn

- Ứng dụng: mẫu phân của gia súc hình viên (dê, cừu) tìm ấu trùng của giun phổi

3 Phương pháp nuôi ấu trùng

- Mục đích: trứng của nhiều loài giun tròn khi theo phân ra ngoài không phânbiệt được bằng hình thái Để xác định giống (hoặc loài) giun tròn này cần phảidựa vào hình thái của ấu trùng

I.Nguyên lý

Kỹ thuật nuôi cấy ấu trùng trong ống nghiệm sử dụng giấy lọc được Harada

và Mori giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1955, sau đó được cải tiến bởi một số tác giả khác (H C Hsieh, 1962; M S Sasa, 1958)

Phương pháp được tiến hành dựa trên nguyên lý: mẫu phân được dàn mỏnglên một tấm giấy lọc, rồi được đặt vào một ống nghiệm (ống falcon 15 hoặc 50ml) Nước được bổ sung vào đáy ống nghiệm và thấm vào giấy lọc theo

nguyên tắc thẩm thấu để cung cấp độ ẩm trong quá trình nuôi Cần nuôi mẫu phân

trong điều kiện thích hợp cho sự phát triển của ấu trùng hoặc cho ấu trùng thoát vỏ.

Yêu cầu: mẫu phân tươi và không được bảo quản lạnh

2 Chuẩn bị mẫu phân: 0.5 – 1g phân được dầm nát trong cốc hoặc cối

sứ (nếu phân khô thì bổ sung thêm nước)

3 Dàn mỏng mẫu phân trên mảnh giấy lọc trong khoảng đã được đánh dấu

4 Thêm 3 – 4 ml vào ống nghiệm 15ml

5 Đặt tấm giấy lọc vào trong ống nghiệm theo chiều đầu nhọn hướng xuống đáy ống Mực nước trong ống nghiệm cách mẫu phân khoảng 1.5 cm

Có thể dùng nút bằng cotton đậy nên miệng ống nghiệm

6 Giữ ống nghiệm theo chiều thẳng đứng ở 25 – 28oC Bổ sung thêm nước đến mức quy định trong 2 ngày đầu do nước bị bốc hơi

7 Giữ ống nghiệm trong 10 ngày, kiểm tra hàng ngày bằng cách dùng pipet hút một lượng nhỏ nước ở đáy ống nghiệm đưa lên phiến kính, đậy lamen và kiểm tra dưới kính hiển vi với độ phóng đại 10x

8 Kiểm tra sự chuyển động và các đặc điểm hình thái để nhận dạng ấu trùng

IV Ứng dụng

- Tìm ấu trùng của giun tròn

V Ưu, nhược điểm

- Kỹ thuật này có thể phát hiện được ấu trùng của cả giun tròn sống ký sinh và sống tự do Cần phải phân biệt hai dạng này bằng cách dùng acid hydrochloric Thêm 0.3 ml acid HCl vào 10 ml dung dịch chứa ấu trùng sao cho tỷ lệ pha loãng acid đạt 1 : 30 Các loài giun tròn sống tự do sẽ bị giết, trong khi các loài giun tròn sống ký sinh có thể sống được 24 giờ

- Tốn kém thời gian, không thích hợp trong chẩn đoán lâm sàng Tuy nhiên, có thể ứng dụng kỹ thuật này cho các hoạt động điều tra

BÀI 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP MỔ KHÁM TÌM GIUN SÁN

Mục đích

V Đây là phương pháp chính xác nhất giúp ta tìm được

mọi loài giun sán ở các giai đoạn phát triển khác nhau,

ký sinh ở các vị trí khác nhau trong cơ thể ký chủ

VI Biết cách thu lượm bảo quản và phân loại giun sán

Bước 1: Kiểm tra bên ngoài xác chết để tìm ký sinh trùng Dùng kính lúp

soi ở những vùng da mỏng, các điểm nghi ngờ có ký sinh trùng vàcác lỗ tự nhiên

Bước 2: Lột da tìm ký sinh trùng dưới da.

Dưới da thường có ấu trùng sán dâyThực hiện: Trâu, bò, gia cầm

Đối với Lợn không thực hiện bước này, vì hiện nay chưa có tàiliệu nào dẫn chứng có ký sinh trùng ký sinh dưới da Lợn

Bước 3: Mổ khám các xoang tìm ký sinh trùng.

Ví dụ: Xoang mắt, xoang miệng, xoang mũi

Trên gia cầm ở xoang mắt thường có giun xoăn mắt gàTrên trâu bò ở xoang bụng có giun chỉ

Bước 4: Mổ khám phân lập các khí quan riêng rẽ.

Tách các khí quan để vào các dụng cụ đựng mẫu riêng rẽ

Để tránh nhầm lẫn giữa các mẫu cần viết nhãn tạm thời

MẪU NHÃN TẠM THỜI

Bước 5: Dùng các phương pháp thích hợp để xử lý đối với từng khíquan

Có 3 cách:

 Cách 1: Đối với chất chứa của các khí quan hình ống (Dạ dày,

ruột non, ruột già…)

Lấy toàn bộ chất chứa xét nghiệm bằng phương pháp gạn rửa sa lắng

Lưu ý:

Không sử dụng đũa thuỷ tinh khuấy mạnh như trong phương pháp gạn rửa salắng đối với phân gia súc để tránh tình trạng làm tổn thương đến ký sinh trùng(Trường hợp các đốt sán dây bị đứt…) Chỉ dùng lực của dòng nước

 Cách 2: Đối với niêm mạc, các khí quan hình ống, dùng

phương pháp Nạo vét ép soi

Dùng vật cứng (phiến kính, chuôi dao mổ) nạo niêm mạc rồi ép lên giữa haiphiến kính soi lên kính hiển vi với độ phóng đại 7x10 và 7x15

 Cách 3: Đối với các khí quan là thực thể như gan, thận, tim, phổi, cơ dùng

phương pháp Cắt lát ép soi

Dùng kéo cong cắt thành các lát mỏng ép giữa 2 phiến kínhlớn

Chú ý: Khi xử lý đối với từng khí quan:

Phổi: dùng kéo cắt đến tận cuống các phế nang

Dạ dày kép (4 túi): Xử lý từng túi riêng rẽ

Loài gia súc

Số hiệuTính biệtKhí quan

Dạ dày đơn: Cắt theo đường cong lớn.

Gia cầm: Phân tách dạ dày cơ riêng và dạ dày tuyến riêng

Ruột: Dùng kéo cắt theo đường cong lớn đối diện với màng treo ruột.Thận: Bổ đôi thận để tìm giun sán trong bể thận

II Phương pháp mổ khám toàn diện ở 1 khí quan

Mục đích:

Tìm mọi loài giun sán ở một khí quan nhất định

III Phương pháp mổ khám không toàn diện

Mục đích:

Tìm 1 loài giun sán nào đó từ nhiều khí quan trong cơ thể

Phương pháp này thường áp dụng trong công tác kiểm soát giết mổ, ví dụ;bệnh giun bao, bệnh gạo lợn

IV Phương pháp thu giữ và bảo quản mẫu vật

Thực hiện các bước sau:

- Nhẹ nhàng tách giun sán ra khỏi các khí quan (Có thể dùng pince)

- Để giun sán chết tự nhiên trong nước lã

- Bảo quản giun sán trong các dung dịch thích hợp

- Đối với sán lá sán dây, giun đầu gai, bảo quản trong dung dịch cồn 70°

- Đối với giun tròn, bảo quản trong dung dịch Barbagallo

- Cách pha dung dịch Barbagallo: NaCl 7,5gr

Formol 30ml (38-40%)Nước cất: 1000mlKhi bảo quản phải để từng khí quan riêng rẽ và viết nhãn cố định đi kèm theomẫu Nhãn được viết bằng bút chì cứng trên giấy can Nhãn có 2 mặt:

MẪU NHÃN CỐ ĐỊNH

Tính biệtKhí quan có KSTLớp

Số lượng

Nhãn được đặt trong lọ tiêu bản, mục đích của viết nhãn là để gửi đi phân loại giunsán và ghi vào sổ mổ khám

Phân loại:

Cách phân loại các loài giun sán khác nhau tuỳ thuộc vào loài

Đối với lớp sán lá sán dây, ép giữa 2 phiến kính và nhuộm bằng phương pháp nhuộmCarmin đối với giun tròn và giun đầu gai, làm trong suốt bằng dung dịch Glyxerin +

Ac Lactic tỷ lể 1:1

BÀI 3 QUAN SÁT HÌNH THÁI CẤU TẠO CỦA MỘT SỐ

LOÀI SÁN LÁ, SÁN DÂY KÝ SINH Ở GIA SÚC, GIA CẦM

(Dùng cho cả Ký sinh trùng 1 và Ký sinh trùng 2) Mục đích

Nắm vững các đặc điểm hình thái cơ bản của các loài sán lá sán dây ký sinh ởgia súc gia cầm

Phân biệt được các loài sán lá, sán dây

A SÁN LÁ

Giới thiệu chung

Sán lá thuộc lớp Trematoda ngành Nemathelmilthe

Vòng đời phát triển gián tiếp, bắt buộc phải qua vật chủ trung gian

I Sán lá gan lớn ký sinh ở loài nhai lại.

Có 2 loài ký sinh là Fasciola hepatica và Fasciola gigantica

Trứng: có kích thước lớn, phình rộng ở giữa, thon dần 2 đầu Đầu nhỏ